CN114159478B

CN114159478B - 一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114159478B
Application number: CN202111403653.0A
Authority: CN
Inventors: 耿燕; 闫建国; 段文慧; 马晓霞; 许正宏; 史劲松; 贾玮玮; 单香芬; 杜学贤; 杨树泉; 梁国威; 任怡琳
Original assignee: Ningxia Saishang Jinhe Technology Co ltd; Jiangnan University
Current assignee: Ningxia Saishang Jinhe Technology Co ltd; Jiangnan University
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-11-22
Also published as: CN114159478A

Abstract

本发明公开了一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物及其制备方法与应用，本发明采用具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力的副干酪乳杆菌JN‑1冻干菌粉，配合膳食纤维和维生素，制备得到副干酪乳杆菌JN‑1菌粉组合物。本发明的副干酪乳杆菌JN‑1能够增加有益细菌的数量并减少病原菌的数量，从而恢复肠道微生物群稳态，还可降低炎症因子的级联反应；本发明还添加能够被细菌发酵，形成短链脂肪酸的膳食纤维，具有抗炎和增强肠道屏障功能的作用；此外还添加具有抗炎，抗氧化，增强肠屏障功能，提高免疫等功能的维生素，从而进一步降低IBD的发病和进展。

Description

一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

炎症性结肠炎(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性的，死亡率低的肠道疾病，临床上会表现为反复的腹痛、腹泻、粘液血便。IBD存在于各个年龄阶段，大多数发生在青春期和成年早期，在中国炎症性结肠炎发病率已达到万分之三。研究表明，预计未来十年，每年新诊断的IBD患者的数量呈指数级增长，这使得炎症性结肠炎成为了主要公共卫生问题之一。目前，对IBD的确切病因尚未完全明确。有些学者认为可能与肠道微生物或自身免疫有关。治疗炎症性结肠炎的药物主要为氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素等，但药物治疗对人体的副作用大，而且长期的服药会给肝，肾器官增加一定的负担，同时也会在一定程度上破坏肠道菌群的稳态，需要小心地控制肠道微生物群。

益生菌是天然、安全、有效的胃肠道疾病干预手段，其中乳酸菌在各种胃肠道和炎症疾病中显示出许多有益的作用。如公开号为202110313301.X的中国发明专利公开了缓解便秘的双歧杆菌及其制备的发酵食品与益生菌制剂。该发明提供了两歧双歧杆菌CCFM1167可改善便秘小鼠首粒黑便时间，肠道推进率和粪便含水量表观病变指标。此外，两歧双歧杆菌CCFM1167还调节胃肠蠕动，减少结肠组织病理损伤，进而有效缓解小鼠便秘情况。与长双歧杆菌GDMCC NO:60941相比有更明显的缓解作用。

虽然目前存在较多的能够用来调理胃肠道的益生菌产品，但是针对炎症性结肠炎，且治疗效果较好的产品还较少，急需开发更多的能够预防和治疗炎症性结肠炎的益生菌产品。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种含有副干酪乳杆菌JN-1的菌粉组合物，本发明结合了对肠炎具有较好治疗效果的副干酪乳杆菌JN-1、膳食纤维、维生素和脱脂乳粉，制备得到一种可以显著改善IBD带来的肠道损伤，具有良好治疗IBD的菌粉组合物。

本发明的第一个目的是提供一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，所述的菌粉组合物包括副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1冻干菌粉、膳食纤维和维生素，其中，所述的副干酪乳杆菌JN-1于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。

进一步地，按重量份计，所述的菌粉组合物包括40～60份副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉、20～30份膳食纤维和5～10份维生素。

进一步地，所述的副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中活菌数不低于1×10⁸CFU/g。

进一步地，所述的副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中还包括占副干酪乳杆菌JN-1菌体质量8～10％的脱脂奶粉。

