CN114174502A - 具有改进的引物识别的Phi29 DNA聚合酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本文公开了与野生型酶相比具有改进的引物识别的噬菌体Phi29DNA聚合酶的突变体。某些突变体包含K64R或M97K突变之一或二者。所提供的突变体能够比野生型Phi29DNA聚合酶更有效地使用更短和更长的随机合成DNA引物，在多重置换扩增(MDA)反应中产生更多的扩增产物。与用野生型Phi29DNA聚合酶进行的反应相比，本发明的突变体扩增人类基因组DNA聚合酶的偏差更小并且覆盖率更高。
Description
相关申请的引用
本申请要求2019年5月17日提交的美国临时申请62/849,252的优先权日期的权益，该美国临时申请的内容以其全部并入本文。
序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过引用并入本文。
背景
Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNApol)是一种单体酶(66kDa)，负责通过催化线性dsDNA分子两端的蛋白引发的起始(protein-primed initiation)和每条DNA链的完全延伸二者来复制噬菌体基因组(19285bp)(Blanco和Salas，1984；1985)。Phi29 DNApol属于DNA聚合酶的B家族(Bernad等，1987)，显示了包含手掌(palm)、拇指(thumb)和手指(finger)子结构域的共同右手折叠，但也有两个额外的被称为TPR1和TPR2的结构域(Rodriguez等，2005；Kamtekar等人，2006；Berman等人，2007)。Phi29 DNApol显示出使其能够应用于众多的DNA扩增和DNA测序技术和平台的独特的性质：高度进行性的DNA合成，使该酶在缺乏进行性因子的情况下，每次DNA结合事件能掺入超过70000个核苷酸(Blanco等人，1989)；卓越的链置换，在不存在解旋酶型酶的情况下，允许聚合与双链DNA的解链偶联(Blanco等人，1989)；合成的高保真度，具有非常低的错误插入率(10-4至10-6)和插入错误的有效校对，这共同增强了保真度，达到106至108个掺入核苷酸中仅一个错误(Esteban等人，1993和1994)。
这些性质使得Phi29 DNApol成为等温多重置换扩增(MDA)(Dean等人，2002)和滚环扩增(RCA)(Lizardi等人，1998)的最佳选择。这些DNA扩增技术是基于Phi29 DNApol与随机合成引物(RP)(主要是六核苷酸或六聚体)或能够在反应过程中原位合成DNA引物的DNA引发酶中的任一项的组合(Picher等人，2016)。
目前的测序技术经常需要扩增DNA，因为从某些样品(如单细胞)可获得的DNA量不足以用于测序过程。遗憾的是，DNA扩增有引入错误、产生不对称(偏差)而且甚至促进微量污染DNA共扩增的风险。因此，决定扩增质量的关键参数是反应产物中没有污染和伪迹(artefact)、覆盖广度和均匀性、低核苷酸错误率，以及回收单核苷酸变体(SNV)、拷贝数变体(CNV)和结构变体的能力。
基于随机六聚体的当前MDA方法中潜在扩增偏差的来源是由寡核苷酸的不同序列依赖性杂交动力学引起的引发不均等。更重要的是，由自配对六聚体的指数扩增造成的产生引物来源的非输入物依赖的DNA扩增(primer-derived input-independent DNAamplification)的伪迹的倾向。
已经表明，在反应温度40℃使用较长的引物而不是六聚体显著减少DNA扩增的伪迹(Alsmadi等人，2009)。这种表现背后最可能的原因是，较高的温度降低了引物稳定自配对的可能性，并且从而降低了它们随后扩增的可能性。然而，为了在高达40℃的温度进行扩增反应(比Phi29 DNApol的最佳温度高10℃)，需要热稳定的或耐热的Phi29 DNApol变体。在这方面，一些突变的Phi29 DNApol已经被描述为显示出改进的热稳定性(Povilaitis等人，2016)。
附图简述
并入本文且形成本说明书一部分的附图说明了示例性实施方案，并且与本说明书一起进一步用于使相关领域的技术人员能够进行和使用这些实施方案以及对使其他实施方案对本领域技术人员变得明白易懂。将结合以下附图更具体地描述本发明，其中：
图1.与DNA和dNTP复合的Phi29 DNApol的三维结构(PDB id:2PYL)。除了拇指(THUMB)(深绿色)、TPR2(青色)和TPR1(黄色)子结构域外，蛋白质的大部分显示为白色。N末端3’-5’核酸外切酶结构域没有完全描绘(只显示了两个片段(黄色)，一个包含Arg96，并且另一个包含Lys64)。引物链(青色)，显示对应于每个核苷酸位置的数字。模板链(浅绿色)、引入的核苷酸(洋红色)和两种活化金属离子(米色)也被显示出来。
图2.A)涉及与引物链的前10个核苷酸的相互作用的野生型(WT)Phi29 DNApol氨基酸残基的示意图，源自晶体结构(PDB id:2PYL)。编号为1的核苷酸是3’最末端的，通常描述为“引物末端”，并且是最接近酶活性位点的核苷酸。B)该示意图显示了获得与引物链的新相互作用，由所示的不同突变(洋红色)产生。彩色箭头表示相互作用是涉及磷酸二酯(红色)、糖(橙色)还是碱基(绿色)。预计突变体T499K和突变体T499R与互补/模板链的相同位置相互作用(用虚线箭头表示)。
图3.WT Phi29 DNApol或设计的突变体与TthPrimPol或不同长度的随机引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合，使用1ng人类基因组DNA作为反应中的输入物的扩增效率。
图4.WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K和双突变体K64R/M97K的核酸外切酶和聚合酶活性的平衡，随着提供的脱氧核苷酸(dNTP)浓度而变化。
图5.WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K和双突变体K64R/M97K与不同长度的随机引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合，使用1ng人类基因组DNA作为反应中的输入物的扩增效率。对于每种引物长度N，各列从左到右依次显示：WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K、双突变体K64R/M97K。
图6.在低离子强度条件下，由WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K或双突变体K64R/M97K与不同大小的随机合成引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合，在没有输入DNA的情况下观察到的扩增产量。对于每种引物长度N，各列从左到右依次显示：WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K、双突变体K64R/M97K。
图7.在高离子强度条件下，由WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K或双突变体K64R/M97K与不同大小的随机合成引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合，在没有输入DNA的情况下观察到的扩增产量。对于每种引物长度N，各列从左到右依次显示：WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K、双突变体K64R/M97K。
