[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN114096271A - β-淀粉酶变体 - Google Patents

β-淀粉酶变体 Download PDF

Info

Publication number
CN114096271A
CN114096271A CN202080030423.1A CN202080030423A CN114096271A CN 114096271 A CN114096271 A CN 114096271A CN 202080030423 A CN202080030423 A CN 202080030423A CN 114096271 A CN114096271 A CN 114096271A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
variant polypeptide
polypeptide
asn
amylase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202080030423.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114096271B (zh
Inventor
H·乌尔维纳
K·W·常
T·德兰
G·N·L·洛
A·休斯顿达文波特
谭旭秋
李侗
S·耶内魏因
S·泽迈尔
J·库切尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to CN202410340644.9A priority Critical patent/CN118086254A/zh
Publication of CN114096271A publication Critical patent/CN114096271A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114096271B publication Critical patent/CN114096271B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/104—Fermentation of farinaceous cereal or cereal material; Addition of enzymes or microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01002—Beta-amylase (3.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Paper (AREA)

Abstract

本发明涉及在热处理后与亲本β‑淀粉酶相比具有增加的％残余外淀粉酶活性的β‑淀粉酶变体。本发明还涉及制备变异β‑淀粉酶的方法以及变异β‑淀粉酶在烘焙、洗涤剂、个人护理产品中，在纺织品加工中，在纸浆和纸张加工中，在生产乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆中，以及在油田和采矿业中用作降粘剂的用途。