进一步地，所述的膳食纤维为抗性糊精、低聚木糖、半乳糖寡糖、苹果果胶、柑橘果胶、魔芋、菊粉、燕麦麸中的一种或多种。

进一步地，所述的维生素为维生素C、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素A、维生素D、维生素D3、叶酸、维生素K中的一种或多种。

本发明的第二个目的是提供一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)将所述的副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，35～38℃培养24～48h，获得菌株单菌落；

(2)挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，35～38℃厌氧培养20～28h，得到初级种子液；

(3)将初级种子液以2～4％的接种量接种于液体MRS培养基中，35～38℃厌氧培养20～28h，得到发酵液；

(4)将得到的发酵液2000～6000rpm/min离心5～20min，收集并洗涤菌体，得到副干酪乳杆菌JN-1菌体；

(5)向收集到的副干酪乳杆菌JN-1菌体中加入脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉；

(6)按照重量份的原料，将副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉、膳食纤维和维生素混合，制成所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物。

进一步地，在步骤(5)中，脱脂奶粉的添加量为副干酪乳杆菌JN-1菌体质量的8～10％。

进一步地，MRS固体培养基：胰蛋白胨8～12g/L；酵母粉4～6g/L；牛肉膏8～12g/L；葡萄糖15～25g/L；柠檬酸氢二胺1～3g/L；乙酸钠4～6g/L；K₂HPO₄·3H₂O 2.5～2.7g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L；MnSO₄·4H₂O 0.04～0.06g/L；吐温80 0.8～1.2mL/L；1.5～2％的琼脂粉。

进一步地，MRS液体培养基：胰蛋白胨8～12g/L；酵母粉4～6g/L；牛肉膏8～12g/L；葡萄糖15～25g/L；柠檬酸氢二胺1～3g/L；乙酸钠4～6g/L；K₂HPO₄·3H₂O 2.5～2.7g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L；MnSO₄·4H₂O 0.04～0.06g/L；吐温80 0.8～1.2mL/L。

本发明的第三个目的是提供一种所述的菌粉组合物在制备治疗炎症性结肠炎的产品中的应用。

进一步地，所述的产品为药品。

本发明的有益效果是：

本发明采用具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力的副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉，配合膳食纤维和维生素，制备得到副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物。本发明的副干酪乳杆菌JN-1能够增加有益细菌的数量并减少病原菌的数量，从而恢复肠道微生物群稳态，还可降低炎症因子的级联反应；本发明还添加能够被细菌发酵，形成短链脂肪酸的膳食纤维，具有抗炎和增强肠道屏障功能的作用；此外还添加具有抗炎，抗氧化，增强肠屏障功能，提高免疫等功能的维生素，从而进一步降低IBD的发病和进展。

本发明的副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物能够显著减少腹泻次数，缓解结肠组织的病变，显著降低IBD小鼠结肠炎症因子TNF-α的水平，显著提高抗炎因子IL-10的水平。在肠道微生物方面，副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物改善了肠道菌群稳态，增强肠道屏障，显著提高了乳酸菌的丰度。以上说明本发明的副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物可以显著改善IBD带来的肠道损伤，可以作为一种具有良好治疗IBD的药品。

生物材料保藏：

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。

附图说明：

图1为小鼠粪便含水量和小鼠结肠组织长度变化。###与正常组比较P＜0.001；***与模型组相比较，P＜0.001；**与模型组相比较，P＜0.01；*与模型组比较，P＜0.05；

图2为各组小鼠血清细胞因子水平的统计结果。细胞因子(a)TNF-α、(b)IL-6、(c)IL-17和IL-23(d)的基因表达量变化。###与正常组比较P＜0.001；##与正常组比较P＜0.01；***与模型组相比较，P＜0.001；**与模型组相比较，P＜0.01；*与模型组比较，P＜0.05；

图3为肠道菌群组成结构变化，图中微生物对应图例由上向下顺序区分。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

