CN103946710B

CN103946710B - 维生素d化合物的释放制剂

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Publication number: CN103946710B
Application number: CN201280056463.9A
Authority: CN
Inventors: S.安托尼; C.沃格尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: US20160025750A1; CN103946710A; US20170363649A1; AU2012338908B2; US20220043012A1; SG11201402196YA; JP6038945B2; CA2852275C; KR20140096286A; HK1195359A1; US20200072854A1; BR112014009500B1; MX2014005642A; US20160245829A1; US12013405B2; WO2013072342A1; EP3467510B1; EP3467510A1; CA2852275A1; BR112014009500A2

Abstract

本发明涉及用于释放与维生素D-结合蛋白结合的维生素D化合物的试剂组合物，用于检测维生素D化合物的体外方法，其中通过使用该试剂组合物，使得所述维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放，且还涉及以该方式获得的试剂混合物。本发明还涉及所披露的用于释放维生素D化合物的试剂组合物的用途。所述方法以使用还原剂碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)和碱化剂为基础。

Description

维生素D化合物的释放制剂

背景资料

本发明涉及用于释放与维生素D-结合蛋白结合的维生素D化合物的试剂组合物(reagent composition)，用于检测维生素D化合物的体外方法，其中通过使用该试剂组合物，使得所述维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放，且还涉及以该方式获得的试剂混合物。本发明还涉及所披露的用于释放维生素D化合物的试剂组合物的用途以及用于检测维生素D化合物的试剂盒，其含有除常见检测试剂之外的用于释放维生素D化合物的试剂组合物。

维生素D的充分供给是极其重要的，如术语“维他命(vitamin)”早已暗示的那样。维生素D的缺乏导致严重的疾病诸如佝偻病或者骨质疏松。虽然在上个世纪的早期，维生素D仍然被看作一种单一物质，但是在过去的几十年内，维生素D系统已经变为一种维生素D代谢产物的复杂且多样的网络。如今，40种以上的不同的维生素D代谢产物是已知的(Zerwekh,J.E.,Ann.Clin.Biochem.41(2004)272-281)。

人类只能通过来自阳光的紫外线作用于皮肤上而产生D₃维生素或者维生素D₂(calciferols)。在血液中，维生素D₃结合到所谓的维生素D-结合蛋白，并将其输送到肝脏中，在此通过25-羟基化作用将其转化为25-羟基维生素D₃。除皮肤和肝脏之外，许多其它组织目前已知涉及维生素D新陈代谢，而上述两个器官早已在下述文献中提及(Schmidt-Gayk,H.et al.(eds.),“Calcium regulating hormones,vitamin D metabolites and cyclicAMP”,Springer Verlag,Heidelberg(1990)pp.24-47)。25-羟基维生素D，更具体地说，25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃，就其数量而言，是人有机体中的重要存储形式。当需要时，这些前体可以在肾中转化而形成生物活性的1α,25-二羟基维生素D，所谓的D激素。生物活性的维生素D调节从肠的钙摄取、骨矿化，并且影响许多其它代谢途径诸如胰岛素体系。

测量维生素D水平本身是没有多少益处的，当测定患者的维生素D状况时，因为取决于食物摄取或者暴露于阳光，维生素D(维生素D₂和维生素D₃)的浓度变化很大。另外，在循环(24小时)中维生素D具有较短的生物半衰期，因此出于这种原因也不是合适的测定患者的维生素D状况的参数。同样也适用于生理活性形式的维生素D(1,25-二羟基维生素D)。相比于25-羟基维生素D而言，这些生物活性形式同样以较小的且较大波动的浓度存在。由于全部这些原因，特别地，25-羟基维生素D的量化是一种合适的全面分析患者的总的维生素D状况的手段。

维生素D代谢产物如25-羟基维生素D以高亲和性由维生素D-结合蛋白结合且也以受限的程度与白蛋白和一些脂蛋白结合。在正常情况下适于从维生素D-结合蛋白释放维生素D代谢产物的方法相比于从任何其它蛋白释放维生素D代谢产物而言将是非常适当的。

25-羟基维生素D或者其它维生素D化合物对维生素D-结合蛋白的结合使得维生素D化合物的确定极大地复杂化。全部已知的方法要求待分析的维生素D化合物从其与维生素D-结合蛋白形成的复合物中释放或者分离。在下文中，为了简化的目的，这被称为从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物，虽然当然其只能从维生素D化合物和维生素D-结合蛋白的复合物中，而不是单独地从维生素D-结合蛋白中被释放。

维生素D-结合蛋白在酸性pH条件下为未折叠的，但在pH重新变为中性条件时，其具有正确重折叠且重新结合分析物的高趋势。因此，通常需要首先释放维生素D化合物，然后将所述维生素D-结合蛋白与待分析的维生素D化合物分离。

由于25-羟基维生素D的高的临床价值，许多方法从文献中是已知的，这使得25-羟基维生素D可以或多或少被可靠地确定。

Haddad,J.G.et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.33(1971)992-995，和Eisman,J.A.et al.,Anal.Biochem.80(1977)298-305例如描述了使用高效液相色谱(HPLC)确定血液样品中25-羟基维生素D的浓度。

其它确定25-羟基维生素D的方法尤其是基于使用维生素D-结合蛋白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick,M.F.and Ray,R.(US5,981,779)以及DeLuca et al.(EP 0 583 945)描述了用于羟基维生素D和二羟基维生素D的维生素D测定，其基于这些物质结合到维生素D-结合蛋白，其中这些物质的浓度是通过竞争性测试程序确定的。然而，这种方法的先决条件是待确定的维生素D代谢产物首先需要从原始的血液或者血清样品中分离并且必需通过例如色谱进行纯化。

Armbruster,F.P.et al.(WO 99/67211)教导了为通过乙醇沉淀法进行维生素D确定，应当制备血清或者血浆样品。在这种方法中，通过离心作用除去蛋白质沉淀物，并且乙醇(ethanolic)上清液包含可溶维生素D代谢产物。这些可以在竞争性结合测定中进行测量。

