CN114164213B

CN114164213B - 一种敲除mic3基因的重组球虫载体及其检测方法

Info

Publication number: CN114164213B
Application number: CN202111500852.3A
Authority: CN
Inventors: 林瑞庆; 方园婷; 周德荣; 翁亚彪; 陆肖; 蔡晓懿; 孟甜; 王瑞珍
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114164213A

Abstract

本发明提供一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向球虫MIC3基因的sgRNA，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA的靶点位于MIC3基因；由sgRNA、Cas9和同源重组质粒建立基因编辑系统，可精确地敲除球虫MIC3基因并同源重组荧光标记蛋白于MIC3基因，构建一种表达荧光标记蛋白的重组球虫载体。所述重组球虫载体的DNA经过PCR检测和测序，表明荧光标记基因已成功重组于MIC3基因，且重组球虫载体在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功敲除MIC3基因并表达荧光标记蛋白。

Description

一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法。

背景技术

微线体蛋白(Microneme protein，MIC)是由微线体分泌的蛋白，具有识别、粘附与侵染宿主细胞的功能。细胞内游离钙水平的升高可以引起微线体蛋白的分泌(Carruthersand Sibley，1999)，当柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子暴露于白蛋白时也可因受到刺激而合成MIC蛋白(Bumstead and Tomley，2000)，当裂殖子与宿主细胞接触时也可产生(Carruthers and Sibley,1997)。

微线体蛋白从微线体顶端释放出来，并向后覆盖在子孢子上，这些蛋白质在运动和侵袭中起着至关重要的作用，很可能介导寄生虫和宿主细胞表面之间的粘附，并促进寄生虫肌动蛋白骨架的产生。柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白3(EtMIC3)最早由Tomley等人克隆并测序，序列分析结果显示EtMIC3与TgMIC1的相似性较高。Labbe等人运用两种不同的从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊阶段制备的单克隆抗体，从子孢子cDNA表达文库中筛选出EtMIC3并克隆，结果显示EtMIC3表达于子孢子的顶端，在胞内寄生的早期检测不到EtMIC3的表达，但是在成熟的裂殖体内可以检测到；两种针对不同EtMIC3基序的单克隆抗体对球虫的阻断作用各不相同，一种抑制艾美耳球虫对宿主细胞的入侵，另外一种阻碍球虫入侵后在宿主细胞内的发育；这一系列表达和定位实验表明EtMIC3在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主过程中发挥关键作用(Labbe，2005)。

目前，关于MIC3蛋白与球虫感染之间的作用机理并不明确。如何提供一种球虫的MIC蛋白模型，为相关的研究工作奠定基础，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法，所述靶向MIC3基因的sgRNA具有良好的特异性与靶向性，利用其制备的重组球虫载体稳定表达荧光，可应用于相关的研究及疫苗的制备中。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向球虫MIC3基因的sgRNA，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA的靶点位于MIC3基因。

优选地，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA包括SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸序列中的任意一种。

SEQ ID NO.1：tacgaccccgcctactcctacgg；

SEQ ID NO.2：tattcgaaaatactgctggtggg。

本发明中，所述靶向MIC3基因的sgRNA位于MIC3基因编码区的内部，可配合Cas9以及同源重组质粒实现MIC3基因的敲除以及外源基因的定点插入，基因编辑效率高，脱靶率低，且避免了外源片段的随机插入。

第二方面，本发明提供了一种球虫MIC3基因编辑系统，所述球虫MIC3基因编辑系统包括第一方面所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA。

优选地，所述球虫MIC3基因编辑系统还包括Cas9。

优选地，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA与所述Cas9连接在同一个基因编辑质粒中。

本发明中，CRISPR-Cas9基因编辑系统由规律成簇间隔短回文重复序列以及CRISPR相关蛋白9组成，是继锌指核酸酶和转录激活因子效应物核酸酶技术之后迅速发展起来的基因组编辑技术，在细胞基因敲除中已被广泛应用。

CRISPR-Cas9通过小导向RNA识别靶向序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂。断裂的DNA为防止降解会自动启动内源性修复机制，通常有两种：在非同源末端连接修复机制下修复时并不是非常精确，在断裂缺口处往往随机插入或删除碱基，若突变位点位于蛋白编码区，将转录错误的mRNA，导致翻译失败或蛋白失活从而实现基因敲除；在同源重组修复机制以及修复模板存在的条件下，也可以实现定点的单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变，实现基因的敲入与敲除。