MRS固体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K₂HPO₄·3H₂O 2.6g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；MnSO₄·4H₂O 0.05g；吐温801mL；1.5～2％的琼脂粉。pH调节6.8±0.2；定容至1L。

MRS液体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K₂HPO₄·3H₂O 2.6g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；MnSO₄·4H₂O 0.05g；吐温80 1mL。pH调节6.8±0.2；定容至1L。

LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，超纯1.0L，调节pH至7.4。

在本发明实施例中，所添加的膳食纤维是抗性糊精和低聚木糖按照质量比1:1混合得到，维生素是维生素A和维生素E按照质量比1:1混合得到。

实施例1：

本发明所采用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。

该副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1的性能测试如下：

菌株的人工胃肠液抗性实验：

1、模拟唾液、胃液和肠液的制备：

(1)胃肠储备液的制备(见表1)

表1模拟唾液，胃液和肠液制备

药品	储备液浓度(mol/L)	胃液盐浓度(mmol/L)	肠液盐浓度(mmol/L)
				KCl	0.5	6.9	6.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.5	0.9	0.8
				NaHCO<sub>3</sub>	1	25	85
NaCl	2	47.2	38.4
				MgCl<sub>2</sub>(H<sub>2</sub>O)<sub>6</sub>	0.15	0.12	0.33
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>	0.5	0.5	-
				HCl	6	15.6	8.4
CaCl<sub>2</sub>(H2O)2<sup>a</sup>	0.3	0.15	0.6

^a在使用前添加CaCl₂(H₂O)₂

(2)调节pH：利用NaOH溶液或HCl溶液调节SGF溶液pH至3；SIF溶液pH调节至7。

(3)SGF溶液中添加胃蛋白酶溶液和胃脂肪酶溶液，最终混合物的活性分别达到2,000U/mL和60-75U/mL；SIF溶液中添加胰蛋白酶，最终混合物的活性分别达到100U/mL。

(4)在实验过程中保持37℃的温度，不断搅拌，可以用来模拟胃肠的蠕动。

2、胃肠液抗性实验操作

乳酸菌菌液以10％的接种量接种到SGF中，置37℃厌氧培养，分别在0h和3h时，取样测定OD₆₀₀计算各菌种的存活率(％)。吸取经人工胃液处理3h后的菌液，接种于无菌的SIF中，静置于37℃厌氧培养，在0h，3h取样测定OD₆₀₀。存活率＝A₁/A₀×100％

3、按照以上操作步骤对鼠李糖乳杆菌CICC6001，副干酪乳杆菌JN-1，副干酪乳杆菌CICC 6244和植物乳杆菌CICC 21794进行胃肠液抗性实验。结果见表2，菌株JN-1的存活率大大高于其他菌株，显示出更强的胃肠液抗性。

表2乳酸菌落对人工胃肠液的耐受性结果

菌株的对胆盐的耐受性实验：

1、含胆盐的MRS培养基配置：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K₂HPO₄·3H₂O 2.6g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；MnSO₄·4H₂O 0.05g；吐温801mL，定容至1L。胆盐分别添加0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％和0.6％。

2、耐胆盐实验步骤：将乳酸菌按2％的接种量分别接种于含不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，放置于37℃厌氧培养，24h分别测定OD600。以胆盐耐受能力(Ability BileSalts,ABS)作为乳酸菌的胆盐耐受能力的评价指标，ABS用以下公式表示：

式中：μ_mBS为乳酸菌在不同浓度胆盐的培养基中培养24h的OD600值；μ_m为乳酸菌不含胆盐培养24h的OD600值。

3、耐胆盐实验结果见表3，与其他菌株相比，JN-1展现出更强的耐胆盐特性见表3，与其他菌株相比，JN-1展现出更强的耐胆盐特性。

表3乳酸菌样品A_BS测定结果

体外抑制金黄色葡萄球菌实验：

(1)LB培养基的配置：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，超纯1.0L，调节pH至7.4。121℃灭菌15min后备用。