Description

β-淀粉酶变体
技术领域
本发明涉及在热处理后与亲本β-淀粉酶相比具有增加的％残余外淀粉酶(exoamylase)活性的β-淀粉酶变体。本发明还涉及制备变异β-淀粉酶的方法以及变异β-淀粉酶在烘焙、洗涤剂、个人护理产品中，在纺织品加工中，在纸浆和纸张加工中，在生产乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆中，以及在油田和采矿业中用作降粘剂的用途。
背景技术
数千年来，面包一直是人类营养的主食。面包通常是通过将面粉、水、盐、酵母和/或其它食品添加剂组合来制作面团或糊状物而制成的；然后将面团烘焙，制作面包。已知酶在烘焙中有用，因为酶对烘焙过程的作用可能与化学替代物的作用相比类似或更好。可以使用几种不同的酶来制作面包，例如，已知淀粉酶有助于随着时间的流逝维持新鲜感(抗老化或硬度)并且随着时间的流逝维持弹性。面包老化是由烘焙后淀粉颗粒中发生支链淀粉结晶引起的。当面包老化时，它失去面包屑的柔软度和水分，变得不那么有弹性。
因此，仍需要历经比现有时间更长的时间可以提供新鲜面包的淀粉酶，或随着时间流逝可以提供比新鲜面包还要好的面包的淀粉酶。
解决这一问题的解决方案是具有满足或超过这些工业要求的β-淀粉酶活性的变异多肽。另外，β-淀粉酶变体可以在动物饲料、洗涤剂、个人护理产品、织物处理、纸浆和纸处理中、在乙醇生产中、在木质纤维素乙醇生产中、在糖浆生产中使用或在油田和采矿工业中用作降粘剂。
发明内容
本发明人惊奇地发现，与亲本酶的活性相比，在β-淀粉酶的氨基酸序列中引入氨基酸修饰增加了变体的外淀粉酶活性。
因此，本发明涉及具有β-淀粉酶活性并包含与根据SEQ ID No.1的序列至少80％相同的氨基酸序列的根据SEQ ID No.1的β-淀粉酶的变异多肽，该氨基酸序列包含氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P和在SEQ ID No.1的编号中在选自以下的氨基酸残基位置编号处的至少第一个进一步的氨基酸修饰：13、90、91、131、132、148、196、198、205、206、208、209、210、214、222、236、239、251、269、276、318、375、419、435、438、463、469、494、499、502和519或其组合。
在一个实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合。
在一个实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代，并且氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代：P13S、T90D、V91C、Q131K、L132E、K148E、N196I、M198I、I205K、A206G/M/N/W、V208C、N209D、S210V、T214H、I222C、Y236I、T239S、V251S/T、P269G/S、G276D、M318L、C375I/V、N419C/D/E/G、Y435E/P、N438A/K/M/Q/Y和P463D/E/I/K/Q/T/V/Y、T469I/V、T494E、S499P、T502E、N519D或其组合。
在一个实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代的组合：
(a)K148E、N438A；
(b)P13S、Y236I；
(c)T239S、N519D；
(d)T469I、S499P；
(e)V208C、G276D；
(f)L132E、Q131K；
(g)T90D、V91C；
(h)T494E、T502E；和
(i)N419G、T494E、T502E。
在一个实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1编号中的N419、T494E、T502，并且多肽包含至少第二个进一步的氨基酸修饰。
在一个实施方案中，第二个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合。
在一个实施方案中，第二个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代，并且氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，第二个进一步的氨基酸修饰是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代：P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435P/E、N438K和P463T或其组合。
在一个实施方案中，第二个进一步的一个氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代的组合：
(j)A206W、V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(k)P13S、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(l)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435E、N438K、P463T；
(m)V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(n)V208C、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(o)A206W、V208C、G276D、C375I、Y435E、N438K、P463T；
(p)A206W、V208C、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(q)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(r)A206W、V208C、G276D、M318L、Y435E、N438K、P463T；
(s)A206W、V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、P463T；
(t)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(u)P13S、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(v)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(w)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、C375I、Y435P、P463T；
(x)V208C、G276D、M318L、Y435P；
(y)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、P463T；
(z)A206W、V208C、G276D、M318L、P463T；
(aa)P13S、V208C、Y236I、G276D、N438K、P463T；
(bb)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L；
(cc)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D；
(dd)G276D、N419G、T494E、T502E；
(ee)C375I、N419G、T494E、T502E；
(ff)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D；
(gg)T90D、V91C、P269S、C375I；和
(hh)T90D、V91C、P269S、G276D、C375I。
在一个实施方案中，与SEQ ID No.1或2的多肽相比，变异多肽在暴露于80至95摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
在一个实施方案中，与SEQ ID No.1或2的多肽相比，变异多肽在暴露于86摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
在一个实施方案中，与SEQ ID No.1、2或3的多肽相比，变异多肽在暴露于90摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
在一个实施方案中，与SEQ ID No.1或2的多肽相比，变异多肽在pH 4.5-6和80-85摄氏度的温度下具有增加的活性。
在一个实施方案中，变异多肽具有β-淀粉酶活性并且是全长氨基酸序列的片段。
在一个实施方案中，变异多肽包含根据前述实施方案中任一项的至少一种变异多肽与具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有β-淀粉酶活性。
本发明进一步涉及包含根据前述实施方案中任一项的变异多肽的组合物。
在一个实施方案中，该组合物进一步包含第二酶。
在一个实施方案中，第二酶选自：α-淀粉酶、脂肪酶、第二β-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。
本发明还涉及一种制造变异多肽的方法，其包含：提供编码本发明的多肽变体的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化到表达宿主中，培育所述表达宿主以产生所述变异多肽，并且纯化所述变异多肽。
在一种实施方案中，所述表达宿主选自由以下组成的组：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。
在一种实施方案中，所述细菌表达系统选自大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。
在一种实施方案中，所述酵母表达系统选自念珠菌(Candida)、毕赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。
在一种实施方案中，所述真菌表达系统选自青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、镰刀霉(Fusarium)、毁丝霉(Myceliopthora)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、嗜热真菌(Thermomyces)和木霉(Trichoderma)。
本发明还涉及一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将本发明变异多肽添加到面团中，并且最终将面团烘焙。
在一个实施方案中，与通过其中不添加变异多肽的其他相同方法生产的烘焙产品相比，由前述方法生产的烘焙产品在储存10天后表现出更低的硬度和更大的弹性。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于加工淀粉的用途。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的用途。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于制备乙醇的用途。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于处理油井的用途。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于加工纸浆或纸的用途。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于喂养动物的用途。
本发明进一步涉及本发明变异多肽用于制备糖浆的用途。
附图说明
图1A、1B和1C：不同变异多肽以及中间亲本多肽(SEQ ID No.2)在pH 5.5下的温度曲线。如实施例4中所述，通过PAHBAH测定测量外淀粉酶活性。
图2A、2B和2C：不同变异多肽以及中间亲本多肽(SEQ ID No.2)在80℃下的pH曲线。如实施例5中所述，通过PAHBAH测定测量外淀粉酶活性。
图3:10天后，通过全质构分析(TPA)测量的具有或不具有变异酶或Novamyl 3D对照的面包的弹性和硬度，如实施例6所示。
具体实施方式
尽管将针对特定实施方案描述本发明，但是该描述不应被理解为限制性的。
在详细描述本发明的示例性实施方案之前，给出对于理解本发明而言重要的定义。除非另有说明或从定义的性质显而易见，否则这些定义适用于本文所述的所有方法和用途。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个/种(a/an)”也包含各自的复数，除非上下文另外明确指出。在本发明的上下文中，术语“约(about)”和“大约(approximately)”表示本领域技术人员将理解以仍然确保所讨论特征的技术效果的精度范围。该术语通常表示与所指示的数值的偏差为±20％，优选地为±15％，更优选地为±10％，并且甚至更优选地为±5％。
应当理解，术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中组被定义为包含至少一定数量的实施方案，则这意味着还涵盖优选地仅由这些实施方案组成的组。
此外，说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分相似要素，而不一定用于描述顺序或时间次序。应当理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或说明的其它顺序操作。在术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”“(b)”“(c)”“(d)”、“i”、“ii”等涉及方法或用途或测定的步骤的情况下，步骤之间不存在时间或时间间隔的连贯性，即，这些步骤可以同时执行，或者在这些步骤之间可能存在几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周、几个月甚至几年的时间间隔，除非在上文或下文中提出的申请中另有说明。
应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
如上所述，本发明基于以下发现：与亲本β-淀粉酶相比，β-淀粉酶的变体具有增加的外淀粉酶活性。在烘焙应用中，外淀粉酶活性是优选的，因为它完成了导致抗老化作用的淀粉降解，但不会对最终烘焙产品的质量产生负面影响。相反，内淀粉酶活性会对最终烘焙产品的质量产生负面影响，因为它会导致支化糊精的积累，这例如导致产生粘性或胶状面包屑。
“变异多肽”是指在其氨基酸序列中与其亲本多肽不同的酶。“变异β-淀粉酶”是指在其氨基酸序列方面与其亲本β-淀粉酶不同并具有β-淀粉酶活性的β-淀粉酶。根据IUPAC关于单个字母或三个字母的氨基酸缩写的建议，使用单氨基酸分子的命名法和缩写来描述变异多肽。