优选地，所述MIC3基因编辑系统还包括同源重组质粒。

优选地，所述同源重组质粒中包括筛选标记基因。

优选地，所述筛选标记基因包括荧光标记基因。

优选地，所述同源重组质粒还包括5’同源臂、启动子和3’同源臂。

本发明中，5’同源臂和3’同源臂为同源重组修复提供了模板，提高了同源重组的效率。

本发明中，通过靶向球虫MIC3基因的sgRNA、Cas9与同源重组质粒的相互配合，实现了在球虫MIC3基因内部定点插入筛选标记基因，避免了外源片段随机插入的不可控性，插入效率更高。

第三方面，本发明提供了一种敲除球虫MIC3基因的重组球虫载体，所述重组球虫载体含有第一方面所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA。

本发明中，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫或早熟艾美耳球虫中的任意一种。

优选地，所述重组球虫载体含有第二方面所述的球虫MIC3基因编辑系统。

优选地，所述重组球虫载体为经过第二方面所述的球虫MIC3基因编辑系统编辑后，在MIC3基因中插入了筛选标记基因的球虫载体。

本发明中，所述重组球虫载体敲除了MIC3基因，且稳定表达荧光蛋白，可用于球虫生长、基因功能研究、球虫与宿主的作用机制以及疫苗制备等相关的研究中。

第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的重组球虫载体的构建方法，所述构建方法包括：

构建基因编辑质粒；

构建同源重组质粒；

将所述基因编辑质粒和所述同源重组质粒导入球虫子孢子中，筛选阳性克隆，得到所述重组球虫载体。

本发明中，所述重组球虫的构建方法容易操作，技术成熟，为相关产品的制备与推广创造了条件。

优选地，所述基因编辑质粒的构建方法包括：

PCR扩增所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接，得到含有靶向球虫MIC3基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒。

优选地，所述同源重组质粒的构建方法包括：

依次将5’同源臂、启动子、荧光标记基因和3’同源臂按顺序连接，再连接到克隆载体上，得到含有荧光标记基因的同源重组质粒。

优选地，所述荧光标记基因包括EGFP基因。

优选地，所述同源重组质粒的构建方法还包括测序验证的步骤。

优选地，所述导入包括电转染。

优选地，所述筛选阳性克隆的步骤包括：

使用球虫子孢子感染动物，收获卵囊后进行筛选，得到阳性球虫载体。

优选地，所述动物包括鸡。

优选地，所述筛选包括细胞流式分选。

作为优选技术方案，本发明所述重组球虫载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建含有靶向球虫MIC3基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒：

PCR扩增所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接，得到含有靶向球虫MIC3基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒；

(2)构建含有筛选标记基因的同源重组质粒：

依次将5’同源臂、启动子、EGFP基因和3’同源臂按顺序连接，再连接到克隆载体上，测序验证，得到含有EGFP基因的同源重组质粒；

(3)构建重组球虫载体：

将所述含有靶向球虫MIC3基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒和所述含有EGFP基因的同源重组质粒通过电转染导入球虫子孢子中，使用球虫子孢子感染鸡，收获卵囊后，再细胞流式分选筛选阳性克隆，荧光显微镜观察和PCR扩增验证为阳性，即所述的重组球虫载体。

第五方面，本发明提供一种第三方面所述的重组球虫载体的检测方法，所述检测方法包括PCR扩增检测和/或荧光检测。

优选地，所述PCR扩增检测的靶点基因包括荧光标记基因。

优选地，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述靶向MIC3基因的sgRNA以及MIC3基因编辑系统具有良好的特异性，基因编辑效率高，其实现了外源片段的定点插入，与传统的同源重组技术、酶切技术相比，显著提高了敲除及同源重组的效率；