图8.在高离子强度条件下，WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K和双突变体K64R/M97K与不同长度的随机引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合，使用1ng人类基因组DNA作为反应中的输入物的扩增效率。对于每种引物长度N，各列从左到右依次显示：WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K、双突变体K64R/M97K。
图9.在低离子强度和高离子强度条件下，WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K和双突变体K64R/M97K与不同长度的随机引物(四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N))组合，在反应中使用不同的人类基因组DNA输入物(1pg、10pg、100pg和1ng)的扩增效率。对于每种引物长度N，各列从左到右依次显示：WT Phi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K、双突变体K64R/M97K。
图10.通过将Phi29 DNApol变体与TthPrimPol组合的多重置换扩增(MDA)扩增1pg、10pg、100pg和1ng人类基因组DNA。对于每种量的DNA，各列按从左到右的顺序显示：WTPhi29 DNApol、突变体K64R、突变体M97K、双突变体K64R/M97K。
图11.从使用六聚体(6N)、五聚体(5N)和四聚体(4N)与Phi29 DNApol变体和不同的人类基因组DNA输入物组合的扩增反应的CovCheck分析获得的估计覆盖率值，每种情况都达到可以观察到覆盖率差异的条件。
图12.从由TthPrimPol与Phi29 DNApol变体组合进行的扩增反应的CovCheck分析获得的估计覆盖率值。
概述
修饰的DNA聚合酶可用于多种应用，如DNA测序、DNA扩增、文库制备、DNA基因分型等。本发明提供了重组Phi29 DNA聚合酶，其包括赋予改进性质(特别是这些或其他应用期望的改进性质)的突变。这些氨基酸序列改变可以通过使用较短的随机合成引物来提高多重置换DNA扩增(MDA)的表现，其导致扩增伪迹的减少、更好的序列依赖性杂交动力学，以及因此导致覆盖广度和均匀性的提高。“Phi29”有时被写作“φ29”。
重组Phi29 DNA聚合酶包含来自由K64R和M97K组成的组的一个或两个突变。
详细描述
I.定义
“分离的”是指分子是存在的主要种类，即以摩尔计，比组合物中任何其他单个大分子种类更充足。通常，分离的分子可以构成组合物中存在的大分子种类的80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的大分子物质，是目的纯化种类。溶剂种类、小分子(<500道尔顿)、稳定剂(例如BSA)和元素离子种类不被视为就本定义而言的大分子种类。
如本文使用的，术语“重组核酸”是指包含在自然中通常不相互附接的两个或更多个附接的核苷酸序列的核酸分子。
如本文使用的，术语“重组细胞”是指包含重组核酸的细胞，例如动物、植物、真菌或微生物(如细菌)细胞。
用于描述两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列之间序列关系的术语包括“参考序列”、“选自”、“比较窗口”、“相同”、“序列同一性百分比”、“基本相同的”、“互补的”和“基本互补的”。
“参考序列”是用作序列比较基础的定义序列，并且可以是较大序列(例如完整的cDNA、蛋白质或基因序列)的子集。
因为两个核酸或多肽可各自包含(1)在两个核酸之间相似的序列(即，仅完整核酸或多肽序列的部分)或(2)在两个核酸之间不同的序列，两个(或更多个)核酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个核酸的序列来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。
“比较窗口”是指与参考序列进行比较的通常至少12个连续核苷酸或4个连续氨基酸残基的概念性片段。比较窗口常常具有至少15个或至少25个核苷酸或者至少5个或至少8个氨基酸的长度。为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。用于对齐比较窗口的序列的最佳比对可通过算法的计算机化工具(Wisconsin Genetics Software Package发布7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.Madison,WI,WI)或通过检查来进行并选择各种方法的任一种产生的最佳比对(即，导致比较窗口的最高同源性百分比)。
如果主题核苷酸序列或氨基酸序列与参考序列在核苷酸或氨基酸序列长度上为了最大对应性对齐时相同，则这两个序列“相同”。
两个序列之间的“序列同一性百分比”通过如下计算：在一个比较窗口比较两个最佳对齐的序列，确定两个序列中出现相同的核苷酸或氨基酸的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
除非另有说明，否则用于比较两个序列的比较窗口是较短序列的长度。
Natl.Acad.Sci.USA 85:2444；Higgins&Sharp(1988)Gene 73:237-244；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Research 16:10881-90；Huang等人(1992)Computer Applications in the Biosciences 8:155-65；和Pearson等人(1994)Methods in Molecular Biology24:307-31中进一步描述了方法。比对也经常通过检查和手动对齐来执行。
如果主题氨基酸序列或核苷酸序列在比较窗口具有至少80％的序列同一性，则该主题核苷酸序列或氨基酸序列与参考序列是“基本相同的”。因此，与参考序列具有至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列也是“基本相同的”。当然，两个彼此相同的序列也是“基本相同的”。
如本文使用的，术语“转录调节序列”是指调节与其可操作性地连接的第二核苷酸序列的转录的第一核苷酸序列。
如本文使用的，当转录调节序列在细胞中起作用以调节核苷酸序列的转录时，核苷酸序列与转录调节序列“可操作地连接”。这包括通过聚合酶和启动子之间的相互作用来促进核苷酸序列的转录。
“启动子”是至少足以促进DNA中的核苷酸序列向RNA转录物的转录的转录调节序列。从启动子转录的转录物通常包括来自转录起始位点下游启动子的序列，以及在mRNA的情况中编码氨基酸序列的下游序列。启动子因为它们在紧邻转录起始位点上游的可预测位置是最佳表征的转录调节序列。启动子包括调节RNA聚合酶的识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用的或可以是对反式作用因子响应的。根据调节的性质，启动子可以是组成型的或调节型的。它们通常被描述为具有两个独立的片段：核心启动子区和延伸启动子区。
核心启动子包括足以进行RNA聚合酶识别、结合和转录起始的序列。核心启动子包括转录起始位点、RNA聚合酶结合位点和其他一般转录结合位点，并且是前起始复合体形成和一般转录机器组装的地方。前起始复合体通常在转录起始位点(TSS)的50个核苷酸(nt)以内。
核心启动子还包括将mRNA翻译成多肽所必需的用于核糖体结合位点的序列。