“亲本”多肽氨基酸序列是用于向序列中引入氨基酸修饰(例如，通过引入一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其组合)，从而产生亲本多肽氨基酸序列的“变体”的起始序列。亲本多肽包括野生型多肽氨基酸序列或合成产生的多肽氨基酸序列二者，其用作引入(其它)变化的起始序列。在本发明中，亲本多肽优选为具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽。或者，亲本多肽可以是包含与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列并且与根据SEQ ID No.1的序列相比在任何以下氨基酸残基处没有氨基酸修饰的多肽：13、25、27、90、91、131、132、148、185、196、198、205、206、208、209、210、214、220、222、236、239、251、269、276、318、364、369、375、389、419、435、438、463、469、494、499、502和519。根据SEQ ID No.1的亲本多肽描述于KITAMOTO,“Cloning and Sequencing of the GeneEncoding Thermophilic B-amylase of Clostridium Thermosulfurogenes”(1988)J.Bacteriology Vol.170,p.5848-5854；NCBI_P19584.1是AAA23204.1。
“中间亲本”多肽氨基酸序列在本文中指具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的多肽。它与SEQ ID No.1的不同之处在于它包含氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P。
也称为1,4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶、糖原酶和糖原淀粉酶的β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是在多糖中预形成(1->4)-α-D-糖苷键的水解以从链的非还原端去除连续的麦芽糖单元的酶。它们作用于例如淀粉、糖原和相关多糖以及寡糖，并通过反转产生β-麦芽糖。β-淀粉酶广泛用于制造焦糖、麦芽糖、麦芽糊精和酿造啤酒、酒精和醋的发酵工业。
β-淀粉酶的特征在于高等植物和微生物来源，例如来自微生物来源的β-淀粉酶包括来自以下的那些：嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(美国专利4,970,158)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)(Matsunaga,Okada和Yamagat,H.和Tsukagishi,N.1987，《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》(169)1564-1570和美国专利8,486,682。来自微生物来源的其它β-淀粉酶是来自以下的那些：热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)(Kitaoto,1988,Kitamoto,N.,Yamagata,H.,Kato,T.,Tsukagoshi,N.和Udaka,S.1998.《细菌学杂志》(170)5848-5854)、美国专利申请公开案2012/0225164、WO2015/021600、WO2015/021601、EP0337090A1)和热硫化氢嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)(JP01218589)。基于源自热硫梭菌的β-淀粉酶，研发出耐酸性β-淀粉酶(CN103695386和CN 103881993)。另外，淀粉酶公开于例如WO2002/068589、WO2002/068597、WO2003/083054、WO2004/042006、WO2008/080093、WO2013/116175和WO2017/106633。
用于食品处理和烘焙的市售淀粉酶包括：来自AB酶(AB Enzymes)的
Figure GDA0003482057630000081
可购自DSM的
Figure GDA0003482057630000082
和
Figure GDA0003482057630000083
可购自杜邦(DuPont)的
Figure GDA0003482057630000084
Max-LIFETM、
Figure GDA0003482057630000085
和
Figure GDA0003482057630000086
和可购自诺维信(Novozymes)的
Figure GDA0003482057630000087
Figure GDA0003482057630000088
和
Figure GDA0003482057630000089
β-淀粉酶活性可以通过本领域技术人员已知的各种测定来测定，包括BCA还原末端测定(BCA Reducing Ends Assay)(Smith,P.K.(1985)Anal.Biochem.150(1):76–85)、PAHBAH测定(Lever(1972)Anal.Biochem.47:273-279)、碘测定法(Fuwa(1954)J.Biochem.41:583-603)、可从Megazyme获得的Betamyl-3测定法。
本发明的变异多肽的特征在于，与亲本多肽相比，优选与具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽相比，以及与具有根据SEQ ID No.2的氨基酸序列的多肽相比，它们具有增加的％残余外淀粉酶活性。优选地，本发明的变异多肽的特征还在于，与具有根据SEQ IDNo.3的氨基酸序列的多肽相比，它们具有增加的％残余外淀粉酶活性。术语“外淀粉酶活性”旨在表示淀粉分子从上述底物的非还原端裂解。相反，“内淀粉酶活性”是指淀粉分子内的α-D-(1->4)-O-糖苷键以随机方式裂解。术语“％残余活性”是指与未经历热处理的参考样品相比，在变体或亲本多肽热灭活一定时间后仍表现出的外淀粉酶活性的百分比。
通过在热处理之前和之后测量多肽(例如变异多肽、亲本多肽、中间亲本多肽)的活性，例如通过PAHBAH测定法(见上文)，确定％残余外淀粉酶活性。然后将热处理后观察到的活性表示为热处理前观察到的活性的百分比。
增加的％残余外淀粉酶活性意味着变异多肽的％残余活性高于亲本或中间亲本多肽的％残余活性。在本文的实施例部分中提供了这种确定的实例。
“序列同一性”、“％序列同一性”、“％同一性”、“％相同”或“序列比对”是指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较或第一核酸序列与第二核酸序列的比较，并基于该比较计算为百分比。这一计算结果可以描述为“相同百分比”或“ID百分比”。
通常，序列比对可用于通过两种不同方法之一来计算序列同一性。在第一种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置的不匹配项和单个位置的空位均计为不相同位置。在第二种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置的不匹配项计为不相同位置；然而，在最终序列同一性计算中，单个位置的空位不计为(忽略)不相同位置。换句话说，在第二种方法中，在最终序列同一性计算中忽略空位。这两种方法之间的差异(即，将空位计为不相同位置而不是忽略空位)可能会导致两个序列之间的序列同一性值发生变化。
序列同一性由程序确定，所述程序产生比对，并且在最终序列同一性计算中将单个位置的不匹配项和单个位置的空位均计为不相同位置，从而计算同一性。举例来说，程序Needle(EMBOS)，所述程序已实施Needleman和Wunsch的算法(Needleman and Wunsch,1970,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443-453)，并且所述程序通过首先产生第一个序列与第二序列之间的比对，然后计数比对长度上相同位置的数目，然后将相同残基的数目除以比对长度，然后将这一数字乘以100以产生序列同一性％[序列同一性％＝(相同残基数/比对长度)×100)]来计算序列同一性。
可以根据成对的比对计算出序列同一性，所述成对的比对显示全长上的两个序列，因此显示出其全长上的第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。举例来说，程序Needle(EMBOSS)产生这样的比对；序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。
可以根据仅显示第一序列或第二序列的局部区域的成对的比对计算序列同一性(“局部同一性”)。举例来说，程序Blast(NCBI)产生这样的比对；序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。
计算序列比对，其中将单个位置的不匹配计为最终序列同一性计算中的不相同位置；然而，在最终序列同一性计算中，将单个位置的缺口不计为(忽略)不相同位置。序列比对通过使用Needleman和Wunsch的算法(《分子生物学杂志》(1979)48,第443-453页)产生。优选地，程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular BiologyOpen Software Suite；EMBOSS))与程序默认参数(缺口开放＝10.0，缺口延伸＝0.5和矩阵＝EBLOSUM62)一起使用。然后，可以根据比对计算出序列同一性，所述比对显示全长上的两个序列，因此显示出其全长上的第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。举例来说：序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。
通过参考与各个亲本酶的氨基酸序列具有至少n％同一性的氨基酸序列来描述变异多肽，其中“n”是介于80和100之间的整数。变异多肽包含与根据SEQ ID No.1的亲本β-淀粉酶的全长氨基酸序列相比时具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的酶，其中与根据SEQ ID No.1的亲本多肽和根据SEQ ID No.2的多肽相比，该酶变体具有β-淀粉酶活性以及增加的％残余外淀粉酶活性。
变异多肽包含在SEQ ID No.1编号中的氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P和与亲本多肽，优选根据SEQ ID No.1的多肽相比至少第一个进一步的氨基酸修饰。即，除了氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P之外，在不同位置处的至少一个进一步的氨基酸被修饰。术语“氨基酸修饰”是指与亲本多肽，优选根据SEQ ID No.1的多肽的氨基酸序列相比，变异多肽的氨基酸序列被修饰。术语“氨基酸修饰”不旨在包括对氨基酸残基本身的修饰，例如但不限于磷酸化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、乙酰化、烷基化、酰胺化、γ-羧化或糖基化。术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、氨基酸插入和氨基酸缺失。因此，与亲本多肽，优选根据SEQ ID No.1的多肽相比，本发明的变异多肽包含至少第一个进一步的氨基酸取代、氨基酸插入和/或氨基酸缺失。优选地，所述至少第一个进一步的氨基酸修饰是至少一个氨基酸取代。
“氨基酸取代”是通过提供亲本多肽中的原始氨基酸残基，然后是该氨基酸残基在氨基酸序列中的位置编号来描述的。举例来说，氨基酸残基13的取代是指在位置13处的亲本的氨基酸可以被19个其它氨基酸残基中的任一者取代并且被命名为P13。另外，可以通过提供在亲本多肽中原始氨基酸残基，然后是该氨基酸残基在氨基酸序列内的位置编号，并且然后是在变异多肽中特定取代的氨基酸来描述取代。例如，位置22的甘氨酸被谷氨酰胺取代被命名为“Pro12Ser”或“P13S”。如果在位置编号之后有不止一个特定的氨基酸取代，例如“C375I/V”，则在指定位置(此处：位置375)处的亲本氨基酸(此处：半胱氨酸)可以被任何一个列出的取代氨基酸(此处：异亮氨酸或缬氨酸)取代。取代的组合通过在氨基酸残基之间插入顿号来描述，例如：G22Q、P35K、S59P、W128Y、D256A；在与亲本多肽相比时表示五个不同氨基酸残基的取代的组合。在氨基酸水平上具有取代的变体由至少在编码取代的氨基酸残基的位置与编码亲本多肽的亲本核酸序列不同的核酸序列编码。
变异多肽中的氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”或“用相关氨基酸取代”意指用与亲本氨基酸序列相比在相同位置处具有类似特性的不同氨基酸残基置换氨基酸序列中的一个氨基酸残基。保守氨基酸取代的一些实例包括但不限于用不同的带正电氨基酸残基置换带正电氨基酸残基；用不同的极性氨基酸残基置换极性氨基酸残基；用不同的非极性氨基酸残基置换非极性氨基酸残基、用不同的碱性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基或用不同的芳香族氨基酸残基置换芳香族氨基酸残基。
下表中提供了保守氨基酸取代的列表(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds))。
Figure GDA0003482057630000121
“氨基酸插入”是通过提供氨基酸序列内插入氨基酸的位置编号，然后是撇号和特定插入的氨基酸残基来描述的。例如，在位置84后面插入丝氨酸被命名为“84'S”。在氨基酸水平上具有插入的变体由至少在编码插入的氨基酸残基的位置与编码亲本多肽的亲本核酸序列不同的核酸序列编码。
“氨基酸缺失”是通过提供氨基酸序列中缺失氨基酸残基的位置编号，然后是Δ和特定缺失的氨基酸残基来描述的。例如，位置10的甘氨酸的缺失被命名为“10ΔG”。在氨基酸水平上具有缺失的变体由至少在编码缺失的氨基酸残基的位置与编码亲本多肽的亲本核酸序列不同的核酸序列编码。
在一个实施方案中，变异多肽包含氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P和在SEQ ID No.1的编号中在选自以下的氨基酸残基位置编号处的至少第一个进一步的氨基酸修饰：13、90、91、131、132、148、185、196、198、205、206、208、209、210、214、222、236、239、251、269、276、318、375、419、435、438、463、469、494、499、502和519或其组合。
在一个实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合。例如，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代，并且氨基酸取代是保守氨基酸取代。优选地，第一个进一步的氨基酸修饰是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代：P13S、T90D、V91C、Q131K、L132E、K148E、C185S、N196I、M198I、I205K、A206G/M/N/W、V208C、N209D、S210V、T214H、I222C、Y236I、T239S、V251S/T、P269G/S、G276D、M318L、C375I/V、N419C/D/E/G、Y435E/P、N438A/K/M/Q/Y和P463D/E/I/K/Q/T/V/Y、T469I/V、T494E、S499P、T502E、N519D或其组合。
在更优选的实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代的组合：
(a)K148E、N438A；
(b)P13S、Y236I；
(c)T239S、N519D；
(d)T469I、S499P；
(e)V208C、G276D；
(f)L132E、Q131K；
(g)T90D、V91C；
(h)T494E、T502E；和
(i)N419G、T494E、T502E。