(2)本发明中的同源重组同源臂仅为约0.6kb，与传统同源重组使用的长度为3～4kb同源臂相比长度大大减少，更加有利于后续检测工作的进行；

(3)本发明所述重组球虫载体敲除了MIC3基因并插入了EGFP基因，构建的重组球虫载体能稳定表达荧光信号，可用于探究目的基因编码的蛋白质的生物学功能、观察球虫不同发育阶段的转化、球虫的宿主特异性以及球虫载体疫苗的研究中；

(4)本发明所述重组球虫载体具有可遗传性及稳定性，可通过细胞分裂将编辑后的基因型传递给子代，应用价值更高。

附图说明

图1为本发明实施例1中基因编辑质粒的图谱；

图2为本发明实施例1中同源重组质粒的图谱；

图3为本发明实施例2中重组球虫载体的构建原理示意图；

图4为本发明实施例2中重组球虫载体的荧光图片(比例尺＝20μm)；

图5为本发明实施例3中重组球虫载体PCR验证的凝胶电泳图，图中，M-标准DNA分子量marker，泳道1-PCR1扩增产物，泳道2-PCR2扩增产物，泳道1-PCR3扩增产物。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料与方法：

胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；

重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；

Q5点突变试剂盒(包括KLD和酶切所需的salI和缓冲液)购自NEB(北京)有限公司；

电击缓冲液购自哈佛生物科学生物公司；

柔嫩艾美耳球虫来自佛山市正典生物技术有限公司；

雏鸡来自广东新兴县温室总部后山SPF实验动物中心。

实施例1

本实施例提供一种球虫MIC3基因编辑系统，所述球虫MIC3基因编辑系统包括靶向球虫MIC3基因的sgRNA、Cas9和同源重组质粒；

所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA与所述Cas9连接在同一个基因编辑质粒中；

所述同源重组质粒中包括依次连接的5’同源臂、SAG13启动子、EGFP基因和3’同源臂。

SEQ ID NO.1：tacgaccccgcctactcctacgg。

所述基因编辑质粒通过如下方法进行制备：

(1)PCR扩增所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA和Cas9的编码序列：

以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒为模板，进行PCR反应，得到PCR产物；

所述PCR扩增的反应体系如下：

SEQ ID NO.3：tacgaccccgcctactcctacgggttttagagctagaaatagcaagttaa；

SEQ ID NO.4：aacttgacatccccatttacc。

所述PCR扩增的反应程序如下：

预变性：98℃，1min；

循环扩增：98℃，10s；55℃，20s；72℃，5min，25个循环；

循环外延伸：72℃，2min；

灭活：16℃，30s。

扩增片段大小为9600bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增产物大小正确。

(2)连接：

参照试剂盒上的说明进行KLD反应，将扩增产物成环连接，反应体系如下：

反应程序为：在室温下孵育5min。

取全部的KLD反应产物转化到DH5α感受态细胞中，涂布Amp抗性的固体培养基平板，37℃倒置培养过夜；

挑取单菌落置于5mL Amp抗性的液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养10h至菌液浑浊；

取500μL菌液和500μL 40％甘油混匀，于-20℃保藏；剩余菌液用于提取质粒，并对提取的质粒进行酶切鉴定，反应体系如下：

反应程序为：37℃反应4h。

酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产物为6kb和3.7kb两条带，证明质粒为阳性克隆；

将阳性克隆进行测序分析，测序引物为M13反向引物，测序结果显示靶点序列已完全被替换，表明基因编辑质粒构建成功，其质粒图谱如图1所示。

所述同源重组质粒通过如下方法进行制备：

(1)扩增5’同源臂序列：

以序列N-5’h-F(SEQ ID NO.5)和N-5’h-R(SEQ ID NO.6)为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。

SEQ ID NO.5：agctatgaccatgattacgcttggcgcggaagtctgaa；

SEQ ID NO.6：tttcccggatgatggcagttgagcaaaaa。

扩增片段大小为600bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增产物大小正确，使用胶回收试剂盒回收产物后连入pMD19-T载体中，测序，显示5’同源臂序列正确。

(2)扩增3’同源臂序列：

以N-3’h-F(SEQ ID NO.7)和N-3’h-R(SEQ ID NO.8)为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。

SEQ ID NO.7：atactgacacctgcaagtgcgagtcg；

SEQ ID NO.8：cctgcaggcatgcaagcttgtgaacagagttgaactgcggg。

扩增片段大小为600bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增产物大小正确，使用胶回收试剂盒回收产物后连入pMD19-T载体中，测序，显示3’同源臂序列正确。