延伸的启动子区包括所谓的近端启动子，其延伸至转录起始位点上游约250个核苷酸(即-250nt)。它包括主要的调节元件诸如特定的转录因子结合位点。已经发现许多基因具有位于更上游的转录调节元件。特别地，包含基因的大多数转录调节元件的片段可以延伸到转录起始位点上游多至700nt或更多。在某些基因中，已经在转录起始位点上游数千个核苷酸处发现转录调节序列。
如本文使用的，如果第一核苷酸序列在自然界中不与第二核苷酸序列附接，例如可操作地连接，则第一核苷酸序列对第二核苷酸序列是“异源的”。就延伸而言，如果多肽由与转录调节序列异源的核苷酸序列编码，则该多肽对转录调节序列是“异源的”。
如本文使用的，术语“等位基因变体”是指基因的天然存在的变异。
如本文使用的，术语“人工变体”是指包含对天然存在的基因或蛋白质的一种或更多种遗传修饰的基因或蛋白质。
如本文使用的，本文使用的术语“突变”通常指与野生型相比核苷酸序列的改变、变异或多态性。这种改变、变异或多态性可以是相对于参考基因组，例如基因组数据库中的参考基因组。突变包括但不限于单核苷酸变异(SNV)、取代、插入或缺失(也统称为“插入缺失(indel)”)和重复。
II.引言
一种减少源自序列依赖性杂交动力学的扩增伪迹和扩增偏差的新策略可以利用使用比当前金标准六聚体更短的DNA引物。这种策略要求获得能够识别、稳定结合和有效使用较短的DNA引物的Phi29 DNApol变体，其将允许显著改进当前的DNA扩增技术。
Phi29 DNApol与DNA和引入核苷酸复合的3D结构的可用性(Berman等人，2007)允许我们对直接参与与引物链相互作用的氨基酸残基进行详细检查(图1)。引物链的这些配体(参见图2A的方案)是：
·R96(与引物的核苷酸7和8之间的磷酸二酯相互作用)。
·R306(与引物的核苷酸8和9之间的磷酸二酯相互作用)。
·R308(与引物的核苷酸9和10之间的磷酸二酯相互作用)。
·K498(与引物第一个3’核苷酸的糖相互作用)。
·Y500(与引物的核苷酸1和2之间的磷酸二酯相互作用)。
·K529(与引物的核苷酸1和2之间的磷酸二酯相互作用)。
基于这几个接触，Phi29 DNApol建立了跨越引物链前10个碱基的直接相互作用，表明这样的大小将赋予引物最大的结合稳定性。非常令人惊讶的是，在核苷酸3和6之间的间隔中缺乏接触。引人注目的是，目前使用Phi29 DNApol的MDA程序是基于提供随机六聚体的情况，仅通过与前两个核苷酸之间的磷酸二酯键和与3’-末端核苷酸的碱基接触，其稳定性将很差。因此，六聚体不具有作为被Phi29 DNApol结合和延伸的初始引物的最佳大小。非常可能的是，这些次优引物被选择为在任何DNA样品中以足够短的间隔具有互补序列，以实现有效和均匀的扩增，同时最小化称为引物二聚体的自杂交伪迹。
另一方面，替代性TruePrime DNA扩增技术(Picher等人，2016)利用DNA引物酶(TthPrimPol)按需合成DNA引物，但还没有确定TthPrimPol向Phi29 DNApol递送的最佳引物大小，以及那些保持比Phi29 DNApol最佳延伸所需的最小大小更短的引物的命运如何。
基于这些信息和注意事项，我们探索了产生对短引物(理想情况下在4个和6个核苷酸之间的限制)具有改进的亲和力的Phi29 DNApol突变体(本发明的变体)的可能性。为此，我们采用了两种不同的方法：1)加强一些现有的相互作用，2)在引物区中创造新的(不存在的)酶:DNA配体。
这样的改进的变体有望在基于RP的MDA程序中发挥作用，可能减少引物-二聚体伪迹和扩增嵌合体的形成。此外，在TruePrime DNA扩增技术的背景下，使用可由TthPrimPol产生的短引物，可提高扩增效率，和/或导致提高覆盖率。
同样，对Phi29 DNApol的3D结构的详细分析(Berman等人，2007)允许选择5个氨基酸残基作为“获得功能”突变的候选物。这些残基是：Lys64(位于ExoII基序)、Met97(与WTPhi29 DNApol的引物配体Arg96相邻)、Thr499(与WT Phi29 DNApol的两个引物配体Lys498和Tyr500相邻)、Thr534和Lys538(与WT Phi29 DNApol的引物配体Lys529接近)。在这些残基选择的突变(总结在图2B中)是：
·K64R，产生与引物链的残基4和5之间的磷酸二酯的相互作用的获得。
·K64KG、K64KK、L63LG、L63LH，作为Lys64侧翼的+1插入突变，其设计与在B家族DNA聚合酶的不同ExoII基序观察到的异质性一致。还预计这些变化会获得与引物链的残基4和5的相互作用。
·R96K，预计会削弱与引物的残基7和8之间的磷酸二酯键的相互作用。
·M97K，产生与引物链的核苷酸5的氮碱基的相互作用的获得。
·M97R，产生与引物链的氨基酸残基4和5的碱基的相互作用的获得。
·T499K，产生与模板链的氨基酸残基5的糖的相互作用的获得。
·T499R，产生与模板链的氨基酸残基4和5的糖的相互作用的获得。
·K529R，产生与引物链的残基1和3之间的磷酸二酯键的双重相互作用的获得。
·T534K，产生与引物链的氨基酸残基4的糖的相互作用的获得。
·T534R，产生与引物链的残基3和4之间的磷酸二酯的相互作用的获得。
·K538R，产生与引物链的残基2和3之间的磷酸二酯的相互作用的获得。
所示突变体被设计用于增加Phi29 DNApol对短引物的亲和力，其按照标准方案进行表达和纯化以获得WT Phi29 DNApol。无法预测引入的突变引起的与引物链的任何特定相互作用的获得是否会对Phi29 DNApol的特性如易位、持续性(processivity)或适当的(TthPrimPol)和随机引发的DNA扩增技术产生不利影响。
III.核酸、表达构建体、重组细胞和突变体聚合酶多肽
A.核酸
本文提供了具有编码具有改进的引物识别的突变体Phi29聚合酶的核苷酸序列的核酸。野生型Phi29聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中提供。编码突变体Phi29聚合酶的序列的核酸编码具有突变K64R和M97K之一或二者。在一些实施方案中，编码这些突变之一或二者的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的序列基本相同。
B.表达构建体
本文还提供了包含可操作地连接到编码本文描述的突变体Phi29聚合酶的核苷酸序列的转录调节序列的表达构建体。表达构建体可以采取质粒的形式或任何其他适合在目的细胞中表达的形式。
C.重组细胞
本文还提供了包含本文描述的表达构建体的重组细胞。在某些实施方案中，细胞是细菌细胞。这样的重组细胞可用于复制本公开内容的核酸分子和产生本公开内容的突变体Phi29聚合酶。突变体Phi29聚合酶可以通过培养包含表达构建体的重组细胞来产生。所用的转录调节序列可以包含组成型启动子。
D.突变体Phi29聚合酶
本文还提供了具有改进的引物识别的突变体Phi29聚合酶。本公开内容的突变体Phi29聚合酶具有与SEQ ID NO:1(也作为UniProtKB-P03680保藏)的氨基酸序列基本相同并且包含K64R和M97K氨基酸取代之一或二者的氨基酸序列。
具有基本相同氨基酸序列的聚合酶可以基于天然存在的序列，诸如等位基因变体，只要它们包括K64R和M97K氨基酸取代之一或二者。与野生型序列SEQ ID NO:1相比，这样的变体可以具有最多或者不多于30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失中的任何一个，同样只要存在K64R和M97K氨基酸取代之一或二者。