上述变异多肽的特征在于它们在暴露于80至95例如摄氏度，例如80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃的温度后，与SEQ ID No.1或2的多肽相比，具有增加的％残余活性。优选地，与SEQ ID No.1或2的多肽相比，上述变异多肽在暴露于86摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
在一个特别优选的实施方案中，第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1编号中的N419、T494E、T502，并且多肽包含至少第二个进一步的氨基酸修饰。即，除了氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、419、T494E和T502(如SEQ ID No.3所示)之外，在不同位置处的至少一个其他氨基酸被修饰。
在一个实施方案中，第二个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合。例如，第二个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代，并且其中氨基酸取代是保守氨基酸取代。优选地，第二个进一步的氨基酸修饰是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代：
P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435P/E、N438K和P463T或其组合。
在一个特别优选的实施方案中，第二个进一步的一个氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代的组合：
(j)A206W、V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(k)P13S、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(l)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435E、N438K、P463T；
(m)V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(n)V208C、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(o)A206W、V208C、G276D、C375I、Y435E、N438K、P463T；
(p)A206W、V208C、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(q)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(r)A206W、V208C、G276D、M318L、Y435E、N438K、P463T；
(s)A206W、V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、P463T；
(t)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(u)P13S、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(v)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(w)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、C375I、Y435P、P463T；
(x)V208C、G276D、M318L、Y435P；
(y)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、P463T；
(z)A206W、V208C、G276D、M318L、P463T；
(aa)P13S、V208C、Y236I、G276D、N438K、P463T；
(bb)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L；
(cc)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D；
(dd)G276D、N419G、T494E、T502E；
(ee)C375I、N419G、T494E、T502E；
(ff)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D；
(gg)T90D、V91C、P269S、C375I；和
(hh)T90D、V91C、P269S、G276D、C375I。
优选地，与SEQ ID No.1、2或3的多肽相比，包含第二个进一步氨基酸修饰的变异多肽在暴露于90摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
优选地，与SEQ ID No.1或2的多肽相比，包含第二个进一步氨基酸修饰的变异多肽在pH4.5-6和80-85摄氏度的温度例如80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、或85℃下具有增加的活性。
变异多肽可以是片段。β-淀粉酶的“片段”被理解为是指β-淀粉酶的较小部分，其由在β-淀粉酶的氨基酸序列中发现的连续氨基酸序列组成并且具有β-淀粉酶活性。技术人员知道，对于具有酶促活性的片段，该片段必须至少包含存在于β-淀粉酶催化中心的氨基酸。这些氨基酸对于给定的β-淀粉酶是已知的，或者可以由技术人员容易地鉴定，例如通过同源性筛选或诱变。此外，该片段必须包含指定的修饰残基。优选地，与根据SEQ ID No.1的全长多肽相比，β-淀粉酶的片段具有增加的％残余外淀粉酶活性。优选地，片段占根据SEQID No.1的全长多肽的氨基酸的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。
变异多肽可以包含至少一种变异多肽和具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有β-淀粉酶活性。例如，具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以是超过一种β-淀粉酶的杂合体。“杂合体”或“嵌合”或“融合蛋白”意指第一变异多肽β-淀粉酶的结构域与第二β-淀粉酶的结构域合并形成杂合体淀粉酶，并且杂合体具有β-淀粉酶活性。优选地，与根据SEQ ID No.1的多肽相比，杂合β-淀粉酶具有增加的％残余外淀粉酶活性。具有β淀粉酶活性的变异多肽的结构域可以与市售淀粉酶的结构域组合，所述市售淀粉酶例如可获自AB酶的
Figure GDA0003482057630000151
可购自DSM的
Figure GDA0003482057630000152
和
Figure GDA0003482057630000153
可购自杜邦的
Figure GDA0003482057630000154
Max-LIFETM、
Figure GDA0003482057630000155
和
Figure GDA0003482057630000156
和可购自诺维信的
Figure GDA0003482057630000157
和
Figure GDA0003482057630000158
另外，来自各种淀粉酶的结构域可以再合并到单一酶中，其中所述酶具有β-淀粉酶活性。优选地，与根据SEQ ID No.1的多肽相比，包含来自各种淀粉酶的结构域的杂合β-淀粉酶具有增加的％残余外淀粉酶活性。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以是“成熟多肽”。成熟多肽意指呈其最终形式的酶，所述形式包括任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短、N端修饰、C端修饰或信号序列缺失。成熟多肽可以视表达系统、载体、启动子和/或产生方法而变化。
“酶活性”意指酶发挥的至少一种催化作用。酶活性表示为每毫克酶的单位数(比活性)，或每分子酶每分钟转化的底物分子数(分子活性)。酶活性可以由酶的实际功能指定，并且在本发明中是指如上所述的β-淀粉酶活性。
在酶的储存或操作使用期间，酶活性发生变化。术语“酶稳定性”涉及在储存或操作期间酶活性随时间变化的保持率。
为了确定和量化在一定条件下随时间推移储存或使用的酶的催化活性的变化，在限定条件下在时间为零(100％)时并且在稍后的某个时间点(x％)测量“初始酶活性”。通过比较所测量的值，可以确定酶活性的潜在损失的程度。酶活性损失的程度决定酶的稳定性或非稳定性。
影响酶的酶活性和/或储存稳定性和/或操作稳定性的参数是例如pH、温度和氧化物质的存在。
“pH稳定性”是指蛋白质在特定pH范围内起作用的能力。通常，大多数酶都在较高或较低pH范围的条件下起作用。
变异多肽可在宽的pH范围内在约pH 4.0到约pH 12.0的范围内在任何单个点下具有活性。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在pH 4.0到pH 11.0、pH 4.0到pH 10.0、pH 4.0到pH9.0、pH 4.0到pH 8.0、pH 4.0到pH 7.0、pH 4.0到pH 6.0或pH 4.0到pH 5.0的范围内具有活性。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH9.0、pH 9.1、pH 9.2、pH 9.3、pH 9.4、pH 9.5、pH 9.6、pH 9.7、pH 9.8、pH 9.9、pH 10.0、pH10.1、pH 10.2、pH 10.3、pH 10.4、pH 10.5、pH 10.6、pH 10.7、pH 10.8、pH 10.9、pH 11.0、pH 11.1、pH 11.2、pH 11.3、pH 11.4、pH 11.5、pH 11.6、pH 11.7、pH 11.8、pH 11.9、pH12.0、pH 12.1、pH 12.2、pH 12.3、pH 12.4和pH 12.5、pH 12.6、pH 12.7、pH 12.8、pH 12.9和更高pH下具有活性。
术语“热稳定性(thermal stability/thermostability)”是指蛋白质在一定温度范围内起作用的能力。通常，大多数酶具有其起作用的有限温度范围。除了在中等范围温度(例如室温)下起作用的酶外，还存在能够在非常高或非常低的温度下起作用的酶。热稳定性的特征在于称为T50值(也称为半衰期)的内容。T50指示与未经历热处理的样品相比，在一定时间内热失活一段时间后仍有50％残余活性的温度。
术语“耐热性(thermal tolerance/thermotolerance)”是指蛋白质在暴露于特定温度(例如非常高或非常低的温度)后起作用的能力。耐热蛋白可能不会在暴露温度下起作用，但一旦恢复到有利的温度就会起作用，即展现出高的％残余活性。这在烘焙中尤为重要，烘焙过程中面团中的酶必须承受非常高的温度。因此，添加到面团中的β淀粉酶必须能够承受高烘焙温度，并且在烘焙产品冷却后，在较低温度下仍表现出活性以防止老化。
变异多肽可以在烘焙过程期间在任何时间所用的宽的温度范围内具有活性，其中所述温度是约20℃到约60℃的范围内的任一点。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、或20℃至25℃的温度范围内具有活性。优选地，具有β-淀粉酶活性的变异多肽在至少19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃的温度或更高温度下具有活性。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以单独或以酶的混合物形式使用或配制。
包含本发明的变异多肽的制剂可以是固体形式，例如粉末、冻干制剂、细粒、片剂、条棒、晶体、胶囊、丸剂、丸粒；或呈液体形式，例如呈水溶液、气溶胶、凝胶、糊状物、浆料、水性/油性乳剂、乳膏、胶囊或呈囊泡或胶束悬浮液。
本发明的变异多肽可以与至少一种其它酶组合使用。其它酶可以来自相同类别的酶，例如可以是第二β-淀粉酶。其它酶也可以来自不同类别的酶，例如可以是脂肪酶。与至少一种其它酶的组合可以是包含至少三种酶的组合物。三种酶可以来自同一类别的酶，例如组合可以包含本发明的变异多肽、第二淀粉酶和第三种淀粉酶；或者酶可以来自不同类别的酶，例如组合可以包含本发明的变异多肽、脂肪酶和木聚糖酶。
第二酶可以选自：第二β淀粉酶、α-淀粉酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶，也称为外麦芽四糖水解酶、G4-淀粉酶；葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，也称为产麦芽糖α-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶；内-1,4-β-木聚糖酶；木聚糖酶、纤维素酶、氧化还原酶；磷脂酶A1；磷脂酶A2；磷脂酶C；磷脂酶D；半乳糖脂酶、三酰基甘油脂肪酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、转谷氨酰胺酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、蛋白酶或其任何组合。酶组合可以包含本发明的变异多肽和脂肪酶，或者酶组合可以包含本发明的变异多肽、脂肪酶和木聚糖酶。
本发明还涉及包含本发明的变异多肽的组合物。
包含本发明变异多肽的组合物还可包含第二酶。
优选地，第二酶选自由以下组成的组：第二β-淀粉酶、脂肪酶、α-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。
本发明的组合物可用于制备烘焙产品。
在一个方面，本发明提供一种制造变异多肽的方法，其包含：提供编码多肽变体的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化到表达宿主中，培育所述表达宿主以产生所述变异多肽，并且纯化所述变异多肽。
优选地，根据本发明的变异β-淀粉酶是使用细菌、真菌、酵母或合成表达系统产生的重组蛋白。“表达系统”还指宿主微生物体、表达宿主、宿主细胞、生产生物体或生产菌株，并且这些术语中的每一个可以互换使用。表达系统的实例包括但不限于：黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、疏棉嗜热霉菌、尖镰孢菌、异孢镰刀菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、假单胞菌、优选荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、甲醇酵母(Pichia pastoris)(也称为法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophile)(C1)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、木霉、优选里氏木霉(Trichoderma reesei)和酵母、优选酿酒酵母(preferably Saccharomyces cerevisiae)。
“转化”是指通过本领域技术人员熟知的方法将外源DNA引入表达宿主中。
“纯化”是指通过本领域熟知的方法从变异多肽中去除表达宿主的其他细胞物质。
本发明还涉及一种制备面团的方法，该方法包括将本发明的变异多肽添加到面团中。