(3)扩增SAG13启动子序列：

以SAG13-F(SEQ ID NO.9)和SAG13-R(SEQ ID NO.10)为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。

SEQ ID NO.9：aactgccatcatccgggaaaggcacctatgct；

SEQ ID NO.10：tttgctcaactgccatcatccgggaaaggcacctatgct。

扩增片段大小为1356bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增产物大小正确，使用胶回收试剂盒回收产物后连入pMD19-T载体中，测序，显示SAG13启动子序列正确。

(4)扩增EGFP序列：

以EGFP-F(SEQ ID NO.11)和EGFP-R(SEQ ID NO.12)为引物，以EGFP编码质粒为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。

SEQ ID NO.11：gctttctgtgtttttccgcaatggtgagcaagggcgagg；

SEQ ID NO.12：gcacttgcaggtgttacttgtacagctcgtccatgcc。

扩增片段大小为720bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增产物大小正确，使用胶回收试剂盒回收产物后连入pMD19-T载体中，测序，显示EGFP序列正确。

(5)扩增PUC19序列：

以PUC19-F(SEQ ID NO.13)和PUC19-R(SEQ ID NO.14)为引物，以PUC19质粒为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。

SEQ ID NO.13：caagcttgcatgcctgcag；

SEQ ID NO.14：gcgtaatcatggtcatagctgttt。

扩增片段大小为2600bp，1％琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增产物大小正确，使用胶回收试剂盒回收产物后连入pMD19-T载体中，测序，显示PUC19序列正确。

(6)重组反应：

将5’同源臂、SAG13启动子、EGFP、3’同源臂与PUC19载体通过同源重组反应连接。

反应体系如下：

反应条件为：37℃反应30min，在4℃下保存。

在冰上解冻DH5α化学感受态细胞，取10μL重组产物加入100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min后，在42℃水浴热激45s，再置于冰上冷却2min；

加入900μL LB培养基，37℃下200rpm震荡培养1h后，5000rpm离心5min，弃掉900μL上清；

用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在37℃培养箱中预热后的Amp抗性的平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养12h；

挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，使用的上游引物为M13通用引物(SEQ ID NO.15)，下游引物为N-3’h-R(SEQ ID NO.8)。

SEQ ID NO.15：caggaaacagctatgac。

挑取扩增产物片段大小正确(3276bp)的菌落加入Amp抗性的培养基中，在37℃、200rpm下震荡培养12h，提取质粒测序验证。测序结果显示序列正确，如SEQ ID NO.16所示。

