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CN114214305B - 一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114214305B
CN114214305B CN202210052396.9A CN202210052396A CN114214305B CN 114214305 B CN114214305 B CN 114214305B CN 202210052396 A CN202210052396 A CN 202210052396A CN 114214305 B CN114214305 B CN 114214305B
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Abstract

本发明涉及植物原生质体技术领域，特别是涉及一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用。本发明以蓝果忍冬叶片为材料制备原生质体，针对蓝果忍冬的种属特点以及叶片的结构等特点，通过适宜的组分复配得到一种适宜蓝果忍冬的酶解液。本发明提供的酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。另外，本发明提供的酶解液将有助于蓝果忍冬原生质体融合育种的实施，为基于细胞融合和基因转化的蓝果忍冬细胞工程育种和分子生物学研究提供重要材料，具有较大的应用价值。

Description

一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物原生质体技术领域，特别是涉及一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用。
背景技术
蓝果忍冬(Lonicera caerulea L.)是忍冬科忍冬属的一种多年生落叶灌木，生于落叶林下或林缘荫处灌丛中，广泛分布于我国各地。蓝果忍冬作为第三代新兴小浆果树种，其浆果富含氨基酸、矿物质、糖类、维生素和多种活性物质，可生食，营养价值丰富，具有极高的药用价值和经济价值，是一种纯天然的保健产品。
植物原生质体是指去除细胞壁后的活细胞，具有全能性，在一定条件下可再生细胞壁并再生成新植株。由于其无细胞壁障碍的特性，常被用来作为细胞融合和体细胞杂交等研究的理想材料，能有效克服种、属间的不亲和障碍。此外，原生质体能够摄取DNA、病毒、细菌等外源物质，因此也被广泛应用于亚细胞定位、筛选突变体、基因瞬时表达和蛋白互作等分子生物学方面的研究。近些年来，对蓝果忍冬植物的研究主要集中在药理药效以及化学成分分析等方面，而生物技术在蓝果忍冬植物研究中的应用起步较晚，多个领域的研究还比较缺乏。目前为止，对于蓝果忍冬原生质体分离、培养以及融合等方面的研究尚属空白。
由于不同植物的细胞结构等存在较大差异，采用其他植物的原生质体分离方法进行蓝果忍冬叶片的处理，较难得到较高的原生质体数量，且得到的原生质体的完整性和活性也不佳。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用。本发明提供的酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7～0.8mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl220mmol/L和BSA 1g/L～3g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g；所述离析酶的酶活为>3000U/g。
优选的，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl220mmol/L和BSA 1g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g；所述离析酶的酶活为>3000U/g。
本发明还提供了上述酶解液的制备方法，包括以下步骤：将纤维素酶、离析酶、MES、甘露醇和KCl混合，55℃水浴10min，得到混合液；混合液降温至20～25℃后，将混合液和CaCl2及BSA混合，得到所述酶解液。
本发明还提供了上述酶解液或利用上述制备方法制备得到的酶解液在制备蓝果忍冬原生质体中的应用。
本发明还提供了一种制备蓝果忍冬植物原生质体的方法，包括以下步骤：
将蓝果忍冬叶片和上述酶解液或利用上述制备方法制备得到的酶解液混合，暗处理3h，得到混合液；
将所述混合液与W5溶液混合，过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀为原生质体；所述W5溶液包括以下组分：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl20.1mol/L和KCl 5mmol/L；所述W5溶液的pH值为5.8。
优选的，所述蓝果忍冬植物叶片和权利要求1或2所述酶解液混合后还包括抽真空30min。
优选的，所述暗处理的温度为20～25℃。
优选的，所述离心的方法包括：将滤液在离心力为100g下离心2min，得到初级沉淀；
将初级沉淀与所述W5溶液混合，在离心力为100g下离心10min，得到的沉淀为原生质体。
优选的，所述初级沉淀与所述W5溶液混合后还包括将混合液在冰上静置30min。
优选的，得到原生质体后还包括：将原生质体与MMG溶液混合，得到含有原生质体的混合液；所述MMG溶液包括以下组分：甘露醇0.4mol/L、MgCl20.015mol/L和MES 4mmol/L；所述MMG溶液的pH值为5.7。
有益效果：
本发明提供了一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7～0.8mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl220mmol/L和BSA 1g/L～3g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g；所述离析酶的酶活为>3000U/g。本发明以蓝果忍冬叶片为材料制备原生质体，针对蓝果忍冬的种属特点以及叶片的结构等特点，通过适宜的组分复配得到一种适宜蓝果忍冬的酶解液。本发明提供的酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。另外，本发明提供的酶解液将有助于蓝果忍冬原生质体融合育种的实施，为基于细胞融合和基因转化的蓝果忍冬细胞工程育种和分子生物学研究提供重要材料，具有较大的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为用于原生质体分离的蓝果忍冬植株和叶片；