可选择地，EP 0 753 743教导了使用高碘酸盐，蛋白质可以和血液或者血清样品分离。在这种情况下，在获自用高碘酸盐处理的样品的不含蛋白质的上清液中确定维生素D化合物。在一些商业测试中，乙腈被推荐用于萃取血清或者血浆样品(例如，在DiaSorin的放射免疫测定中或者在“Immundiagnostik”公司的维生素D测试中)。

最近几年中，许多不同的释放试剂被提出，其原则上应当适于从样品中存在的任何结合蛋白中释放维生素D化合物。然而，这种释放或者脱附(detachment)应当在相对温和条件下进行，使得能够在结合测试中直接使用用释放试剂处理的样品(参见例如WO 02/57797和US 2004/0132104)。最近几年中虽然进行了很多努力，但是用于确定维生素D的所有可得的方法具有缺点，诸如费力的样品制备，差的标准化，测试程序间的差的一致性或者加料(spiked)维生素D的差的回收(就此特别参见Zerwekh,J.E.,见上文)。

在US 7,087,395中，金属氢氧化物和环糊精及其衍生物以及金属水杨酸盐已经用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，这导致了维生素D-结合蛋白或者其它血清蛋白的不可逆的变性。表面活性剂如Triton X100或者Tween-20已经用于防止维生素D化合物与变性后的样品中的脂质和蛋白进行非特异性结合。

特别难以使维生素D化合物的测试自动化。自动化要求解决非常困难的问题，即钢丝行走生存(surviving a tightrope walk)：一方面，必需在合适的释放试剂的帮助下从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物，另一方面，条件必需被选择使得所述样品可以直接进行进一步的分析。这种直接进一步的分析的先决条件是，一方面，内源性维生素D-结合蛋白在这种分析期间没有结合或者不再显著地结合维生素D化合物并由此不妨碍这种分析，而另一方面，所用的释放试剂没有妨碍检测试剂诸如抗体或维生素D-结合蛋白的结合。另外，众所周知，维生素D-结合蛋白的不同的等位基因存在于人群中，其生物化学表现不同。维生素D化合物的释放和测量应当对于各种等位基因/表型是可比较的。

因此，本发明的目的是开发一种用于维生素D化合物且特别是用于羟基维生素D化合物从样品中的维生素D-结合蛋白的释放的试剂组合物，其可以至少部分地解决现有技术的问题。在下文中描述了并且由所附权利要求涵盖了用于释放维生素D化合物的合适的试剂组合物、用于确定维生素D化合物的体外方法、试剂组合物的用途和使用该试剂组合物的用于确定维生素D化合物的试剂盒。

发明概要

本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：a)提供待研究的样品；以及b)使步骤(a)的样品与以下物质混合：i)含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，ii)还原剂，和iii)碱化剂，由此从维生素D-结合蛋白释放所述维生素D化合物。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于测量维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：a)提供待研究的样品；b)使步骤(a)的样品与以下物质混合：i)含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，ii)还原剂，和iii)碱化剂，由此从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物；以及c)测量步骤(b)中释放的维生素D化合物。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，包含一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，以及还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及试剂混合物，其包含待研究的样品、用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物以及碱化剂，所述试剂组合物包含一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，和还原剂，以及碱化剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂盒，其包含含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，以及还原剂的试剂组合物。

发明详述

本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：a)提供待研究的样品；b)使步骤(a)的样品与以下物质混合：i)含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，ii)还原剂，和iii)碱化剂，由此从维生素D-结合蛋白释放所述维生素D化合物。

如本申请所使用，以下各术语具有与其在该部分相关的含义。

本申请使用的冠词"一个"和"一种"是指一个或者多于一个(即至少一个)的合乎语法的物品对象(grammatical object of the article)。

表述“一个或者多个”是指1至50，优选1至20，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或者15。

如果没有另外叙述，术语“维生素D化合物”将被理解为包括包含根据以下结构式I和II的维生素D2的主链或维生素D3的主链的所有化合物。

在结构式I和II中，根据甾族化合物命名法，描述了维生素D的位置。25-羟基维生素D表示维生素D代谢产物，其在结构式I和II，即25-羟基维生素D₂以及25-羟基维生素D₃的位置25处羟基化。另外的已知的羟基维生素D化合物是例如1,25-二羟基维生素D和24,25-二羟基维生素D形式。

1,25-二羟基维生素D是指在结构式I和II的位置1以及位置25处具有羟基化作用的维生素D的活性形式(所谓的D激素)。

其它已知的维生素D化合物为24,25-二羟基维生素D₂、24,25-二羟基维生素D₃和C3-表-25-羟基维生素D。

令人惊讶的是，本发明人已经发现在本发明披露的体外方法中存在碳酸氢盐或者能够在碱性条件下水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质导致维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放。

本发明的“碳酸氢根离子”(bicarbonate ion)为具有经验式HCO₃ ^-以及61.01道尔顿的分子量的阴离子。

本发明的“碳酸氢盐”为选自下述的化合物：碳酸氢钠(NaHCO₃)、碳酸氢钾(KHCO₃)、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、碳酸氢钙(Ca(HCO₃)₂)和碳酸氢镁(Mg(HCO₃)₂)。

本发明实施方案的“能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质”为选自碳酸酯。本发明的“碳酸酯”为两侧具有两个烷氧基的羰基。这些碳酸酯的通用结构为R₁O(C＝O)OR₂。可使用环状碳酸酯(例如碳酸亚乙酯)或者非环状碳酸酯(例如碳酸二甲酯)以及其羟基化或者卤化衍生物。

优选地，方法步骤i)的所述碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质分别具有如下浓度：0.1M至1.5M，或者0.2M至1.0M，或者至少0.1、0.2、0.3或者0.4M，或者至多2.0、1.7、1.5、1.3、1.0或者0.75M。

在优选的实施方案中，所述碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙和碳酸氢镁。在另外优选的实施方案中，所述碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵。另外优选的碳酸氢盐选自碳酸氢钠和碳酸氢钾。