SEQ ID NO.16：

ttggcgcggaagtctgaagatcgcgggtggcgaagcagcaacagccgtggcctggagagctgcgcgggcactgcaagactgcgagagttcgctcgaatttcgccggcattgggtctttttctccgtttaaattcaaggtgaagttgaattttcaaaatgtattcgaaaatactgctggtgggggcgctggcgctgggggaaacggccgcgccatctgcgcagcgggccacggcgccgagcacgcagcagcagccgctggctgcgcccgtttcggactttttggcgtttcccgacgaagaaaaagatttaaatttgcaatcgaaaggtgaatttgagaaaatagtggctttgaaggggcctggggaggccgcgaagttcactgacatcaccgaagaggagttcaacaaaatcgacaaggccatgaagccctgcttccagtccttgaacagagaggcctgcggggcccgggcctcagcagcagagtaccctgggggcctccactgccccccggatagctgctgcagcaaaactgtgattgaacagggaaaaataggaaactggtgttcccagagttgggttttttgctcaactgccatcatccgggaaaggcacctatgctgcaagtcgcagctcactgaaaaaatagagccgtgcagggtctgttttgacgcttgcgcatgtaccagtagcggaaaggttgttaagtgcaaaaaatttcagtttatatagcgagtttatcgcagcccctcactaaccgtgaatctgtcagcgaatgcgtgagtacttcaatgttttggtccaccacttacacgcatcataggccgaaggttgctcacattttgacgatgaaaaaacgtgtgtatctaagaaaactgtctaatgagcataaaatgcatcgtcgtaatatagagggagatgcggtcagagacctgtaaaacgatcagatgctgtcacaggagccacctcacctagcgcacgtttcaccatagaaagttgccgacgcactcatacagaatccagaaaataacacaaaaatggagttgtaatgatgcattgtgagcgcctgcagcatctgctaaggttagtccttcaacgggcactccccccaaagtccgactgcacatggggatctaacctattcttaacagacctgactgatcccattaactcaacaggctcacatatgtatcatattaattccggccagtgtctctaaataaactcttttgtaggatctgccaactcactgcgggggggcacacagaagcaccacattgcacgacactgcttttgcgcaggctgcggggcaattaaacgttaacagtgcttgatccggccgaaatgacgcgaaatatttaaaacattatctgtttgtcagcctaacggagatgacatggtcgcacaagagactacagtgtgtgtgtgatgtctttcgtgcatcccaccgagcctctggaattcggcaccgcattagcccacacgtaaaacattgcgtacctaaccaagaagacttctcgggcagagaaaatgtaaaattatacattagcagagccacacattacactaaattgtttaattaggcttggttcacgttccgcagctcgtaatgcgggcgcgcgacagatcaacacacacacacaagcatctcggcagcacgtagtcactagtggaataaccgcgcacttcaacagaccattaaaaacctagacatttatatcctaaagcatgttctgttgaagcttcacaaagcagaattctaagacagcttagctcgtcgcaactcaggtggtgaaacagcaccatgctctagctggcagctgggactgtcacgtcgatgagccctgagtttctcatcgtacacacgcatttttcccagcatttcaattttttttgttgacccgggtgtgctcgcccactttgttcctgttgtccctttgctttctgtgtttttccgcaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacacctgcaagtgcgagtcgtacagaaaccgctgccccataggcagcagctgcctcgactccagcttcggggctttttgcaaatgcaatgaagacttagaagagcgaaacgggggctgccacttcaccacaacgaccacaaccaccaccaccaccaccaccaccacaaccaccaccaccacaacaaccaccaccaccacgccccccgcgcgatctctctgcaaagtcgacgactgcaggccgggcttctgcgatgttattgataataaagtagtttgcacttgcgtgggaggttatgtttccaaaaagctctccgaagagaaggagcagtgcgtcttcaactactagtgcgctggggtgtataggcagctccggccgcacgcgcctccccccagcccttctgctcggcacttcatttcctccgcagcaagtccacttctttctctttagtaggtttttcctttccactttgcattctccccaacagatcttttccctttcctccttcttctcccgcttcccttcggtttcctccccgcatccgcggccgcagcgtgcccacccgctgcgtggactgcccacccgcagttcaactctgttca。

所述同源重组质粒的质粒图谱如图2所示。

至此，含有所述靶向MIC3基因的sgRNA与所述Cas9的基因编辑质粒以及5’同源臂、SAG13启动子、EGFP基因和3’同源臂顺次连接的同源重组质粒构建成功，得到了所述MIC3基因编辑系统。

实施例2

本实施例提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体为经过实施例1所述的球虫MIC3基因编辑系统编辑后，在球虫MIC3基因中插入了EGFP基因的球虫载体。

所述重组球虫载体的构建原理示意图如图3所述，构建方法如下：

(1)制备鸡柔嫩艾美耳球虫子孢子：

将孢子化卵囊液置于50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃去上清，加入灭菌PBS洗涤3次，4000rpm离心10min，弃去上清，保留沉淀；

将1倍体积的30％次氯酸钠溶液加入沉淀，重悬静置10min，1500rpm离心10min，收集上清，镜检沉淀，如果有较多孢子化卵囊再次以同样方法将30％次氯酸钠溶液加入沉淀，重悬静置10min，离心后收集上清；

将收集的上清加入等体积的PBS溶液，4000rpm离心10min，收集沉淀镜检，如果卵囊干净则进行下一步，如果不干净则继续用30％次氯酸钠溶液漂浮，方法同上；

将沉淀以PBS溶液洗涤3次，收集沉淀，弃上清；

将沉淀重悬于10mL的PBS溶液中，吸入50mL带有玻璃珠的离心管中，拧紧盖子，于涡旋仪涡旋2min，显微镜检查孢子化卵囊的破裂情况，至90％孢子化卵囊破裂为止，力度不可过大，防止子孢子溢出；

