CN114045321A - 谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。本发明通过在甲醇诱导表达阶段加入谷胱甘肽，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，促进重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。
背景技术
重组类人胶原蛋白能够通过基因工程菌实现大量表达。目前研究较为广泛的宿主菌株主要包括大肠杆菌和毕赤酵母菌。中国专利201110327865.5公开了一种表达重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，保藏编号为CGMCC No.5021。虽然与传统工艺相比，胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点，但也存在着发酵周期较长、生产效率较低等问题。为此，需要进一步提高该菌株的重组人源胶原蛋白表达量。
中国专利201810049618.5公开了一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺，通过添加L-精氨酸或者L-赖氨酸，作为蛋白酶的抑制性底物，保护目标产物重组胶原蛋白，不被蛋白酶水解。该方法虽然能够提高重组人源胶原蛋白稳定性，但重组人源胶原蛋白的产量并没有提升。中国专利2018100489088公开了一种毕赤酵母表达重组胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺，将甲醇诱导阶段时改成分阶段恒速流加，可以保证毕赤酵母在不同代谢时期对碳源的需求，该方法的胶原蛋白产量超过20g/L，产量提高5％以上，重组胶原蛋白的回收率达到75％以上。该方法重组胶原蛋白表达量虽有所提高，但提升幅度不大。综上所述，需要进一步地提高蛋白表达量，进而提高发酵水平，促进重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。本发明通过在发酵过程中加入谷胱甘肽，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，缩短发酵周期，提高重组人源胶原蛋白的表达量，提升重组人源胶原蛋白的生产水平。
本发明的技术方案如下：
谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用，具体应用方法如下：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入谷胱甘肽；所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为CGMCC No.5021。
本发明所述的应用中，谷胱甘肽的加入量为0.1g/L～10g/L，优选为0.1g/L～1g/L。
本发明所述的应用中，谷胱甘肽的加入方式为一次性加入或流加，更优选为流加。
本发明所述的应用中，发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.2～5.4，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
谷胱甘肽在毕赤酵母中被用在如DNA的合成和修复、蛋白质的生物合成和转运、氨基酸的活化等的相关的反应中。在发酵培养过程中，谷胱甘肽帮助毕赤酵母在甲醇中生长。在甲醇诱导阶段，毕赤酵母需要大量的氧气，如果溶氧不足，会产生有害物质，比如甲醛和过氧化氢，会对细胞有毒害作用。谷胱甘肽作为辅助因子，降低这些物质对毕赤酵母的毒害作用，从而促进毕赤酵母表达蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入谷胱甘肽，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，有利于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
具体实施方式
本发明采用的巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisCGMCC No.5021，已在中国专利201110327865.5中充分公开。
下述实施例中，采用的PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO30.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。
下述实施例中，采用的发酵培养基的具体配方为：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM14.35mL/L。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为0.01g/L发酵培养基。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为23.5g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.210g/L·h，与对照组相比提高21.3％。
实施例2
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为10g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为24.6g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.220g/L·h，与对照组相比提高27.0％。
实施例3
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为25.7g/L，发酵周期113小时，发酵生产水平为0.227g/L·h。与对照组相比提高31.5％。
实施例4
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为25.3/L，发酵周期113小时，发酵生产水平为0.224g/L·h，与对照组相比提高29.4％。
实施例5
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为213g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加谷胱甘肽溶液至发酵结束，总加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为26.3g/L，发酵周期108小时，发酵生产水平为0.244g/L·h，与对照组相比提高40.8％。
实施例6
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加谷胱甘肽溶液至发酵结束，总加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为26.8g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.239g/L·h，与对照组相比提高38.3％。
实施例7
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加谷胱甘肽溶液至发酵结束，总加入量为10g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为25.6g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.229g/L·h，与对照组相比提高32.1％。
对照组1
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为218g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵104h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为20.8g/L，发酵周期120小时，发酵生产水平为0.173g/L·h。
对照组2
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为1g/L，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵104h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为20.6g/L，发酵周期122小时，发酵生产水平仅为0.169g/L·h。
Claims (6)
1.谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用，其特征在于，具体应用方法如下：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入谷胱甘肽；所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No.5021。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，谷胱甘肽的加入量为0.1g/L～10g/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，谷胱甘肽的加入量为0.1g/L～1g/L。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，谷胱甘肽的加入方式为一次性加入或流加。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，发酵培养基的配方为：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.2～5.4，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
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