图2为荧光倒置显微镜拍摄的应用例1分离制备的蓝果忍冬原生质体照片；其中右下角标尺为50μm；
图3为40×显微镜下观察到的应用例1分离制备蓝果忍冬原生质体细胞；其中右下角标尺为20μm；
图4为激光共聚焦显微镜拍摄的在明场下经FDA染色的应用例1分离制备的蓝果忍冬原生质体；其中右下角标尺为50μm；
图5为激光共聚焦显微镜拍摄的在复合场下经FDA染色的应用例1分离制备的蓝果忍冬原生质体；其中右下角标尺为50μm；
图6为激光共聚焦显微镜拍摄的在荧光场下经FDA染色的应用例1分离制备的蓝果忍冬原生质体；其中右下角标尺为50μm。
具体实施方式
本发明提供了一种制备蓝果忍冬植物原生质体的酶解液，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7～0.8mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl220mmol/L和BSA 1g/L～3g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g；所述离析酶的酶活为>3000U/g。
如无特殊说明，本发明对所述酶解液的各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明所述酶解液包括纤维素酶20g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g。在本发明中，所述纤维素酶优选包括纤维素酶R-10。
本发明所述酶解液包括离析酶5g/L；所述离析酶的酶活为>3000U/g。在本发明中，所述离析酶优选包括离析酶R-10。
本发明通过适宜浓度的纤维素酶和离析酶复配，可以充分酶解蓝果忍冬细胞壁，从而可以分离得到更多的原生质体。
本发明所述酶解液包括MES(吗啉乙磺酸)20mmol/L。
本发明所述酶解液包括甘露醇0.7～0.8mol/L，优选为0.7mol/L。
本发明所述酶解液包括KCl 20mmol/L。
本发明通过适宜浓度的MES、甘露醇和KCl复配，可以保证蓝果忍冬原生质体膜的稳定性，避免破裂，从而有利于保证原生质体的完整性和活性。
本发明所述酶解液包括CaCl220mmol/L。
本发明所述酶解液包括BSA(牛血清白蛋白)1g/L～3g/L，优选为1g/L。
本发明通过适宜浓度的CaCl2和BSA复配，能减少或防止降解植物细胞壁过程中对细胞器的破坏，从而有利于保证原生质体的完整性和活性。
本发明以蓝果忍冬叶片为材料制备原生质体，针对蓝果忍冬的种属特点以及叶片的结构等特点，通过适宜的组分复配得到一种适宜蓝果忍冬的酶解液；所述酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。
本发明优选还提供了上述酶解液的制备方法，包括以下步骤：将纤维素酶、离析酶、MES、甘露醇和KCl混合，55℃水浴10min，得到混合液；混合液降温至20～25℃后，将混合液和CaCl2及BSA混合，定容，得到所述酶解液。本发明通过水浴可使酶在一个合适的温度中充分的溶解混合，且不破坏酶的活性，提高后续的酶解效率。
本发明还提供了上述酶解液在制备蓝果忍冬原生质体中的应用。本发明提供的酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。机理同上，在此不再赘述。
本发明还提供了一种制备蓝果忍冬原生质体的方法，包括以下步骤：
将蓝果忍冬叶片和上述酶解液混合，暗处理3h，得到混合液；
将所述混合液与W5溶液混合，过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀为原生质体；所述W5溶液包括以下组分：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl20.1mol/L和KCl 5mmol/L。
本发明将蓝果忍冬叶片和上述酶解液混合，暗处理3h，得到混合液。在本发明中，所述蓝果忍冬叶片优选包括蓝果忍冬无菌苗的幼嫩叶片；所述幼嫩叶片优选包括从上到下3个茎节的所有叶片；所述蓝果忍冬无菌苗优选包括培养30d的蓝果忍冬无菌苗。
在本发明中，所述蓝果忍冬叶片和上述酶解液混合前优选还包括将蓝果忍冬叶片分成0.5～1.0mm宽的叶条；混合后优选还包括抽真空30min，抽真空后暗处理3h。本发明通过抽真空处理可以使酶解液与叶片充分混合。
在本发明中，所述暗处理的温度优选为20～25℃；所述暗处理优选还包括振荡培养；所述振荡培养的转速为35r/min；所述振荡培养优选包括水平振荡；所述振荡培养的装置优选包括水平摇床。
得到混合液后，本发明将所述混合液与W5溶液混合，过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀为原生质体；所述W5溶液包括以下组分：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl20.1mol/L和KCl 5mmol/L；所述W5溶液的pH值为5.8。本发明提供的W5溶液不仅可以去除酶液和细胞碎片达到纯化原生质体的目的，还可在一定时间内保存原生质体。
在本发明中，所述离心的方法优选包括：将滤液在离心力为100g下离心2min，得到初级沉淀；
将初级沉淀与所述W5溶液混合，在离心力为100g下离心10min，得到的沉淀为原生质体。
在本发明中，所述初级沉淀与所述W5溶液混合后还包括将混合液在冰上静置30min。本发明通过将混合液在冰上静置30min可以防止原生质体分离破碎，从而提高原生质体的数量。
在本发明中，所述过滤的孔径优选为100目。