将破裂的卵囊液吸入50mL离心管中，同时将玻璃珠以PBS溶液洗涤3次，同样吸入50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀；

将沉淀加入预热的消化液中，混匀，置于41℃水浴锅中，每隔10min混匀一次，40min时显微镜检查子孢子释出情况，如果孢子囊90％已释出，停止消化，如有大量孢子囊未释出子孢子，则继续消化20min；

将上述消化液置于50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀，以PBS洗涤3次，去除消化液；

将沉淀加入20倍体积的PBS溶液重悬混匀。在超净台中用PBS润洗G3漏斗，加入子孢子悬液，并加入10mL PBS溶液抽真空过滤，将过滤后的溶液置于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀重悬于PBS溶液中，所得沉淀即为纯净的子孢子。

(2)电转染：

取1.5×10⁷个新鲜有活力的柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液加入电转杯中，加入200μL电击缓冲液重悬，按7.0×10¹⁰copies/μL加入基因编辑质粒，再按5.043×10¹⁰copies/μL加入同源重组质粒，加入电击缓冲液定容至800μL，充分混匀；

将电转杯置于BTX电转仪孔中，在电压1500V、电容25μF以及电阻50Ω的条件下电击3次；

电转染后将子孢子按1.5×10⁷个子孢子/鸡的量通过泄殖腔接种至7日龄雏鸡，收集第7～10天粪便，获得卵囊，将卵囊孢子化；

将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊再次接种雏鸡，收集7天的卵囊，通过饱和食盐水漂浮法获取卵囊。

(3)细胞流式分选与荧光检测：

将收集到的重组球虫进行细胞流式分选，然后继续接种健康鸡，继而产生了重组球虫的子代卵囊，此步骤重复3～5次，直到重组球虫载体卵囊荧光率达到80％以上，后用荧光显微镜观察，检测到重组球虫载体能够自发荧光(如图4所示)，证明成功构建了一种敲除球虫MIC3基因并能表达荧光蛋白的重组球虫载体。

实施例3

本实施例对实施例2制备得到的重组球虫载体进行检测，步骤如下：

收集重组球虫卵囊进行基因组提取，以基因组作为DNA模板，设计引物PCR1-F(位于ΔEtMIC3的5’UTR区，SEQ ID NO.17)、PCR1-R(位于ΔEtMIC3的SAG13启动子下游，SEQ IDNO.18)，PCR2-F(位于ΔEtMIC3的EGFP上游，SEQ ID NO.19)、PCR2-R(位于ΔEtMIC3的3’UTR区，SEQ ID NO.20)，PCR3-F(位于EtMIC3基因内部，SEQ ID NO.21)、PCR3-R(位于EtMIC3基因内部，SEQ ID NO.22)进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。

SEQ ID NO.17：ttggcgcggaagtctgaagat；

SEQ ID NO.18：cctttgctttctgtgtttttccgc；

SEQ ID NO.19：atggtgagcaagggcgag；

SEQ ID NO.20：acccgcagttcaactctgttca；

SEQ ID NO.21：aacgttctgaaattgaagagaacttggcg；

SEQ ID NO.22：gaaggcaggcagatgccg。

其中，PCR1检测ΔEtMIC3的5’UTR序列和SAG13启动子的整合情况；PCR2检测EGFP序列和ΔEtMIC3的3’UTR序列的整合情况；PCR3检测EtMIC3基因是否被敲除。

使用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的有无及条带大小，所述琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。检测结果显示，PCR1、PCR2均为阳性反应，片段大小分别为1956bp和1320bp，表明EtMIC3的5’UTR序列和SAG13启动子成功整合，EGFP序列和EtMIC3的3’UTR序列成功整合；PCR3未扩增出目标片段，证明EtMIC3基因被敲除。