(2)金黄色葡萄球菌菌液的制备：将金黄色葡萄球菌CICC10307按2％的接种量接种于LB液体培养基中，于37℃恒温振荡培养24h，经传代后继续以37℃恒温培养，获得活性较高的菌液。

(3)无细胞上清液的制备：乳酸菌按2％接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃恒温环境培养24h，将菌液通过12,000r/min，离心15min，过滤，获得无细胞上清液，放于-80℃冰箱保藏。

(4)对照组和乳酸菌组分别以LB培养基和无细胞上清液培养金黄色葡萄球菌。空白组不接种金黄色葡萄球菌，实验组按培养基3％的接种量接种金黄色葡萄球菌，每株分离菌株设置三组平行实验。37℃恒温静置培养，分别测定空白组与实验组0h和24h的OD600，计算金黄色葡萄球菌的增长率。

金黄色葡萄球菌的抑菌性实验，结果见表4。空白组的OD₆₀₀增长率高达84.7％；相较于其他菌株，副干酪乳杆菌JN-1无细胞上清液对金黄色葡萄球菌均呈现出明显的抑菌效应，表现出较好的抑制作用。

表4抑菌性实验结果

该副干酪乳杆菌JN-1具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力。

实施例2：

一种缓解炎症性结肠炎的副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物的制备方法如下：

(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；

(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；

(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以2％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，得到发酵液；

(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-1的菌体；

(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入8％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌JN-1的活菌数为1×10⁹CFU/g；

(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉60份，膳食纤维20份，维生素10份，混合，制成缓解炎症性结肠炎的副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物。

实施例3：

(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以3％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养22h，得到发酵液；

(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入9％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌JN-1的活菌数为1×10⁸CFU/g；

(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉60份，膳食纤维25份，维生素5份，混合，制成缓解炎症性结肠炎的副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物。

实施例4：

(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以4％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，得到发酵液；

(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉40份，膳食纤维20份，维生素10份，混合，制成缓解炎症性结肠炎的副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物。

对比例1：

一种副干酪乳杆菌CICC20355菌粉组合物的制备方法如下：

(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌CICC20355接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；

(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌CICC20355单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；

(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以4％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养20h，得到发酵液；

(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌CICC20355的菌体；

(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入9％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌CICC20355的活菌数为1×10⁸CFU/g；

(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：冻干菌粉40份，膳食纤维20份，维生素10份，混合，制成副干酪乳杆菌CICC20355菌粉组合物。

试验例：

缓解炎症性结肠炎的应用性能

1实验方案

C57BL/6小鼠，5～6周雄性，60只。

实施例1、实施例2、实施例3、对比例1的制得菌粉组合物和发酵食品(由本单位生产)、葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)。

将小鼠随机分成6组，每组10只，分为正常组、模型组、给药组1、给药组2、给药组3、给药组4，分组及给药关系如表5所示：

表5分组及给药情况

小鼠在第0-7天内自由饮用普通饮用水，在第8-14天，除正常组外，其他组小鼠自由饮用2.5％DSS水溶液。在第1-14天，给药组1,2,3,4小鼠每天灌胃一次0.5g/kg菌粉组合物，正常组和模型组小鼠每天灌胃一次等量无菌水。在第14天对小鼠进行麻醉后将小鼠牺牲，收集小鼠结肠，盲肠内容物及粪便。统计小鼠粪便含水量，检测小鼠结肠组织长度变化，检测结肠中细胞因子的水平及肠道菌群变化。

2、实验方法

2.1检测粪便含水量

收集小鼠粪便，进行称重。在105℃条件下对粪便进行烘干，再次称量烘干后的粪便重量。粪便含水量(重量％)＝(原粪便重-烘干粪便重)/烘干粪便重*100％。

2.2RNA提取

(1)取小鼠结肠组织约100mg放入2ml EP管中，每管加入约10颗陶瓷珠，使用预冷的MP震荡仪震荡至组织破碎完全。

(2)每1ml的样品加入200μL的三氯甲烷，剧烈震荡EP管，让样品完全乳化。EP管置于室温下10min，将离心机预冷到4℃，样品12000g离心15min。取最上层的上清液。

