CN114200050B - 一种对溴苯甲醚中的有关物质含量的hplc检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对溴苯甲醚中的有关物质含量的HPLC检测方法，包括将样品溶液和对照品溶液分别进样，HPLC法检测对溴苯甲醚中对溴苯酚、邻溴苯甲醚的含量，所述HPLC色谱条件为：色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B；进行洗脱；柱温：25～40℃；流速：1.0ml/min；进样体积：1～20μl；检测器：UV检测器：210‑230nm。本发明的HPLC检测方法系统适用性、检测限、定量限、耐用性、精密度、准确度和回收率良好，有利于对溴苯甲醚的质量控制，能更好保证N‑芳基吡啶酮类药物的质量。
Description
技术领域
本发明属于药品检测分析领域，具体涉及一种检测对溴苯甲醚有关物质的高效液相色谱分析方法。
背景技术
N-芳基吡啶酮类药物主要是一种纤维化抑制剂，用于治疗纤维化、系统性硬化症、肉样瘤病及过敏性肺炎。对溴苯甲醚是合成N-芳基吡啶酮类药物的重要起始原料。但是在对溴苯甲醚合成过程中可能会产生多种反应副产物。这些反应副产物会与对溴苯甲醚共同参与到后续的合成中，进而产生新的杂质，影响N-芳基吡啶酮类药物的质量，甚至影响患者的用药安全性。因此，建立一种对溴苯甲醚有关物质的检测方法，有效控制对溴苯甲醚的杂质水平，从而保证N-芳基吡啶酮类药物的质量，具有十分重要的意义。
对溴苯酚、对溴苯甲醚分析方法包括毛细管电泳法(参考文献[1]王玉芳.毛细管电泳检测2-氨基苯酚,对溴苯酚和天然水中的Hg2+[D].安庆师范大学.)、表面活性剂辅助-凝固-漂浮分散液液微萃取(SA-DLLME-SFO)/高效液相色谱法(参考文献[2]郭亚芸,丁燕,胡效亚,等.表面活性剂辅助-凝固-漂浮分散液液微萃取/高效液相色谱法测定环境水样中酚类化合物[J].分析测试学报,2015(09):68-72.)、高效液相色谱法(HPLC)(参考文献[3]管红芳.具有特殊结构的双酚化合物合成工艺研究.大连理工大学,2013.)等。HPLC法中对溴苯甲醚仅做为内标进行检测，并未对灵敏度进行考察。表面活性剂辅助-凝固-漂浮分散液液微萃取(SA-DLLME-SFO)/高效液相色谱法测对溴苯酚，前处理复杂。毛细管电泳法测对溴苯酚，前处理复杂，灵敏度不高。且目前暂无文献报道对溴苯甲醚中对溴苯酚、邻溴苯甲醚的分析方法，也无文献报道检测邻溴苯甲醚的分析方法。
因此，为高效检出对溴苯甲醚中对溴苯酚、邻溴苯甲醚，从而更好控制对溴苯甲醚的质量。本发明提供了一种分离效果好、检测限低、灵敏度高的高效液相色谱法测定对溴苯甲醚中对溴苯酚、邻溴苯甲醚。
发明内容
针对上述技术问题，本发明旨在建立一种分离效果好、检测限低、灵敏度高的对溴苯甲醚有关物质的HPLC检测方法。
本发明的检测方法包括如下步骤：
(1)制备样品溶液：将对溴苯甲醚用溶剂溶解，得到样品溶液；
(2)制备对照品溶液：将对溴苯酚、邻溴苯甲醚用溶剂混合，得到对照品溶液；
(3)高效液相色谱仪检测：将样品溶液和对照品溶液分别进样，HPLC法检测对溴苯甲醚中对溴苯酚、邻溴苯甲醚的含量，
其中，所述HPLC色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B；进行洗脱；
柱温：25～40℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：1～20μl
检测器：UV检测器：210-230nm。
优选地，所述色谱柱为YMC-Triart C18，250×4.6mm×5μm。
优选地，所述流动相洗脱方式是梯度洗脱。
进一步优选地，所述梯度洗脱程序是：
| 时间(分钟) | 乙腈(体积％) | 0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(体积％) |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 50 | 50 |
| 6 | 80 | 20 |
| 20 | 80 | 20 |
优选地，所述UV检测器的检测波长是215nm。
优选地，所述柱温是40℃。
优选地，所述溶剂为乙腈：水＝80:20(体积)。
本发明首次提出一种测定对溴苯甲醚中有关物质的方法，通过该方法能够快速准确地检测对溴苯甲醚中对溴苯酚与邻溴苯甲醚杂质的含量。本发明的HPLC检测方法系统适用性、检测限、定量限、耐用性、精密度、准确度和回收率良好。本发明有利于对溴苯甲醚的质量控制，有利于保证N-芳基吡啶酮类药物的质量。
附图说明
图1是本发明提供的对溴苯甲醚有关物质的专属性色谱图。
图2是本发明提供的对溴苯酚与邻溴苯甲醚的检测限溶液色谱图。
图3是本发明提供的对溴苯酚与邻溴苯甲醚的定量限溶液色谱图。
图4是对溴苯甲醚的线性图。
图5是邻溴苯甲醚的线性图。
图6是对溴苯酚的线性图。
具体实施方式
下面通过参考本发明的实施例对本发明进行进一步描述，需要说明的是，这些实施例仅用于示例性地说明本发明的技术方案，而不能理解为对本发明的限制。
本发明未发现有相关文献报道。通过优化流动相组成和比例，柱温等色谱条件确定最佳的色谱条件用于检测对溴苯甲醚中的有关物质。当选择流动相为乙腈和水等度检测时，峰有轻微拖尾，当用乙腈和水梯度检测时，峰宽过宽，峰有轻微拖尾。当水相为0.05mol/L乙酸铵(pH＝5)或0.5％醋酸时，无论是梯度还是等度，都出现基线有波动，峰形拖尾，分离度偏小。当水相为0.01mol/L磷酸二氢钠的水溶液等度检测时，基线平稳，但峰有拖尾；当水相为0.01mol/L磷酸二氢钠的水溶液梯度检测时，峰形基本对称，分离度较高，但峰宽较宽；当柱温为40℃，水相为0.01mol/L磷酸二氢钠的水溶液梯度检测时，峰宽合适，峰形基本对称，分离度较高。通过优化，最终选择的色谱条件如下：
色谱条件：
梯度洗脱程序：
| 时间(分钟) | 乙腈％ | 水(0.01mol/L磷酸二氢钠)％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 50 | 50 |
| 6 | 80 | 20 |
| 20 | 80 | 20 |
1.检测仪器及色谱条件
仪器：Agilent高效液相色谱仪(HPLC 1260)
色谱柱：YMC-Triart C18；(250×4.6mm×5μm)
2.样品溶液制备：取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液制备：分别取对溴苯酚、邻溴苯甲醚25mg，精密称定，置100ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀；移取该溶液1ml置100ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。
3.进样检测：精密量取样品溶液和对照品溶液各20μl，分别进样。
4.检测条件验证
杂质对照品储备液配制：取邻溴苯甲醚对照品、对溴苯酚对照品各25mg，精密称定，置20ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释至刻度，摇匀。
(1)系统适用性
精密称取对溴苯甲醚25mg，置50ml中，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。重复进样6次。6次进样的峰面积RSD分别为0.18％，系统适用性良好。
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均峰面积 | RSD(％) |
| 峰面积 | 102.09 | 101.94 | 102.07 | 101.96 | 101.80 | 101.59 | 101.91 | 0.18 |
(2)专属性
空白溶液：溶剂(乙腈：水＝80:20)
对溴苯酚定位溶液：取对溴苯酚适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含对溴苯酚2.5μg的溶液。
邻溴苯甲醚定位溶液：取邻溴苯甲醚适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含邻溴苯甲醚2.5μg的溶液。
样品溶液：取对溴苯甲醚25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取杂质对照品储备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。
混合溶液：取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，精密加入杂质对照品储备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。
分别取上述溶液20μl进样，空白溶液对检测无干扰，对溴苯甲醚与相邻杂质之间的分离度为3.51，专属性良好。检测图谱详见图1。
(3)检测限
对溴苯酚检测限：取对溴苯酚对照品适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含对溴苯酚0.053μg的溶液，作为检测限溶液，检测限为0.053μg/ml(信噪比为3)。
邻溴苯甲醚检测限：取邻溴苯甲醚对照品适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含邻溴苯甲醚0.006μg的溶液，作为检测限溶液，检测限为0.006μg/ml(信噪比为3)。
对溴苯甲醚检测限：取对溴苯甲醚对照品适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含对溴苯甲醚0.010μg的溶液，作为检测限溶液，检测限为0.010μg/ml(信噪比为3)。
对溴苯酚与邻溴苯甲醚的检测限图谱详见图2。
(4)定量限
对溴苯酚定量限：取对溴苯酚适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含对溴苯酚0.11μg的溶液，作为定量限溶液，定量限为0.11μg/ml(信噪比为10)。
邻溴苯甲醚定量限：邻溴苯甲醚适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含邻溴苯甲醚0.21μg的溶液，作为定量限溶液，定量限为0.21μg/ml(信噪比为10)。
对溴苯甲醚定量限：取对溴苯甲醚适量，精密称定，加溶剂(乙腈：水＝80:20)溶解并稀释制成每1ml含对溴苯甲醚0.040μg的溶液，作为定量限溶液，定量限为0.040μg/ml(信噪比为10)。
对溴苯酚与邻溴苯甲醚的定量限图谱详见图3。
(5)线性
对溴苯甲醚线性：取对溴苯甲醚对照品适量，分别定量稀释制成5.00μg/ml、3.75μg/mll、3.00μg/ml、2.50μg/ml、2.00μg/ml、1.50μg/ml、1.00μg/ml、0.50μg/ml、0.25μg/ml、0.20μg/ml、0.04μg/ml，各精密量取20μl进样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立线性回归曲线，线性回归方程为y＝34.4121x-0.3767，R2＝0.9994。
邻溴苯甲醚线性：取邻溴苯甲醚对照品适量，分别定量稀释制成5.00μg/ml、3.75μg/mll、3.00μg/ml、2.50μg/ml、2.00μg/ml、1.50μg/ml、1.00μg/ml、0.50μg/ml、0.25μg/ml、0.20μg/ml，各精密量取20μl进样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立线性回归曲线，线性回归方程为y＝55.2522x-0.7624，R2＝0.9992。
对溴苯酚的线性：取对溴苯酚对照品适量，分别定量稀释制成5.00μg/ml、3.75μg/mll、3.00μg/ml、2.50μg/ml、2.00μg/ml、1.50μg/ml、1.00μg/ml、0.50μg/ml、0.25μg/ml、0.20μg/ml、0.11μg/ml，各精密量取20μl进样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立线性回归曲线，线性回归方程为y＝35.2327x-0.8721；R2＝0.9998。
(6)精密度
取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，精密加入杂质对照品储备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。平行配制6份。各精密量取20μl进样，记录色谱图。对溴苯酚6次测定结果RSD为0.73％；邻溴苯甲醚6次测定结果RSD为0.46％。
由另一操作者在不同时间，取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，精密加入杂质对照品储备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。平行配制6份。各精密量取20μl进样，记录色谱图。对溴苯酚6次测定结果RSD为0.18％，12次测定结果RSD为0.65％；邻溴苯甲醚6次测定结果RSD为0.16％，12次测定结果RSD为0.71％。
(7)准确度
取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，分别精密加入杂质对照品储备液0.3ml、1ml、1.2ml，分别置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀。平行配制3份，共9份。各精密量取20μl进样，记录色谱图。以(测定量-样品量)/加入量×100％计算回收率。
对溴苯酚9次回收率RSD为0.43％；邻溴苯甲醚9次回收率RSD为2.32％。
(8)溶液稳定性
取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀；精密加入杂质对照品储备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀；分别在放置0天、1天、3天各精密量取20μl进样，记录色谱图。对溴苯甲醚样品溶液3天内测定结果RSD为1.01％；对溴苯酚对照品溶液3天内测定结果RSD为1.02％；邻溴苯甲醚对照品溶液3天内测定结果RSD为1.23％，溶液在3天内稳定性良好。
(9)耐用性
取对溴苯甲醚约25mg，精密称定，精密加入杂质对照品储备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂(乙腈：水＝80:20)稀释至刻度，摇匀，作为耐用性溶液，分别考察改变柱温25～35℃，流速0.9～1.1ml/min条件下该方法的耐用性情况。各精密量取20μl进样，记录色谱图。对溴苯酚测定结果RSD为7.38％；邻溴苯甲醚测定结果RSD为6.50％。耐用性良好。
Claims (5)
1.一种对溴苯甲醚中的有关物质含量的HPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备样品溶液：将对溴苯甲醚用溶剂溶解，得到样品溶液；
(2)制备对照品溶液：将对溴苯酚、邻溴苯甲醚用溶剂混合，得到对照品溶液；
(3)高效液相色谱仪检测：将样品溶液和对照品溶液分别进样，HPLC法检测对溴苯甲醚中对溴苯酚、邻溴苯甲醚的含量，
其中，所述HPLC色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B；进行梯度洗脱；
柱温：25～40℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：1～20μl；
检测器：UV检测器：210-230nm；
所述梯度洗脱程序是：
。
2.如权利要求1所述对溴苯甲醚中的有关物质含量的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱柱为YMC-Triart C18，250×4.6mm×5μm。
3.如权利要求1所述对溴苯甲醚中的有关物质含量的HPLC检测方法，其特征在于：所述UV检测器的检测波长是215nm。
4.如权利要求1所述对溴苯甲醚中的有关物质含量的HPLC检测方法，其特征在于：所述柱温是40℃。
5.如权利要求1所述对溴苯甲醚中的有关物质含量的HPLC检测方法，其特征在于：所述溶剂为乙腈：水＝80:20。
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2021
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