使用胶回收试剂盒回收产物后连入pMD19-T载体中，测序，分析结果显示序列正确，证实成功获得了所述重组球虫载体。

综上所述，本发明提供了一种靶向MIC3基因的sgRNA以及MIC3基因编辑系统，所述靶向MIC3基因的sgRNA以及MIC3基因编辑系统具有良好的特异性及靶向性，实现了在球虫的MIC3基因中定点插入EGFP基因，编辑效率高，脱靶率低；构建的重组球虫载体实现了MIC3基因的敲除以及外源基因EGFP的插入，稳定表达荧光蛋白，可用于基因功能、球虫生长以及疫苗制备等相关的研究中。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法

<130> 2021

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列 sgRNA

<400> 1

tacgaccccg cctactccta cgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列 sgRNA

<400> 2

tattcgaaaa tactgctggt ggg 23

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacgaccccg cctactccta cgggttttag agctagaaat agcaagttaa 50

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacttgacat ccccatttac c 21

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列 N-5'h-F

<400> 5

agctatgacc atgattacgc ttggcgcgga agtctgaa 38

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列 N-5'h-R

<400> 6

tttcccggat gatggcagtt gagcaaaaa 29

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列 N-3'h-F

<400> 7

atactgacac ctgcaagtgc gagtcg 26

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列 N-3'h-R

<400> 8

cctgcaggca tgcaagcttg tgaacagagt tgaactgcgg g 41

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列 SAG13-F

<400> 9

aactgccatc atccgggaaa ggcacctatg ct 32

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列 SAG13-R

<400> 10

tttgctcaac tgccatcatc cgggaaaggc acctatgct 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列 EGFP-F

<400> 11

gctttctgtg tttttccgca atggtgagca agggcgagg 39

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列 EGFP-R

<400> 12

gcacttgcag gtgttacttg tacagctcgt ccatgcc 37

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列 PUC19-F

<400> 13

caagcttgca tgcctgcag 19

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列 PUC19-R

<400> 14

gcgtaatcat ggtcatagct gttt 24

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列 M13通用引物

<400> 15

caggaaacag ctatgac 17

<210> 16

<211> 3276

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttggcgcgga agtctgaaga tcgcgggtgg cgaagcagca acagccgtgg cctggagagc 60