(3)吸取一定量(400μL)上清液，加入去RNA酶的1.5mL的EP管中。向管中加入等量的异丙醇，轻柔的颠倒EP管，使样品混匀。将样品放于冰上静置10min，以便于RNA沉降。用预冷的离心机12000g离心10min，取出后可在管底观察到白色沉淀。

(4)配置75％的乙醇(用DEPC水配)，将离心结束后的上层液体吸净，每个EP管中加入1mL预先配好的75％乙醇。小心弹动管体，使白色沉淀脱离管底，预冷离心机，7500g转速下离心5min。

(6)离心结束后，将EP管中上清吸净，通风干燥至管中的白色沉淀物干燥至透明状态。

(7)每个EP管中加入20μL RNase-free水，轻弹EP管使沉淀溶解。RNA完全溶解后放置冰上静置30min。

(8)将RNA 65℃金属浴5min。

(9)提取RNA结束后检测提取的RNA的质量，可以用OD 260/OD 280代表纯度，OD260/OD 280在1.8-2.0之间即代表RNA纯度合格。

2.3逆转录-cDNA的制备

准备好RNA，按照表6所示添加各种试剂和酶。

表6逆转录反应体系

反应体系加好后，按表7所示的反应程序进行反应，得到cDNA。

表7逆转录反应程序

2.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

实验涉及到的相关基因的引物序列，如表8所示，荧光定量PCR采用17μL总体系，cDNA溶液浓度为1μg/μL。按表9所示准备好进行荧光定量PCR的反应体系，反应程序如表10所示。以Gapdh为标准利用2^-ΔΔCT方法分析目标基因的相对表达量。

表8引物序列

表9荧光定量PCR反应体系

表10荧光定量PCR程序

2.5小鼠肠道微生物16S rRNA基因分析

(1)实验流程：为了探索小鼠肠道菌群的分类学组成，我们选择了16S rRNA基因的V3-V4区域进行测序。取30ng DNA，使用细菌引物341F和806R(5‘-ACT CCT ACG GGA GGCAGC AG-3‘，5‘-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3‘)进行PCR扩增，PCR产物使用1.5％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent 2100Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序。

(2)信息分析流程：下机数据过滤，获得高质量的有效数据(Clean Reads)；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成Tags；利用软件USEARCH(v7.0.1090)将拼接好的相似度在97％的以上的Tags聚类为OTU(Operational Taxonomic Unit)，与数据库比对进行物种注释。其中OTU水平上的α和β多样性是利用MOTUUR(v1.31.2)评估的，相对丰度热图使用R软件包“gplots”绘制，主成分分析(PCA)图是由R软件包“ade4”绘制，LEfSe聚类或LDA是利用LEfSe软件进行分析的，OTU网络分析是使用R(v3.4.1)和Cytoscape进行的，功能预测利用Picrust分析的。

3、实验结果

在灌胃终点，我们统计了各组小鼠粪便含水量和结肠长度。如图1所示，结果显示，与模型组相比，给药组1,2,3降低了炎症性结肠炎小鼠粪便含水量，增加了小鼠的结肠长度。以上结果说明实施例2,3,4菌粉组合物改善了小鼠炎症性结肠炎。

进一步地，对小鼠结肠组织中细胞因子的表达水平进行分析。模型组小鼠结肠组织中多种细胞炎症因子基因表达上调。如图2所示，与模型组相比，这些细胞炎症因子基因在给药组中显著下降或存在下降趋势。其中，给药组1,2,3小鼠的TNF-α、IL-6、IL-17和IL-23mRNA相对表达量显著下调，给药组4小鼠的细胞因子mRNA相对表达量下调不显著。这表明实施例2,3,4菌粉组合物显著改善了炎症性结肠炎小鼠的肠道炎症。