在优选的实施方案中，能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质为环状或者非环状的碳酸酯或者其各自的羟基化或者卤化衍生物。在另外优选的实施方案中，能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质为环状或者非环状的碳酸酯或者其各自的卤化衍生物。在另外优选的实施方案中，所述环状或者非环状的碳酸酯或者其卤化衍生物选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、碳酸丙烯酯、碳酸亚乙烯酯、碳酸三亚甲酯、赤藓醇二碳酸酯、丙三醇1,2-碳酸酯、4-氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮、4,5-二氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮、2,5-二氧杂己二酸二甲酯、碳酸1,2-丁烯酯、碳酸顺式2,3-丁烯酯和碳酸反式2,3-丁烯酯。另外优选的环状或者非环状的碳酸酯或者其卤化衍生物选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、碳酸丙烯酯、碳酸亚乙烯酯、碳酸三亚甲酯、赤藓醇二碳酸酯、丙三醇1,2-碳酸酯、4-氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮和4,5-二氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮。

另外优选的环状或者非环状的碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、丙三醇1,2-碳酸酯、碳酸丙烯酯和碳酸亚乙烯酯。另外优选的环状或者非环状的碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、丙三醇1,2-碳酸酯和碳酸丙烯酯。另外优选的环状或者非环状的碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯和丙三醇1,2-碳酸酯。

本领域技术人员已知为了获得本发明公开的效果，可以分别将一种或多种碳酸氢盐和一种或多种在水解后能够释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质任意混合。

在一个实施方案中，本发明方法步骤(i)的含有碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂在用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的适当条件下以至少2M溶于水溶液中。在另外的实施方案中，本发明方法步骤(i)的含有碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂在用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的适当条件下以至少1.5M或者更优选的至少1.0M溶于水溶液中。本领域技术人员已知的是如何将碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质溶解于水中以获得本发明方法步骤(i)的试剂。碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质应该在25℃在水中溶解。溶解于水溶液中的所述碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质应该能够在4℃的温度储存而不出现变质(drop out)或者结晶。

碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质与所述碱化剂各自的摩尔比优选为1:3和3:1之间，更优选地1:2和2:1之间且更优选地1:1.5和1.5:1之间。

本领域技术人员也应该认识到碱化剂与碳酸氢盐和/或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的摩尔比以相应的反应离子OH^-或者HCO₃ ^-的浓度来计算。

本领域技术人员已知的是可在本发明的方法中使用至少两种不同的碳酸氢盐和/或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的不同物质的各自的混合物。碳酸氢盐和/或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的所述混合物与所述碱化剂的摩尔比优选为1:3和3:1之间，更优选地1:2和2:1之间且更优选地1:1.5和1.5:1之间。

不被理论所束缚，很可能的是存在于试剂组合物中的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质导致pH变化。在预先处理反应过程中，所述碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质在试剂组合物中的较低浓度引起了试剂混合物的较缓慢的pH降低。在预先处理反应过程中，所述碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质在试剂组合物中的较高浓度引起了试剂混合物的较快的pH降低。也应该认识到由于碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质和还原剂在碱性缓冲条件下的协同作用，实现了维生素D-结合蛋白的不可逆的变性且由此促使维生素D化合物之后的检测。

在一个实施方案中，方法步骤ii)的所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、N-甲基马来酰亚胺、Ellman试剂和1,2-二硫杂环戊烷-3-羧酸。

在另外的实施方案中，方法步骤ii)的所述还原剂的特征在于步骤ii)的所述还原剂含有巯基。

在另外的实施方案中，方法步骤ii)的所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl和二硫苏糖醇(DTT)。

在一个实施方案中，方法步骤ii)的所述还原剂具有2mM至30mM的浓度，在另外的实施方案中，浓度为3mM至20mM，在另外的实施方案中，浓度为3.5mM至15mM，且在另外的实施方案中，浓度为4mM至10mM。

“碱化剂”可为碱金属氢氧化物或者碱土金属氢氧化物(即在水溶液中)。碱化剂也可包含碱金属氢氧化物和/或者碱土金属氢氧化物的混合物，即NaOH和KOH、NaOH和LiOH、NaOH和Ca(OH2)、KOH和Ca(OH)₂、KOH和LiOH以及其它组合。

“碱金属氢氧化物”为这样的一类化合物，其由碱金属阳离子以及氢氧根阴离子(OH^-)组成。碱金属氢氧化物为诸如NaOH、KOH、LiOH、RbOH和CsOH。“碱金属”为形成元素周期表第一族(IUPAC命名)的一系列化学元素：锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr)。

“碱土金属氢氧化物”为这样的一类化合物，其由碱土金属阳离子和2个氢氧根阴离子(OH^-)组成。“碱土金属”包含元素周期表第二族(IUPAC命名)(IIA族)的元素：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)和镭(Ra)。

在一个实施方案中，本发明方法步骤iii)的所述碱化剂选自NaOH、KOH、Ca(OH)₂和LiOH。

在另外的实施方案中，方法步骤iii)的所述碱化剂分别具有以下浓度：0.1M至2.0M，或者0.1M至1.5M，或者0.2M至1.75M或者0.2M至1.0M，或者至少0.1、0.2、0.3或者0.4M，或者至多2.0、1.7、1.5、1.3、1.0或者0.75M。

在另外的实施方案中，方法步骤iii)的所述碱化剂选自NaOH和KOH。

在另外的实施方案中，本发明方法中使用的所述碱化剂在样品+试剂i)+还原剂ii)+碱化剂iii)混合物中具有分别为0.1M至0.6M，或者0.2M至0.5M，或者至少0.1或者0.2M，或者至多0.6或者0.5M的终浓度。

在所述方法的另外的实施方案中，步骤i)、ii)和iii)的三种试剂与待研究的样品的混合比例分别优选为1:3和3:1之间。

在一个实施方案中，可按照任何移液顺序加入本发明方法的步骤a)的样品、步骤i)的含有碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的试剂+步骤ii)的所述还原剂+步骤iii)的所述碱化剂。混合后，在另外的实施方案中，本发明方法步骤b)的特征在于其在至少10、12、15或者20秒具有9.5至14的pH，另外优选的步骤b)在混合后在至少10、12、15或者20秒具有10.5至14的pH。