“面团”定义为面粉、盐、酵母和水的混合物，可以在烘焙之前将其揉捏、模制、塑形或卷起。另外，也可以使用其它成分，例如糖、人造奶油、鸡蛋、牛奶等。所述术语包括用于制备焙烤制品的面团，例如面包、面包卷、三明治面包、法式长棍面包、拖鞋面包、牛角面包、甜酵母面团等。
本发明还涉及一种制备由面团制备烘焙产品的方法，该方法包括将本发明的变异多肽加入面团并烘焙所述面团，从而制备烘焙产品。
术语“烘焙产品”包括但不限于例如以下的烘焙产品：面包、脆面包卷、三明治面包、圆面包、法式长棍面包(baguette)、拖鞋面包(ciabatta)、牛角面包(croissant)、面条、以及精美的面包制品、如甜甜圈、布里欧修(brioche)、史多伦(stollen)、蛋糕、玛芬蛋糕(muffin)等。
烘焙产品包括但不限于：面包、面包卷、圆面包、糕点、蛋糕、扁面包、批萨饼、口袋面包、威化饼、派皮馕、亚美尼亚脆饼(lavash)、皮塔饼、佛卡恰(focaccia)、酸面团、面条、曲奇、甜甜圈、油炸玉米饼、薄饼、可丽饼、油炸面包丁和饼干。烘焙产品也可以是可食用的容器，例如杯子或椎体。
烘焙面包通常涉及混合成分以形成面团、揉捏、发酵、塑形、烘焙、冷却和储存。用于制作面团的成分通常包括面粉、水、盐、酵母和其它食品添加剂。在本发明的方法中，本发明的变异多肽是用于制作面团的成分之一。
面粉通常由小麦制成，并且可以出于不同目的进行碾磨，所述目的例如制作面包、糕点、蛋糕、饼干、意大利面和面条。小麦粉的替代品包括但不限于：杏仁粉、椰子粉、奇亚粉、玉米粉、大麦粉、斯佩耳特小麦粉(spelt flour)、大豆粉、土豆粉、藜麦、特夫粉(teffflour)、黑麦粉、苋菜粉(amaranth flour)、竹芋粉(arrowroot flour)、鹰嘴豆(chickpea/garbanzo)粉、腰果粉、亚麻粉、夏威夷果(macadamia)粉、小米粉、高粱粉、米粉、木薯粉和其任何组合。已知面粉类型在全世界不同地区与不同国家之间有所不同。
处理面粉或面团可包括添加无机物质、有机物质，例如脂肪酸、碳水化合物、氨基酸、蛋白质和坚果。面粉或面团可以在烘焙之前通过冷却、加热、辐射、聚结或冻干进行预处理。另外，面粉或面团可以在烘焙之前通过添加酶例如本发明的变异多肽或微生物体例如酵母进行预处理。
酵母将糖分解为二氧化碳和水。通常衍生自酿酒酵母的多种烘焙用酵母是所属领域技术人员已知的，包括但不限于：奶油酵母、压缩酵母、蛋糕酵母、活性干酵母、速溶酵母、耐高渗酵母、速发酵母、去活化酵母。其它种类的酵母包括营养酵母、啤酒用酵母、蒸馏用酵母和葡萄酒酵母。
可以加入面团的甜味剂包括但不限于：液态糖、糖浆、白(粒化)糖、棕(原始)糖、蜂蜜、果糖、右旋糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、甜菊糖苷和人工甜味剂。
可以加入面团的乳化剂包括但不限于单酸甘油酯的二乙酰基酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、乙氧基化单酸甘油酯和二酸甘油酯(EMG)、聚山梨醇酯(PS)和丁二酰化单酸甘油酯(SMG)。
可以在烘焙方法中使用的其它食品添加剂包括：脂质、油、黄油、人造奶油、起酥油、乳脂、甘油、鸡蛋、乳制品、非乳制品替代品、增稠剂、防腐剂、着色剂和酶。
在烘焙过程期间，可以单独添加用于烘焙的成分或添加剂到面团中。成分或添加剂也可以与超过一种成分或添加剂合并以形成预混合物，并且然后在烘焙过程期间添加预混合物到面团中。面粉或面团混合物可以在烘焙之前制备，包括准备好的烤箱面团、包装好的面团或包装好的面糊。
可以对面包产品进行改进，以满足特殊的饮食要求，例如无糖膳食、无麸质膳食、低脂膳食或其任何组合。所述酶可以延长面团类产品的贮存期或提供抗微生物(无霉菌)作用。
“面包体积”是通过使用激光扫描仪(例如Micro Stable System的VolscanProfiler)测量体积以及比体积而确定的烘焙制品的体积。所述术语还包括通过测量某些烘焙制品的长度、宽度和高度确定的体积。
本发明的变异多肽在制作面团的方法中的使用增加了由面团制备的烘焙产品的弹性。在确定回弹性之前，烘焙产品可以储存五天、10天、15天或20天。回弹可以通过使用全质构分析(TPA)的质构仪测试来确定。TPA是一个两循环压缩试验，回弹是通过做的可恢复功除以质构仪所做的硬度功来计算的。使用本发明的变异多肽从面团制备的烘焙产品的回弹性增加至少5％或8％，优选至少10％或12％，更优选至少15％或20％和最优选至少25％或30％。
本发明的变异多肽在制作面团的方法中的使用降低了由面团制备的烘焙产品在储存后的硬度。通常，在确定硬度之前，烘焙产品在室温下储存10天、15天或20天。硬度可以根据AACC 74-09测试确定，例如使用35mm样品和5kg载荷传感器。测试中可使用以下参数：测试前速度：1毫米/秒，测试速度：5毫米/秒，测试后速度：5毫米/秒，目标模式：距离，距离：10毫米，时间5秒，触发类型：自动(力)，触发力：5g。使用本发明的变异多肽从面团制备的烘焙产品的硬度降低至少5％或8％，优选至少10％或12％，更优选至少15％或20％，仍然更优选至少25％或30％，最优选至少35％或40％。
在一个优选的实施方案中，通过从面团制备烘焙产品的方法生产的烘焙产品在储存10天后表现出比其中未将变异多肽添加到面团中以相同方式生产的烘焙产品更低的硬度和更大的弹性。
本发明的变异多肽可用于其他工业应用。具有β-淀粉酶活性的变异多肽可用于洗涤剂、个人护理产品中、织物处理中、纸浆和纸处理中、在乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆的生产中；或在油田和采矿业中用作降粘剂。
提供以下实施例用于说明性目的。因此，应当理解，这些实施例不应解释为限制性的。技术人员将显然能够设想对本文提出的原理的进一步修改。
实施例
实施例1：通用方法
1.PAHBAH测定
使用如Lever M.(1972)Anal.Biochem.47,273–279中所述的4-羟基苯酰肼方法与以下修改来测量β-淀粉酶和变异酶的淀粉水解的定量。在65℃下使112uL的1％土豆支链淀粉与12.5uL稀释酶反应，并且在60分钟时取样品。然后反应物通过混合到100ul 1％PAHBAH试剂中淬灭。将反应物加热到95℃维持6分钟，冷却到室温，并且在BioTek板读取器中在410nm下读取溶液吸收率。
2.残余活性
通过比较热激之前和之后使用PAHBAH分析所测量的每种酶的活性来计算残余活性。将样品加热10或15分钟之后，在65℃下使用PAHBAH分析测试之前将样品冷却到室温或持续10分钟到4℃。
实施例2：产生变异β-淀粉酶
根据SEQ ID No.1的亲本酶描述于KITAMOTO,“Cloning and Sequencing of theGene Encoding Thermophilic B-amylase of Clostridium Thermosulfurogenes”(1988)J.Bacteriology Vol.170,p.5848-5854；NCBI_P19584.1是AAA23204.1。设计了根据SEQ IDNo.2的酶，其对应于包含氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P和S398P的SEQ IDNo.1，与SEQ ID No.1的β淀粉酶相比，其表现出提高的β-淀粉酶活性。根据SEQ ID No.2的酶，在本文中将被称为“中间亲本”，在实验室中被工程改造以产生与中间亲本酶相比具有增加的％残余外淀粉酶活性的非天然存在的β-淀粉酶变异酶。变异多肽酶以中间亲本酶开始形成，并且使用如至少US 6,562,594、US 6,171,820和US 6,764,835中所述的基因位点饱和诱变(GSSM)、易错PCR和/或如美国专利9,476,078中所述的修剪式多位点组合装配(TMSCA)使其进化。
产生了与根据SEQ ID No.2的中间亲本多肽相比具有一个氨基酸取代的以下变异多肽，并且如实施例1中所述确定了所示热激后的％残余活性：
表1：单个GSSM突变
Figure GDA0003482057630000231
Figure GDA0003482057630000241
产生了与根据SEQ ID No.2的中间亲本多肽相比具有氨基酸取代的组合的以下变异多肽，并且如实施例1中所述确定了所示热激后的％残余活性：
表2：多个GSSM突变
Figure GDA0003482057630000251
通过酶进化，如至少US 6,562,594、US 6,171,820和US 6,764,835中所述；易错PCR；和/或修剪式多位点组合装配(TMSCA)，如美国专利9,476,078中所述，在中间亲本多肽(SEQ ID No.2)中产生通过GSSM获得的上述突变的组合，并且如实施例1中所述确定所示的热激后％残余活性：
表3：第一轮酶进化
Figure GDA0003482057630000252
通过酶进化，如至少US 6,562,594、US 6,171,820和US 6,764,835中所述；易错PCR；和/或修剪式多位点组合装配(TMSCA)，如美国专利9,476,078中所述，在中间亲本多肽(SEQ ID No.2)中将通过GSSM获得的上述突变的各种与BAV48(SEQ ID No.3)的那些组合，并且如实施例1中所述确定所示的热激后％残余活性：
表4：第二轮酶进化
Figure GDA0003482057630000261
Figure GDA0003482057630000271
Figure GDA0003482057630000281
Figure GDA0003482057630000291
实施例3：变异β-淀粉酶的表达
通过构建含有编码多核苷酸序列的表达质粒，将所示质粒转化到甲醇酵母(法夫驹形氏酵母)中，并且以以下方式生长所得表达菌株，获得具有β-淀粉酶活性的变异多肽。
表达菌株的新鲜甲醇酵母细胞通过将序列确认菌株的甘油库存铺展到含有博莱霉素(Zeocin)的酵母提取蛋白胨右旋糖(YPD)琼脂板上获得。2天后，使用来自这些板的细胞将生产菌株的起始种子培养物接种到100mL缓冲甘油复合培养基(BMGY)中，并且在30℃和225-250rpm下生长20-24小时。通过将合适的量转移到装有挡板的发酵罐中的2-4L BMMY培养基中来扩大种子培养物的规模。发酵在30℃下并且在由平叶片轮叶提供的1100rrp的搅拌下进行48-72小时。在发酵的初始分批阶段之后，每当培养物中的溶解氧水平降到30％以下时，就添加灭菌过滤的甲醇作为饲料。或者，每3小时以起始分批培养物的0.5％v/v添加饲料。将最终的发酵液在4℃下以7000×g离心30分钟，以获得无细胞上清液。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽通过SDS-PAGE或毛细管电泳分析上清液的目的蛋白表达来检测。
实施例4：变异β-淀粉酶的温度曲线
变异β-淀粉酶的温度曲线使用如实施例1中所述的PAHBAH测定法测定以确定在65、66.6、69.6、74.2、79.7、84.4、87.5和89℃的温度下pH 5.5时的活性。结果示于图1A、1B和1C中。
实施例5：变异β-淀粉酶的pH曲线
变异β-淀粉酶的pH曲线使用如实施例1中所述的PAHBAH测定法测定以确定在pH4.0、4.5、5.0、5.5和6.0时在80℃下的活性。结果示于图2A、2B和2C中。
实施例6：变异β-淀粉酶的烘焙性能
具有β-淀粉酶活性的变异多肽的烘焙性能在以直接方法产生的小麦面包中进行测试。将1000g 550型面粉(Vogtmühlen Illertissen)、30g压缩酵母、20g盐、20g糖、20g人造奶油、60ppm抗坏血酸、150ppm
Figure GDA0003482057630000301
CS 30(真菌木聚糖酶、纤维素酶、真菌α-淀粉酶)、8g
Figure GDA0003482057630000302
55(蒸馏单甘油酸酯)和580g水在Kemper SP 15螺旋形混合器中以速度1混合4.5分钟并且以速度2混合2.25分钟，直到最终面团温度为28℃，制备面包面团。静置15分钟后，将面团分成500g的块，搓圆并且醒发15分钟。之后，将面团块模制，放入烘焙罐中，并且在35℃下在85％的相对湿度下醒发80分钟。醒发后的面团块在柜式烤箱中在255℃/240℃的下部和上部加热下烘焙25分钟，并且注入蒸汽15秒。
将变异多肽酶样品以50ppm到200ppm的剂量添加到面粉中。对面团特性和最终烘焙制品的影响与阴性对照(无酶)和Novamyl 3D进行比较。
通过激光扫描仪(Stable Micro Systems VolScan Profiler，VolScan 600)测量面包条来确定体积作用。阴性对照定义为0％。
面团特性由熟练的高级烘焙师进行触觉评估，并且与阴性对照比较来进行描述。
将准备好的烘焙面包包装并且密封在塑料袋中。另外，将其部分地在85℃下巴氏灭菌90分钟。通过使用质构仪(Stable Micro Systems，TA.XTplus Texture Analyzer)的质构分析，在储存10天后测定面包屑特性。在测量之前，从面包条的中间切出25毫米厚的切片。图3中示出了结果。
序列表
<110> 巴斯夫欧洲公司
<120> β-淀粉酶变体
<130> 190259
<150> US62576930
<151> 2019-04-23
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 519
<212> PRT
<213> 热硫梭菌
<400> 1
Ser Ile Ala Pro Asn Phe Lys Val Phe Val Met Gly Pro Leu Glu Lys
1 5 10 15
Val Thr Asp Phe Asn Ala Phe Lys Asp Gln Leu Ile Thr Leu Lys Asn
20 25 30
Asn Gly Val Tyr Gly Ile Thr Thr Asp Ile Trp Trp Gly Tyr Val Glu
35 40 45
Asn Ala Gly Glu Asn Gln Phe Asp Trp Ser Tyr Tyr Lys Thr Tyr Ala
50 55 60
Asp Thr Val Arg Ala Ala Gly Leu Lys Trp Val Pro Ile Met Ser Thr
65 70 75 80
His Ala Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Thr Val Asn Ile Pro Ile Pro
85 90 95
Ser Trp Val Trp Thr Lys Asp Thr Gln Asp Asn Met Gln Tyr Lys Asp
100 105 110
Glu Ala Gly Asn Trp Asp Asn Glu Ala Val Ser Pro Trp Tyr Ser Gly
115 120 125
Leu Thr Gln Leu Tyr Asn Glu Phe Tyr Ser Ser Phe Ala Ser Asn Phe
130 135 140
Ser Ser Tyr Lys Asp Ile Ile Thr Lys Ile Tyr Ile Ser Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Ser Tyr Asn Pro Ser His Gly Trp Thr
165 170 175
Tyr Pro Gly Arg Gly Ser Leu Gln Cys Tyr Ser Lys Ala Ala Ile Thr
180 185 190
Ser Phe Gln Asn Ala Met Lys Ser Lys Tyr Gly Thr Ile Ala Ala Val
195 200 205
Asn Ser Ala Trp Gly Thr Ser Leu Thr Asp Phe Ser Gln Ile Ser Pro
210 215 220