得到沉淀后，本发明优选还包括：将沉淀与MMG溶液混合，得到含有原生质体的混合液；所述MMG溶液包括以下组分：甘露醇0.4mol/L、MgCl20.015mol/L和MES 4mmol/L；所述MMG溶液的pH值为5.7。本发明提供的MMG溶液能够较好的维持原生质体的渗透压平衡，保持原生质体的完整性。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种制备蓝果忍冬植物原生质体的酶解液，由以下组分组成：纤维素酶R-10 20g/L、离析酶R-10 5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl220mmol/L和BSA1g/L；所述纤维素酶R-10的酶活为>10000U/g；所述离析酶R-10的酶活为>3000U/g。
所述酶解液的制备，由以下步骤组成：
将纤维素酶R-10、离析酶R-10、MES、甘露醇和KCl混合，55℃水浴10min，得到混合液；混合液降温至室温(20～25℃)后，将混合液和CaCl2及BSA混合，定容，得到所述酶解液。
实施例2
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的甘露醇浓度为0.8mol/L。
实施例3
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的BSA浓度为2g/L。
实施例4
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的BSA浓度为3g/L。
对比例1
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的纤维素酶R-10浓度为10g/L。
对比例2
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的纤维素酶R-10浓度为15g/L。
对比例3
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的离析酶R-10浓度为10g/L。
对比例4
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的纤维素酶R-10浓度为10g/L，离析酶R-10浓度为10g/L。
对比例5
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的纤维素酶R-10浓度为15g/L，离析酶R-10浓度为10g/L。
对比例6
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的甘露醇浓度为0.4mol/L。
对比例7
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的甘露醇浓度为0.5mol/L。
对比例8
一种与实施例1相似的的酶解液，唯一区别在于，酶解液中的甘露醇浓度为0.6mol/L。
应用例1
一种制备蓝果忍冬原生质体的方法，由以下步骤组成：
1)在培养皿中加入10mL实施例1制备的酶解液；
2)取培养30d的蓝果忍冬无菌苗植株，取其上部幼嫩叶片(从上到下3个茎节的所有叶片，见图1)，称取0.20g，用手术刀快速切成0.5～1.0mm叶条；
3)将叶条加入酶解液中，轻轻晃动培养皿润湿叶条后，将培养皿置于连接真空泵的干燥器中，抽真空30min；
4)将含有叶条的酶解液放在水平摇床上以35r/min速度于室温下暗处理3h，得到混合液；
5)轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来，用3mL预冷的W5溶液(所述W5溶液由以下组分组成：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl20.1mol/L和KCl 5mmol/L，pH值为5.8)稀释含有原生质体的酶液；
6)用W5溶液润湿100目尼龙膜，然后用它过滤含有原生质体的酶解液；
7)在室温(20～25℃)下，100g条件下离心2min，沉淀原生质体，去除上清液后用10mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体，在冰上静至原生质体30min；
8)在室温下，100g离心10min，去除上清液，得到原生质体；
9)用1mL MMG溶液(所述MMG溶液由以下组分组成：甘露醇0.4mol/L、MgCl20.015mol/L和MES 4mmol/L，pH值为5.7)重悬原生质体，用移液器按200μL/管的规格分装至2mL离心管中，得到含有原生质体的溶液，室温避光静置。
应用例2
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为实施例2制备的酶解液。
应用例3
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为实施例3制备的酶解液。
应用例4
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为实施例4制备的酶解液。
对比例9
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例1制备的酶解液。
对比例10
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例2制备的酶解液。
对比例11
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例3制备的酶解液。
对比例12
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例4制备的酶解液。
对比例13
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例5制备的酶解液。
对比例14
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例6制备的酶解液。
对比例15
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例7制备的酶解液。
对比例16
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤1)中的实施例1制备的酶解液替换为对比例8制备的酶解液。