在本发明方法的一个实施方案中，使步骤a)的待研究的样品在步骤b)中与步骤i)的含有碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂、步骤ii)的还原剂和步骤iii)的碱化剂混合并孵育。孵育步骤b)的时间可按照需要的时长进行。孵育时间为例如15秒至24小时。在一个实施方案中，将本发明方法步骤b)的混合物孵育1至60分钟由此从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物。

方法步骤b)的组分的浓度可由本领域技术人员容易地选择以使得在与待研究的样品一起孵育的过程中，碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质、所述还原剂和所述碱化剂各自的特定pH范围以及预期浓度适于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物。

碱性条件导致维生素D-结合蛋白的变性以及待研究的样品的释放。所述碱化剂的浓度必须足以在预先处理反应中将“试剂混合物”(＝待研究的样品+本发明的试剂组合物+碱化剂)的pH增加为至少pH10.0，优选地，至少pH10.5，更优选地，至少11.0。本领域技术人员应该认识到，所述试剂混合物的pH需要在混合待研究的样品+本发明试剂组合物+碱化剂时进行测量。由于碳酸氢盐和/或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的水解，试剂混合物的pH降低(参见图1和实施例1.5)。

本申请使用的术语“样品”是指针对体外评价目的由个体获得的生物样品。在本发明的方法中，在一个实施方案中，待研究的样品为液体样品。在本发明另外的实施方案中，所述样品可包含任意的体液。在另外的实施方案中，待研究的样品为血液、血清或者血浆，其中血清或者血浆为最优选的。在另外的实施方案中，所述液体样品在滤纸或者滤膜上干燥。在一个实施方案中，本申请使用的样品是指由个体获得的样品的等分溶液。

本发明在另外的实施方案中，包括用于测量维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：(a)从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物以及(b)测量步骤(a)中释放的维生素D化合物。

在另外的实施方案中，本发明包括用于测量维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：(a)在有关的样品中释放与维生素D-结合蛋白结合的维生素D化合物以及(b)测量步骤(a)中释放的维生素D化合物。

在另外的实施方案中，本发明包括用于测量维生素D化合物的体外方法，其中测量的维生素D化合物选自25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃、24,25-二羟基维生素D₂、24,25-二羟基维生素D₃和C3-表-25-羟基维生素D。

在另外的实施方案中，本发明包括用于测量维生素D化合物的体外方法，其中测量的维生素D化合物选自25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃、24,25-二羟基维生素D₂和24,25-二羟基维生素D₃。

在另外的实施方案中，本发明包括用于测量维生素D化合物的体外方法，其中维生素D化合物确定为25-羟基维生素D₂和/或者25-羟基维生素D₃。

试剂组合物:

在一个实施方案中，本发明涉及用于从在待研究的样品中的维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，其含有一种碳酸氢盐和能够在水解后在溶液中释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，以及还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于从在待研究的样品中的维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，其含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至1.5M，以及还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于从在待研究的样品中的维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，其含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.2M至1.0M，以及还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于从在待研究的样品中的维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，其含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为至少0.1、0.2、0.3或者0.4M，以及还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于从在待研究的样品中的维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，其含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为至多2.0、1.7、1.5、1.3、1.0或者0.75M，以及还原剂。

在另外优选的实施方案中，试剂组合物中的碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢钙和碳酸氢镁。试剂组合物中进一步优选的碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵。试剂组合物中进一步优选的碳酸氢盐为碳酸氢钠和/或者碳酸氢钾。

在另外优选的实施方案中，所述试剂组合物中能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质为环状或者非环状的碳酸酯或者其各自的羟基化或者卤化衍生物。

在另外优选的实施方案中，所述试剂组合物中能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质为环状或者非环状的碳酸酯或者其各自的卤化衍生物。在另外优选的实施方案中，所述试剂组合物中所述环状或者非环状的碳酸酯或者其卤化衍生物选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、碳酸丙烯酯、碳酸亚乙烯酯、碳酸三亚甲酯、赤藓醇二碳酸酯、丙三醇1,2-碳酸酯、4-氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮、4,5-二氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮、2,5-二氧杂己二酸二甲酯、碳酸1,2-丁烯酯、碳酸顺式2,3-丁烯酯和碳酸反式2,3-丁烯酯。所述试剂组合物中另外优选的环状或者非环状的碳酸酯或者其卤化衍生物选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、碳酸丙烯酯、碳酸亚乙烯酯、碳酸三亚甲酯、赤藓醇二碳酸酯、丙三醇1,2-碳酸酯、4-氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮和4,5-二氯-1,3-二氧杂环戊-2-酮。所述试剂组合物中另外优选的环状或者非环状的碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、丙三醇1,2-碳酸酯、碳酸丙烯酯，碳酸亚乙烯酯。所述试剂组合物中另外优选的环状或者非环状的碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯、丙三醇1,2-碳酸酯、碳酸丙烯酯和碳酸亚乙烯酯。所述试剂组合物中另外优选的环状或者非环状的碳酸酯选自碳酸亚乙酯、碳酸二甲酯和丙三醇1,2-碳酸酯。

本发明涉及在另外的实施方案中，试剂组合物的特征在于所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、N-甲基马来酰亚胺、Ellman试剂和1,2-二硫杂环戊烷-3-羧酸。

在另外的实施方案中，本发明涉及试剂组合物，其特征在于所述还原剂含有巯基。

在另外的实施方案中，本发明涉及试剂组合物，其特征在于所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl和二硫苏糖醇(DTT)。

在本发明的某些实施方案中，所述还原剂的浓度为2mM至30mM，在另外的实施方案中，所述浓度为3mM至20mM，在另外的实施方案中，所述浓度为3.5mM至15mM，以及在另外的实施方案中，所述浓度为4mM至10mM。

本领域技术人员已知的是，还原剂的能力取决于官能团即还原基团的存在。因此，本领域技术人员已知的是根据活性还原基团的数目来选择还原剂的适当浓度。

编码维生素D-结合蛋白的基因以不同的等位基因的形式出现在人类群体中。已知的是由这些等位基因编码的多肽在生物化学上不同，即它们产生不同的表型。这些生物化学差异也影响维生素D化合物的结合和释放。本发明的试剂组合物适用于释放独立于维生素D-结合蛋白表型的维生素D化合物。因此，本发明优选的实施方案为本发明的试剂组合物在将维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放中的用途。