优选地，本发明的DNA聚合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4具有至少80％同一性。更优选地，本发明的聚合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少90％同一性。仍更优选地，本发明的聚合酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
IV.使用方法
本文提供了使用本文描述的突变体Phi29聚合酶进行引物延伸和/或核酸聚合的方法。引物延伸方法可用于核酸复制、扩增和测序。
引物延伸包括引物与核酸分子模板的杂交，随后是聚合酶催化的聚合反应，这将核苷酸添加到引物的3’末端。引物可以被外源添加到反应混合物中，或者可以由引发酶/聚合酶产生。引发酶是催化合成称为引物的与核酸模板互补的寡核苷酸的酶。一种这样的引发酶是诸如TthPrimPol。
合成引物通常用于核酸扩增。这样的引物的长度通常在约6个和约25个核苷酸之间。当要扩增特定序列时，引物可以具有与靶序列互补的序列。为了全基因组扩增或其他非定向扩增方法目的，可以使用随机引物。随机引物通常包含寡核苷酸的集合(collection)或组(set)，其中每个碱基存在于组中一个或更多个引物的寡核苷酸的每个位置。在某些情况下，一个或更多个位置(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)可以由固定的碱基或两个或三个碱基的组合来填充。
A.扩增
核酸扩增，例如通过如Mullis(US 5,656,493)所介绍的聚合酶链式反应(PCR)扩增，是医学和生物研究中不可缺少的技术。它已成功地用于各种应用，如核酸的克隆、操作或测序、基因的基于DNA的功能和系统发育分析、疾病的检测和诊断，以及法医学和亲子鉴定。
B.滚环扩增
滚环扩增是一种扩增共价闭合的DNA分子诸如单链共价闭合的DNA分子的方法。用引物例如引发酶/聚合酶提供的引物来引发模板DNA分子。DNA聚合酶围绕闭合的DNA分子对引物进行引物延伸。聚合酶置换杂交的拷贝，并且继续围绕模板进行多核苷酸延伸，以产生串联的扩增产物。
C.多重置换扩增(MDA)
多重置换扩增(MDA)是一种等温、非基于PCR的DNA扩增方法，其中从模板的引发和延伸产生ssDNA链，该链可以通过链置换合成连续地重新引发和复制，产生多支链的DNA结构。在双链DNA样品的初始变性后，多重链置换(MDA)扩增产生多支链结构，因为DNA合成可以从扩增分子的许多位置连续引发和延伸，而不需要另外轮次的变性。当新引物从一个DNA分子模板延伸到支链区域中时，支链被彼此置换。MDA在例如2011年4月21日公布的WO2011/047307A1(“Multiple Displacement Amplification”)中进一步描述。MDA可以简单描述为：在自我生成的ssDNA模板(self-generated ssDNA templates)上的多个引发位点延伸引物的等温聚合。
在某些实施方案中，MDA采用随机三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体作为引物，在初始模板及其扩增拷贝的多个位点引发扩增。在所公开的方法的某些实施方案中，用DNA引发酶/聚合酶诸如TthPrimPol来实现引发。
在某些实施方案中，双链线性多核苷酸的扩增包括使用：1)随机合成引物和/或DNA导向的引发酶/聚合酶，诸如TthPrimPol；2)具有链置换活性的修饰的DNA聚合酶，诸如Phi29 DNApol；3)dNTP。在某些实施方案中，dNTP底物是未修饰的。在其他实施方案中，dNTP可以通过附接标记基团(例如荧光分子)来修饰。如本文使用的，术语“标记”是指被附接至分子(诸如核酸分子)的化学部分。可检测的标记包括，例如，荧光标记、发光标记、酶标记、比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠以及放射性标记。在组合中，这三种试剂促进给定的DNA的多重置换扩增(MDA)，通过随机合成引物或通过引发酶/聚合酶多重引发，并通过DNA聚合酶延伸。此外，随机合成引物和/或引发酶/聚合酶和DNA聚合酶的组合可以通过用引发酶/聚合酶和/或随机寡核苷酸引物对扩增的分子进行引发并且通过DNA聚合酶使引物延伸来实现多重链置换扩增。
1.具有链置换活性的DNA聚合酶
扩增方法如MDA可以采用具有链置换活性的DNA聚合酶，例如与单链DNA强结合(例如优先于双链DNA)的聚合酶。链置换活性可用于置换DNA分子的杂交链，同时延伸引物位置。
可用于本文公开的方法的具有链置换活性的DNA聚合酶包括，例如，Phi29DNApol。Phi29 DNApol可以从例如，New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)、ThermoFisher Scientific(Waltham,MA,USA)和Expedeon(Cambridge,UK)商购获得。Phi29DNApol具有固有的高持续性和与DNA聚合相偶联的链置换能力，能够从单个酶:DNA结合事件产生长于70kb的DNA片段(Blanco等人，1989)。这种潜力使Phi29 DNApol能够复制含有二级结构诸如发夹环的DNA模板。该酶还具有3’→5’核酸外切酶校对活性(Blanco和Salas，1985；Garmendia等人,1992)而且提供了与基于Taq DNA聚合酶的方法相比高达1000倍更高的保真度。
2.脱氧核糖核苷三磷酸
引物产生和引物延伸可以通过将专门的DNA引发酶/聚合酶(如TthPrimPol，能够合成DNA引物)(Picher等人，2016)与延伸DNA的聚合酶(如Phi29 DNApol)组合来完成，只需提供脱氧核糖核苷酸底物，如dNTP。通常，这些包括四种标准碱基，A、T、G和C。然而，在某些实施方案中，可以包括非天然核苷酸，诸如肌苷。在某些实施方案中，核苷酸可以带有标记以用于检测或捕获它们被掺入的多核苷酸。
D.DNA测序
到目前为止，存在许多不同的测序技术，通常分为“第一代测序”、“第二代测序”(通常称为“下一代测序”或NGS)和“第三代测序”，“第三代测序”也称为单分子测序(SMS)。第一代测序主要指Maxam和Gilbert(Maxam和Gilbert，1977)或Sanger(Sanger等人，1977；Sanger和Coulson，1978)的方法，其中只有后者是今天使用的。
第二代或下一代测序是指使用先进的技术(光学)检测碱基位置的方法同时产生许多序列的技术。(Metzker，2010)中给出了现有方法的概述。
第三代或单分子测序(SMS)技术不需要预先扩增，并且模板不是DNA的克隆或集合，而是单分子，其序列通常被“实时”复制/读取和在线记录，作为聚合酶活性的结果(Sam等人，2011；Thompson和Milos，2011)。
如本文使用的，术语“高通量测序”是指对数千个核酸分子同时或几乎同时测序。高通量测序的平台包括但不限于大规模平行标签测序(MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、DNA纳米球测序(Complete Genomics/BGI Shenzhen)、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序(PacBio)和纳米孔DNA测序(例如，Oxford Nanopore)。
本文描述的方法可以用于但不限于全基因组测序、外显子组测序和扩增子测序。然而，可以对被扩增的分子本身进行特定扩增子的扩增。使用针对基因组中的基因序列的诱饵的序列捕获可以用于分离扩增的代表外显子的分子。通过将mRNA逆转录成双链cDNA，可以产生扩增的转录组以进行测序。
V.试剂盒
本文还提供了用于进行本文公开的方法的试剂盒。如本文使用的，术语“试剂盒”是指意图一起使用的物品(item)的集合。