为了分析各菌剂对肠道菌群的影响，利用16S rRNA基因高通量测序对小鼠盲肠内容物进行了分析。多样性指数Chao指数、ACE指数、Shannon指数表征了小鼠肠道微生物的丰度和多样性。如表11所示，给药组1,2,3可显著提高DSS诱导的结肠炎症小鼠肠道菌群的丰富度和多样性。给药组4与模型组相比，多样性指数也有增加但不显著。表明实施例2,3,4菌粉组合物可以显著缓解炎症性结肠炎。

表11肠道菌群多样性变化

进一步地，分析了肠道微生物的组成，结果如图3所示。在门水平上，拟杆菌门(Bacteroidetes)是所有小鼠肠道微生物中丰度最高的菌门，其次是厚壁菌门(Firmicutes)。在属水平上，肠道微生物中的乳酸杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度变化显著。与正常组小鼠肠道菌群比，模型组显著升高了厚壁菌门和脱硫弧菌属的水平，显著降低了Bacteroidetes，Lactobacillus和Akkermansia的水平，给药组1,2,3可显著逆转这一变化，给药组4改善的效果不大。以上结果表明实施例2,3,4菌粉组合物可以改善显著炎症性结肠炎小鼠的肠道菌群结构进而起到缓解炎症性结肠炎的作用。

综上可知，副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物能够显著缓解炎症性结肠炎。其能降低小鼠肠道损伤及腹泻情况，显著降低小鼠结肠细胞因子的水平。

进一步地，对小鼠肠道微生物进行分析，结果表明副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物显著增加肠道微生物的丰富度和多样性。在肠道微生物的组成方面，降低厚壁菌门和脱硫弧菌属的相对丰富度，显著增加乳酸杆菌属的相对丰富度，显著改善肠道微生物的组成，进而显著缓解炎症性结肠炎。以上结果说明副干酪乳杆菌JN-1菌粉组合物具有显著缓解炎症性结肠炎效果，可以作为一种具有缓解炎症性结肠炎效果的药品。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，其特征在于，所述的菌粉组合物包括副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）JN-1冻干菌粉、膳食纤维和维生素，其中，所述的副干酪乳杆菌JN-1于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。

2.根据权利要求1所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，其特征在于，按重量份计，所述的菌粉组合物包括40~60份副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉、20~30份膳食纤维和5~10份维生素。

3.根据权利要求2所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中活菌数不低于1×10⁸ CFU/g。

4.根据权利要求3所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中还包括占副干酪乳杆菌JN-1菌体质量8~10%的脱脂奶粉。

5.根据权利要求1所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，其特征在于，所述的膳食纤维为抗性糊精、低聚木糖、半乳糖寡糖、苹果果胶、柑橘果胶、魔芋、菊粉、燕麦麸中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物，其特征在于，所述的维生素为维生素C、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素A、维生素D、维生素D3、叶酸、维生素K中的一种或多种。

7.一种权利要求1~6任一项所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）将所述的副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，35~38℃培养24~48h，获得菌株单菌落；

（2）挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，35~38℃厌氧培养20~28 h，得到初级种子液；

（3）将初级种子液以2~4%的接种量接种于液体MRS培养基中，35~38℃厌氧培养20~28h，得到发酵液；

（4）将得到的发酵液2000~6000 rpm/min离心5~20 min，收集并洗涤菌体，得到副干酪乳杆菌JN-1菌体；

（5）向收集到的副干酪乳杆菌JN-1菌体中加入脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉；

（6）按照重量份的原料，将副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉、膳食纤维和维生素混合，制成所述的缓解炎症性结肠炎的菌粉组合物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，脱脂奶粉的添加量为副干酪乳杆菌JN-1菌体质量的8~10%。

9.一种权利要求1~6任一项所述的菌粉组合物在制备治疗炎症性结肠炎的产品中的应用，所述的产品为药品。