在一个实施方案中，本发明的试剂组合物用于从待研究的样品中的维生素D-结合蛋白释放与维生素D-结合蛋白表型无关且独立于该表型的维生素D化合物。

针对从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的目的，使本发明的试剂组合物与待研究的样品例如血清或者血浆以及碱化剂混合。

试剂混合物:

本申请如下使用的术语“试剂混合物”包含待研究的样品、本发明的试剂组合物以及碱化剂。

在另外的实施方案中，所述试剂混合物的特征在于所述碱化剂选自NaOH、KOH、Ca(OH)₂和LiOH。

在另外的实施方案中，所述试剂混合物的特征在于所使用的碱化剂分别具有以下浓度：0.1M至2.0M，或者0.1M至1.5M，或者0.2M至1.75M，或者0.2M至1.0M，或者至少0.1、0.2、0.3或者0.4M，或者至多2.0、1.7、1.5、1.3、1.0或者0.75M。

在另外的实施方案中，所述试剂混合物的特征在于所述碱化剂选自NaOH和KOH。

在另外的实施方案中，本发明方法中使用的所述碱化剂在试剂混合物中分别具有以下的终浓度：0.1M至0.6M，或者0.2M至0.5M，或者至少0.1或者0.2M，或者至多0.6或者0.5M。

在一个实施方案中，试剂组合物和碱化剂与待研究的样品的混合比优选在1:3和3:1之间。

可以任何移液顺序加入待研究的样品、本发明披露的试剂组合物以及碱化剂以形成试剂混合物。混合后，在另外的实施方案中，所述试剂混合物的特征在于其在至少10、12、15或者20秒内具有9.5至14的pH，另外优选的试剂混合物在混合后在至少10、12、15或者20秒内具有10.5至14的pH。

使待研究的样品与本发明的试剂组合物以及碱化剂混合并孵育。该步骤也可称为预先处理步骤。所述预先处理步骤可按照需要的时长进行。所述孵育时间为例如15秒至24小时。在一个实施方案中，孵育所述试剂混合物1至60分钟以将维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放。在另外的实施方案中，孵育所述试剂混合物4至10分钟以将维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放。

所述试剂混合物以及其中的组分浓度可由本领域技术人员容易地选择，以使得在与待研究的样品一起孵育过程中所述碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质、还原剂和碱化剂各自的特定pH范围和预期浓度适于将维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放。

在一个实施方案中，所述试剂混合物还包含如在本发明的试剂组合物中所述的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的优选的物质。

优选地进行维生素D化合物的检测，以使得能够检测到选自包含25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃、24,25-二羟基维生素D₂、24,25-二羟基维生素D₃和C3-表-25-羟基维生素D的至少一种维生素D化合物。

在维生素D化合物的特定检测过程中，还包括在预先处理步骤之后的孵育步骤。试剂混合物中存在的所述还原剂的剩余可通过加入非特异性蛋白优选地例如人血清白蛋白(HSA)进行阻断。该非特定的蛋白可分开加入或者可简单地包含于还包含检测试剂的溶液中。通过阻断所述还原剂的残余还原能力，可以使用与维生素D化合物的蛋白质特异结合试剂来进行维生素D化合物的非危害性检测(noncompromised detection)。

如本领域技术人员将要认识到的，包含特异性结合剂的溶液将含有pH缓冲系统，其保证了在将含有所述特异性结合剂的溶液加入至所述试剂混合物之后，pH为维生素D化合物与所述特异性结合剂结合的必要条件。只要发生所述特异性结合剂与维生素D化合物的结合，必需的缓冲系统以及最终的pH均不是关键的。在维生素D-结合蛋白用作特异性结合剂的情况下，在孵育步骤过程中的pH优选地为pH6.0和pH9.0之间。在抗体用作针对维生素D化合物的特异性结合剂的情况下，在该孵育步骤过程中的pH优选地为pH5.5和pH7.5之间。

包含所述特异性结合剂的溶液优选地含有20mM至400mM的缓冲系统。同样优选的是，所述缓冲剂具有50mM和350mM之间或者100mM和300mM之间的摩尔浓度。

基于本发明所披露的，用于检测维生素D化合物的体外方法可以各种方式来进行。

原则上，与一种或者多种维生素D化合物结合的所有蛋白性结合配偶体(partner)诸如特异性结合多肽可用作特异性结合剂。特异性结合剂可为抗体或者维生素D-结合蛋白本身。

许多商业测试系统是基于用抗生物素蛋白(avidin)或者抗生物素蛋白链菌素(SA)涂覆的固相的使用的，例如SA-涂覆的微量滴定板(microtitreplate)或者SA-涂覆的胶乳(latices)。

在测试操作之前或者过程中，例如，生物素化的分析物衍生物结合至该SA固相上。当检测维生素D化合物时，该生物素化的分析物衍生物化合物可为例如生物素化的25-羟基维生素D₂和/或者生物素化的25-羟基维生素D₃。

在本发明的一个实施方案中，体外检测方法按照竞争性测定来进行。在所述竞争性测试中，以确定量加入至测试物中的维生素D化合物衍生物与来自样品的相应的维生素D化合物针对特异性结合剂的结合位点进行竞争。样品中存在的维生素D化合物越多，检测信号越小。

在一个实施方案中，维生素D化合物衍生物为生物素化的维生素D化合物。在另外的实施方案中，所述生物素化的维生素D化合物为生物素化的25-羟基维生素D₂和/或者生物素化的25-羟基维生素D₃。在另外的实施方案中，所述生物素化的维生素D化合物为生物素化的25-羟基维生素D₂。

如上所提及的，在本发明披露的检测方法中使用的优选的特异性结合剂为抗体和维生素D-结合蛋白。如果以竞争性测定形式来使用，则维生素D-结合蛋白将导致所有维生素D化合物与其对一种或者多种(生物素化的)维生素D化合物衍生物的结合进行竞争的整合测量。在一个实施方案中，所述维生素D-结合蛋白为可检测的标记，例如钌标记的(ruthenylated)。

用途:

在一个实施方案中，本发明涉及试剂组合物与碱化剂一起在从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物中的用途。