Pro Thr Asp Gly Asp Asn Phe Phe Thr Asn Gly Tyr Lys Thr Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Asn Asp Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Ser Val Leu Thr Asn Glu Leu
245 250 255
Ala Asn Ile Ala Ser Val Ala His Ser Cys Phe Asp Pro Val Phe Asn
260 265 270
Val Pro Ile Gly Ala Lys Ile Ala Gly Val His Trp Leu Tyr Asn Ser
275 280 285
Pro Thr Met Pro His Ala Ala Glu Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Asn Tyr
290 295 300
Ser Thr Leu Leu Asp Gln Phe Lys Ala Ser Asn Leu Ala Met Thr Phe
305 310 315 320
Thr Cys Leu Glu Met Asp Asp Ser Asn Ala Tyr Val Ser Pro Tyr Tyr
325 330 335
Ser Ala Pro Met Thr Leu Val His Tyr Val Ala Asn Leu Ala Asn Asn
340 345 350
Lys Gly Ile Val His Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Asn Asn
355 360 365
Asn Gln Ala Tyr Val Asn Cys Ala Asn Glu Leu Thr Gly Tyr Asn Phe
370 375 380
Ser Gly Phe Thr Leu Leu Arg Leu Ser Asn Ile Val Asn Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Val Thr Ser Glu Met Ala Pro Phe Val Ile Asn Ile Val Thr Leu
405 410 415
Thr Pro Asn Gly Thr Ile Pro Val Thr Phe Thr Ile Asn Asn Ala Thr
420 425 430
Thr Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Tyr Ile Val Gly Ser Thr Ser Asp Leu
435 440 445
Gly Asn Trp Asn Thr Thr Tyr Ala Arg Gly Pro Ala Ser Cys Pro Asn
450 455 460
Tyr Pro Thr Trp Thr Ile Thr Leu Asn Leu Leu Pro Gly Glu Gln Ile
465 470 475 480
Gln Phe Lys Ala Val Lys Ile Asp Ser Ser Gly Asn Val Thr Trp Glu
485 490 495
Gly Gly Ser Asn His Thr Tyr Thr Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Ser
500 505 510
Val Thr Ile Thr Trp Gln Asn
515
<210> 2
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成生成
<400> 2
Ser Ile Ala Pro Asn Phe Lys Val Phe Val Met Gly Pro Leu Glu Lys
1 5 10 15
Val Thr Asp Phe Asn Ala Phe Lys Lys Gln Cys Ile Thr Leu Lys Asn
20 25 30
Asn Gly Val Tyr Gly Ile Thr Thr Asp Ile Trp Trp Gly Tyr Val Glu
35 40 45
Asn Ala Gly Glu Asn Gln Phe Asp Trp Ser Tyr Tyr Lys Thr Tyr Ala
50 55 60
Asp Thr Val Arg Ala Ala Gly Leu Lys Trp Val Pro Ile Met Ser Thr
65 70 75 80
His Ala Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Thr Val Asn Ile Pro Ile Pro
85 90 95
Ser Trp Val Trp Thr Lys Asp Thr Gln Asp Asn Met Gln Tyr Lys Asp
100 105 110
Glu Ala Gly Asn Trp Asp Asn Glu Ala Val Ser Pro Trp Tyr Ser Gly
115 120 125
Leu Thr Gln Leu Tyr Asn Glu Phe Tyr Ser Ser Phe Ala Ser Asn Phe
130 135 140
Ser Ser Tyr Lys Asp Ile Ile Thr Lys Ile Tyr Ile Ser Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Ser Tyr Asn Pro Ser His Gly Trp Thr
165 170 175
Tyr Pro Gly Arg Gly Ser Leu Gln Cys Tyr Ser Lys Ala Ala Ile Thr
180 185 190
Ser Phe Gln Asn Ala Met Lys Ser Lys Tyr Gly Thr Ile Ala Ala Val
195 200 205
Asn Ser Ala Trp Gly Thr Ser Leu Thr Asp Phe Leu Gln Ile Ser Pro
210 215 220
Pro Thr Asp Gly Asp Asn Phe Phe Thr Asn Gly Tyr Lys Thr Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Asn Asp Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Ser Val Leu Thr Asn Glu Leu
245 250 255
Ala Asn Ile Ala Ser Val Ala His Ser Cys Phe Asp Pro Val Phe Asn
260 265 270
Val Pro Ile Gly Ala Lys Ile Ala Gly Val His Trp Leu Tyr Asn Ser
275 280 285
Pro Thr Met Pro His Ala Ala Glu Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Asn Tyr
290 295 300
Ser Thr Leu Leu Asp Gln Phe Lys Ala Ser Asn Leu Ala Met Thr Phe
305 310 315 320
Thr Cys Leu Glu Met Asp Asp Ser Asn Ala Tyr Val Ser Pro Tyr Tyr
325 330 335
Ser Ala Pro Met Thr Leu Val His Tyr Val Ala Asn Leu Ala Asn Asn
340 345 350
Lys Gly Ile Val His Asn Gly Glu Asn Ala Leu Pro Ile Ser Asn Asn
355 360 365
Pro Gln Ala Tyr Val Asn Cys Ala Asn Glu Leu Thr Gly Tyr Asn Phe
370 375 380
Ser Gly Phe Thr Leu Leu Arg Leu Ser Asn Ile Val Asn Pro Asp Gly
385 390 395 400
Ser Val Thr Ser Glu Met Ala Pro Phe Val Ile Asn Ile Val Thr Leu
405 410 415
Thr Pro Asn Gly Thr Ile Pro Val Thr Phe Thr Ile Asn Asn Ala Thr
420 425 430
Thr Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Tyr Ile Val Gly Ser Thr Ser Asp Leu
435 440 445
Gly Asn Trp Asn Thr Thr Tyr Ala Arg Gly Pro Ala Ser Cys Pro Asn
450 455 460
Tyr Pro Thr Trp Thr Ile Thr Leu Asn Leu Leu Pro Gly Glu Gln Ile
465 470 475 480
Gln Phe Lys Ala Val Lys Ile Asp Ser Ser Gly Asn Val Thr Trp Glu
485 490 495
Gly Gly Ser Asn His Thr Tyr Thr Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Ser
500 505 510
Val Thr Ile Thr Trp Gln Asn
515
<210> 3
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成生成
<400> 3
Ser Ile Ala Pro Asn Phe Lys Val Phe Val Met Gly Pro Leu Glu Lys
1 5 10 15
Val Thr Asp Phe Asn Ala Phe Lys Lys Gln Cys Ile Thr Leu Lys Asn
20 25 30
Asn Gly Val Tyr Gly Ile Thr Thr Asp Ile Trp Trp Gly Tyr Val Glu
35 40 45
Asn Ala Gly Glu Asn Gln Phe Asp Trp Ser Tyr Tyr Lys Thr Tyr Ala
50 55 60
Asp Thr Val Arg Ala Ala Gly Leu Lys Trp Val Pro Ile Met Ser Thr
65 70 75 80
His Ala Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Thr Val Asn Ile Pro Ile Pro
85 90 95
Ser Trp Val Trp Thr Lys Asp Thr Gln Asp Asn Met Gln Tyr Lys Asp
100 105 110
Glu Ala Gly Asn Trp Asp Asn Glu Ala Val Ser Pro Trp Tyr Ser Gly
115 120 125
Leu Thr Gln Leu Tyr Asn Glu Phe Tyr Ser Ser Phe Ala Ser Asn Phe
130 135 140
Ser Ser Tyr Lys Asp Ile Ile Thr Lys Ile Tyr Ile Ser Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Ser Tyr Asn Pro Ser His Gly Trp Thr
165 170 175
Tyr Pro Gly Arg Gly Ser Leu Gln Cys Tyr Ser Lys Ala Ala Ile Thr
180 185 190
Ser Phe Gln Asn Ala Met Lys Ser Lys Tyr Gly Thr Ile Ala Ala Val
195 200 205
Asn Ser Ala Trp Gly Thr Ser Leu Thr Asp Phe Leu Gln Ile Ser Pro
210 215 220
Pro Thr Asp Gly Asp Asn Phe Phe Thr Asn Gly Tyr Lys Thr Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Asn Asp Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Ser Val Leu Thr Asn Glu Leu
245 250 255
Ala Asn Ile Ala Ser Val Ala His Ser Cys Phe Asp Pro Val Phe Asn
260 265 270
Val Pro Ile Gly Ala Lys Ile Ala Gly Val His Trp Leu Tyr Asn Ser
275 280 285
Pro Thr Met Pro His Ala Ala Glu Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Asn Tyr
290 295 300
Ser Thr Leu Leu Asp Gln Phe Lys Ala Ser Asn Leu Ala Met Thr Phe
305 310 315 320
Thr Cys Leu Glu Met Asp Asp Ser Asn Ala Tyr Val Ser Pro Tyr Tyr
325 330 335
Ser Ala Pro Met Thr Leu Val His Tyr Val Ala Asn Leu Ala Asn Asn
340 345 350
Lys Gly Ile Val His Asn Gly Glu Asn Ala Leu Pro Ile Ser Asn Asn
355 360 365
Pro Gln Ala Tyr Val Asn Cys Ala Asn Glu Leu Thr Gly Tyr Asn Phe
370 375 380
Ser Gly Phe Thr Leu Leu Arg Leu Ser Asn Ile Val Asn Pro Asp Gly
385 390 395 400
Ser Val Thr Ser Glu Met Ala Pro Phe Val Ile Asn Ile Val Thr Leu
405 410 415
Thr Pro Glu Gly Thr Ile Pro Val Thr Phe Thr Ile Asn Asn Ala Thr
420 425 430
Thr Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Tyr Ile Val Gly Ser Thr Ser Asp Leu
435 440 445
Gly Asn Trp Asn Thr Thr Tyr Ala Arg Gly Pro Ala Ser Cys Pro Asn
450 455 460
Tyr Pro Thr Trp Thr Ile Thr Leu Asn Leu Leu Pro Gly Glu Gln Ile
465 470 475 480
Gln Phe Lys Ala Val Lys Ile Asp Ser Ser Gly Asn Val Glu Trp Glu
485 490 495
Gly Gly Ser Asn His Glu Tyr Thr Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Ser
500 505 510
Val Thr Ile Thr Trp Gln Asn
515