本文公开的某些试剂盒包括选自以下的2、3、4、5、6、7种要素：(1)PrimPol酶(例如TthPrimPol)；(2)DNA聚合酶(例如Phi29 DNApol)；(3)随机三聚体；(4)随机四聚体；(5)随机五聚体；(6)随机七聚体；(7)随机八聚体；(8)随机引物；(9)dNTP；(10)反应缓冲液；(11)与任何前述要素一起使用的缓冲液。试剂盒可以包括容纳试剂的容器。可以将容器本身放置在运送容器中。容器可以通过亲手递送或通过公共承运人诸如国家邮政系统或送货服务诸如FedEx来运送。试剂盒还可以包括用于将收集的血液运送至中心设施的容器，诸如盒或袋。试剂盒通常还可以包括使用说明书以及用于数据分析和解释的软件。
示例性实施方案
1.一种Phi29型DNA聚合酶，其包含K64R或M97K突变之一或二者。
2.一种Phi29型DNA聚合酶，其具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％的同一性的氨基酸序列。
3.一种用于复制、扩增或测序模板DNA的方法，包括将所述DNA与反应混合物接触，反应混合物至少包含：a)根据实施方案1至2中任一项的DNA聚合酶，b)缓冲液，c)氯化镁，d)引物，和e)核苷三磷酸。
4.一种用于实施根据实施方案3的方法的试剂盒，包括：a)根据实施方案1至2中任一项的DNA聚合酶，b)缓冲液，和c)氯化镁。
5.一种用于实施根据实施方案3的方法的试剂盒，其包含根据实施方案1至2中任一项的DNA聚合酶，和以下中的一种或更多种：(a)PrimPol酶(例如TthPrimPol)；(b)随机三聚体；(c)随机四聚体；(d)随机五聚体；(e)随机七聚体；(f)随机八聚体；(g)dNTP；(h)反应缓冲液；(i)与任何前述要素一起使用的缓冲液。
6.一种Phi29型DNA聚合酶，其中所述Phi29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、99.5％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述Phi29型DNA聚合酶包含K64R和M97K氨基酸取代之一或二者。
7.实施方案6的Phi29型DNA聚合酶，具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
8.实施方案6的Phi29型DNA聚合酶，除了K64R和M97K氨基酸取代之一或二者之外，还具有不超过30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失。
9.一种分离的核酸分子，包含编码Phi29型DNA聚合酶的核苷酸序列，其中所述Phi29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、99.5％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述Phi29型DNA聚合酶包含K64R和M97K氨基酸取代之一或二者。
10.实施方案9的分离的核酸分子，其中所述Phi29型DNA聚合酶具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
11.实施方案9的分离的核酸分子，其中除了氨基酸取代K64R和M97K之一或两者之外，Phi29型DNA聚合酶还具有不超过30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失。
12.一种重组核酸，包含与实施方案9-11中任一项的Phi29型DNA聚合酶可操作地连接的转录调节序列。
13.实施方案12的重组核酸，其中转录调节序列包含细菌或哺乳动物启动子。
14.实施方案12的重组核酸，被包含在选自质粒载体、病毒载体、粘粒和转座子的载体中。
15.实施方案14的重组核酸，包含相对于编码Phi29型DNA聚合酶的核苷酸序列定位的克隆位点，使得插入克隆位点的转录调节序列变得与编码Phi29型DNA聚合酶的核苷酸序列可操作地连接。
16.一种重组细胞，包含实施方案12-15中任一项的重组核酸。
17.一种方法，包括：a)将核酸模板分子与实施方案1、2、6-8中任一项的Phi29型DNA聚合酶和足以用于引物延伸的试剂接触；和b)使用核酸模板用聚合酶进行引物延伸。
18.实施方案17的方法，其中足以用于引物延伸的试剂包括寡核苷酸引物。
19.实施方案18的方法，其中寡核苷酸引物包括三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、六聚体、八聚体、九聚体或十聚体中的一种或更多种。
20.实施方案19的方法，其中引物是随机引物。
21.实施方案18的方法，其中寡核苷酸引物具有5个和25个核苷酸之间的连接。
22.实施方案17的方法，其中足以用于引物延伸的试剂包括引发酶/聚合酶(例如，TthPrimPol)。
23.实施方案17的方法，其中引物延伸在约或高于以下任一温度进行：31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。
24.实施方案17的方法，其中模板核酸分子以不大于1ng、100pg、10pg或1pg的量存在。
25.实施方案17的方法，其中引物延伸包括(i)多重置换扩增(“MDA”)或(2)滚环扩增。
26.实施方案17所述的方法，其中引物延伸包括基于多次退火和成环的扩增循环(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)。
27.实施方案17-26中任一项的方法，其中Phi29型DNA聚合酶包括K64R和M97K取代二者。
实施例
实施例1：筛选以检测哪些突变体能够在多重置换扩增反应中比WTPhi29DNA pol使用更短的随机合成引物
图3所示为通过多重置换扩增(MDA)扩增1ng人类基因组DNA，该多重置换扩增(MDA)将Phi29 DNApol变体与TthPrimPol或不同大小的随机合成引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合。
如图3所示，WT Phi29 DNApol有效地使用五聚体、六聚体、七聚体和八聚体以及TthPrimPol来扩增人类基因组DNA。三聚体和四聚体不适合进行扩增。
从产生的Phi29 DNApol变体组中，其中6个变体(K538R、T534K、T534R、L63LH、K64KG和K64KK)在MDA中完全无活性，与引物大小或TthPrimPol的替代性使用无关。另一组突变体(K529R、M97R、R96K、L63LG和T499K)显示出比WT Phi29 DNApol更差的扩增性能，显示出较低的扩增产量和/或使用某些引物大小的限制。例如，突变体M97R能够有效地使用五聚体和六聚体，而七聚体和八聚体没有触发扩增。类似地，突变体R96K只能使用来自随机合成引物组的六聚体。引人注目的是，插入突变体L63LG能够用五聚体、六聚体、七聚体和八聚体扩增DNA，但与TthPrimPol的组合没有产生任何扩增物质。相反，突变体T499K在存在TthPrimPol的情况下只能轻微扩增DNA，而随机合成的引物没有一个促进MDA。
突变体T499R表现出与WT Phi29 DNApol大致近似的行为。
最后，突变体K64R和M97K相对于WT Phi29 DNApol显示出显著的改进。仅它们二者能够使用四聚体，而WT Phi29 DNApol和其余突变体没有显示任何扩增产量。
将两个“获得功能”突变引入到同一多肽中以产生双突变体K64R/M97K，其与WTPhi29 DNApol和单突变体K64R和M97K相比特征明显，如以下实施例所示。
实施例2：Phi29 DNApol突变体M97K和双突变体K64R/M97K中，聚合酶活性优于核酸外切酶活性。