对比例17
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤4)中的暗处理3h调整为暗处理1h。
对比例18
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤4)中的暗处理3h调整为暗处理5h。
对比例19
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤4)中的暗处理3h调整为暗处理7h。
对比例20
一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，将步骤4)中的暗处理3h调整为暗处理10h。
对比例21
利用血球计数板对应用例1～4和对比例9～20分离制备的原生质体产量进行计数，具体方法为：吸取10μL原生质体悬液，滴于血球计数板上，置于荧光倒置显微镜下计数(应用例1制备的原生质体见图2)，根据式Ⅰ计算原生质体产量，每个样品重复3次，取平均值，结果见表1。
原生质体活性用二乙酸荧光素(FDA)进行染色测定，具体为：取10μL样品和1μL的0.01％FDA于微量离心管中，混匀后滴于血球计数板，统计原生质体数量，根据式Ⅱ计算原生质体活性，每个样品重复3次，取平均值，结果见表2。利用激光共聚焦显微镜分别拍摄在明场、复合场和荧光场下经FDA染色的蓝果忍冬原生质体(应用例1分离制备得到的原生质体)，结果见图4～6。
原生质体产量(个/g)＝(5个方格内原生质体总数/80×400×104×稀释倍数)/叶片总质量(g)式Ⅰ；
原生质体活性＝发绿色荧光原生质体数/原生质体总数×100％   式Ⅱ
其中，式Ⅰ中的稀释倍数为10倍。
表1不同方法制备的原生质体产量和活性结果
Figure BDA0003474830600000091
Figure BDA0003474830600000101
由表1可知，本发明实施例1～4制备的酶解液可以显著提高蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性，其中0.20g叶片能够分离获得产量为(4.06～5.67)×106个/g，活力为81.36％～89.63％的原生质体细胞，效果显著优于对比例1～8制备的酶解液；另外，本发明通过适宜的暗处理时间可以显著提高蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。
综上所述，本发明提供的酶解液可以显著提高蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性；另外，本发明提供的方法操作简便，设备要求低，污染率极低，分离获得的原生质体颜色鲜艳，形态较圆且透明(见图3)，可以满足后续蓝果忍冬细胞融合、外源基因瞬时转化等实验的需要。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液，其特征在于，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7～0.8mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl2 20mmol/L和BSA 1g/L～3g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g；所述离析酶的酶活为>3000U/g。
2.根据权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl2 20mmol/L和BSA1g/L；所述纤维素酶的酶活为>10000U/g；所述离析酶的酶活为>3000U/g。
3.权利要求1或2所述酶解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将纤维素酶、离析酶、MES、甘露醇和KCl混合，55℃水浴10min，得到混合液；混合液降温至20～25℃后，将混合液和CaCl2及BSA混合，得到所述酶解液。
4.权利要求1或2所述酶解液或利用权利要求3所述制备方法制备得到的酶解液在制备蓝果忍冬原生质体中的应用。
5.一种制备蓝果忍冬植物原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将蓝果忍冬叶片和权利要求1或2所述酶解液或利用权利要求3所述制备方法制备得到的酶解液混合，暗处理3h，得到混合液；
将所述混合液与W5溶液混合，过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀为原生质体；所述W5溶液包括以下组分：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl2 0.1mol/L和KCl 5mmol/L；所述W5溶液的pH值为5.8。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蓝果忍冬植物叶片和权利要求1或2所述酶解液混合后还包括抽真空30min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述暗处理的温度为20～25℃。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心的方法包括：将滤液在离心力为100g下离心2min，得到初级沉淀；
将初级沉淀与所述W5溶液混合，在离心力为100g下离心10min，得到的沉淀为原生质体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述初级沉淀与所述W5溶液混合后还包括将混合液在冰上静置30min。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，得到原生质体后还包括：将原生质体与MMG溶液混合，得到含有原生质体的混合液；所述MMG溶液包括以下组分：甘露醇0.4mol/L、MgCl2 0.015mol/L和MES 4mmol/L；所述MMG溶液的pH值为5.7。
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