在另外的实施方案中，本发明涉及试剂组合物与碱化剂在从维生素D-结合蛋白中释放预期存在于待研究的样品中的维生素D化合物中的用途。

在另外的实施方案中，本发明涉及试剂组合物与碱化剂在检测维生素D化合物的方法中释放维生素D化合物中的用途。

在另外的实施方案中，本发明涉及含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M、2mM至30mM的还原剂的试剂组合物与1M至1.5M的碱化剂溶液在检测维生素D化合物的方法中从维生素D-结合蛋白中释放预期存在于待研究的样品中的维生素D化合物中的用途。

在一个实施方案中，试剂组合物的用途还包括就在本发明试剂组合物所述的优选的碳酸氢盐的物质或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质。

试剂盒:

在一个实施方案中，本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂盒，其含有试剂组合物，其含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，以及还原剂。

在一个实施方案中，本发明涉及用于检测维生素D-结合蛋白中的维生素D化合物的试剂盒，其特征在于其包含试剂组合物和碱化剂，所述试剂组合物具有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，还原剂和碱化剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测维生素D-结合蛋白中的维生素D化合物的试剂盒，其特征在于其包含试剂组合物以及碱化剂，所述试剂组合物具有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M、2mM至30mM的还原剂和碱化剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测维生素D-结合蛋白中的维生素D化合物的试剂盒，其特征在于其除了检测组分之外还包含试剂组合物和1M至1.5M的碱化剂溶液，所述试剂组合物具有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M、2mM至30mM的还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测维生素D化合物的试剂盒，其特征在于除了包含特异性结合剂的溶液之外还包含试剂组合物和碱化剂溶液，所述试剂组合物具有碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质、还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测维生素D化合物的试剂盒，其特征在于其包含试剂组合物、1M至1.5M的碱化剂溶液以及包含特异性结合剂的溶液，所述试剂组合物具有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M、2mM至30mM的还原剂。

在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测维生素D化合物的试剂盒，其特征在于其包含试剂组合物、1M至1.5M的碱化剂溶液以及包含特异性结合剂的溶液，所述试剂组合物具有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M、2mM至30mM的还原剂，所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl和二硫苏糖醇(DTT)，所述碱化剂选自NaOH、KOH、Ca(OH)₂和LiOH。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包含如在本发明的试剂组合物中所述的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的优选的物质。

已经证实本发明的试剂组合物适用于维生素D化合物的自动化测试。本发明优选地涉及本发明的试剂组合物特别在确定维生素D化合物的测试中在从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物中的用途。

针对维生素D化合物的测试优选地完全自动化。在该情况下，完全自动化表示试验人员仅需要将待研究的样品以及含有用于测量维生素D化合物的所有组分的试剂包置于自动化分析器上且所有另外步骤由分析器自动进行。完全自动化测试具体地优选地在来自Roche Diagnostics的分析器上进行。

在另外的实施方案中，本发明的试剂组合物在用于检测维生素D化合物的体外方法中使用，所述维生素D化合物选自25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃、24,25-二羟基维生素D₂、24,25-二羟基维生素D₃和C3-表-25-羟基维生素D。

如上已经提及的，25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃为用于诊断的维生素D的具体相关形式。在本发明的体外方法中，25-羟基维生素D₂或者25-羟基维生素D₃或者两者通过对于25-羟基维生素D₂或者25-羟基维生素D₃的特异性抗体的特异性检测也代表了优选的实施方案。

本发明进一步通过下述实施例和附图阐明。实际的保护范围由本发明随附的权利要求得到。

附图说明:

图1:在预先处理步骤的过程中的试剂混合物的pH变化。测定如在实施例1.5中阐述的来进行。试剂组合物(A)含有各种浓度的碳酸亚乙酯(EC)：0.00M(●)、0.10M(◆)、0.30M(□)、0.50M(▲)、0.75M(○)、1.00M(■)、1.50M(◇)EC。X轴显示时间(分钟)，Y轴为pH。

图2:如在实施例1.5所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有各种浓度的碳酸亚乙酯(EC)：1.50M(●)、1.00M(□)、0.75M(◆)、0.50M(○)、0.30M(▲)和0.10M(◇)EC。X轴显示浓度(ng/ml)，Y轴显示如通常使用来自Roche Diagnostics公司的系统所确定的计数。

图3:如在实施例1.5所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有各种浓度的所述还原剂二硫苏糖醇(DTT)：1.0mM(□)、2.0mM(●)、4.0mM(◆)、6.7mM(○)、10.0mM/12.0mM(▲)、15.0mM(◇)。X轴显示浓度(ng/ml)，Y轴显示如通常使用来自Roche Diagnostics公司的系统所确定的计数。

图4a:方法比较:维生素D测定(实施例1)和液相色谱-串联质谱法(LC-TMS)。25-羟基维生素D通过LC-TMS以及实施例1.5的维生素D测定来确定，其中具有0.5M碳酸亚乙酯(EC)的试剂组合物(A)用于孵育。针对多重血清样品的结果(ng/ml)绘于LC-TMS的X轴以及实施例1.5的维生素D测定的Y轴上。

(–––)y＝x

(——)线性回归

维生素D测定＝2.0116+0.9036*x,皮尔逊系数r(Pearsons r)＝0.9509

图4b:方法比较:维生素D测定(实施例1)和LC-TMS。25-羟基维生素D通过LC-TMS以及实施例1.5的维生素D测定来确定，其中不具有碳酸亚乙酯(EC)的试剂组合物(A)用于孵育。针对多重血清样品的结果(ng/ml)绘于LC-TMS的X轴以及实施例1.5的维生素D测定的Y轴上。

(–––)y＝x

(——)线性回归

维生素D测定＝0.7496+0.7338*x,皮尔逊系数r＝0.7914

图5:如在实施例2所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有0.5M碳酸亚乙酯(◆)、0.5M Na₂CO₃(○)、0.5M NaH₂PO₄(▲)、0.5MNaCl(◇)和对照(□)。X轴显示浓度(ng/ml)，Y轴显示如通常使用来自RocheDiagnostics公司的系统所确定的计数。