tgcgcgggca ctgcaagact gcgagagttc gctcgaattt cgccggcatt gggtcttttt 120

ctccgtttaa attcaaggtg aagttgaatt ttcaaaatgt attcgaaaat actgctggtg 180

ggggcgctgg cgctggggga aacggccgcg ccatctgcgc agcgggccac ggcgccgagc 240

acgcagcagc agccgctggc tgcgcccgtt tcggactttt tggcgtttcc cgacgaagaa 300

aaagatttaa atttgcaatc gaaaggtgaa tttgagaaaa tagtggcttt gaaggggcct 360

ggggaggccg cgaagttcac tgacatcacc gaagaggagt tcaacaaaat cgacaaggcc 420

atgaagccct gcttccagtc cttgaacaga gaggcctgcg gggcccgggc ctcagcagca 480

gagtaccctg ggggcctcca ctgccccccg gatagctgct gcagcaaaac tgtgattgaa 540

cagggaaaaa taggaaactg gtgttcccag agttgggttt tttgctcaac tgccatcatc 600

cgggaaaggc acctatgctg caagtcgcag ctcactgaaa aaatagagcc gtgcagggtc 660

tgttttgacg cttgcgcatg taccagtagc ggaaaggttg ttaagtgcaa aaaatttcag 720

tttatatagc gagtttatcg cagcccctca ctaaccgtga atctgtcagc gaatgcgtga 780

gtacttcaat gttttggtcc accacttaca cgcatcatag gccgaaggtt gctcacattt 840

tgacgatgaa aaaacgtgtg tatctaagaa aactgtctaa tgagcataaa atgcatcgtc 900

gtaatataga gggagatgcg gtcagagacc tgtaaaacga tcagatgctg tcacaggagc 960

cacctcacct agcgcacgtt tcaccataga aagttgccga cgcactcata cagaatccag 1020

aaaataacac aaaaatggag ttgtaatgat gcattgtgag cgcctgcagc atctgctaag 1080

gttagtcctt caacgggcac tccccccaaa gtccgactgc acatggggat ctaacctatt 1140

cttaacagac ctgactgatc ccattaactc aacaggctca catatgtatc atattaattc 1200

cggccagtgt ctctaaataa actcttttgt aggatctgcc aactcactgc gggggggcac 1260

acagaagcac cacattgcac gacactgctt ttgcgcaggc tgcggggcaa ttaaacgtta 1320

acagtgcttg atccggccga aatgacgcga aatatttaaa acattatctg tttgtcagcc 1380

taacggagat gacatggtcg cacaagagac tacagtgtgt gtgtgatgtc tttcgtgcat 1440

cccaccgagc ctctggaatt cggcaccgca ttagcccaca cgtaaaacat tgcgtaccta 1500

accaagaaga cttctcgggc agagaaaatg taaaattata cattagcaga gccacacatt 1560

acactaaatt gtttaattag gcttggttca cgttccgcag ctcgtaatgc gggcgcgcga 1620

cagatcaaca cacacacaca agcatctcgg cagcacgtag tcactagtgg aataaccgcg 1680

cacttcaaca gaccattaaa aacctagaca tttatatcct aaagcatgtt ctgttgaagc 1740

ttcacaaagc agaattctaa gacagcttag ctcgtcgcaa ctcaggtggt gaaacagcac 1800

catgctctag ctggcagctg ggactgtcac gtcgatgagc cctgagtttc tcatcgtaca 1860

cacgcatttt tcccagcatt tcaatttttt ttgttgaccc gggtgtgctc gcccactttg 1920

ttcctgttgt ccctttgctt tctgtgtttt tccgcaatgg tgagcaaggg cgaggagctg 1980

ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 2040

agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 2100

tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 2160

gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 2220

atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 2280

acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 2340

atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 2400

cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 2460

cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 2520

atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2580

agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 2640

gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaacacc tgcaagtgcg agtcgtacag 2700

aaaccgctgc cccataggca gcagctgcct cgactccagc ttcggggctt tttgcaaatg 2760

caatgaagac ttagaagagc gaaacggggg ctgccacttc accacaacga ccacaaccac 2820

caccaccacc accaccacca caaccaccac caccacaaca accaccacca ccacgccccc 2880

cgcgcgatct ctctgcaaag tcgacgactg caggccgggc ttctgcgatg ttattgataa 2940

taaagtagtt tgcacttgcg tgggaggtta tgtttccaaa aagctctccg aagagaagga 3000

gcagtgcgtc ttcaactact agtgcgctgg ggtgtatagg cagctccggc cgcacgcgcc 3060

tccccccagc ccttctgctc ggcacttcat ttcctccgca gcaagtccac ttctttctct 3120

ttagtaggtt tttcctttcc actttgcatt ctccccaaca gatcttttcc ctttcctcct 3180

tcttctcccg cttcccttcg gtttcctccc cgcatccgcg gccgcagcgt gcccacccgc 3240

tgcgtggact gcccacccgc agttcaactc tgttca 3276

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列 PCR1-F

<400> 17

ttggcgcgga agtctgaaga t 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列 PCR1-R

<400> 18

cctttgcttt ctgtgttttt ccgc 24

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 PCR2-F

<400> 19

atggtgagca agggcgag 18

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列 PCR2-R

<400> 20

acccgcagtt caactctgtt ca 22

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列 PCR3-F

<400> 21

aacgttctga aattgaagag aacttggcg 29

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 PCR3-R

<400> 22

gaaggcaggc agatgccg 18

Claims

1.一种靶向球虫MIC3基因的sgRNA，其特征在于，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA的靶点位于MIC3基因；

所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA如SEQ ID NO.1所示。

2.一种球虫MIC3基因编辑系统，其特征在于，所述球虫MIC3基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA；

所述球虫MIC3基因编辑系统还包括Cas9；

所述球虫MIC3基因编辑系统还包括同源重组质粒；

所述同源重组质粒中包括筛选标记基因；

所述筛选标记基因包括荧光标记基因。

3.一种敲除球虫MIC3基因的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体含有权利要求1所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA。

4.根据权利要求3所述的敲除球虫MIC3基因的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体含有权利要求2所述的球虫MIC3基因编辑系统。

5.根据权利要求4所述的敲除球虫MIC3基因的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体为经过权利要求2所述的球虫MIC3基因编辑系统编辑后，在球虫MIC3基因中整合了所述荧光标记基因的球虫载体。