Claims (33)

1.一种具有β-淀粉酶活性并包含与根据SEQ ID No.1的序列至少80％相同的氨基酸序列的根据SEQ ID No.1的β-淀粉酶的变异多肽，该氨基酸序列包含氨基酸取代D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P和在SEQ ID No.1的编号中在选自以下的氨基酸残基位置编号处的至少第一个进一步的氨基酸修饰：13、90、91、131、132、148、196、198、205、206、208、209、210、214、222、236、239、251、269、276、318、375、419、435、438、463、469、494、499、502和519或其组合。
2.根据权利要求1所述的变异多肽，其中第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合。
3.根据权利要求2所述的变异多肽，其中第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代，并且其中氨基酸取代是保守氨基酸取代。
4.根据权利要求2所述的变异多肽，其中第一个进一步的氨基酸修饰是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代：P13S、T90D、V91C、Q131K、L132E、K148E、N196I、M198I、I205K、A206G/M/N/W、V208C、N209D、S210V、T214H、I222C、Y236I、T239S、V251S/T、P269G/S、G276D、M318L、C375I/V、N419C/D/E/G、Y435E/P、N438A/K/M/Q/Y和P463D/E/I/K/Q/T/V/Y、T469I/V、T494E、S499P、T502E、N519D或其组合。
5.根据权利要求4所述的变异多肽，其中第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代的组合：
(a)K148E、N438A；
(b)P13S、Y236I；
(c)T239S、N519D；
(d)T469I、S499P；
(e)V208C、G276D；
(f)L132E、Q131K；
(g)T90D、V91C；
(h)T494E、T502E；和
(i)N419G、T494E、T502E。
6.根据权利要求1所述的变异多肽，其中第一个进一步的氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1编号中的N419、T494E、T502，并且其中所述多肽包含至少第二个进一步的氨基酸修饰。
7.根据权利要求6所述的变异多肽，其中第二个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合。
8.根据权利要求7所述的变异多肽，其中第二个进一步的氨基酸修饰是氨基酸取代，并且其中氨基酸取代是保守氨基酸取代。
9.根据权利要求6所述的变异多肽，其中第二个进一步的氨基酸修饰是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代：P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435P/E、N438K和P463T或其组合。
10.根据权利要求9所述的变异多肽，其中第二个进一步的一个氨基酸修饰是氨基酸修饰的组合，并且氨基酸修饰的组合是在SEQ ID No.1的编号中选自以下的氨基酸取代的组合：
(j)A206W、V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(k)P13S、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(l)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、Y435E、N438K、P463T；
(m)V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(n)V208C、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(o)A206W、V208C、G276D、C375I、Y435E、N438K、P463T；
(p)A206W、V208C、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(q)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、C375I、Y435P、N438K、P463T；
(r)A206W、V208C、G276D、M318L、Y435E、N438K、P463T；
(s)A206W、V208C、G276D、M318L、C375I、Y435P、P463T；
(t)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(u)P13S、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(v)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、C375I、N438K、P463T；
(w)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、C375I、Y435P、P463T；
(x)V208C、G276D、M318L、Y435P；
(y)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L、P463T；
(z)A206W、V208C、G276D、M318L、P463T；
(aa)P13S、V208C、Y236I、G276D、N438K、P463T；
(bb)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D、M318L；
(cc)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D；
(dd)V208C、G276D、N419G、T494E、T502E；
(ee)C375I、N419G、T494E、T502E；
(ff)P13S、A206W、V208C、Y236I、G276D；
(gg)T90D、V91C、P269S、C375I；和
(hh)T90D、V91C、P269S、G276D、C375I。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的变异多肽，其中与SEQ ID No.1或2的多肽相比，所述变异多肽在暴露于80至95摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
12.根据权利要求11所述的变异多肽，其中与SEQ ID No.1或2的多肽相比，所述变异多肽在暴露于86摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
13.根据权利要求6-10中任一项所述的变异多肽，其中与SEQ ID No.1、2或3的多肽相比，所述变异多肽在暴露于90摄氏度的温度后具有增加的％残余活性。
14.根据权利要求6-10中任一项所述的变异多肽，其中与SEQ ID No.1或2的多肽相比，所述变异多肽在pH 4.5-6和80-85摄氏度的温度下具有增加的活性。
15.根据权利要求1-14任一项所述的变异多肽，其具有β-淀粉酶活性，其中所述变异多肽是全长氨基酸序列的片段。
16.一种变异多肽，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的至少一种变异多肽和具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有β-淀粉酶活性。
17.一种包含根据权利要求1-16中任一项所述的变异多肽的组合物。
18.根据权利要求17所述的组合物，进一步包含第二酶。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述第二酶选自由以下组成的组：α-淀粉酶、脂肪酶、第二β-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。
20.一种制造变异多肽的方法，其包含：提供编码根据权利要求1-16中任一项所述的多肽变体的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化到表达宿主中，培育所述表达宿主以产生所述变异多肽，并且纯化所述变异多肽。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述表达宿主选自由以下组成的群组：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细菌表达系统选自大肠杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌和链霉菌。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述酵母表达系统选自念珠菌、毕赤酵母、酵母、裂殖酵母。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述真菌表达系统选自青霉、曲霉、镰刀霉、毁丝霉、根毛霉、根霉、嗜热真菌和木霉。
25.一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将根据权利要求1-16中任一项所述的变异多肽添加到所述面团中，并且最终烘焙所述面团。
26.根据权利要求25所述的方法，其中与通过其中不添加变异多肽的其他相同方法生产的烘焙产品相比，由所述方法生产的烘焙产品在储存10天后表现出更低的硬度和更大的弹性。
27.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于加工淀粉的用途。
28.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于清洁或洗涤织物、硬表面或餐盘的用途。
29.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于制备乙醇的用途。
30.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于处理油井的用途。
31.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于加工纸浆或纸的用途。
32.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于喂养动物的用途。
33.权利要求1-16中任一项所述的变异多肽用于制备糖浆的用途。
CN202080030423.1A 2019-04-23 2020-04-21 β-淀粉酶变体 Active CN114096271B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410340644.9A CN118086254A (zh) 2019-04-23 2020-04-21 β-淀粉酶变体