图6:如在实施例3所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有：

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC或者

▲:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT或者

□:10mM NaOH,4mM EDTA。

X轴显示浓度(ng/ml)，Y轴显示如通常使用来自Roche Diagnostics公司的系统所确定的计数。

图7:如在实施例4所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有：

○:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M碳酸二甲酯。

图8:如在实施例5所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有：

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

○:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M NaHCO₃ ^-者

▲:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M NaHCO₃ ^-+0.5M乙二醇或者

□:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT。

图9:如在实施例4所述的维生素D测定的校准曲线，其中试剂组合物(A)含有：

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

○:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M甘油-1,2碳酸酯。

实施例1

用于检测25-羟基维生素D的测定

根据厂商说明书使用商业测定。所述25-羟基维生素D确定通过HPLC(测试25(OH)维生素D₃，来自“Immundiagnostik”Company,Bensheim,序号KC3400)或者通过如在文献中所述的LC-MS/MS(Vogeser,M.et al.,Clin.Chem.50(2004)1415-1417)来进行。

对于新的测试的成分制备以及一般测试方法如下所述：

1.1羟基维生素D₂-3-2’-氰基乙醚的合成

在氩气气氛下将20.6mg(50μmol)25-羟基维生素D₂(Fluka号17937)在配备有内部温度计的25ml三颈圆底烧瓶中溶于10ml无水乙腈中。将1.5ml叔丁醇/乙腈(9:1)加入至溶液中并在冰浴中冷却至6℃。随后加入820μl丙烯腈溶液(86μl丙烯腈溶于1.0ml乙腈中)并在6℃搅拌15分钟。然后加入205μl氢化钾溶液(25mg KH溶于0.5ml9:1的叔丁醇/乙腈中)。在获得澄清溶液之后出现短暂的絮凝。将反应溶液在6℃搅拌另外45分钟并随后在4℃搅拌60分钟。

随后将反应溶液用10ml甲基-叔丁醚中稀释并每次用10ml H₂O洗涤两次。将有机相用约1g无水硫酸钠干燥，经G3玻璃料漏斗滤过并在旋转蒸发器上蒸发。将其在高真空干燥，形成粘稠的澄清残留物，其具有约55mg的质量。

1.2羟基维生素D₂-3-3-氨基丙基醚的合成

将上面获得的全部腈溶于15ml乙醚中并在搅拌的同时与7.5mg氢化锂在7.5ml乙醚中的混悬液混合。将反应混合物在室温搅拌1小时。之后，加入38.4mg氢化铝锂在6.6ml乙醚中的混悬液。这导致混合物的强的浑浊度。将反应混合物在室温搅拌另外1小时，然后将反应混合物在冰浴中冷却至0-5℃并小心地加入35ml水。通过加入6.6ml10M氢氧化钾溶液将pH调节为强碱性。

将其每次用65ml甲基-叔丁醚萃取三次。将合并的有机相使用约5g无水硫酸钠干燥，滤过并在室温在旋转蒸发器上蒸发。使用油泵将残留物干燥为恒重。将粗产物溶于5ml DMSO和3.0ml乙腈中并通过制备性HPLC纯化。

洗脱剂A＝Millipore-H₂O+0.1％三氟乙酸；

洗脱剂B＝95％乙腈+5％Millipore-H₂O+0.1％TFA；

梯度：50％B至100％B，100分钟

流速：30ml/min

温度：室温

柱尺寸：L＝25cm

柱材料：Vydac C18//15-20μm

检测波长：226nm

在圆底烧瓶中收集根据分析性HPLC(Vydac C18//5μm；4.6x250mm)确定的产物含量大于85％的馏分并低压冻干。得到13.7mg(收率：58％)，其为无色冷冻干燥物。

1.3羟基维生素D₂-3-3’-N-(半环庚基)氨基丙基-醚-生物素-(β-丙氨酸)-谷氨酸-谷氨酸-赖氨酸(ε)结合物(hydroxyvitaminD₂-3-3’-N-(hemisuberyl)aminopropyl-ether-biotin-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(epsilon)conjugate)(＝Ag-Bi)的合成

将13.7mg(25μmol)羟基维生素D₂-3-3′-氨基丙基醚溶于3.5ml DMSO中，加入28.7mg(30μmol)生物素-(β-丙氨酸)-谷氨酸-谷氨酸-赖氨酸(ε)-半-辛二酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Applied Science,No.11866656)和12.5μl三乙胺并将其在室温搅拌过夜。将反应溶液用4.5ml DMSO稀释，经0.45μm微过滤器滤过，随后通过制备性HPLC(条件参见实施例2.3b))纯化。收集含有根据分析性HPLC确定的大于85％的产物的馏分并低压冻干。得到9.8(收率：30％)经纯化的生物素结合物。

1.4维生素D-结合蛋白的钌化(Ruthenylation)以及通过凝胶过滤色谱法的纯化

将维生素D-结合蛋白转移至100mM磷酸钾/150mM氯化钠缓冲剂pH8.5中并将蛋白浓度调节为5-10mg/ml。将钌化剂(钌(II)三(联吡啶)-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶于DMSO中并加入至抗体溶液中，摩尔比为3比1。反应时间45分钟后，通过加入l-赖氨酸终止反应，并将钌化的维生素D-结合蛋白(＝DBP-Ru)经凝胶过滤在Superdex200柱上纯化。

1.5测定中的测试操作

使用来自Roche Diagnostics公司的系统测量待研究的样品。

通过使待研究的样品与试剂组合物(A)和碱化剂(B)混合形成试剂混合物。

在该实施例中，试剂混合物由15μl样品与15μl试剂组合物(A)和10μl所述碱化剂(B)混合形成。将试剂混合物孵育9分钟。在下一步中，将70μl检测试剂(溶液C)加入至试剂混合物中并孵育另外的9分钟。在最后一步中，加入生物素化的细胞壁抗原(溶液D)(60μl)以及用抗生物素蛋白链菌素(SA)(30μl)涂覆的30μl磁化聚苯乙烯颗粒(混悬液E)。另外的9分钟孵育之后，照常确定结合的钌化维生素D-结合蛋白的量(参见图1、2、3、4a、4b)。

试剂组合物(A)含有：

10mM NaOH

4mM EDTA

6.7mM 二硫苏糖醇(DTT)

0.5M 碳酸亚乙酯(EC)

pH 5.5

碱化剂(B)含有：

1.375M NaOH

具有钌化维生素D-结合蛋白(DBP-Ru)的溶液C含有：

0.2M 二-三-丙烷(pH7.5)

2.5％人血清白蛋白(HSA)

50mM NaCl

1％甘露醇

0.1％ Oxypyrion

0.12μg/mL DBP-Ru

具有钌化细胞壁抗原的溶液D含有：

0.2M二-三-丙烷(pH8.6)

0.5％吐温-20溶液

0.1％ Oxypyrion

30ng/ml 生物素

0.0108μg/mL Ag-Bi(来自实施例1.1)

具有SA-涂覆的胶乳颗粒的混悬液E含有：

0.72mg/ml具有470ng/ml的结合能力的SA-涂覆的磁化聚苯乙烯颗粒。

实施例2

碳酸酯与金属盐、磷酸盐缓冲剂和碳酸盐的比较

使用来自Roche Diagnostics公司的系统测量待研究的样品。总计测定操作在实施例1.5中显示。

与实施例1.5不同的是，试剂组合物(A)分别含有0.5M碳酸亚乙酯(EC)、0.5M Na₂CO₃、0.5M NaCl或者0.5M NaH₂PO₄。

试剂组合物(A)：

10mM NaOH

4mM EDTA

6.7mM DTT

0.5M EC、Na₂CO₃、NaCl或者NaH₂PO₄

作为对照，使用含有10mM NaOH、4mM EDTA、6.7mM DTT的试剂组合物(A)。结果显示于图5中。碳酸酯(0.5M EC(◆)，存在于碱性预先处理试剂混合物中)在竞争性测定中引起信号增强作用。特别是相比于不具有EC(□)的测试，信号动力学得到改善。盐(0.5M NaCl,(◇))显示无作用。加入0.5MNa₂CO₃(○)或者0.5M NaH₂PO₄(▲)显示信号的较小作用。

实施例3

具有/不具有碳酸酯的碱性预先处理

使用来自Roche Diagnostics公司的系统测量待研究的样品。测定操作在实施例1.5中显示。

与实施例1.5不同的是，已经制备了三种不同的试剂组合物，其分别含有：

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

▲:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT或者

□:10mM NaOH,4mM EDTA。

在样品+醚◆(在实施例1.5中所述的试剂组合物(A)+碱化剂(B))、▲或者□(＝试剂混合物)的4分钟预先处理孵育之后且在加入溶液C之前，通过加入二-三-丙烷pH6.3，试剂混合物的pH已经设定为pH9(图6)。存在于碱性预先处理(试剂混合物)中的碳酸酯EC在竞争性测定中引起信号增强作用。特别是相比于不具有EC的测试，信号动力学得到改善。

实施例4

碳酸亚乙酯与碳酸二甲酯

与实施例1.5不同的是，已经制备了两种不同的试剂组合物(A)，其分别含有：

○:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M碳酸二甲酯。

碳酸酯、碳酸亚乙酯或者碳酸二甲酯分别显示相同的测定表现(图7)。

实施例5

碳酸亚乙酯的水解产物的作用

与实施例1.5不同的是，已经制备了五种不同的试剂组合物(A)，其分别含有：

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

○:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M NaHCO₃ ^-者

▲:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M NaHCO₃ ^-+0.5M乙二醇

□:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT。

EC的碱性水解产物为乙二醇，其对该测定不具有影响(▲)。碳酸氢钠(NaHCO₃)也显示信号增强作用，但不如碳酸酯作用强(图8)。

实施例6

碳酸亚乙酯与甘油1,2-碳酸酯

◆:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M EC(参见实施例1.5)或者

○:10mM NaOH,4mM EDTA,6.7mM DTT,0.5M甘油1,2-碳酸酯。

碳酸酯、碳酸亚乙酯或者甘油1,2-碳酸酯分别显示相同的测定表现(图9)。

Claims

1.用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：

a)提供待研究的样品以及

b)使步骤(a)的样品与以下物质混合：

i)含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的试剂，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，

ii)还原剂，和

iii)碱化剂，

由此从维生素D-结合蛋白释放所述维生素D化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述步骤(i)的试剂在用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的适当条件下在水溶液中为可溶的。

3.权利要求1或2中任一项的方法，其中能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的所述物质为环状或者非环状的碳酸酯或者其各自的羟基化或者卤化衍生物。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述样品为液体样品。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述样品为血液、血清或者血浆。

6.用于测量维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：

a)根据权利要求1至5中任一项的方法从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，以及

b)测量步骤(a)中释放的维生素D化合物。

7.权利要求6的方法，其中所述维生素D化合物选自25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃、24,25-二羟基维生素D₂、24,25-二羟基维生素D₃和C3-表-25-羟基维生素D。

8.权利要求7的方法，其中确定了所述维生素D化合物为25-羟基维生素D₂和/或者25-羟基维生素D₃。

9.试剂组合物用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的用途，其包含一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，以及还原剂。

10.权利要求9的用途，其特征在于所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、N-甲基马来酰亚胺、Ellman试剂和1,2-二硫杂环戊烷-3-羧酸。

11.权利要求9的用途，其特征在于所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl和二硫苏糖醇(DTT)。

12.权利要求9至11中任一项的试剂组合物的用途，其特征在于所述还原剂具有2mM至30mM的浓度。

13.试剂混合物，包含待研究的样品、含有一种碳酸氢盐和能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质，其中来自所述碳酸氢盐和释放自能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的物质的碳酸氢根离子(HCO₃ ^-)的总浓度为0.1M至2.0M，以及还原剂的试剂组合物以及选自NaOH、KOH、Ca(OH)₂和LiOH的碱化剂，其中所述样品为血液、血清或者血浆，且其中所述碱化剂具有0.1M至2.0M的浓度。

14.权利要求9至12中任一项的试剂组合物的用途，其特征在于所述试剂组合物还包含选自NaOH、KOH、Ca(OH)₂和LiOH的碱化剂，其中所述碱化剂具有0.1M至2.0M的浓度。