图4显示了相对于WT Phi29 DNApol的最相关发明突变体(K64R、M97K和双突变体K64R/M97K)的3’-5’核酸外切酶和5’-3’聚合活性之间的动态平衡分析。由5’-标记的引物(5’GATCACAGTGAGTAC,SEQ ID NO:5)与模板(5’AGAAGTGTATCTGGTACTCACTGTGATC,SEQ IDNO:6)杂交形成的DNA双链体被用于分析DNA合成和DNA降解之间的偶联随着dNTP浓度(0nM、10nM、25nM、50nM、100nM和500nM)的变化。在没有dNTP的情况下，观察到引物末端的核酸外切酶降解。降解模式反映了相对于WT Phi29 DNApol的本发明变体的核酸外切酶活性水平。随着dNTP浓度增加，核酸外切酶的活性逐渐被5’-3’聚合所战胜，并且净dNMP掺入可以作为标记的引物尺寸的增加被观察到，定义了每个突变体获得引物有效延伸所需的dNTP浓度。如图4中观察到的，突变体K64R显示出与WT酶显示的大致相似的Pol/Exo平衡，在25nM dNTP达到28-mer位置。另一方面，突变体M97K和双突变体K64R/M97K在测试的最低dNTP浓度(10nM)时到达相同位置(28-mer)，表明这些突变体的聚合酶活性优于核酸外切酶。
实施例3：本发明的突变体(K64R、M97K和K64R/M97K)能够在多重置换扩增反应中比WT Phi29 DNApol使用更短的随机合成引物
图5所示为通过多重置换扩增来扩增1ng人类基因组DNA，该多重置换扩增将Phi29DNApol的选择的变体(K64R、M97K和双突变体K64R/M97K)与不同大小的随机合成引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合。显示的扩增产量是各自包括每个条件下的3个重复的两个独立实验的平均值。描述了两个实验的标准偏差。
如图5中观察到的，没有一种测试的酶能够使用随机合成三聚体有效地扩增基因组DNA。只有双突变体K64R/M97K显示接近1μg的产量。
三种本发明的变体能够使用四聚体来触发扩增，而用WT Phi29DNApol没有观察到扩增。变体K64R表现出最低的扩增产量(2.7μg)，突变体M97K表现出稍高的产量(3.8μg)，并且双突变体K64R/M97K表现出高得多的产量(12.9μg)。在双突变体中观察到的最高产量表明同一多肽中两种突变的协同效应。
WT Phi29 DNApol和三种本发明的变体能够有效地使用随机五聚体来启动扩增。同样，双突变体K64R/M97K产生最高产量(超过20μg的扩增DNA)，明显胜于单变体和WT酶的性能。
在随机六聚体情况下，观察到类似的可比模式，尽管扩增产量在所有情况下都更高。
使用随机七聚体，WT Phi29 DNApol相对于使用六聚体获得的结果保持相同的产量，而三种本发明的变体倾向于降低扩增效率，产生的DNA水平与使用随机五聚体获得的DNA水平相似。
在八聚体的情况下，K64R和M97K单突变体都显示出比WT Phi29DNApol更低的扩增产量。另一方面，双突变体K64R/M97K明显胜于WT Phi29 DNApol，因为它出现在所有测试条件下，证实了与用于启动扩增的随机合成引物的长度无关的稳健和有效的扩增价值。
实施例4：在无模板对照(NTC)中没有输入DNA时观察到的背景扩增中离子强度的影响。
图6显示了当将WT Phi29 DNApol或所选的本发明变体(K64R、M97K和K64R/M97K)与不同大小的随机合成引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合时，在没有输入DNA的情况下观察到的扩增产量。
在测试的低离子强度条件下(20mM KCl；57mM NaCl)，在没有输入DNA的情况下，M97K单突变体和K64R/M97K双突变体二者都显示出在使用五聚体和六聚体时显著的扩增产量，而且在双突变体的情况下也显示出使用四聚体显著的扩增产量(参见图6)。然而，扩增产量明显低于在相同条件下使用DNA(1ng)作为输入物时获得的产量(参见图5)，表明所涉及的扩增机制不同。在没有输入DNA的情况下Phi29 DNApol的引物-二聚体扩增能力在本领域中众所周知(Alsmadi等人，2009)，而在测试的条件下，M97K单突变体和K64R/M97K双突变体中引物-二聚体的稳定性可能会增强。
图7显示了在没有输入DNA但通过加入硫酸铵[(NH4)2SO4]增加离子强度条件观察到的扩增产量。在硫酸铵(45mM)存在的情况下，在没有输入DNA的情况下观察到的扩增水平在所有变体和所有引物大小中被完全消除。
实施例5：高离子强度条件增强了双突变体K64R/M97K使用不同长度的随机引物扩增DNA的稳健性和效率。
图8所示为在高离子强度条件下(20mM KCl；57mM NaCl；45mM(NH4)2SO4)，通过多重置换扩增(MDA)扩增1ng人类基因组DNA，该多重置换扩增(MDA)将WT Phi29 DNApol或所选的本发明的变体(K64R、M97K和K64R/M97K)与不同大小的随机合成引物(三聚体(3N)、四聚体(4N)、五聚体(5N)、六聚体(6N)、七聚体(7N)或八聚体(8N))组合。显示的扩增产量是各自包括每个条件下的3个重复的两个独立实验的平均值。描述了两个实验的标准偏差。
如图8中观察到的，没有一种测试的酶能够使用随机合成三聚体有效地扩增基因组DNA。只有双突变体K64R/M97K显示的产量接近600ng。
与先前条件下观察到的情况(参见图5)相反，四聚体仅被M97K单突变体和K64R/M97K双突变体有效利用，而单突变体K64R仅产生接近1μg的少量产量。值得注意的是，对M97K单突变体和K64R/M97K双突变体观察到的扩增产量与在没有硫酸铵的情况下获得的扩增产量相比增加(分别从4μg增加至12μg和从13μg增加至16μg)。
在五聚体和六聚体的情况下，M97K单突变体和K64R/M97K双突变体显示出相似的结果，明显胜于用WT酶或K64R变体获得的扩增产量。如同其在没有硫酸铵的情况下所示，WTPhi29 DNApol显示出比K64R变体更高的产量。
在七聚体的情况下，只有双突变体K64R/M97K保持了用较短的随机合成引物和/或在没有硫酸铵的情况下获得的扩增产量。WT Phi29 DNApol和K64R变体二者都显著降低了产量，在这些条件下显示出相同的值。用M97K突变体获得的产量与以前的条件相比也降低了。
最后，八聚体仅被双突变体K64R/M97K有效利用，而其他三种酶显示非常低的扩增产量。
Phi29 DNApol双突变体K64R/M97K在低和高离子强度条件下都保持完整的扩增性能，这可能是由酶与来自引物核苷酸5的氮碱基以及核苷酸4和5之间的磷酸二酯键的另外接触所带来的获得功能的结果(参见图2)。这些另外的接触使酶能够在不同的离子强度条件下熟练地稳定不同大小的引物。
实施例6：双突变K64R/M97K导致与测试的引物大小无关的微量DNA的非常灵敏的扩增。
图9所示为在低(20mM KCl；57mM NaCl)或高(20mM KCl；57mM NaCl；45mM(NH4)2SO4)离子强度条件下，通过多重置换扩增(MDA)扩增不同量的人类基因组DNA(1pg、10pg、100pg和1ng)，该多重置换扩增将WT Phi29 DNApol或所选的本发明的变体(K64R、M97K和K64R/M97K)与不同大小的随机合成引物(四聚体(4N)、五聚体(5N)或六聚体(6N))组合。
在低离子强度条件下(图9，上方的图)，双突变体K64R/M97K在所有测试条件产生最一致和最高的扩增产量。
在随机合成四聚体的情况下，如前所示(参见图5)，WT Phi29 DNApol不能扩增测试的任何DNA输入物。变体K64R仅在1ng DNA输入物产生可检测的产量，缺乏扩增较低DNA量的灵敏度。相反，M97K和M97K/K64R突变体都有效地扩增了测试的DNA输入物，双突变体在所有情况下产生更高的产量。
在随机合成五聚体的情况下，所有的酶能够使用它们来启动扩增，但是表现出不同水平的灵敏度和效率。当DNA输入物的量下降时，WT Phi29DNApol显示扩增产量显著降低，而三种本发明的变体在所有测试条件保持合理的效率。双突变体M97K/K64R在三种本发明的变体中表现出与DNA输入量无关的最高的扩增效率，因而表现出最佳的灵敏度。
在随机合成六聚体的情况下，所有的酶能够有效地使用它们来启动每一个测试的DNA输入物的扩增，在每一种情况下显示出显著的扩增产量。当分析低量DNA输入物时，三种本发明的变体胜于WT Phi29 DNApol，显示出更高的扩增产量。与五聚体情况一样，双突变体M97K/K64R在三种本发明的变体中表现出与DNA输入量无关的最高的扩增效率。
如前所示(参见图6)，当使用五聚体和六聚体时，M97K和M97K/K64R变体在没有输入DNA的情况下(无模板对照，NTC)显示出显著的扩增产量。为此，在高离子强度条件下(20mM KCl；57mM NaCl；45mM(NH4)2SO4)进行同样的灵敏度分析，以防止这种源于引物-二聚体扩增的伪迹效应。
在高离子强度条件下(参见图9，下方的图)，随机合成的四聚体在测试的变体中显示出与低离子强度条件相比相似的使用模式，尽管在大多数情况下扩增产量是增加的。这条规则的例外是M97K变体，它在1pg和10pg的DNA输入物时显示出较低的产量。
在高离子强度条件下随机合成五聚体的情况下，M97K和M97K/K64R变体在灵敏度和效率方面表现出最佳性能，与具有相同DNA输入量的低离子强度条件相比，表现出更高的扩增产量。当测试限制量的DNA时(1pg和10pg)，反应离子强度的增加导致变体K64R的扩增效率降低，而其他两种输入物的效率相似(100pg)或更高(1ng)。令人惊讶的是，在所有情况下，在这些条件下，WT Phi29 DNApol胜于K64R变体。
在高离子强度条件下随机合成六聚体的情况下，与低离子强度条件下获得的结果相比，双突变体K64R/M97K是使对于所有DNA输入物观察到的产量增加的唯一变体。单一突变体M97K在最低输入(1pg和10pg)表现出较低的产量，而在100pg和1ng DNA输入物时产量增加，表明灵敏度降低。变体K64R和WT Phi29 DNApol表现出相似的行为。如同五聚体一样，在所有情况下，在这些条件下，WT Phi29 DNApol比K64R变体产生更高的扩增产量。
总之，在用所有测试的DNA引物进行扩增反应的过程中，双突变体K64R/M97K在低和高离子强度条件下在扩增效率和灵敏度方面都表现出最佳性能。
实施例7：当引物由TthPrimPol产生时，扩增效率和灵敏度不会因本发明的变体的使用而改变
图10显示了通过多重置换扩增(MDA)对1pg、10pg、100pg和1ng人类基因组DNA的扩增，该多重置换扩增将WT Phi29 DNApol或所选的本发明的变体(K64R、M97K和K64R/M97K)与TthPrimPol(一种能够在Phi29 DNApol的反应过程中合成引物的DNA引发酶)(Picher等人，2016)组合。
如图10中观察到的，在WT Phi29 DNA pol和测试的本发明的变体之间没有显著的产量差异，这导致在这种设置下相似的灵敏度和效率水平。实施例8：选定的本发明的变体(K64R、M97K和K64R/M97K)提高了通过CovCheck技术测量的扩增覆盖率
CovCheck技术允许使用包括24个不同引物对的PCR小组(PCR panel)对全基因组扩增进行覆盖分析，这些引物对扩增每个人类染色体的一小部分。通过将CovCheck覆盖率值与通过低通全基因组测序获得的真实覆盖率进行比较，验证了CovCheck技术，获得了出色的相关性值(https://www.expedeon.com/products/genomics/dna-rna-products/covcheck-pcr-kits/)。
为了分析每种变体获得的扩增覆盖率，选择了有限数量的输入材料：30pg的人类基因组DNA。这一DNA量相当于5个人类二倍体基因组，并且这可能是确保有每个染色体的足够的拷贝用于扩增的最低数量。低于这个水平，由于纯化的DNA样品中分子的随机分布，在用于扩增的输入物中可能缺少某些区域或完整的染色体，导致区域由于缺少模板而没有被扩增材料覆盖，而不是由于扩增失败。
图11显示了从扩增反应的CovCheck分析获得的估计覆盖率值，该扩增反应使用六聚体、五聚体和四聚体与WT Phi29 DNApol或所选的本发明的变体和30pg的人类基因组DNA输入物的组合。覆盖率值是每个条件6个独立反应的平均值。
在随机合成六聚体的情况下，当使用三种本发明的变体时，扩增覆盖率与通过WTPhi29 DNApol获得的值相比得到了提高。
在随机合成五聚体的情况下，在这些条件下，所有酶显示在90％以上的覆盖率值。因此，没能观察到显著差异。然而，M97K变体在测试的6个重复中以完美的覆盖率脱颖而出。
在随机合成四聚体的情况下，只有M97K和M97K/K64R变体产生扩增的DNA，这与WTPhi29 DNApol和K64R变体与四聚体组合时显示的扩增灵敏度一致(图9)。CovCheck分析显示在这两种情况下都有极好的扩增覆盖率(99％)，表明使用本发明的变体与尽可能短的引物相组合的益处，以便最大化扩增覆盖率和一致性，防止扩增偏差和序列丢失。
在使用酶(TthPrimPol)制造针对Phi29 DNApol的DNA引物的情况下，图12显示了通过TthPrimPol与WT Phi29 DNApol或本发明的变体的组合进行的扩增反应的CovCheck分析获得的估计覆盖率值，在扩增反应中使用30pg(5基因组当量)的人类基因组DNA作为输入物。覆盖率值是每个条件12个独立反应的平均值。当使用本发明的变体时，CovCheck分析还揭示了扩增覆盖率的提高，支持了那些增强扩增材料相对于原始DNA输入物的一致性的优点。
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如本文使用的，除非另外指定，否则以下含义适用。措辞“可以”用于允许性的含义(即，意指有可能)，而非强制性的含义(即，意指必须)。措辞“包括/包含(include)”、“包括/包含(including)”和“包括/包含(includes)”等意指包括/包含但不限于。单数形式“一(a)”、“一(a)”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，述及“要素(an element)”包括两个或更多个要素的组合，尽管对于一个或更多个要素使用了其他术语和措辞，诸如“一个或更多个”。除非另外指明，否则术语“或”是非排他性的，即，涵盖“和”和“或”两者。在修饰语和序列之间的术语“......中的任一个”意指修饰语修饰序列中的每一个成员。因此，例如，措辞“至少1、2或3中的任一个”意指“至少1、至少2或至少3”。在某些实施方案中，“包括”各种要素的发明也可以“基本上由”这些要素“组成”。术语“基本上由…组成”指的是包含所列举的要素和不实质上影响所要求保护的组合的基本的和新颖的特征的其他要素。
应当理解，本说明书和附图并不意图将本发明受制于所公开的特定形式，而是相反，意图覆盖落入由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式。根据本说明书，本发明的各方面的进一步修改和替代实施方案对于本领域技术人员将是明显的。因此，本说明书和附图仅应被解释为说明性的，并且是为了教导本领域技术人员进行本发明的一般方式的目的。应理解，本文示出和描述的本发明的形式应被认为是实施方案的实例。本文说明和描述的要素和物质可以被替换，组成部分(part)和过程可以颠倒或省略，并且本发明的某些特征可以被独立使用，所有这些对了解本发明说明书的益处的本领域技术人员来说都将是明显的。在不脱离如随附权利要求书描述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述的要素进行改变。本文使用的标题仅为了组织的目的，并不意味着用来限制本说明书的范围。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入的相同程度。
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Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr
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Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> K64R / M97K Phi29DNApol双突变体
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<212> DNA
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<223> DNA双链体的5'-标记的引物
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA双链体的模板
<400> 6
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Claims (27)
1.一种Phi29型DNA聚合酶，所述Phi29型DNA聚合酶包含K64R或M97K突变之一或二者。
2.一种Phi29型DNA聚合酶，所述Phi29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％的同一性的氨基酸序列。
3.一种用于复制、扩增或测序模板DNA的方法，所述方法包括将所述DNA与反应混合物接触，所述反应混合物包含至少：
a)根据权利要求1至2中任一项所述的DNA聚合酶，
b)缓冲液，
c)氯化镁，
d)引物，以及
e)核苷三磷酸。
4.一种试剂盒，所述试剂盒用于实施根据权利要求3所述的方法，包含：a)根据权利要求1至2中任一项所述的DNA聚合酶，b)缓冲液，和c)氯化镁。
5.一种试剂盒，所述试剂盒用于实施根据权利要求3所述的方法，包含根据权利要求1至2中任一项所述的DNA聚合酶，以及以下中的一种或更多种：
(a)PrimPol酶(例如TthPrimPol)；
(b)随机三聚体；
(c)随机四聚体；
(d)随机五聚体；
(e)随机七聚体；
(f)随机八聚体；
(g)dNTP；
(h)反应缓冲液；
(i)与任何前述要素一起使用的缓冲液。
6.一种Phi29型DNA聚合酶，其中所述Phi29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、99.5％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述Phi29型DNA聚合酶包含K64R和M97K氨基酸取代之一或二者。
7.根据权利要求6所述的Phi29型DNA聚合酶，所述Phi29型DNA聚合酶具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
8.根据权利要求6所述的Phi29型DNA聚合酶，除了K64R和M97K氨基酸取代之一或二者之外，所述Phi29型DNA聚合酶还具有不超过30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失。
9.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码Phi29型DNA聚合酶的核苷酸序列，其中所述Phi29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、99.5％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述Phi29型DNA聚合酶包含K64R和M97K氨基酸取代之一或二者。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其中所述Phi29型DNA聚合酶具有SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
11.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其中除了K64R和M97K氨基酸取代之一或二者之外，所述Phi29型DNA聚合酶还具有不超过30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失。
12.一种重组核酸，所述重组核酸包含与根据权利要求9-11中任一项所述的Phi29型DNA聚合酶可操作地连接的转录调节序列。
13.根据权利要求12所述的重组核酸，其中所述转录调节序列包含细菌启动子或哺乳动物启动子。
14.根据权利要求12所述的重组核酸，所述重组核酸被包含在选自质粒载体、病毒载体、粘粒和转座子的载体中。
15.根据权利要求14所述的重组核酸，所述重组核酸包含相对于编码所述Phi29型DNA聚合酶的核苷酸序列定位的克隆位点，使得插入所述克隆位点的转录调节序列变得与编码所述Phi29型DNA聚合酶的核苷酸序列可操作地连接。
16.一种重组细胞，所述重组细胞包含根据权利要求12-15中任一项所述的重组核酸。
17.一种方法，包括：
a)将核酸模板分子与根据权利要求1、2、6-8中任一项所述的Phi29型DNA聚合酶和足以用于引物延伸的试剂接触；以及
b)使用所述核酸模板用所述聚合酶进行引物延伸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述足以用于引物延伸的试剂包含寡核苷酸引物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述寡核苷酸引物包含三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、六聚体、八聚体、九聚体或十聚体中的一种或更多种。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述引物是随机引物。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述寡核苷酸引物具有5个和25个核苷酸之间的连接。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述足以用于引物延伸的试剂包含引发酶/聚合酶(例如，TthPrimPol)。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述引物延伸在约或高于以下任一温度进行：31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述模板核酸分子以不大于1ng、100pg、10pg或1pg的量存在。
25.根据权利要求17所述的方法，其中所述引物延伸包含(1)多重置换扩增(“MDA”)或(2)滚环扩增。
26.根据权利要求17所述的方法，其中所述引物延伸包含基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。
27.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述Phi29型DNA聚合酶包含K64R和M97K取代二者。
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