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962837328P 2019-04-23 2019-04-23
US62/837,328 2019-04-23
PCT/US2020/029122 WO2020219450A1 (en) 2019-04-23 2020-04-21 Beta-amylase variants

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410340644.9A Division CN118086254A (zh) 2019-04-23 2020-04-21 β-淀粉酶变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114096271A true CN114096271A (zh) 2022-02-25
CN114096271B CN114096271B (zh) 2024-04-12

Family

ID=72941511

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410340644.9A Pending CN118086254A (zh) 2019-04-23 2020-04-21 β-淀粉酶变体
CN202080030423.1A Active CN114096271B (zh) 2019-04-23 2020-04-21 β-淀粉酶变体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410340644.9A Pending CN118086254A (zh) 2019-04-23 2020-04-21 β-淀粉酶变体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220220463A1 (zh)
EP (1) EP3958890A4 (zh)
CN (2) CN118086254A (zh)
CA (1) CA3176520A1 (zh)
WO (1) WO2020219450A1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102639687A (zh) * 2009-11-13 2012-08-15 诺维信公司 酿造方法
WO2015021601A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Danisco Us Inc. Simultanenous liquifaction and malto-saccharification
WO2018209026A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Basf Se Method for using lipase enzymes for cleaning
CN111278970A (zh) * 2017-10-25 2020-06-12 巴斯夫欧洲公司 β-淀粉酶

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK160563C (da) 1986-02-19 1991-09-02 Novo Industri As Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen
JPH01218589A (ja) 1988-02-26 1989-08-31 Juzo Udaka 耐熱性β−アミラーゼ遺伝子
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US7323336B2 (en) 2001-02-21 2008-01-29 Verenium Corporation Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
ES2637501T3 (es) 2001-02-21 2017-10-13 Basf Enzymes Llc Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
AU2003285906A1 (en) 2002-10-31 2004-06-07 Diversa Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
GB0305685D0 (en) * 2003-03-12 2003-04-16 Danisco Enzyme
US20080102497A1 (en) * 2006-10-31 2008-05-01 Dominic Wong Enzymatic hydrolysis of starch
ES2734114T3 (es) 2006-12-21 2019-12-04 Basf Enzymes Llc Amilasas y glucoamilasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para formarlas y utilizarlas
WO2009018449A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Verenium Corporation Tailored multi-site combinatorial assembly
PL2295563T3 (pl) 2008-05-08 2016-08-31 Amano Enzyme Inc Beta-amylaza, kodujący ją gen i sposób jej wytwarzania
GB2499463B (en) 2012-01-31 2014-04-02 Verenium Corp Reduced sugar syrups and methods of making reduced sugar syrups
WO2015021600A1 (en) 2013-08-13 2015-02-19 Danisco Us Inc. Beta-amylase and methods of use
CN103695386B (zh) 2013-12-25 2015-09-16 南宁邦尔克生物技术有限责任公司 一种耐酸性高温β-淀粉酶突变体及其应用
CN103881993B (zh) 2014-03-13 2015-11-18 南宁邦尔克生物技术有限责任公司 一种耐酸性高温β-淀粉酶的突变体TBA-H2及其应用
CA3007668A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Basf Enzymes Llc A liquid formulation of alpha-amylase
US20240108016A1 (en) * 2019-10-18 2024-04-04 Basf Se Improved method for preparing a dough or a baked product therefrom

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102639687A (zh) * 2009-11-13 2012-08-15 诺维信公司 酿造方法
WO2015021601A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Danisco Us Inc. Simultanenous liquifaction and malto-saccharification
WO2018209026A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Basf Se Method for using lipase enzymes for cleaning
CN111278970A (zh) * 2017-10-25 2020-06-12 巴斯夫欧洲公司 β-淀粉酶

Also Published As

Publication number Publication date
EP3958890A1 (en) 2022-03-02
CA3176520A1 (en) 2020-10-29
CN114096271B (zh) 2024-04-12
WO2020219450A1 (en) 2020-10-29
EP3958890A4 (en) 2023-05-03
US20220220463A1 (en) 2022-07-14
CN118086254A (zh) 2024-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2981170A1 (en) Method of producing a baked product with alpha-amylase, lipase and phospholipase
WO2022090562A1 (en) Baked and par-baked products with thermostable amg variants from penicillium
US20230212544A1 (en) Beta-amylase enzymes
EP2595488B1 (en) Process for preparing a baked product with anti-staling amylase and peptidase
AU2016207959B2 (en) Method to improve sliceability of baked goods
US10316306B2 (en) Thermostable alpha amylase
CN112384616B (zh) 淀粉酶
US20240108016A1 (en) Improved method for preparing a dough or a baked product therefrom
US20230323327A1 (en) Alpha-amylase variants
CN114096271B (zh) β-淀粉酶变体
EP4052581A1 (en) Use of gh12 cellulases in spelt, oat, barley, and / or millet baking
WO2024118096A1 (en) Baking at low-ph with thermostable glucoamylase variants
CA3238924A1 (en) Alpha-amylase variants
CN116471938A (zh) 具有来自青霉属的热稳定amg变体的烘焙和部分烘焙产品
CN115867141A (zh) 一种酶法减少烘焙产品中油脂使用量的方法
US20190320665A1 (en) Process for Preparing a Baked Product with Anti-Staling Amylase and Peptidase

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant