CN103889448A - 用于预防和治疗人、动物和细胞培养物感染的尿枝原体疫苗和抗体 - Google Patents

Abstract

本发明包括用于尿枝原体（Ureaplasma）感染预防和/或治疗的方法和组合物。在特别的情况下，本发明涉及用于尿枝原体的疫苗，包括DNA疫苗。在某些实施方案中，本发明涉及针对尿枝原体的多条带抗原的疫苗。

Description

用于预防和治疗人、动物和细胞培养物感染的尿枝原体疫苗和抗体

本申请要求2011年4月29日提交的美国临时申请系列号61/480,639的优先权，该美国临时申请通过提及而以其整体合并入本文。

技术领域

总体而言，本发明涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学、感染性疾病和医学领域。在特殊的实施方案中，本发明涉及关于尿枝原体的免疫学组合物和相关方法，包括疫苗。

发明背景

存在有多达7种尿枝原体物种。两种与人感染相关的物种为小尿枝原体（Ureaplasma parvum）和解脲尿枝原体（Ureaplasmaurealyticum）。所有的物种都属于枝原体科（Mycoplasmataceae），尿枝原体属（Ureaplasma）。它们是缺乏细胞壁的原核生物，并因此对于青霉素和革兰氏染色不敏感。它们是小的（0.1-0.85um）并且在肉汤培养物中通过暗视野或相差显微术而得到最佳显现，但它的多形性质使得难以在培养基中鉴定其。因此，在固体培养基上识别生物典型菌落（7-30um），并且是用于进行鉴定的必要条件（Taylor-Robinson和Gourley,1984）。

尿枝原体需要尿素用于进行生长（甚至在高度复杂的培养基中），并且产生允许该生物代谢尿素的脲酶（Pollack,1986）。它们不合成叶酸，并因而对于磺胺类或甲氧苄啶不易感。尿枝原体产生溶血素（Furness,1973；Shepar和Masover,1979）。尿枝原体看起来通过独特的机制附着至各种各样的宿主细胞，然后侵入所述宿主细胞（Busolo等人,1984；Masover等人,1977；Robertson等人,1991；Saada等人,1991；Shepard和Masover,1979；Torres-Morquecho等人,2010）。已将这与细胞凋亡（Li等人,2002）和增加的炎性细胞因子相关联。数人已报道，可以使用Hela（McGarrity和Kotani,1986；Smith等人,1994）或A549（Torres-Morquecho等人,2010）细胞来研究该附着。

可以将分离自各种不同宿主的已确立和未成为物种的尿枝原体物种和血清变型之中的血清学和基因组学关系总结如下。（人的）被分为两个基因组聚簇（小尿枝原体和解脲尿枝原体）。差异尿枝原体（Ureaplasma diversum）（牛的）具有三个血清学聚簇，其鉴定所有差异尿枝原体株系。非人灵长类的株系形成四个血清学群，并且每个血清群由从属于四个不同动物学灵长类科之一的灵长类分离出的株系组成。绵羊-山羊的株系具有两个血清学聚簇。犬的株系形成四个血清学聚簇，但血清变型1和2由于DNA同源性而紧密相关。鸟类的株系属于具有两个基因组聚簇的一个血清群（Barile MF,Pediatr InfectDis19865(6Suppl):S296-9）。

解脲尿枝原体和小尿枝原体在其数目众多的株系中具有通过血清学和生物学特征所定义的至少14种血清型。这些血清型最近已被细分为两种生物变型：解脲尿枝原体或群2（血清型2、4、5、7、8、9、10、11、12、13）；小尿枝原体或群1（血清型1、3、6、14）（Robertson等人,2001）。各种不同株系的基因组大小看起来变化很大，并且相应于两个血清变型聚簇。聚簇群1的基因组大小为大约760kb，而群2的范围在880至1140kb（Robertson等人,1990）。血清变型鉴定可以通过血清学（Roberson和Stemke,1982）、免疫荧光（Roberson和Stemke,1982）和ELISA（Brown等人,1981；Horotzitz等人,1995）来完成。后者是劳动强度最小的，并且已得到再现（Turunen等人,1982；Wiley和Quinn,1984）。由于可变的生长速率（Stemke和Robertson,1985）和每个样品的多种血清变型（Quinn,1986），检测出所有血清变型可能是困难的。

分离尿枝原体的最灵敏的方法在于将样品接种入液体培养基中并传代培养至琼脂（Robertson,1978；Taylor-Robinson等人,1967；Taylor-Robinson和Gourley,1984；Taylor-Robinson,1989）。当将样品直接铺板在琼脂上时，菌落有时候不能形成。在液体培养基中，通过其脲酶活性来检测生物。通常由于缺乏经典的煎蛋外观而在琼脂上出现小的菌落，但改进的培养基增加了菌落大小，并且硫酸锰或氯化钙（两者都是氨的灵敏的指示剂）导致暗棕色的尿枝原体菌落（Shepard和Masover,1979；Taylor-Robinson和Gourlay,1984；Taylor-Robinson,1989）。

多条带抗原（multiple banded antigen，MBA）基因存在于尿枝原体的所有血清变型中（Teng等人,1994）。该基因看起来在该生物的毒力中发挥重要的作用（Kong等人,1999），并且该基因的5’区域是生物变型特异性和多样性的标志物（Teng等人,1994）。该区域不仅可被用于区分小尿枝原体与解脲尿枝原体，它还表明可能存在解脲尿枝原体物种的5种MBA基因型：A（血清变型2、5、8）、B（血清变型10）、C（血清变型4、12、13）、D（血清变型9）、E（血清变型7、11）。已对MBA基因进行了克隆和测序（Zheng等人,1994）。MBA基因由编码信号肽和膜锚定物的保守区段以及编码许多一致的重复单元的可变区段组成（Zimmerman等人,2011）。因此，在本发明的特殊的实施方案中，编码恒定区域的MBA基因的那个部分的选择是用于疫苗或抗体开发的优异靶标。选择血清型6的MBA基因用于本发明的疫苗的初始开发，因为它是经常被分离出的临床血清型（Vancutsem等人,2008）。MBA看起来在该生物的附着中是重要的（Monecke等人,2003；Torres-Morquecho等人,2010）。MBA还看起来通过TLR1、TLR2和TLR6来激活NF-kappaB，并且诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（Shimizu等人,2008）。体内MBA变体的数目与临床炎症的发展负相关（Knox等人,2010）。

已经开发出了简单和快速的尿枝原体鉴定方法，但现在只能确认培养物。固相酶免疫测定法是不可靠的（Taylor-Ronbinson,1989）。全染色体DNA探针是不灵敏的（尤其是，<10³ccu/ml）并且对于培养物-阴性的样品来说是阳性的（Roberts等人,1987）。尿枝原体的PCR看起来是非常好的感染指示剂（Blanchard和Gautier,1990；Willoughby等人,1990），并且临床评价已确认了这一点（Abele-Horn等人,1996；Blanchard等人,1993；Cunliffe等人,1996），但是商业试剂盒仍然不容易得到。

生物的临床重要性：尿枝原体是与宽范围的在男性和女性中的临床疾病相关的性传播感染，所述疾病包括非淋球菌性尿道炎、泌尿道结石形成、化脓性关节炎和不育。在男性中，它引起非淋球菌性尿道炎和前列腺炎。在女性中，它引起盆腔炎性疾病、习惯性流产、绒毛膜羊膜炎、死产、早产、低出生体重和产后子宫内膜炎。在新生儿中，它与几种疾病相关，包括肺炎、脓毒症、脑膜炎、骨髓炎、死亡、脑室内出血、脑室周围白质软化病、坏死性小肠结肠炎（Pediatr.Res.2011May,69(5Pt1):442-7）和慢性肺病（O’Leary,1990；Pinna等人,2006；Waites等人,2005）。然而，在被该生物移殖建群（colonize）的患者中存在有这些疾病的可变的发生（Krause和Taylor-Robinson,1992）。在被移殖建群的患者中疾病的可变发展指明了致病株系中的毒力因子，或者抗体、变异性或两者。

关于非怀孕女性的生殖道移殖建群的数据是有限的，但看起来在性工作者（44%）、STD门诊客户（40%）（Kong等人,1999）、计划生育门诊客户（43%）（Domingues等人,2002）、有症状的（48%）和无症状的（22%）STD门诊患者（Gupta等人,2008）中是高的。此外，已从12%（9%为解脲尿枝原体，3%为小尿枝原体）的所有不育男性的精液中分离出了尿枝原体，而从3%（2%为小尿枝原体，1%为解脲尿枝原体）的能育男性的精液中分离出了尿枝原体（Zeighami等人,2009）。

在怀孕女性中下生殖道被尿枝原体移殖建群是非常普遍的，从44%至88%变动（Carey等人,1991；Cassell等人,1993；Eschenbach,1993；Kundsin等人,1996；Luton等人,1994）。下生殖道被血清型3或6尿枝原体移殖建群在51%的女性中与对于这些尿枝原体血清型的可变区域的MBA抗体响应相关，而15%的未被这些生物移殖建群的女性显示出相同的抗体（Vancutsem等人,2008）。

在怀孕女性中上生殖道或羊膜液被尿枝原体移殖建群看起来与不利的怀孕结果（包括自发流产、早产、产前胎膜破裂和产后子宫内膜炎）强烈地相关，并且可以以没有微观或临床的炎症征候的方式发生（Andrews等人,1995；Cassell等人,1983；Font等人,1995；Gray等人,1992；Hazan等人,1995；Horowitz等人,1995；Kundsin等人,1996）。

发明人最近完成了前瞻性病例-对照研究以确定胎盘的尿枝原体移殖建群或感染是否与不利的怀孕结果（特别是早产）的增加相关（Okunola等人,2006；Okunola等人,2007）。在18个月的时间段期间在三家Baylor附属医院（St Luke’s Episcopal Hospital、MethodistHospital和Ben Taub General Hospital）分娩的252名女性参与了该研究。这些女性由3组组成：58名在20和30周妊娠期之间分娩出了早产儿；27名发展出了围产期并发症（延长的胎膜破裂，>18小时；胎膜早破；母体发热，>100.4°F；或者临床绒毛膜羊膜炎或子宫内膜炎）并且分娩了足月儿；167名没有围产期并发症并且分娩了足月儿。超过40%的分娩了早产儿的那些女性（p<0.0001）或者具有围产期并发症但足月分娩的那些女性（p<0.004）具有尿枝原体的胎盘移殖建群或感染，而足月分娩但没有围产期并发症的那些女性具有<15%的尿枝原体胎盘移殖建群或感染。看起来没有母体的人口统计、医学、外科或怀孕因素能够预测胎盘的尿枝原体感染或移殖建群。在58名早产儿中（Molina等人,2010），23个胎盘对于尿枝原体来说是培养物阳性的（40%）。其胎盘为阳性的婴儿与阴性的婴儿在妊娠期（26±2.4对26±2.1周）、出生体重（884±278对890±401）、男性性别（44%对54%）、种族（38%对31%）和出生前因素方面没有差别。70%的尿枝原体是生物变型1，并且它们都是血清型3、6或14。在存活至36周校正孕龄（CGA）的婴儿中，在69%的在其胎盘中具有尿枝原体的婴儿中发展出了BPD，而具有阴性培养物的那些婴儿为37%（p=0.062）。在所有婴儿中，在78%的在其胎盘中具有尿枝原体的婴儿中在36周CGA之前产生死亡或BPD，而具有阴性培养物的那些婴儿为51%（p=0.054）。胎儿在出生前暴露于尿枝原体可能增加BPD或死亡的风险。用于防止尿枝原体胎盘移殖建群的策略可以降低早产及其并发症。

为了确定处于胎盘移殖建群的风险中的那些女性，发明人最近完成了一项评价尿枝原体阴道移殖建群的290名女性的前瞻性研究（Weisman等人,2009），并且观察到下列结果：在16周妊娠期时44%的女性具有阴道尿枝原体移殖建群；在整个妊娠期期间，移殖建群未显著地改变；32%的所有被移殖建群的女性发展出了胎盘尿枝原体感染（12%的所有女性）；所有具有胎盘尿枝原体感染的女性在16周妊娠期时具有阴道移殖建群。在早产中：67%的女性具有阴道移殖建群；这在整个妊娠期期间不改变；62%的被移殖建群的女性发展出了胎盘尿枝原体感染（42%的所有女性）。在本发明的某些情况下，在16周妊娠期时的阴道移殖建群是对于处于差的怀孕结果的风险中的那些女性来说的早期标志物和潜在的靶标干预。尽管其他条件（例如，其他感染、解剖学异常、内分泌紊乱、母体医疗条件等）可能对于差的怀孕结果有贡献，但胎盘的尿枝原体移殖建群看起来具有显著关联。如果可以较早地鉴定出处于差的结果的风险中的那些女性，那么干预策略（包括抗生素，或者更有可能地，疫苗）就可以提供免于尿枝原体和不利怀孕结果的保护作用。

已经提出，应当从女性和其配偶的泌尿生殖道中根除尿枝原体（Kundsin等人,1996）。尿枝原体在体外对于青霉素类、磺胺类、甲氧苄啶、氨基糖苷类和克林霉素不易感，但通常（大约90%）在体外对于四环素类和可变地对于大环内酯类（例如，红霉素）易感（Cassell等人,1993）。发明人在最近的研究中已确认了尿枝原体在体外对于红霉素的可变的易感性。鉴于尿枝原体的高的移殖建群率和性传播率，不可能的是，这样的策略在其根除中将会是有效的。另外，已观察到该生物在生殖道中持续存在，尽管有抗生素治疗。在前往不育门诊的夫妇中，该生物在生殖道中持续存在，尽管有抗生素治疗（Hipp等人,1983）。在剖宫产术时术中预防性抗微生物疗法的常规使用不影响在分娩时绒毛膜羊膜的尿枝原体移殖建群（Andrews等人,1995）。在两个随机对照试验中，在根除生殖道尿枝原体或不利的围产期结果方面，大环内酯类（Eschenbach等人,1991；Mazor等人,1993；Romero等人,1993）已经不是可靠的。尽管可以证明更新的抗生素例如甘氨酰环素类（Kenny和Cartwright,1994）和喹诺酮类（Kenny和Cartwright,1996）是更有效的，但它们在怀孕期间的安全性和效力还未被证明。

已经暗示但未证实，特异性抗体的缺乏可能对于防止尿枝原体感染来说是关键的，因为特异性蛋白质抗体可以抑制体外生长（Cassell等人,1993）。低γ球蛋白血症患者具有增加的对于尿枝原体的易感性（Taylor-Robinson等人,1986）。低γ球蛋白血症患者（Volger等人,1985）、早产儿（Quinn等人,1983）和具有习惯性自发流产的女性（Quinn等人,1983）的血清学研究支持了这一概念。具有<30周孕龄的婴儿的增加的对于由尿枝原体诱导的呼吸系统疾病的易感性可能与其低γ球蛋白血症（Ballow等人,1986）或者与其特异性抗体的缺乏（Cassell等人,1988；Cassell等人,1988）有关。

已经暗示但未证实，针对尿枝原体的特异性蛋白质抗原的单克隆抗体可以在体外抑制这些生物的生长，并且表明特异性抗体对于宿主防御可能是重要的（Watson等人,1990）。在本领域中对于提供用于尿枝原体疫苗的有用方法和试剂以及用于预防或治疗尿枝原体感染的方法和组合物存在有久已感到的需要。

发明简述

本发明旨在用于尿枝原体的免疫学方法和组合物，包括用于预防和/或治疗哺乳动物感染的疫苗和抗体，包括例如，关于其相关抗体的DNA疫苗。在特别的实施方案中，所述组合物对于预防感染和还有对于减少感染的有害效应（一旦个体被感染）来说是有用的。在特殊的实施方案中，可以对于女性或男性或两者使用所述组合物。可以在成人、青少年、儿童或婴儿中使用所述组合物。在特殊的情况下，在变为性活跃（包括第一次变为性活跃）开始前向个体递送所述组合物。性活动的类型可以是任何类型的。青少年可以在青春期开始的时候或者在青春期开始的时候左右进行疫苗接种。在某些情况下，女性在怀孕之前进行疫苗接种，而在另一些情况下，女性在怀孕期间进行疫苗接种。在本发明的一些实施方案中，向对于先天性的（例如，无γ球蛋白血症）或获得性的（接受或未接受治疗的癌症患者）免疫缺陷综合征易感的或者具有所述免疫缺陷综合征的个体施用本发明的方法和组合物。在特殊的实施方案中，至少用本发明的一些方面（包括抗体或疫苗组合物）治疗处于幼童期的个体。在特殊的情况下，向在诊断出了癌症或诊断出了免疫缺陷后的个体提供本发明的方法和/或组合物。在某些情况下，在性活跃时或者在变成性活跃之前对男性或女性进行疫苗接种。

施用了本发明的组合物和方法的个体可以是对于具有尿枝原体感染来说易感的，可以被怀疑具有尿枝原体感染，或者可以已知具有尿枝原体感染或高的感染风险。至少在个体已知具有尿枝原体感染的某些情况下，还可以向所述个体施用另一种用于尿枝原体的疗法，包括例如某些抗生素。

在少数几个临床研究和一个动物研究中，已暗示在怀孕和分娩期间的尿枝原体感染引起婴儿中异常的脑发育。在怀孕期间的尿枝原体感染对于脑发育异常的作用包括在本发明中。它看起来不仅影响早产儿的长期行为，而且还能够在其他与炎症相关的脑状况（包括新生儿中由于缺氧、血液感染、脑感染和严重的黄疸而引起的脑损伤，以及儿科学中的癫痫发作、脑性瘫痪、孤独症和注意力缺陷多动症）中具有作用。本公开内容包括小鼠模型并且专注于在怀孕期间的尿枝原体感染对于婴儿的脑炎症和行为的影响，以及还包括用于预防胎儿或婴儿中脑发育异常的方法和组合物。

尿枝原体感染在脑发育异常中的作用是一个重要的研究领域，因为它看起来不仅影响早产儿的发育结果，而且在本发明的一些情况下，它看起来还在其他与炎症相关的脑状况（包括新生儿中的低氧缺血性围产期脑损伤、脓毒症、脑膜炎和高胆红素血症，以及儿科学中的癫痫发作、脑性瘫痪、孤独症谱系障碍和注意力缺陷多动症）中具有作用。本发明包括围产期尿枝原体感染和炎症对于脑发育的影响。

在某些情况下，本发明包括出生前尿枝原体绒毛膜羊膜炎的鼠类模型。在一些实施方案中，它包括测定在乳鼠中尿枝原体绒毛膜羊膜炎对于脑发育的影响，包括行为和记忆、脑病理学和结构以及分子信号。在某些实施方案中，本发明包括确定在脑发育中影响尿枝原体相关变化的尿枝原体重组DNA（rDNA）疫苗、蛋白质疫苗或单克隆抗体的出生前母体施用。

在本发明的一些实施方案中，存在与尿枝原体的多条带抗原发生免疫反应的免疫学组合物（例如抗体），所述组合物包含在药理学上可接受的赋形剂中。在特殊的实施方案中，将所述组合物进一步定义为疫苗，包括DNA、蛋白质或抗原疫苗。在特殊的实施方案中，所述疫苗包含一种或多种DNA多核苷酸、蛋白质或抗原。在某些情况下，所述疫苗包含单克隆或多克隆抗体。

某些实施方案包括尿枝原体感染的诊断，例如通过PCR。特殊的实施方案使用本发明的抗体用于尿枝原体检测，例如从个体中或从培养物中。

在特别的实施方案中，本发明的抗体被用于细胞培养物和培养基污染应用。示例性的细胞培养物系和培养基是本领域中熟知的（Hassan M等人,J Basic Microbiol.2010；Harasawa R等人,ResMicrobiol.1993；Kong F等人,Appl Environ Microbiol.2001；Wang H等人,Appl Environ Microbiol.2004；Sung H等人,J Microbiol.2006；Johansson KE等人,Molecular and Cellular Probes.1990；Teyssou R等人,Molecular and Cellular Probes.1993）。在至少一些特殊的方面，所述抗体直接杀死培养基中的该生物，而无需补体或嗜中性粒细胞或巨噬细胞。

在本发明的一些实施方案中，存在DNA疫苗，其包含编码尿枝原体抗原的部分或全部的多核苷酸。在特殊的实施方案中，所述抗原为脲酶、UU376基因产物、毒力基因产物或尿素转运蛋白，或者所述多核苷酸包含MBA N-末端平行进化同源物、16S rRNA、脲酶A基因上游的区域、脲酶A-脲酶B间隔区、脲酶B-脲酶C间隔区或16S-23SrRNA基因间间隔区。在某些方面，将所述疫苗进一步定义为包含编码至少一种多条带尿枝原体抗原的多核苷酸的DNA疫苗。

在核酸疫苗实施方案中，可以将所述多核苷酸进一步定义为如下：a)包含强的病毒启动子；b)包含具有或不具有rev的摩-傅猴病毒（MPV）-CTE；c)包含内含子A或者来自SV40或Raucous肉瘤的内含子；d)包含强的多腺苷酸化/转录终止信号；e)表达来自超过一种的尿枝原体物种、生物变型、血清型或株系的多重结合蛋白；f)包含关于致病性mRNA的密码子；g)包含免疫增强剂（例如来自人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）；h)包含N-末端遍在蛋白信号；i)包含来自不同病原体的小基因（或Ｉ类MHC表位）或寡核苷酸的链串（例如，其中所述来自不同病原体的I类MHC表位或寡核苷酸的链串包括CpG基序）；j)包含TH表位；或者k)其组合。

在疫苗实施方案的某些方面，可以将所述疫苗进一步定义为包含两种尿枝原体抗原。在特殊的情况下，将DNA疫苗进一步定义为在起始密码子之前包含ANNATPG。

在特别的实施方案中，存在与尿枝原体的多条带抗原发生免疫反应的疫苗，所述疫苗包含在药理学上可接受的赋形剂中。在一个特殊的实施方案中，所述疫苗包含所述多条带抗原的肽或多肽。在特殊的方面，所述疫苗包含与所述多条带抗原发生免疫反应的抗体。

在本发明的一个实施方案中，存在包含本发明的疫苗的试剂盒，其被储藏在合适的容器中。

在本发明的一个实施方案中，存在预防个体中尿枝原体感染或减轻个体中尿枝原体感染的症状的方法，其包括向所述个体递送治疗有效量的本发明的抗体或疫苗的步骤。在特殊的实施方案中，所述个体为人、牛、雌性、雄性等。在一些情况下，所述个体是在第一次性活动之前的雌性或雄性，或者所述个体是在怀孕之前的雌性。可以将所述疫苗递送给怀孕的雌性。所述个体可以是婴儿、儿童或青少年。在一些实施方案中，存在防止细胞培养基中尿枝原体感染的方法，其包括向所述培养基递送有效量的抗体的步骤，所述抗体识别尿枝原体多条带抗原的保守区域或所述多条带抗原的5’末端。

在某些实施方案中，所述抗体或疫苗通过注射来进行递送，例如肌内，静脉内，皮下，腹膜内，通过基因枪，通过气动注射，或者它包含脂质体。在特殊的情况下，当所述疫苗包含DNA时，所述基因枪包括经由表皮递送来递送包被有DNA的金珠或钨珠。在某些情况下，当所述疫苗包含DNA时，所述气动注射经由表皮递送。本发明的特别的方面进一步包括向所述个体的多次递送，例如相隔数年、数月、数周或数天的递送。在特殊的情况下，所述多次递送相隔一个月或更多个月。在特殊的情况下，所述多次递送相隔两年至十年。在一些实施方案中，将所述疫苗或抗体例如递送到羊膜腔中或者通过阴道来进行递送。

在一些实施方案中，存在抗体，其与尿枝原体多条带抗原的保守区域或所述多条带抗原的5’末端发生免疫反应。在某些实施方案中，预防个体中尿枝原体感染或减轻个体中尿枝原体感染的症状的方法，其包括向所述个体递送治疗有效量的抗体的步骤，所述抗体识别尿枝原体多条带抗原的保守区域或所述多条带抗原的5’末端。

因此，在本发明的实施方案中，存在尿枝原体多条带抗原基因的保守区段的克隆和表达，例如在示例性的pVAX1载体中。本文提供的数据包括了在体外（IgG细菌结合、IgA细菌结合、细菌杀灭）和在体内（动物保护）证实的效力。该示例性的工作证实了，该疫苗通过其抗体和可选地其他因子而在体外结合尿枝原体、不依赖于其他免疫因子（补体和嗜中性粒细胞）地体外中和（杀死）尿枝原体以及给被尿枝原体感染的动物提供保护（降低的死亡率和菌血症）方面是有效的。在本发明的实施方案中，疫苗相关抗体在人感染的预防和治疗、动物感染的预防和治疗以及已被尿枝原体污染的培养基的防止和处理中具有应用。

在本发明中还包括经优化的疫苗递送、剂量和计划安排方法，并且在本文中评价了对于所述疫苗和相关抗体的免疫学应答。

前述内容已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点以便可以更好地理解下面的对于本发明的详细描述。本发明的另外的特征和优点将在下文中描述，它们形成本发明的权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，可以容易地利用所公开的概念和特殊的实施方案作为基础来修饰或设计其他结构以实现相同的本发明的目的。本领域技术人员还应当意识到，这样的等价构建物不背离在所附的权利要求书中所阐明的本发明的精神和范围。被认为对于本发明来说特征性的（关于其组织和操作方法两者）新特征，以及进一步的目标和优点，将会从下面的描述中得到更好的理解，当与所附随的附图相关联地进行考虑时。然而，待明确理解的是，所述附图中的每一张仅为了举例说明和描述的目的而提供，并不意欲作为本发明的界限的限定。

附图简述

图1.在经疫苗接种的小鼠中的血清IgA水平。

图2.在经疫苗接种的小鼠中的IgM的血清水平。

图3.在经疫苗接种的小鼠中的IgG亚类的血清水平。

图4.在经疫苗接种的小鼠中的病原体特异性IgG的血清水平。每个数据点包含来自3只动物的血清并重复3次。

图5.在经疫苗接种的小鼠中的病原体特异性IgA的血清水平。每个数据点包含来自3只动物的血清并重复3次。

图6.采用来自用尿枝原体DNA疫苗血清型6（小尿枝原体）进行免疫接种的小鼠的血清（IMS）和来自正常小鼠的血清（NMS）来实施的血清型A（差异尿枝原体）、血清型1（小尿枝原体）和血清型8（解脲尿枝原体）的体外细菌杀灭测定法。第1、5和6列为尿枝原体（第1列为血清型A；第5列为血清型1；第6列为血清型8）+IMS。第3、7和8列为仅10B。第2和4列为血清型A+NMS。第9列为血清型1+NMS。第10列为血清型8+NMS。

图7.采用来自用尿枝原体DNA疫苗血清型1和6进行免疫接种的小鼠的血清（IMS）或正常小鼠血清（NMS）来实施的差异尿枝原体血清型A的体外细菌杀灭测定法。所有孔包含10B肉汤+尿枝原体，除了第3列。第1列：IMS。第2列：NMS。第3列：仅10B。第4和5列：10B肉汤。

图8.疫苗组和非疫苗组的动物存活率，针对用血清型6（小尿枝原体）、血清型8（解脲尿枝原体）或血清型14（小尿枝原体）进行的尿枝原体感染。

图9.疫苗组和非疫苗组的动物存活率，针对尿枝原体血清型14感染。

图10.疫苗组和非疫苗组的动物存活率，针对尿枝原体血清型6感染。

图11.疫苗组和非疫苗组的动物存活率，针对尿枝原体血清型8感染。

图12.疫苗组（血清型1和6）和非疫苗组的动物存活率，针对尿枝原体血清型14感染。

发明详述

对于本领域专业人员来说容易看出来的是，可以对在本申请中所公开的发明形成各种不同的实施方案和修改而不背离本发明的范围和精神。

单词“a”或“an”的使用，当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”联合使用时，可以表示“一个（种）”，但也与“一个（种）或多个（种）”、“至少一个（种）”和“一个（种）或超过一个（种）”的含义相一致。在权利要求书中术语“或”的使用表示“和/或”，除非明确指明仅是指备选选项或者备选选项是相互排斥的，尽管该公开内容支持仅是指备选选项和是指“和/或”的定义。

本文所使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是可互换的，并且是指导致疾病或状况的至少一种症状的改善或纠正的量。本领域技术人员理解，有效量可以改善患者或受试者的状况，但可以不是疾病和/或状况的完全治愈。

本文所使用的术语“预防”是指最小化、降低或抑制发展出疾病状态的风险或者与所述疾病状态或进展或其他异常或有害的状况相关的参数。

本文所使用的术语“进行治疗”和“治疗”是指向受试者施用治疗有效量的组合物，从而使得所述受试者在疾病或状况方面具有改善。所述改善是任何可观察到的或可测量的改善。因此，本领域技术人员意识到，治疗可以改善患者的状况，但可以不是疾病的完全治愈。治疗也可以包括治疗处于发展出疾病和/或状况的风险中的受试者。

I.本发明的一般性实施方案

本发明的某些实施方案包括可用于预防和/或治疗哺乳动物（包括例如，人、牛、狗、猫、马、猪、山羊或绵羊，或者鸟）中的尿枝原体的组合物。某些方面包括组合物，其可用于为了医学、微生物学、药物学等用途的人或动物组织的细胞培养物或培养基，以便处理尿枝原体污染或防止这样的污染。所述组合物可以包括抗体、蛋白质、肽、核酸表达载体，等等。在一些情况下，可以将所述组合物视为疫苗。在本发明的至少一些实施方案中，给个体提供所述方法和/或组合物以便预防尿枝原体感染，并且该个体可以是或可以不是怀孕的。在用本发明的组合物对雌性或雄性个体进行接种的情况下，那么在用尿枝原体进行攻击时可以防止所述雌性或雄性免于具有有害的效应。在至少某些情况下，保护在雌性的当前或以后怀孕中的胎儿免于尿枝原体的有害效应。可以存在超过一个同时受保护或相继受保护的胎儿。

进一步地，在少数几个临床研究和一个动物研究中，已暗示在怀孕和分娩期间的尿枝原体感染引起婴儿中异常的脑发育。本发明包括这样的实施方案，其中包括了在怀孕期间的尿枝原体感染对于脑发育异常的作用。在特殊的实施方案中，它不仅影响早产儿的长期行为，而且至少在一些情况下还在其他与炎症相关的脑状况（包括新生儿中由于缺氧、血液感染、脑感染和严重的黄疸而引起的脑损伤，儿科学中的癫痫发作、脑性瘫痪、孤独症和注意力缺陷多动症）中具有作用。在本发明的实施方案中，使用小鼠模型来证实在怀孕期间的尿枝原体感染对于婴儿的脑炎症和行为的影响。

在特别的方面，本发明的组合物和方法可用于非淋球菌性尿道炎、泌尿道结石形成、化脓性关节炎、不育、前列腺炎、盆腔炎症疾病、习惯性流产、绒毛膜羊膜炎、死产、早产、低出生体重、产后子宫内膜炎、肺炎、脓毒症、脑膜炎、骨髓炎、死亡、脑室内出血、脑室周围白质软化病、坏死性小肠结肠炎和慢性肺病。

II.尿枝原体的多条带抗原

在本发明的一些实施方案中，所述免疫学组合物（包括疫苗）使用多条带抗原作为其抗原。

存在有十四种确认的尿枝原体血清变型，其可以被分为两个生物变型聚簇：具有血清变型1、3、6和14的生物变型1（或小尿枝原体生物变型）；和具有血清变型2、4、5、7、8、9、10、11、12和13这10种血清变型的生物变型2（或解脲尿枝原体或T960生物变型）。生物变型1和生物变型2的成员可以至少通过DNA-DNA杂交、限制性片段长度多态性、1D和2D凝胶电泳、基因组大小和某些基因的PCR扩增来区分。不同的血清变型各自具有不同的抗原，其在本发明的一些情况下被用作免疫学组合物的靶标。在被尿枝原体感染的患者中存在占优势的可识别的抗原（Watson等人,1990；还可参见Teng等人,1994；Zheng等人,1995；Kong等人,1999a；1999b；和Kong等人,2000），并且这些抗原被称为多条带抗原。

示例性的尿枝原体多条带抗原至少包括通过其

序列进行标示的来自不同血清变型的下列那些，它们全部通过提及而合并入本文：AAD09745.2；AAD09744.2；AAD09743.2；AAD02701.2；AAD02700.2；AAD02699.2；AAD02698.2；AAD02697.2；AAD02696.2；AAD02695.2；AAD02694.2；AAD02693.2；AAD02692.2；AAD00075.1；AAC41437.1；AAD00077.1；AAD00076.1；AAB38978.1；AAD19956.1；AAD19955.1；AAD19954.1；AAD19953.1；AAD19952.1；AAD19951.1；AAD19950.1；AD19949.1；AAD19948.1；AAD19947.1；AAD19946.1；NP_078209.1；YP_002284809.1；YP_002284808.1；YP_002284599.1；YP_002284567.1；YP_002284811.1；YP_002284585.1；YP_001752457.1；ACI60346.1；ACI60338.1；ACI60127.1；ACI60016.1；ACI59928.1；ACI59882.1；ACA32903.1；AAF61146.1；AAF61145.1；AAF30784.1；ABU75287.1；AAT79416.1；AAT79415.1；AAT79414.1；AAT79413.1；AAT79412.1；AAT79411.1；ZP_03772473.1；ZP_03772432.1；ZP_03772428.1；ZP_03772407.1；ZP_03772313.1；ZP_03772151.1；ZP_03003758.1；ZP_02997126.1；ZP_02570847.2；ZP_02553955.2；ZP_02555017.2；ZP_02691486.2；ZP_02691471.2；ZP_02690312.2；ZP_02691487.1；ZP_02691469.1；ZP_02690307.1；ZP_02690299.1；ZP_02570851.1；ZP_02570848.1；ZP_02555874.1；ZP_02555020.1；ZP_02555016.1；ZP_02555015.1；ZP_02555013.1；ZP_02553953.1；ZP_03771933.1；ZP_03771930.1；ZP_03771929.1；ZP_03771924.1；ZP_03771712.1；ZP_03771427.1；ZP_03771410.1；ZP_03771378.1；ZP_03771338.1；ZP_03771299.1；ZP_03771272.1；ZP_03771271.1；EEH02496.1；EEH02495.1；EEH02491.1；EEH02279.1；EEH01994.1；EEH01977.1；EEH01945.1；EEH01905.1；EEH01866.1；EEH01840.1；EEH01837.1；EEH01836.1；EEH01707.1；EEH01666.1；EEH01662.1；EEH01641.1；EEH01547.1；EEH01385.1；ZP_03206353.1；EDY74356.1；ZP_03079858.1；ZP_03079727.1；EDX53837.1；EDX53694.1；EDX53543.1；EDX53525.1；EDX53195.1；ZP_02558219.2；ZP_02558216.1；ZP_02558215.1；EDU67250.1；EDU67198.1；EDU56636.1；EDU56624.1；EDU56617.1；EDU56613.1；EDU19480.1；EDU19358.1；EDU06306.1；EDU06277.1；EDU06259.1；EDU06258.1；EDU06213.1；EDT87551.1；EDT87494.1；EDT48735.1；EDT48714.1；EDT48712.1；EDT48706.1；和/或EDT48704.1。

在本发明的某些实施方案中，所述免疫学组合物（例如疫苗）通过能够与各种各样的多条带抗原发生免疫反应而是有效的，和在一些实施方案中，所述免疫学组合物（包括疫苗）针对单个多条带抗原是有效的。在一些情况下，所述免疫学组合物可以识别生物变型的多种血清型。在特殊的情况下，所述免疫学组合物识别在生物变型之间保守的抗原。

多条带抗原（MBA）是在尿枝原体感染过程中被识别的占优势的抗原，并且在毒力中发挥作用（Watson HL等人,Infect Immun1990）。它是物种特异的，并且包含交叉反应表位。MBA基因的5’末端是相对保守的，但包含一些生物变型和血清变型特异性。MBA在N-末端区域中包含信号肽和酰化位点，而C-末端区域由多个“六氨基酸（由18个核苷酸编码）串联重复”组成，所述六氨基酸串联重复包含血清变型特异性表位。重复单元的拷贝数的改变导致MBA大小变化（Zheng X等人,Ann NY Acad Sci1994）。与该重复区域相反，5’区域在血清变型变体中是保守的（Teng LJ等人,J Clin Microbiol1994）。尽管血清变型特异性由MBA的C-末端区域的组成决定，但存在有一些在不同血清变型的MBA基因的5’区域序列中检测到的异质性，这允许将14种血清变型分为几个亚组。因此，在本发明的特殊的实施方案中，将所述组合物集中在MBA的更保守的区域上，以便任何疫苗、抗原或抗体将可应用于所有或大多数血清型、生物变型和甚至物种。关于保守序列的示例性的序列如下：

血清型6MAB cDNA序列（AF056984）（SEQ ID NO:4）：

1 GTATTTGCAA TCTTTATATG TTTTCGTTAA AATTAAAAAT TAATTACTAT AAAAATTATG

61 TAAGATTAAT AAATCTTAGT GTTCATATTT TTTACTAGTA TTAAATTAAA AACAATAAAA

121 TGACATATTT TTTATATTAG GAGAACCATA AATGAAATTA TTAAAAAATA AAAAATTCTG

181 AGCTATGACA TTAGGAGTTA CCTTAGTTGG AGCTGGAATA GTTGCTATAG CGGCTTCATG

241 TTCTAATTCA ACTGTTAAAT CTAAGTTAAG TAGCCAATTT GTTAAATCAA CAGATGATAA

301 AAGTTTTTAT GCAGTTTACG AAATTGAAAA CTTTAAAGAT CTAAGTGATA ATGATAAAAA

361 ATCATTAAAT GACATTGAAT TTAATGCTGC ACTTACATCA GTTGAAAACA AAACAGAAAA

421 TCTAGTTACA AAAGGTCATT TGGTTGGTGA AAAAATTTAC GTTAAATTAC CTCGTGAACC

481 AAAACCTAAT GAACAATTAA CTATTATTAA TAAAAGTGGA TTAATCAAGA CTTCAGGTTT

541 GTTAATACCT AATAATTTGA ATTATCAAAC AGAAAAAGTG AACTTTGAAA CAGCTCCGAA

601 AACTCAAGAA CCAGGTAAAG AACCAGGTAA AGAACCAGGT AAAGAACCAG GTAAAGAACC

661 AGGTAAAGAA CCAGGTAAAG AACCAGGTAA AGAACCAGGT AAAGAACCAG GTAAAGAACC

721 AGGTAAAGAA CCAGGTAAAG AACCAGGTAA AGAACCAGGT AAAGAACCAG GTAAAGAACC

781 AGGTAAAGAA CCAGGTAAAG AACCACGTAA AGAACCAGGT AAAGAACCAG GTAAAGAACC

841 AGGTAAAGAA CCAGGTAAAG AACCAGGTAA AGAACCAGGT AAAGAACCAG GTAAAGAACC

901 AGGTAAAGAA CCAGGTAAAG AACCAGGTAA AGAACCAGGT AAAGAACCAG GTAAAGAACC

961 AGGTAAAGAA

在本发明的一些情况下，免疫学组合物例如与来自患者的尿枝原体多条带抗原发生免疫反应，尽管所述免疫学组合物本身可能是针对来自天然出现的相应抗原的具有轻微修饰的抗原而产生的。例如，抗体可以识别天然出现的抗原（例如来自患者的），尽管所述抗体可能是针对与天然出现的抗原具有小于100%的同一性的肽或多肽序列而产生的。在特殊的实施方案中，所述抗体是针对与天然出现的抗原中的序列具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的肽或多肽序列而产生的。在一些情况下，所述抗体是针相比于天然出现的抗原的序列而言具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸差异的肽或多肽而产生的，然而所述抗体仍然识别天然出现的抗原中的序列。

III.本发明的示例性疫苗

在本发明的一些实施方案中，存在针对一种或多种尿枝原体抗原的疫苗。所述抗原可以是多条带抗原，或者它可以是另一种抗原。

在本发明的一些实施方案中，存在数种其他的非多条带抗原（MBA）的抗原，并且它们或其各自的DNA可以是关于用于相似的预防和治疗策略的疫苗或其抗体产物的靶标，以及可能的诊断靶标，包括下列。1)对于该生物的生存来说必需的脲酶。存在有几种目前已知的脲酶（A-G）（UU428、UU429、UU430、UU431、UU432、UU433、UU434）。2)邻近MBA基因（UU375）的是基因UU376，其是尿枝原体-特异的保守的假定基因和另一个潜在的靶标。3)在一些方面，看起来存在有毒力基因（溶血素），包括hlyC（UU072）、hlyA（UU436），它们是有用的靶标。4)MBA N-末端平行进化同源物（UU172、UU189、UU483、UU487、UU526）。多条带抗原（MBA）与其对应物UU376蛋白的相转变（phase variation）导致在特殊的反向重复处的DNA倒位。这些重组事件是动态的并且可以导致宽范围的抗原变异，通过其该生物可以逃避宿主免疫应答；因此在特殊的实施方案中，这些被作为靶标。5)存在有几个也待考虑的其他基因，其例如包括下列：a)16SrRNA基因；b)毗连脲酶基因的基因，包括脲酶A基因上游的区域、脲酶A-脲酶B间隔区、脲酶B-脲酶C间隔区；c)16S-23S rRNA基因间间隔区；和/或d)尿素转运蛋白。

DNA疫苗。在本发明的特殊的实施方案中，所述疫苗由一段该病原体的DNA（例如，质粒）组成，该段DNA经基因工程改造以产生至少一种、两种或更多种来自病原体的特异性蛋白质（抗原）。将所述质粒DNA（pDNA）注射入身体的细胞中，在那里宿主细胞阅读pDNA并产生其抗原。这些抗原在当由宿主细胞产生和展示时被识别为外来的，并且宿主免疫系统触发一系列免疫应答（Alarcon等人,1999；Robinson和Pertmer,2000）。

迄今为止，已开发了几种DNA疫苗并且更多的正在考虑之中（Kutzler和Weiner,2008）。特别地，对于一种禽流感DNA疫苗看到了阳性结果（Cinatl等人,2007）。兽医学DNA疫苗已被批准用于：1)保护马免于西尼罗河病毒（Fort Dodge Animal Health AnnouncesApproval of West Nile Virus DNA Vaccine for Horses,PR Neswire2005-07-18）；2)保护鲑鱼免于传染性造血器官坏死病毒；3)保护仔猪免于围产期死亡和由于断奶引起的患病；4)治疗具有侵袭性黑素瘤的狗。关于针对多发性硬化症的DNA疫苗的初步研究被报道是有效的（Stuve等人,2007）。

对于DNA疫苗，存在有几个优点和缺点（Alarcon等人,1999；Kutzler和Weiner,2008；Robisnson和Pertmer,2000；Sedegah等人,1994）。优点包括下列：没有感染风险的亚基疫苗接种；通过I类和II类MHC分子两者进行的抗原呈递；使T-细胞辅助倾向1或2型的能力；仅集中在目的抗原上的免疫应答；易于开发和生产；对于储存和运输而言的疫苗稳定性；有成本效益；消除对于肽合成，重组蛋白质的表达和纯化，以及使用毒性佐剂的需要；免疫原的长期持续存在；体内表达确保蛋白质与正常的真核生物结构更近地相似，其伴随有翻译后修饰。

DNA疫苗开发和设计。存在有几种用于优化DNA疫苗开发的方法。1)当使用具有高度活性的表达载体时，DNA疫苗看起来获得最佳的免疫应答。因此，驱动作为目标的DNA或互补DNA的体内转录和翻译的强的病毒启动子是有用的（Mor等人,1995）。在一些实施方案中，使用巨细胞病毒（CMV）早期启动子，因为它具有比SV40启动子或劳斯肉瘤病毒启动子更高的表达率。2)在一些实施方案中，包括了具有rev的摩-傅猴病毒（Mason-Pfizer monkey virus，MPV）-CTE+rev，其增加包膜表达并且是更具免疫原性的（Muthumani等人,2003）。可以向疫苗中添加MPV-CTE+rev并试图增加包膜表达和免疫原性。3)有时可以在该质粒载体中包括内含子A以改善mRNA稳定性并因此增加蛋白质表达（Leitner等人,1997）。在一些实施方案中，可以在该位置处将Invitrogen的pVAX1包括在该质粒中。可以使用更新的更有效的载体（例如，Invitrogen的pVAX200-DEST）。4)质粒还应当包括强的多腺苷酸化/转录终止信号，例如牛生长激素（BGH）（Alarcon等人,1999；Bohm等人,1996；Robinson和Pertmer,2000）。发明人已经用pVAX1载体做了这事，并且BGH也存在于pVAX200-DEST载体上。5)表达超过一种免疫原的载体也增强疫苗的效力和影响并且可以被采用（Carey等人,1991）。在一些情况下，在该质粒中存在有超过一种免疫原的表达以增强疫苗效力和影响。特别地，可以表达来自几种尿枝原体血清型和株系的多重结合蛋白（multiple binding protein，MBP）。6)为了优化载体设计以用于最大蛋白质表达，可以使用关于真核细胞的致病性mRNA的密码子（Lewis和Babiuk,1999）。病原体常常具有不同于进行免疫接种的物种的不同的AT含量，因此在本发明的某些情况下，改变免疫原的基因序列以反映在靶物种中更普遍使用的密码子可以改善其表达（3）。在特殊的实施方案中，在起始密码子之前采用ANNATPG（SEQ ID NO:1）。在某些情况下，可以使用腺病毒三联前导序列（TPL）（Kutzler和Weiner,2008）。进一步地，对于所述疫苗可以使用增强子序列。在特殊的实施方案中，在当前的疫苗中使用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）作为免疫增强剂（Kutzler和Weiner,2008）。7)可以将免疫原靶向各种不同的细胞区室以便改善抗体或细胞毒性T-细胞应答。在某些情况下，质膜结合型抗原在诱导抗体应答方面比胞质抗原更有效（Robinson和Pertmer,2000），并且可以在所述疫苗中使用这样的方式。8)可以通过经由向终止密码添加N-末端遍在蛋白信号（Rodriguez等人,1997）将抗原靶向胞质降解和随后进入I类MHC途径来改善细胞毒性T-细胞应答（Robinson和Pertmer,2000），并且在某些实施方案中，在本发明中使用这样的方式。9)蛋白质的构象对于抗体应答也可以具有影响，其中有序的结构比无序的结构更有效，并且可以在本发明中使用它（Wunderlich等人,2000）。10)来自不同病原体的I类MHC表位或寡核苷酸（例如，CpG基序）的链串能够引起对于许多病原体的细胞毒性T-细胞应答，尤其是如果还包括TH表位（Robinson和Pertmer,2000），并且在某些实施方案中可以采用这样的方式。

DNA疫苗递送。已经通过几种不同的方法将DNA疫苗引入动物组织中（Weiner和Kennedy,1999）。这些递送方法包括下列：1)通过肌内（IM）、真皮内（ID）、静脉内（IV）、皮下（SC）或腹膜内（IP）途径，经由皮下针头注射处于盐水中的DNA的水溶液。后三种途径具有可变的成功率，并且所有都需要大量的DNA（100-200ug）。尽管这些不是专门的递送机制，但它们简单，导致永久或半永久的表达，导致pDNA快速扩散至整个身体。然而，它们在其摄取方面是无效的，需要相对大量的DNA，并且Th1应答可能不是所需要的应答。尽管可以使用几种方法来增加向细胞的递送，包括电穿孔（Widera等人,2000），用肌毒素（例如，布比卡因）或高渗溶液（例如，盐水或蔗糖）损害肌纤维，或者更具损害性的注射（针头类型、针头对准、注射速度、注射体积）（2），但这些方法的实际应用的缺乏或其副作用潜在地超过了它们的益处，并且至少在一些情况下不使用它们。2)通过皮肤或外膜（阴道粘膜），或经手术而暴露的肌肉或其他器官，经由表皮递送（ED）来进行的包被有DNA的金珠或钨珠的基因枪递送。该方法允许通过使用压缩氦气作为加速剂来将DNA直接轰击入细胞中，并且要求少量的DNA（少至16ng）。然而，缺点是，可能不要求Th2应答且要求惰性颗粒作为载体。3)通过ED来进行的DNA水溶液的气动（喷射）注射。优点是，不要求颗粒，可以将DNA递送至处于皮肤或组织表面以下mm至cm处的细胞。缺点是，在高压喷出后存在DNA的显著剪切，已经报道了以10倍程度更低的表达和更低的免疫应答，并且它要求大量的DNA（高达300ug）。4)几个上面提及的系统（但特别是IM、IV、IP和口服或粘膜（鼻、阴道））的由脂质体介导的递送具有几个优点。它可以实质上提高免疫应答，增加pDNA的转染，并且经粘膜递送的脂质体-DNA复合物可以导致在远端粘膜处的表达和IgA抗体的产生。潜在的缺点是，应答的可变性和因此无效性，和对于增强的免疫应答而言继发的毒性的可能性。对于某些情况，发明人采用了用水溶液的IP途径，以允许pDNA的最全身化的分布，而同时使IV递送疫苗或者使用更昂贵的递送系统（基因枪）或复杂介质（脂质体）的复杂性最小化。不论这些方法为何，几个因素可以影响与注射相关的免疫应答，包括年龄和性别，并且可以在本发明的某些实施方案中加以考虑。

IV.一般性疫苗实施方案

对于可用作疫苗的抗原组合物，抗原组合物必须在细胞、组织或动物（例如，哺乳动物，包括人）中诱导针对所述抗原的免疫应答。本文所使用的“抗原组合物”可以包含抗原（例如，肽或多肽）、编码抗原的核酸（例如，抗原表达载体）或者表达或呈递抗原的细胞。在特别的实施方案中，所述抗原组合物包含或编码肽或多肽序列的全部或部分，或者其免疫学功能等价物。在其他实施方案中，所述抗原组合物以包含另外的免疫刺激试剂或编码这样的试剂的核酸的混合物形式。免疫刺激试剂包括但不限于另外的抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其他实施方案中，另外的试剂中的一种或多种被共价结合至抗原或免疫刺激试剂，以任意组合。在某些实施方案中，所述抗原组合物被缀合至或者包含HLA锚基元氨基酸。

在某些实施方案中，在动物中诱导抗尿枝原体的体液的和/或细胞介导的免疫应答方面，可以将抗原组合物或免疫学功能等价物用作有效的疫苗。本发明考虑了一种或多种用于在主动和被动免疫接种实施方案两者中使用的抗原组合物或疫苗。

本发明的疫苗在其蛋白质、核酸和/或细胞组分的组成方面可以变化。在一个非限制性的实例中，还可以用蛋白质佐剂来配制编码抗原的核酸。当然，将会理解的是，本文所描述的各种不同的组合物可以进一步包含另外的组分。例如，可以在脂质或脂质体中包含一种或多种疫苗组分。在另一个非限制性的实例中，疫苗可以包含一种或多种佐剂。鉴于本公开内容，可以通过本文所公开的或本领域技术人员已知的任何方法来制备和/或施用本发明的疫苗和其各种不同的组分。

A.蛋白质抗原

可以理解，本发明的抗原组合物可以通过本领域熟知的方法来制备，所述方法包括但不限于，通过固相合成进行化学合成和通过HPLC与其他化学反应产物相纯化分离，或者通过在体外翻译系统中或在活细胞中表达编码包含本发明抗原的肽或多肽的核酸序列（例如，DNA序列）来产生。优选地，所述抗原组合物是分离的，并且彻底地进行透析以去除一种或多种不希望的小分子量分子和/或进行冻干以便更容易配制入所希望的载料中。进一步可以理解的是，在疫苗组分中产生的另外的氨基酸、突变、化学修饰等，如果有的话，优选地将不实质上干扰表位序列的抗体识别。

相应于本发明的尿枝原体的一个或多个抗原决定簇的肽或多肽通常应当具有至少五个或六个氨基酸残基的长度，并且可以包含多达大约10个、大约15个、大约20个、大约25个、大约30个、大约35个、大约40个、大约45个或大约50个或者更多个左右的残基。可以通过本领域技术人员已知的方法来合成肽序列，这些方法例如为使用自动肽合成仪（例如从Applied Biosystems(Foster City,CA)可得到的那些）来进行的肽合成。

较长的肽或多肽也可以例如通过重组方法来制备。在某些实施方案中，例如可以使用编码本文所描述的抗原组合物和/或组分的核酸，以便在体外或在体内产生抗原组合物用于本发明的各种组合物和方法。例如，在某些实施方案中，将编码抗原的核酸包含在例如位于重组细胞中的载体之中。可以表达所述核酸以产生包含抗原序列的肽或多肽。所述肽或多肽可以从细胞中分泌，或者被包含作为细胞的一部分或被包含在细胞内。

B.蛋白质抗原

在某些实施方案中，可以通过用编码抗原的核酸转染或接种动物来促进免疫应答。在向动物施用了核酸后，在靶动物内就包含了一个或多个表达由该核酸所编码的序列的细胞。因此，所述疫苗可以包含可用于免疫接种实验方案的“基因疫苗”。疫苗还可以是以例如编码抗原的肽或多肽序列的全部或部分的核酸（例如，cDNA或RNA）的形式。所述核酸的体内表达可以例如通过质粒类型载体、病毒载体或者病毒/质粒构建体载体。

在优选的方面，所述核酸包含编码区，该编码区编码来自尿枝原体的序列的部分，或其免疫学功能等价物。当然，所述核酸可以包含和/或编码另外的序列，包括但不限于包含一种或多种免疫调节剂或佐剂的那些。先前已经公开了关于各种基因的核苷酸和编码蛋白质、多肽和肽的序列，并且可以在本领域技术人员已知的计算机化的数据库中找到它们。一个这样的数据库是国家生物技术信息中心（NationalCenter for Biotechnology Information）的

和GenPept数据库。这些已知基因的编码区可以通过使用本文所公开的技术或通过本领域技术人员将会知晓的任何技术（例如，Sambrook等人,1987）来进行扩增，与本发明中所包括的序列相组合（例如，连接），和/或进行表达。尽管可以在体外表达系统中表达核酸，但在优选的实施方案中，所述核酸包含用于体内复制和/或表达的载体。

C.细胞疫苗抗原

在另一个实施方案中，表达抗原的细胞可以包含该疫苗。所述细胞可以从培养物、组织、器官或生物体中分离，并且作为细胞疫苗施用给动物。因此，本发明考虑了“细胞疫苗”。所述细胞可以用编码抗原的核酸进行转染以增强其的抗原表达。当然，所述细胞还可以表达一种或多种另外的疫苗成分，例如免疫调节剂或佐剂。疫苗可以包含所述细胞的全部或部分。

在特别的实施方案中，考虑了可以将编码本发明抗原的核酸转染到植物（特别地，可食植物）中，并且使用植物材料的全部或部分来制备疫苗，例如，口服疫苗。这样的方法描述在美国专利号5,484,719、5,612,487、5,914,123、5,977,438和6,034,298中，每篇文献通过提及而合并入本文。

D.免疫学功能等价物

由于可以在本发明的抗原组合物的结构中产生修饰和改变，并且仍然获得具有相似的特征或者相反地所希望的特征的分子，因而这样的免疫学功能等价物也包括在本发明中。

例如，在肽、多肽或蛋白质结构中可以将某些氨基酸置换成其他氨基酸，而没有可察觉地丧失与诸如抗体的抗原结合区域、底物分子或受体上的结合位点、DNA结合位点等这样的结构的相互作用结合能力。由于正是肽、多肽或蛋白质的相互作用能力和性质确定了其生物学（例如，免疫学）功能活性，因而可以在氨基酸序列（或者，当然，其作为基础的DNA编码序列）中进行某些氨基酸序列置换，然而获得具有相似（相反）特性的肽或多肽。因此，发明人考虑，可以在抗原组合物（例如，肽或多肽，或者作为基础的DNA）的序列中产生各种不同的改变，而没有生物学效用或活性的可察觉的丧失。

本文所使用的“氨基分子”是指任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物，如本领域技术人员将会知晓的。在某些实施方案中，所述抗原组合物的残基包含这样的氨基分子，其是连续的，没有任何非氨基分子打断氨基分子残基的序列。在其他实施方案中，所述序列可以包含一个或多个非氨基分子部分。在特别的实施方案中，所述抗原组合物的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分打断。

因此，抗原组合物，特别是本文所公开的序列的免疫学功能等价物，可以包括这样的氨基分子序列，其包含有在天然合成的蛋白质中的20种常见氨基酸之中的至少一种氨基酸，或至少一种经修饰的或不寻常的氨基酸。

关于免疫学功能等价物，本领域技术人员会很好地理解，在该定义中固有的是这样的概念：存在对于可以在该分子的规定部分内产生的改变的数目的限制，而仍然导致具有可接受水平的等价免疫学活性的分子。因此在本文中将免疫学功能等价物肽或多肽定义为其中某些（不是大部分或全部）氨基酸可以被置换的那些肽或多肽。

特别地，当涉及较短长度的肽时，考虑应当在给定的肽内产生更少的氨基酸置换。较长的多肽可以具有中等数目的改变。全长蛋白质对于较大数目的改变将会具有最大的耐受性。当然，根据本发明，可以容易地产生和使用具有不同置换的众多不同的多肽/肽。

还将很好地理解的是，当某些残基显示出对于蛋白质或肽的免疫学或结构特性特别重要时，例如在结合区域或活性位点中的残基，那么这样的残基通常不可以被更换。这在本发明中是一个重要的考虑，其中当希望保持免疫学功能时，就应当仔细考虑在抗原性位点中的改变并随后进行测试以确保保持了免疫学功能（例如，抗原性）。以这种方式，在本文中将功能等价物定义为保持了充分量的其天然免疫学活性的那些肽或多肽。

氨基酸置换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析揭示：精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸都具有相似的大小；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有总体相似的形状。因此，基于这些考虑，在本文中将精氨酸、赖氨酸和组氨酸定义为免疫学功能等价物；将丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸定义为免疫学功能等价物；以及将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸定义为免疫学功能等价物。

为了进行更为定量的改变，可以考虑氨基酸的亲水指数。已经基于其疏水性和电荷特征给每种氨基酸分派了亲水指数，这些是：异亮氨酸（+4.5）；缬氨酸（+4.2）；亮氨酸（+3.8）；苯丙氨酸（+2.8）；半胱氨酸/胱氨酸（+2.5）；甲硫氨酸（+1.9）；丙氨酸（+1.8）；甘氨酸（-0.4）；苏氨酸（-0.7）；丝氨酸（-0.8）；色氨酸（-0.9）；酪氨酸（-1.3）；脯氨酸（-1.6）；组氨酸（-3.2）；谷氨酸（-3.5）；谷氨酰胺（-3.5）；天冬氨酸（-3.5）；天冬酰胺（-3.5）；赖氨酸（-3.9）；和精氨酸（-4.5）。

亲水氨基酸指数在将相互作用生物学功能赋予蛋白质、多肽或肽中的重要性在本领域中是普遍理解的（Kyte和Doolittle,1982，其通过提及而合并入本文）。已知可以将某些氨基酸置换成具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸而仍然保持相似的生物学活性。在基于亲水指数来产生改变中，其亲水指数在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，和在±0.5之内的那些是更加特别优选的。

本领域中还理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的置换，特别是当打算将由此所产生的免疫学功能等价物多肽或肽用于免疫学实施方案时，如在本发明的某些实施方案中那样。美国专利4,554,101（其通过提及而合并入本文）叙述到，蛋白质的最大局部平均亲水性（由其邻近氨基酸的亲水性决定）与其免疫原性和抗原性相关联，即与该蛋白质的免疫学特性相关联。

如在美国专利4,554,101中详细说明的，已经给氨基酸残基分派了下列亲水性值：精氨酸（+3.0）；赖氨酸（+3.0）；天冬氨酸（+3.0±1）；谷氨酸（+3.0±1）；丝氨酸（+0.3）；天冬酰胺（+0.2）；谷氨酰胺（+0.2）；甘氨酸（0）；苏氨酸（-0.4）；脯氨酸（-0.5±1）；丙氨酸（-0.5）；组氨酸（-0.5）；半胱氨酸（-1.0）；甲硫氨酸（-1.3）；缬氨酸（-1.5）；亮氨酸（-1.8）；异亮氨酸（-1.8）；酪氨酸（-2.3）；苯丙氨酸（-2.5）；色氨酸（-3.4）。

在基于相似的亲水性值来产生改变中，其亲水性值在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，和在±0.5之内的那些是更加特别优选的。

许多科学出版物也已致力于从氨基酸序列的分析来预测二价结构和鉴定表位（Chou和Fasman,1974a,b;1978a,b,1979）。可以使用这些出版物中的任一种，如果希望，以补充美国专利4,554,101的教导。

此外，目前可得计算机程序来帮助预测一种或多种蛋白质、多肽或肽的抗原部分和表位核心区域。实例包括基于Jameson Wolf分析（Jameson和Wolf,1988；Wolf等人,1988）的那些程序，

程序（Brutlag等人,1990；Weinberger等人,1985），和其他新的用于蛋白质三级结构预测的程序（Fetrow和Bryant,1993）。另一个能够施行此类分析的商购可得的软件程序是MacVector（IBI,NewHaven,CT）。

在进一步的实施方案中，肽或多肽的主要抗原决定簇可以通过经验方法来进行鉴定，其中在重组宿主中表达编码肽或多肽的核酸的部分，并且就它们引发免疫应答的能力来测试所得到的肽或多肽。例如，可以使用PC^TM来制备一系列肽或多肽，它们相续地缺乏所述氨基酸序列的C末端的更长片段。测定这些肽或多肽中的每一种的免疫活性以鉴定免疫显性的那些片段或结构域。然后，其中在每个叠代处仅去除小数目的氨基酸的进一步研究允许更精确地测定所述肽或多肽的抗原决定簇的位置。

另一种用于测定肽或多肽的主要抗原决定簇的方法是SPOTs系统（Genosys Biotechnologies,Inc.,The Woodlands,TX）。在该方法中，在纤维素膜上合成重叠性肽，其在合成和去保护后，通过使用多克隆或单克隆抗体来进行筛选。可以通过施行随后的具有更大重叠的更小肽的合成，和通过最后替换在沿着所述免疫反应性序列的每个位置处的各个氨基酸，来进一步定位最初鉴定出的肽或多肽的抗原决定簇。

一旦完成了一个或多个这样的分析，就制备抗原组合物，例如肽或多肽，其包含至少一个或多个抗原决定簇的基本特征。然后，将抗原组合物用于产生针对该组合物（优选地，所述抗原决定簇）的抗血清。

尽管所述讨论集中于由于氨基酸改变产生的功能等价物多肽，但将会理解，这些改变可以通过编码DNA的改变来实施；还考虑到遗传密码是简并的并且两个或更多个密码子可以编码相同的氨基酸。也可以通过标准方法（Sambrook等人,1987），例如通过使用PCR克隆方法，来构建编码这些抗原组合物的核酸并将其插入到一种或两种表达载体中。

除了在本文中所描述的肽基化合物外，发明人还考虑了，可以设计制定其他在空间上相似的化合物以模拟所述肽或多肽结构的关键部分或者与例如抗体特异地相互作用。这样的化合物（其可被称为肽模拟物）可以以与本发明的肽或多肽相同的方式进行使用并因此也是免疫学功能等价物。

在Johnson等人（1993）中描述了模拟蛋白质二级结构的要素的某些模拟物。在肽模拟物的使用背后的基础性原理是，蛋白质的肽主链的存在主要是为了使氨基酸侧链定向，从而促进分子相互作用，例如抗体与抗原的相互作用。因此，设计肽模拟物以允许与天然分子相似的相互作用。

E.抗原诱变

在特别的实施方案中，使抗原组合物发生突变，以便例如增强其免疫原性或者产生或鉴定出免疫学功能等价物序列。诱变方法是本领域技术人员熟知的（Sambrook等人,1987）。

本文所使用的术语“寡核苷酸指导的诱变程序”是指依赖于模板的过程和由载体介导的繁殖，其导致相对于其起始浓度而言特定核酸分子的浓度的增加，或者可检测的信号的浓度的增加，例如扩增。本文所使用的术语“寡核苷酸指导的诱变程序”是希望指这样的过程，其牵涉引物分子的依赖于模板的延伸。术语“依赖于模板的过程”是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列受到熟知的互补碱基配对规则（参见例如，Watson,1987）的指导。典型地，由载体介导的方法牵涉将核酸片段引入到DNA或RNA载体中，克隆扩增所述载体，和回收经扩增的核酸片段。这样的方法的实例由美国专利4,237,224提供，其通过提及而以其整体特别地合并入本文。

在一个优选的实施方案中，使用位点定向诱变。位点特异性诱变是一项在通过作为基础的DNA的特异性诱变来制备抗原组合物（例如，包含肽或多肽，或者免疫学功能等价物蛋白质、多肽或肽的组合物）中有用的技术。通常，位点特异性诱变的技术是本领域熟知的。该技术进一步提供了现成能力以便通过将一个或多个核苷酸序列改变引入到DNA中来制备和测试序列变体，所述序列变体合并了一个或多个前述的考虑。位点特异性诱变允许通过使用特异的寡核苷酸序列来产生突变体，所述特异的寡核苷酸序列编码所希望的突变的DNA序列以及足够数目的邻近核苷酸，以提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列从而在待被突变的位置的两侧形成稳定的双链体。典型地，长度为大约17个至大约75个核苷酸的引物是优选的，其中在待被改变的位置的两侧具有大约10个至大约25个或更多个残基；而长度为大约17个至大约25个核苷酸的引物是更优选的，其中在待被改变的位置的两侧具有大约5个至10个残基。

一般地，位点定向诱变通过首先获得单链载体，或者使双链载体的两条链解链来进行，所述载体在其序列中包括编码所希望的蛋白质的DNA序列。正如本领域技术人员将会理解的，该技术通常采用以单链和双链这两种形式存在的噬菌体载体。在位点定向诱变中有用的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体载体是商购可得的并且它们的使用通常是本领域技术人员熟知的。双链质粒也常规地使用于位点定向诱变中，其除去了将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。

然后，使该诱变引物与单链DNA制备物进行退火，并经历DNA聚合酶例如大肠杆菌（E.coli）聚合酶I Klenow片段，以便完成携带突变的链的合成。因此，形成了这样的异源双链体，其中一条链编码原始的未突变的序列，而第二条链携带所希望的突变。然后，使用该异源双链体载体来转化合适的细胞，例如大肠杆菌细胞，并且选择包括携带经突变的序列排列的重组载体的克隆。

备选地，可以使一对引物与双链载体的两条分开的链进行退火以在PCR^TM反应中同时合成具有所希望的突变的两条相应的互补链。已经设计出了用于富集掺入了诱变寡核苷酸的克隆的遗传选择方案（Kunkel等人,1987）。备选地，可以使用采用商购可得的热稳定酶（例如，Taq聚合酶）的PCR来将诱变寡核苷酸引物掺入到扩增出的DNA片段中，然后可以将其克隆到合适的克隆或表达载体中（Tomic等人,1990；Upender等人,1995）。除了热稳定的聚合酶外，还可以使用采用热稳定的连接酶的PCR来将经磷酸化的诱变寡核苷酸掺入到扩增出的DNA片段中，然后可以将其克隆到合适的克隆或表达载体中（Michael1994）。

通过使用位点定向诱变来制备所选择的基因的序列变体是作为产生可能有用的种类的手段而提供的，但并不意味着限制，因为存在有其中可以获得基因的序列变体的其他方法。例如，可以用诱变剂（例如，羟胺）来处理编码所希望的基因的重组载体，以获得序列变体。

另外，一个特别有用的诱变技术是丙氨酸扫描诱变，其中许多残基独个地用丙氨酸进行置换，从而可以测定丧失侧链相互作用的效应，同时使在蛋白质构象中的大规模扰动的风险最小化（Cunningham等人,1989）。

F.载体

在本发明的一些实施方案中，使用包含核酸载体的免疫学组合物。

为了进行核酸的复制、表达或诱变，可以将所述核酸递送（“转染”）到细胞中。在某些实施方案中，可以使用细胞的转染来重组地产生一个或多个疫苗组分，以用于随后的纯化和制备成药学疫苗。在其他实施方案中，可以包含所述核酸作为向动物施用的基因疫苗。在其他实施方案中，将所述核酸转染到细胞中并将所述细胞作为细胞疫苗组分施用给动物。所述核酸可以仅由裸露的重组DNA组成，或者可以包含例如用于保护所述核酸和/或帮助其靶向特定细胞类型的另外的材料。

术语“载体”被用于指其中可以插入核酸序列的用于引入细胞中的运载核酸分子，在所述细胞中它可以进行复制。核酸序列可以是“外源的”，这意味着它对于其中待引入载体的细胞而言是外来的，或者所述序列与细胞中的序列同源但是处于宿主细胞核酸内的其中通常找不到该序列的位置处。载体包括质粒、粘粒、病毒（噬菌体、动物病毒和植物病毒）和人工染色体（例如，YAC）。本领域技术人员将会经历了足够的训练而能够通过标准的重组技术来构建载体（参见例如，Maniatis等人,1988；和Ausubel等人,1994，这两篇文献都通过提及而合并入本文）。

术语“表达载体”是指任何类型的包含编码能够被转录出来的RNA的核酸的遗传构建体。在一些情况下，随后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列不被翻译，例如在产生反义分子或核酶中。表达载体可以包含各种各样的“控制序列”，其是指对于在特别的宿主细胞中可操作地连接的编码序列的转录和可能地翻译而言必需的核酸序列。

可以将编码所述抗原组合物或其他疫苗组分的核酸稳定地整合到细胞的基因组中，或者可以将其作为分开的附加型DNA区段稳定地保持在细胞中。这样的核酸区段或“附加体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步的保持和复制的序列。载体和表达载体可以包含还提供其他功能并在下文中进行描述的核酸序列。如何将表达构建体递送至细胞以及在所述细胞中该核酸保留在哪里，取决于所使用的表达构建体的类型。

1.启动子和增强子

“启动子”是这样的控制序列，其是核酸序列的一个区域，在该区域处控制了转录的起始和速度。它可以包含遗传元件，在所述遗传元件处调节蛋白和分子（例如，RNA聚合酶和其他转录因子）可以进行结合，以起始核酸序列的特异转录。短语“有效地安置”、“有效地连接”、“在……的控制之下”和“在……的转录控制之下”意味着，启动子处于相对于用于控制那个序列的转录起始和/或表达的核酸序列而言正确的功能位置和/或定向。

启动子通常包含其功能为安置用于RNA合成的起始位点的序列。这样的序列的最熟知的例子是TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子（例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶的启动子和SV40晚期基因的启动子）中，覆盖在起始位点本身上面的不连续元件帮助固定起始的地方。另外的启动子元件调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管已经显示许多启动子在起始位点的下游也包含功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制之下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’末端安置在所选择的启动子的“下游”（即，3’）。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进所编码的RNA的表达。

启动子元件之间的间隔常常是灵活的，从而当将元件相对于另一个元件进行颠倒或移动时，启动子功能被保留。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至相距50bp，之后活性才开始下降。取决于启动子，看起来独个元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。启动子可以与或不与“增强子”相联合地进行使用，后者是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然地相联合的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而获得的。这样的启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然地相联合的那种，其位于那个序列的下游或上游。备选地，通过将编码核酸区段安置在重组或异源的启动子的控制之下将会获得某些优点，所述重组或异源的启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相联合的启动子。重组或异源的增强子也是指在其天然环境中通常不与核酸序列相联合的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，和分离自任何其他病毒或者原核或真核细胞的启动子或增强子，和不是“天然出现”（即包含不同转录调节区域的不同元件，和/或改变表达的突变）的启动子或增强子。例如，在重组DNA构建中最通常使用的启动子包括β-内酰胺酶（青霉素酶）、乳糖和色氨酸（trp）启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以通过与本文中所公开的组合物相关地使用重组克隆和/或核酸扩增技术（包括PCR^TM）来产生序列（参见美国专利号4,683,202和5,928,906，每篇文献通过提及而合并入本文）。进一步地，还考虑了，可以使用指导在非核细胞器（例如，线粒体、叶绿体等）内的序列的转录和/或表达的控制序列。

自然，重要的将是采用这样的启动子和/或增强子，其有效地指导DNA区段在被选择用于进行表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达。分子生物学领域中的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达（参见，例如Sambrook等人,1989，其通过提及而合并入本文）。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下有用的，以指导所引入的DNA区段的高水平表达，例如在重组蛋白质和/或肽的大规模产生中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。

另外，还可以使用任何启动子/增强子组合（按照例如真核启动子数据库（Eukaryotic Promoter Data Base，EPDB））来驱动表达。T3、T7或SP6胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。真核细胞可以支持从某些细菌启动子来进行的胞质转录，如果提供合适的细菌聚合酶（要么作为递送复合物的一部分，要么作为另外的基因表达构建体）。

组织特异性启动子或元件的身份，以及用于表征其活性的测定法，是本领域技术人员熟知的。这样的区域的非限制性实例包括人LIMK2基因（Nomoto等人,1999）、促生长素抑制素受体2基因（Kraus等人,1998）、鼠类附睾视黄酸结合基因（Lareyre等人,1999）、人CD4（Zhao-Emonet等人,1998）、小鼠α2（XI）胶原（Tsumaki等人,1998）、D1A多巴胺受体基因（Lee等人,1997）、胰岛素样生长因子-II（Wu等人,1997）和人血小板内皮细胞粘附分子-1（Almendro等人,1996）。

2.起始信号和内部核糖体结合位点

对于编码序列的有效翻译，也可能要求特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员将会容易地能够确定这一点并提供必需的信号。众所周知的是，起始密码子必须与所希望的编码序列的阅读框“符合读框”，以确保整个插入片段的翻译。外源的翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达的效率可以通过包含合适的转录增强子元件来增强。

在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点（IRES）元件以产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕开依赖于5’-甲基化的帽的翻译的核糖体扫描模式，并且在内部位点开始翻译（Pelletier和Sonenberg,1988）。已经描述了来自小RNA病毒科的两个成员（脊髓灰质炎和脑心肌炎）的IRES元件（Pelletier和Sonenberg,1988），以及来自哺乳动物信息的IRES（Macejak和Sarnow,1991）。可以将IRES元件连接至异源的开放阅读框。多个开放阅读框可以一起进行转录（每个通过IRES隔开），从而产生多顺反子信息。借助于IRES元件，每个开放阅读框易被核糖体接近以进行有效的翻译。通过使用单个启动子/增强子转录出单个信息，可以有效地表达多个基因（参见美国专利号5,925,565和5,935,819，每篇文献通过提及而合并入本文）。

3.多克隆位点

载体可以包括多克隆位点（MCS），其是包含多个限制酶切位点的核酸区域，可以将所述限制酶切位点中的任一个与标准重组技术联合使用来消化所述载体（参见例如，Carbonelli等人,1999；Levenson等人,1998；和Cocea,1997，其通过提及而合并入本文）。“限制酶切消化”是指用仅在核酸分子的特异位置处发挥功能的酶催化切割核酸分子。这些限制酶中的许多是商购可得的。此类酶的使用是本领域技术人员广泛了解的。经常地，使用在MCS内进行切割的限制酶来使载体线性化或片段化，从而使得能够将外源序列连接至所述载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是或不是彼此邻接的。牵涉限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员熟知的。

4.剪接位点

大多数转录出的真核RNA分子将会经历RNA剪接，以便从初始转录物中去除内含子。包含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白质表达的转录物的正确加工（参见例如，Chandler等人,1997，其通过提及而合并入本文）。

5.终止信号

通常，本发明的载体或构建体将会包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与通过RNA聚合酶获得的RNA转录物的特异终止的DNA序列组成。因此，在某些实施方案中，考虑了使RNA转录物的产生结束的终止信号。终止子可能在体内对于取得所希望的信息水平来说是必需的。

在真核系统中，终止子区域也可以包含特异的DNA序列，其允许新的转录物的位点特异性切割以便暴露多腺苷酸化位点。这以信号告知专门的内源聚合酶将一段大约200个的A残基（polyA）添加至该转录物的3’末端。用该polyA尾修饰的RNA分子看起来更稳定并且更有效地被翻译。因此，在牵涉真核生物的其他实施方案中，优选的是，终止子包含用于所述RNA的切割的信号，并且更优选的是，所述终止子信号促进所述信息的多腺苷酸化。所述终止子和/或多腺苷酸化位点元件可以用于增强信息水平和使从盒至其他序列的通读最小化。

被考虑用于在本发明中使用的终止子包括在本文中所描述的或者本领域技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以缺乏可转录的或可翻译的序列，例如由于序列截短。

6.多腺苷酸化信号

在表达（特别是真核表达）中，典型地将会包括多腺苷酸化信号以实施所述转录物的正确的多腺苷酸化。并不认为多腺苷酸化信号的性质对于本发明的成功实施来说是关键的，并且可以采用任何这样的序列。优选的实施方案包括SV40多腺苷酸化信号或牛生长激素多腺苷酸化信号，它们是方便的并且已知在各种靶细胞中良好地发挥功能。多腺苷酸化可以增加所述转录物的稳定性或者可以有助于胞质转运。

7.复制起点

为了在宿主细胞中使载体繁殖，它可以包含一个或多个复制起点位点（经常称为“ori”），其是特定的核酸序列，在该处起始了复制。备选地，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列（ARS）。

8.选择性和筛选性标记

在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记来在体外或在体内鉴别包含本发明的核酸构建体的细胞。这样的标记将会赋予细胞以可鉴别的改变，从而允许容易地鉴别出包含所述表达载体的细胞。通常，选择性标记是赋予允许进行选择的特性的标记。正的选择性标记是其中该标记的存在允许其选择的标记，而负的选择性标记是其中其存在阻止其选择的标记。正的选择性标记的例子是药物抗性标记。

通常，包括药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对于新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标记。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标记之外，还考虑了其他类型的标记，包括筛选性标记，例如GFP，其基础是比色分析。备选地，可以使用筛选性酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）或氯霉素乙酰转移酶（CAT）。本领域技术人员也将知道如何使用免疫学标记，可能地与FACS分析相联合地。并不认为所使用的标记是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时被表达。选择性和筛选性标记的进一步的例子是本领域技术人员熟知的。

9.质粒载体

在某些实施方案中，考虑了将质粒载体用于转化宿主细胞。通常，将包含来自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主相关联地进行使用。所述载体通常携带复制位点，以及能够在经转化的细胞中提供表型选择的标记序列。在非限制性的实例中，常常使用pBR322（一种源自大肠杆菌物种的质粒）的衍生物来转化大肠杆菌。pBR322包含关于氨苄青霉素和四环素抗性的基因，并因此提供了容易的用于鉴定经转化的细胞的手段。pBR质粒或者其他微生物质粒或噬菌体还必须包含，或者被修饰而包含，例如可以被微生物生物体使用用于表达其自身蛋白质的启动子。

另外，可以将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作与这些宿主相关联的转化载体。例如，在制备可以用于转化宿主细胞（例如，大肠杆菌LE392）的重组噬菌体载体中，可以利用噬菌体λGEMTM11。

进一步的有用的质粒载体包括pIN载体（Inouye等人,1985）；和pGEX载体，其用于在产生用于后来的纯化和分离或切割的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）可溶性融合蛋白中使用。其他合适的融合蛋白是具有半乳糖苷酶、遍在蛋白等的那些。

包含表达载体的细菌宿主细胞，例如大肠杆菌，在许多合适的培养基中的任一种（例如LB）之中生长。如本领域技术人员将会理解的，通过使宿主细胞与特异于某些启动子的试剂相接触，例如通过向培养基添加IPTG或通过使培育转换至更高的温度，可以诱导在某些载体中的重组蛋白的表达。在将细菌培养进一步的一段时间（通常2至24小时）后，通过离心来收集细胞并进行洗涤以去除残留的培养基。

10.病毒载体

某些病毒感染细胞或通过由受体介导的胞吞作用进入细胞以及稳定且有效地整合入宿主细胞基因组中并表达病毒基因的能力已使得它们成为用于将外来核酸转移到细胞（例如，哺乳动物细胞）中的有吸引力的候选者。本发明的疫苗组分可以为病毒载体，其编码一个或多个抗原组合物或其他组分，例如免疫调节剂或佐剂。可以用于递送本发明的核酸的病毒载体的非限制性实例描述在下面。

11.腺病毒载体

用于递送所述核酸的一个特别的方法牵涉腺病毒表达载体的使用。尽管已知腺病毒载体具有低的整合入基因组DNA中的能力，但这个特征通过由这些载体所给予的高的基因转移效率而得到弥补。“腺病毒表达载体”意味着包括这样的那些构建体，其包含足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达已被克隆在其中的组织或细胞特异性构建体的腺病毒序列。关于腺病毒（一种36kb的、线性的双链DNA病毒）的遗传组织的知识允许用高达7kb的外来序列来置换大段的腺病毒DNA（Grunhaus和Horwitz,1992）。

12.AAV载体

可以通过使用腺病毒辅助的转染来将所述核酸引入到细胞中。已经通过使用腺病毒偶联系统在细胞系统中报道了增加的转染效率（Kelleher和Vos,1994；Cotten等人,1992；Curiel,1994）。腺伴随病毒（AAV）是用于在本发明的发明疫苗中使用的有吸引力的载体系统，因为它具有高的整合频率并且它可以感染非分裂中的细胞，从而使其可用于将基因递送到哺乳动物细胞中，例如在组织培养物中（Muzyczka,1992）或在体内。就感染性而言，AAV具有宽的宿主范围（Tratschin等人,1984；Laughlin等人,1986；Lebkowski等人,1988；McLaughlin等人,1988）。关于rAAV载体的产生和使用的细节描述在美国专利号5,139,941和4,797,368中，每篇文献通过提及而合并入本文。

13.逆转录病毒载体

逆转录病毒在疫苗中作为抗原递送载体是具有前景的，这归因于它们将其基因整合到宿主基因组中、转移大量的外来遗传材料、感染宽范围的物种和细胞类型以及被包装在特殊细胞系中的能力（Miller,1992）。

为了构建疫苗逆转录病毒载体，将核酸（例如，编码目的抗原的核酸）在某些病毒序列处插入到病毒基因组中从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建包含gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系（Mann等人,1983）。当将包含cDNA连同逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入到特殊细胞系中（例如，通过磷酸钙沉淀）时，所述包装序列允许该重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，所述病毒颗粒随后被分泌到培养基中（Nicolas和Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann等人,1983）。然后，收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染各种各样的细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂（Paskind等人,1975）。

慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域中熟知的（参见例如，Naldini等人,1996；Zufferey等人,1997；Blomer等人,1997；美国专利号6,013,516和5,994,136）。慢病毒的一些例子包括人免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2，和猿猴免疫缺陷病毒SIV。已经通过多次减弱HIV毒力基因来产生慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，从而使得该载体在生物学上是安全的。

重组慢病毒载体能够感染非分裂中的细胞，并且可以用于核酸序列的体内和离体基因转移和表达。例如，在美国专利号5,994,136（其通过提及而合并入本文）中描述了能够感染非分裂中的细胞的重组慢病毒，其中用两种或更多种携带包装功能（即gag、pol和env，以及rev和tat）的载体转染合适的宿主细胞。可以通过将包膜蛋白与用于进行靶向的抗体或特定配体相连接来将重组病毒靶向特定细胞类型的受体。通过将目的序列（包括调节区域）连同例如编码关于在特定靶细胞上的受体的配体的另一个基因一起插入到病毒载体中，所述载体现在是靶特异性的了。

14.其他病毒载体

在本发明中可以采用其他病毒载体作为疫苗构建物。可以采用衍生自病毒例如痘苗病毒（Ridgeway,1988；Baichwal和Sugden,1986；Coupar等人,1988）、辛德比斯病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的载体。它们为各种不同的哺乳动物细胞提供了几个有吸引力的特征（Friedmann,1989；Ridgeway,1988；Baichwal和Sugden,1986；Coupar等人,1988；Horwich等人,1990）。

G.使用经修饰的病毒来进行的疫苗递送

可以将待递送的核酸装在已经进行了改造以表达特异性结合配体的感染性病毒之内。因此，所述病毒颗粒将会特异地结合至靶细胞的关联受体，并且将内含物递送至所述细胞。最近基于通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜来进行的逆转录病毒的化学修饰，开发出了被设计用于允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新方法。该修饰可以允许经由唾液酸糖蛋白受体的肝细胞的特异性感染。

设计了另一种用于重组逆转录病毒的靶向的方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的经生物素化的抗体。通过使用链霉抗生物素蛋白，这些抗体经由生物素组分进行偶联（Roux等人,1989）。通过使用针对I类和II类主要组织相容性复合物抗原的抗体，他们证实了在体外用亲嗜性病毒感染了各种携带那些表面抗原的人细胞（Roux等人,1989）。因此，考虑可以使用抗体、特异性结合配体和/或其他靶向部分来特异地转染APC类型。

H.载体递送和细胞转化

用于在本发明中使用的用于进行核酸递送以便转化细胞器、细胞、组织或生物体的合适方法被认为实际上包括任何这样的方法，通过所述方法可以将核酸（例如，DNA）引入到细胞器、细胞、组织或生物体中，如本文中所描述的或者如本领域技术人员将会知晓的。此类方法包括但不限于，DNA的直接递送，例如通过注射（美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每篇文献通过提及而合并入本文），包括显微注射（Harlan和Weintraub,1985；美国专利号5,789,215，其通过提及而合并入本文）；通过电穿孔（美国专利号5,384,253，其通过提及而合并入本文；Tur-Kaspa等人,1986；Potter等人,1984）；通过磷酸钙沉淀（Graham和Van Der Eb,1973；Chen和Okayama,1987；Rippe等人,1990）；通过使用DEAE葡聚糖，随后为聚乙二醇（Gopal,1985）；通过直接的超声加载（Fechheimer等人,1987）；通过由脂质体介导的转染（Nicolau和Sene,1982；Fraley等人,1979；Nicolau等人,1987；Wong等人,1980；Kaneda等人,1989；Kato等人,1991）和由受体介导的转染（Wu和Wu,1987；Wu和Wu,1988）；通过微粒轰击（PCT申请号WO94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且每篇文献通过提及而合并入本文）；通过用碳化硅纤维进行的搅拌（Kaeppler等人,1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，每篇文献通过提及而合并入本文）；通过由土壤杆菌（Agrobacterium）介导的转化（美国专利号5,591,616和5,563,055，每篇文献通过提及而合并入本文）；或通过由PEG介导的原生质体的转化（Omirulleh等人,1993；美国专利号4,684,611和4,952,500，每篇文献通过提及而合并入本文）；通过由干燥/抑制介导的DNA摄取（Potrykus等人,1985）,以及此类方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，可以稳定地或瞬时地转染细胞器、细胞、组织或生物体。

1.注射

在某些实施方案中，可以通过一次或多次注射（即针注射）来将核酸递送至细胞器、细胞、组织或生物体。注射核酸的方法描述在本文中，并且是本领域技术人员熟知的。本发明的进一步的实施方案包括通过向细胞的直接显微注射来引入核酸。直接显微注射已被用于将核酸构建体引入到爪蟾（Xenopus）卵母细胞中（Harland和Weintraub,1985）。所使用的组合物的量可以随所述抗原以及所使用的细胞器、细胞、组织或生物体的性质而变化。

2.电穿孔

在本发明的某些实施方案中，通过电穿孔来将核酸引入到细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔牵涉将细胞和DNA的悬浮液暴露于高压放电。在该方法的一些变化形式中，采用某些降解细胞壁的酶（例如，降解果胶的酶）来使靶受者细胞相比于未处理的细胞而言对于通过电穿孔进行的转化更易感（美国专利号5,384,253，其通过提及而合并入本文）。备选地，可以使受者细胞对于通过机械创伤进行的转化更易感。

通过使用电穿孔来进行的真核细胞的转染已经是相当成功的。以这种方式，已经用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞（Potter等人,1984），并且已经用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞（Tur Kaspa等人,1986）。

为了在细胞（例如，植物细胞）中施行通过电穿孔的转化，可以采用易碎的组织，例如细胞悬浮培养物或胚胎发生愈伤组织，或者备选地，可以直接转化未成熟的胚胎或其他具有组织构造的组织。在该技术中，可以通过将它们暴露于降解果胶的酶（果胶溶酶（pectolyase））或者以受控方式进行机械创伤来部分地降解所选择的细胞的细胞壁。一些已通过完整细胞的电穿孔而被转化的物种的实例包括玉米（美国专利号5,384,253；Rhodes等人,1995；D’Halluin等人,1992）、小麦（Zhou等人,1993）、西红柿（Hou和Lin,1996）、大豆（Christou等人,1987）和烟草（Lee等人,1989）。

对于植物细胞的电穿孔转化，也可以采用原生质体（Bates,1994；Lazzeri,1995）。例如，通过源自子叶的原生质体的电穿孔来产生转基因大豆植物由Dhir和Widholm描述在国际专利申请号WO9217598中，该文献通过提及而合并入本文。对于其已经描述了原生质体转化的物种的其他实例包括大麦（Lazerri,1995）、高粱（Battraw等人,1991）、玉米（Bhattacharjee等人,1997）、小麦（He等人,1994）和西红柿（Tsukada,1989）。

3.磷酸钙

在本发明的其他实施方案中，通过使用磷酸钙沉淀来将核酸引入到细胞中。已经通过使用该技术，用腺病毒5DNA（Graham和Van DerEb,1973）转染了人KB细胞。也是以这种方式，用新霉素标记基因转染了小鼠L（A9）、小鼠C127、CHO、CV1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞（Chen和Okayama,1987），和用各种不同的标记基因转染了大鼠肝细胞（Rippe等人,1990）。

4.DEAE葡聚糖

在另一个实施方案中，通过使用DEAE葡聚糖和随后的聚乙二醇而将核酸递送到细胞中。以这种方式，将报告质粒引入到了小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中（Gopal,1985）。

5.超声处理加载

本发明的另外的实施方案包括通过直接超声加载来引入核酸。已经通过超声处理加载，用胸苷激酶基因转染了LTK成纤维细胞（Fechheimer等人,1987）。

I.由脂质体介导的转染

在本发明的一个进一步的实施方案中，可以将一种或多种疫苗组分或核酸包载在脂质复合物（例如，脂质体）中。脂质体是囊泡结构，其特征为磷脂双层膜和内部的水性介质。多层脂质体具有多个通过水性介质隔开的脂质层。当将磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在形成封闭的结构之前经历自我重排，并且在脂质双层之间包载水和所溶解的溶质（Ghosh和Bachhawat,1991）。还考虑了与Lipofectamine（Gibco BRL）或Superfect（Qiagen）相复合的核酸。

由脂质体介导的核酸递送以及外来DNA的体外表达已经是非常成功的（Nicolau和Sene,1982；Fraley等人,1979；Nicolau等人,1987）。还已经证实了由脂质体介导的递送以及外来DNA在培养的鸡胚胎、HeLa和肝细胞瘤细胞中的表达的可行性（Wong等人,1980）。

在本发明的某些实施方案中，可以将脂质体与血凝病毒（HVJ）相复合。已经显示这有助于与细胞膜的融合并且促进被脂质体所包囊的DNA的细胞进入（Kaneda等人,1989）。在其他实施方案中，可以将脂质体与核内非组蛋白染色体蛋白质（HMG1）相复合或一起进行使用（Kato等人,1991）。在更进一步的实施方案中，可以将脂质体与HVJ和HMG1两者相复合或一起进行使用。在其他实施方案中，递送载料可以包含配体和脂质体。

J.由受体介导的转染

可以通过使用由受体介导的递送载料来递送一种或多种疫苗组分或核酸。这些利用了将会在靶细胞中发生的通过由受体介导的胞吞来进行的大分子的选择性摄取。鉴于各种受体的细胞类型特异性分布，该递送方法给本发明增添了另一特异性程度。已经描述了在另一种哺乳动物细胞类型背景下的特异性递送（Wu和Wu,1993，其通过提及而合并入本文）。

某些由受体介导的基因靶向载料包含细胞受体特异性配体和核酸结合试剂。其他的包含其上已有效地附着了待递送的核酸的细胞受体特异性配体。几种配体已被用于由受体介导的基因转移（Wu和Wu,1987；Wagner等人,1990；Perales等人,1994；Myers,EPO0273085），这建立了该技术的可操作性。已经描述了在另一种哺乳动物细胞类型背景下的特异性递送（Wu和Wu,1993，其通过提及而合并入本文）。在本发明的某些方面，将会对配体进行选择以对应于在靶细胞群体上特异地表达的受体。

在其他实施方案中，细胞特异性核酸靶向载料的核酸递送载料组分可以包含与脂质体相组合的特异性结合配体。将待递送的核酸装在脂质体内，并且将所述特异性结合配体功能性地掺入到脂质体膜中。因此，所述脂质体将会特异地结合至靶细胞的受体并将内含物递送至细胞。此类系统已显示出是有功能的，其中使用了这样的系统，在所述系统中例如在将核酸以由受体介导的方式递送至展示出EGF受体上调的细胞中使用表皮生长因子（EGF）。

在更进一步的实施方案中，靶向递送载料的核酸递送载料组分可以是脂质体本身，其将优选地包含一种或多种指导细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如，已经将乳糖苷神经酰胺（一种半乳糖末端脱唾液酸神经节苷脂）掺入到脂质体中，并且观察到肝细胞对于胰岛素基因的摄取的增加（Nicolau等人,1987）。考虑了可以以相似的方式将本发明的组织特异性转化构建体特异地递送到靶细胞中。

K.微粒轰击

可以使用微粒轰击技术来将核酸引入到至少一个细胞器、细胞、组织或生物体中（美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号5,610,042；和PCT申请WO94/09699，它们中的每一个通过提及而合并入本文）。该方法依赖于将包被有DNA的微粒加速至高速度从而允许它们刺穿细胞膜并进入细胞而不杀死细胞的能力（Klein等人,1987）。存在有各种各样的本领域中已知的微粒轰击技术，它们中的许多可应用于本发明。

在微粒轰击中，可以将一个或多个颗粒用至少一个核酸进行包被并通过推进力递送到细胞中。已开发出了几种用于加速小颗粒的装置。一种这样的装置依赖于高压放电以产生电流，而电流则提供了原动力（Yang等人,1990）。所使用的微粒由生物学上惰性的物质（例如，钨或金颗粒或珠粒）组成。示例性的颗粒包括由钨，铂，和优选地金组成的那些。考虑了，在一些情况下，向金属颗粒上进行的DNA沉淀对于通过使用微粒轰击将DNA递送至受者细胞来说将不是必需的。但是，考虑了颗粒可以包含DNA而不是用DNA进行包被。包被有DNA的颗粒可以增加通过颗粒轰击来进行的DNA递送的水平，但其单独而言不是必需的。

关于轰击，将处于悬浮中的细胞在滤纸或固体培养基上进行浓缩。备选地，可以将未成熟的胚胎或其他靶细胞安排在固体培养基上。将待轰击的细胞以适当的距离安置在微粒挡板（stopping plate）之下。

用于通过加速来将DNA递送到细胞（例如，植物细胞）中的方法的一个举例说明性的实施方案是生物射弹粒子递送系统，其可以用于推动用DNA进行包被的颗粒或细胞穿过筛网（例如，不锈钢或Nytex筛网）到覆盖有细胞（例如，悬浮培养的单子叶植物细胞）的滤纸表面上。所述筛网使所述颗粒散开，从而并不以大的聚集体将它们递送至受者细胞。据信插入在发射设备与待轰击的细胞之间的筛网减小了发射物聚集体的大小，并且可以通过减小由过大的发射物在受者细胞上造成的损害而有助于更高的转化频率。

L.宿主细胞

本文所使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括其后代，所述后代是任何的和所有的后来的世代。可以理解，所有后代可以不是相同的，这归因于故意的或无意的突变。在表达异源核酸序列的背景下，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且它包括能够复制载体和/或表达由载体所编码的异源基因的任何可转化的生物体。可以并且已经使用宿主细胞作为载体的受者。可以“转染”或“转化”宿主细胞，这是指这样的过程，通过所述过程将外源核酸转移或引入到宿主细胞中。经转化的细胞包括原代受试者细胞及其后代。本文所使用的术语“经改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞意指其中已经引入了外源核酸序列（例如，载体）的细胞。因此，重组细胞可区别于天然出现的细胞，所述天然出现的细胞不包含重组地引入的核酸。

在某些实施方案中，考虑了可以将RNA或蛋白质序列与其他选择出的RNA或蛋白质序列一起在相同的宿主细胞中共表达。共表达可以通过用两种或更多种不同的重组载体共转染宿主细胞来实现。备选地，可以构建单个重组载体以包括多个不同的关于RNA的编码区，所述编码区然后可以在用该单个载体转染的宿主细胞中表达。

组织可以包含待用本发明的组合物进行转化的宿主细胞。所述组织可以是来自生物体的一部分或分离自生物体。在某些实施方案中，组织可以包含但不限于，脂肪细胞、肺泡、成釉质细胞、轴突、基底细胞、血液（例如，淋巴细胞）、血管、骨、骨髓、脑、乳腺、软骨、宫颈、结肠、角膜、胚胎、子宫内膜、内皮、上皮、食道、颜面、成纤维细胞、滤泡、神经节细胞、神经胶质细胞、杯形细胞、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮肤、皮肤、小肠、脾脏、干细胞、胃或睾丸。

在某些实施方案中，所述宿主细胞或组织可以包含在至少一个生物体中。在某些实施方案中，所述生物体可以是，但不限于，原核生物（例如，真细菌、古细菌）或真核生物，如本领域技术人员将会理解的。

可以得到许多细胞系和培养物用于作为宿主细胞，并且它们可以通过美国典型培养物保藏中心（ATCC）（其是充当关于活培养物和遗传材料的档案库的组织）获得。本领域技术人员可以基于载体骨架和所希望的结果来确定合适的宿主。例如，可以将质粒或粘粒引入到原核生物宿主细胞中以便进行许多载体的复制。对于载体复制和/或表达可得的细胞类型包括但不限于：细菌，例如大肠杆菌（例如，大肠杆菌菌株RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776（ATCCNo.31537）以及大肠杆菌W3110（F，λ，原养型的，ATCC No.273325）、DH5α、JM109和KC8），芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），和其他肠杆菌科（Enterobacteriaceae），例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），各种假单胞菌属（Pseudomonas）物种，以及许多商购可得的细菌宿主，例如

Competent Cells和SOLOPACK Gold Cells（

La Jolla）。在某些实施方案中，细菌细胞例如大肠杆菌LE392特别地被考虑作为用于噬菌体病毒的宿主细胞。

用于载体的复制和/或表达的真核宿主细胞的例子包括但不限于，HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。许多来自各种细胞类型和生物体的宿主细胞是可得的，并且是本领域技术人员将会知晓的。类似地，可以将病毒载体与真核或原核宿主细胞（特别是许可该载体的复制或表达的细胞）一起使用。

有些载体可以采用允许它在原核细胞和真核细胞两者中进行复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将会进一步理解培育所有上面所描述的宿主细胞以维持它们并允许载体的复制所处的条件。将会允许载体的大规模产生以及由载体所编码的核酸和其关联多肽、蛋白质或肽的产生的技术和条件也是了解和知晓的。

M.表达系统

存在许多包含上面所讨论的组合物中的至少一部分或全部的表达系统。可以采用基于原核生物和/或真核生物的系统用于本发明以产生核酸序列，或其关联多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是在商业上和广泛地可得的。

昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生异源核酸区段的高水平的蛋白质表达，它们例如描述在美国专利号5,871,986、4,879,236（两者均通过提及而合并入本文）中，并且它们可以例如从

以名称

和从

以名称“BACPACK^TM杆状病毒表达系统”购得。

表达系统的其他实例包括

的COMPLETECONTROL诱导型哺乳动物表达系统，其牵涉由合成的蜕皮激素可诱导的受体，或其pET表达系统（一种大肠杆菌表达系统）。诱导型表达系统的另一个例子是从可得的，其携带T-REX^TM（由四环素调节的表达）系统，这是一种使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。

还提供称为甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）表达系统的酵母表达系统，其是为在甲醇毕赤酵母这种甲基营养酵母中高水平地产生重组蛋白质而设计的。本领域技术人员将会知晓如何表达载体（例如，表达构建体），以产生核酸序列或其关联多肽、蛋白质或肽。

考虑了可以“过表达”（即以相对于其在细胞中的天然表达而言增加的水平进行表达）通过本发明的方法产生的蛋白质、多肽或肽。这样的过表达可以通过各种各样的方法（包括放射性标记和/或蛋白质纯化）来进行评估。然而，简单且直接的方法是优选的，例如，牵涉SDS/PAGE和蛋白质染色或Western印迹以及随后的定量分析（例如，结果所得的凝胶或印迹的光密度扫描）的那些。相比于在天然细胞中的水平而言重组蛋白质、多肽或肽的水平的特异增加指示了过表达，如同所述特异的蛋白质、多肽或肽相对于其他由宿主细胞所产生的蛋白质而言的相对丰度那样，并且例如在凝胶上是可见的。

在一些实施方案中，表达出的蛋白质序列在宿主细胞中形成内含体，将宿主细胞裂解（例如，通过在细胞匀浆器中进行破裂），洗涤和/或离心以将密度大的内含体和细胞膜与可溶的细胞组分分开。该离心可以在这样的条件下进行，凭借所述条件，通过将糖（例如，蔗糖）掺入到缓冲液中并且以选择的速度进行离心而选择性地富集了密度大的内含体。可以将内含体在还原剂例如β-巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）存在下溶解在包含高浓度的尿素（例如，8M）或离液序列高的试剂（例如，盐酸胍）的溶液中，并且再折叠成更想要的构象，如本领域技术人员将会知晓的。

N.疫苗组分纯化

在任何情况下，可以从化学合成试剂、细胞或细胞组分中分离和/或纯化出疫苗组分（例如，抗原性肽或多肽或者编码蛋白质组合物的核酸）。在产生疫苗组分的方法中，纯化通过在本文中所描述的或者本领域技术人员熟知的（例如，Sambrook等人,1987）任何合适的技术来完成。尽管对于在某些实施方案中的使用是优选的，但并不存在总是以其最纯化的状态提供本发明的抗原组合物或其他疫苗组分的一般要求。实际上，考虑了，较不基本上纯化的疫苗组分（其相对于天然状态而言在所希望的化合物中仍是富集的）将会在某些实施方案（例如，蛋白质产物的完全回收）或在保持表达出的蛋白质的活性中具有用处。然而，考虑了，无活性的产物在某些实施方案中（例如，在通过抗体产生来测定抗原性中）也具有用处。

本发明还提供了纯化的，和在优选的实施方案中，基本上纯化的疫苗或疫苗组分。本文所使用的术语“纯化的疫苗组分”意指至少一种疫苗组分（例如，蛋白质组合物，其可从细胞中分离），其中将所述组分相对于其天然可获得的状态而言（例如，相对于其在细胞提取物或化学合成试剂中的纯度而言）纯化至任何程度。在其中所述疫苗组分为蛋白质组合物的某些方面，纯化的疫苗组分还指摆脱了在其中它天然出现的环境的野生型或突变型蛋白质、多肽或肽。

当使用术语“基本上纯化的”时，这将涉及这样的组合物，在所述组合物中，特定的化合物（例如，蛋白质、多肽或肽）构成所述组合物的主要组分，例如占所述组合物中的化合物的大约50%或更多。在优选的实施方案中，基本上纯化的疫苗组分将占所述组合物中的化合物的大于大约60%、大约70%、大约80%、大约90%、大约95%、大约99%或甚至更多。

在某些实施方案中，可以将疫苗组分纯化至同质。如应用于本发明的，“纯化至同质”意味着所述疫苗组分具有这样的纯度水平，其中所述化合物基本上不含其他化学品、生物分子或细胞。例如，纯化的肽、多肽或蛋白质经常将会是充分地没有其他蛋白质组分，从而可以成功地进行降解测序。鉴于本公开内容，各种用于定量疫苗组分的纯化程度的方法将会是本领域技术人员已知的。这些方法包括例如，测定级分的比蛋白质活性（例如，抗原性），或者通过凝胶电泳来评估级分内的多肽的数目。

可以将本领域技术人员熟知的适合于在化学、生物分子或生物学纯化中使用的各种技术应用于本发明的疫苗组分的制备。这些技术包括：例如，用硫酸铵、PEG、抗体等或者通过热变性进行沉淀，随后进行离心；分级分离；色谱法程序，包括但不限于分配色谱法（例如，纸色谱法、薄层色谱法（TLC）、气液色谱法和凝胶色谱法）、气相色谱法、高效液相色谱法、亲和色谱法、超临界流体色谱法、离子交换、凝胶过滤、反向色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝集素亲和色谱法；等电聚焦和凝胶电泳（参见例如，Sambrook等人,1989；和Freifelder,Physical Biochemistry,第二版,第238-246页，其通过提及而合并入本文）。

假定许多DNA和蛋白质是已知的（参见例如，国家生物技术信息中心的

和GenPept数据库），或者可以通过使用本文中所描述的方法来鉴定和扩增，那么现在可以采用本领域技术人员已知的任何用于重组表达出的核酸或蛋白质序列的纯化方法。在某些方面，可以在聚丙烯酰胺凝胶和/或氯化铯离心梯度上，或者通过本领域技术人员已知的任何其他手段来纯化核酸（参见例如,Sambrook等人,1989，其通过提及而合并入本文）。在进一步的方面，蛋白质序列的纯化可以通过将该序列重组地表达为融合蛋白来进行。这样的纯化方法在本领域中是常规的。这通过下列内容来举例说明：产生特定蛋白质-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白，在大肠杆菌中进行表达，和通过使用在谷胱甘肽琼脂糖上的亲和色谱法来分离至同质；或者在蛋白质的N或C末端产生聚组氨酸标签，和随后通过使用Ni亲和色谱法来进行纯化。在特别的方面，可以通过流式细胞术来纯化所述疫苗的细胞或其他组分。流式细胞术牵涉液体样品中细胞或其他颗粒的分离，并且是本领域中熟知的（参见例如，美国专利号3,826,364、4,284,412、4,989,977、4,498,766、5,478,722、4,857,451、4,774,189、4,767,206、4,714,682、5,160,974和4,661,913）。可以使用本文中所描述的这些技术中的任一种，以及这些技术与本领域技术人员已知的任何其他技术的组合，来纯化各种化学品、蛋白质化合物、核酸、细胞材料和/或可能包含本发明的疫苗的细胞，和/或测定其纯度。如本领域中通常已知的，认为可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，而仍然导致用于制备基本上纯化的抗原或其他疫苗组分的合适方法。

O.另外的疫苗组分

考虑了可以将本发明的抗原组合物与一种或多种另外的组分相组合以形成更有效的疫苗。另外的组分的非限制性实例包括例如，一种或多种另外的抗原、免疫调节剂或佐剂，其用于刺激针对本发明的抗原组合物和/或所述另外的组分的免疫应答。

1.免疫调节剂

例如，考虑了可以将免疫调节剂包括在所述疫苗中以提高细胞的或患者的（例如，动物的）应答。可以作为纯化的蛋白质、编码免疫调节剂的核酸和/或在疫苗组合物中表达免疫调节剂的细胞来包括免疫调节剂。下面的部分列出了令人感兴趣的免疫调节剂的非限制性实例，并且考虑了在某些实施方案中可以使用免疫调节剂的各种不同的组合（例如，细胞因子和趋化因子）。

2.细胞因子

考虑了将白介素、细胞因子、编码白介素或细胞因子的核酸和/或表达此类化合物的细胞作为可能的疫苗组分。白介素和细胞因子包括但不限于，白介素1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-18、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、制管张素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、METH1、METH2、肿瘤坏死因子、TGF-β、LT以及其组合。

3.趋化因子

还可以使用趋化因子、编码趋化因子的核酸和/或表达此类化合物的细胞作为疫苗组分。趋化因子通常作为化学引诱物起作用以募集免疫效应细胞至趋化因子表达的位点处。可能有利的是，与例如细胞因子编码序列相组合地表达特定的趋化因子编码序列，以增强其他免疫系统组分向处理位点的募集。此类趋化因子包括例如，RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、IP-10以及其组合。本领域技术人员将会认识到，某些细胞因子也已知具有化学引诱效应，并且也可以被归类于术语“趋化因子”之下。

4.免疫原性载体蛋白

在某些实施方案中，可以将抗原组合物化学偶联至载体或者与免疫原性载体肽或多肽一起重组地表达（例如，抗原-载体融合肽或多肽）以增强免疫反应。示例性的和优选的免疫原性载体氨基酸序列包括，乙型肝炎表面抗原、匙孔虫戚血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）。也可以使用其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白作为免疫原性载体蛋白。用于将多肽或肽缀合至免疫原性载体蛋白的手段是本领域中熟知的，并且包括例如，戊二醛、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双-二氮化的联苯胺。

5.生物应答调节物

可能希望的是共施用生物应答调节物（BRM），其已显示上调T细胞免疫或下调抑制性细胞活性。这样的BRM包括但不限于，西咪替丁（CIM；1200mg/日）（Smith/Kline,PA）；低剂量的环磷酰胺（CYP；300mg/m2）（Johnson/Mead,NJ）；或者编码参与一种或多种免疫辅助功能的蛋白质（例如B7）的基因。

6.佐剂

许多年来，免疫接种实验方案已经使用佐剂来刺激应答，并因而佐剂是本领域技术人员熟知的。一些佐剂影响呈递抗原的途径。例如，当用明矾沉淀蛋白质抗原时，增加了免疫应答。抗原的乳化也延长抗原呈递的持续时间。

在一个方面，佐剂效应通过使用诸如明矾的试剂来实现，所述试剂以在磷酸缓冲盐水中的大约0.05%至大约0.1%的溶液来进行使用。备选地，将所述抗原制备成与合成的糖聚合物

的混合物，其作为大约0.25%的溶液来进行使用。佐剂效应也可以通过下述方式来产生：通过用范围在大约70℃至大约101℃的温度分别热处理30秒至2分钟的时间段来使疫苗中的抗原聚集。还可以采用：通过用经胃蛋白酶处理的（Fab）针对白蛋白的抗体进行再激活来施行聚集；与细菌细胞（例如，小棒杆菌（C.parvum））、内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多糖组分相混合；在生理学上可接受的油载料例如二缩甘露醇单油酸酯（Aracel A）中进行乳化；或者用作为血液代用品进行使用的全氟化碳

的20%溶液进行乳化。

一些佐剂，例如从细菌获得的某些有机分子，对于宿主而非对于抗原起作用。一个例子是胞壁酰二肽（N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[MDP]），其是一种细菌肽聚糖。如对于大多数佐剂一样，MDP的效应还未完全了解。MDP刺激巨噬细胞，但也看起来直接刺激B细胞。因此，佐剂的效应不是抗原特异性的。然而，如果将它们与纯化的抗原一起施用，那么可以将它们用于选择性地促进对于该抗原的应答。

已经实验性地将佐剂用于促进针对未知抗原的免疫性的普遍增加（例如，美国专利4,877,611）。

在某些实施方案中，也可以在本发明中使用血蓝蛋白和血赤藓素。来自匙孔虫戚的血蓝蛋白（KLH）的使用在某些实施方案中是优选的，尽管可以采用其他软体动物和节肢动物的血蓝蛋白和血赤藓素。

还可以使用各种多糖佐剂。例如，已经描述了对于小鼠的抗体应答使用各种肺炎球菌多糖佐剂（Yin等人,1989）。应当如所指出的那样（Yin等人,1989）来采用产生最佳应答，或者从其他方面来说不产生抑制的剂量。多糖的聚胺品种是特别优选的，例如壳多糖和壳聚糖，包括脱乙酰壳多糖。

另一组佐剂为细菌肽聚糖的胞壁酰二肽（MDP，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺）组。还考虑了胞壁酰二肽的衍生物，例如氨基酸衍生物苏氨酰-MDP，和脂肪酸衍生物MTPPE。

美国专利4,950,645描述了胞壁酰二肽的亲脂的二糖-三肽衍生物，其被描述用于在由磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油形成的人工脂质体中使用。它在激活人单核细胞和破坏肿瘤细胞方面是有效的，但是在一般高的剂量下是无毒性的。考虑了将美国专利4,950,645和PCT专利申请WO91/16347的化合物与细胞载料和本发明的其他实施方案一起使用。

另一种被考虑在本发明中使用的佐剂为BCG。在本发明中也可以使用BCG（卡-介杆菌，一种分枝杆菌属（Mycobacterium）的减毒株）和BCG细胞壁骨架（CWS）作为佐剂，具有或不具有海藻糖二霉菌酸酯。可以使用海藻糖二霉菌酸酯本身。海藻糖二霉菌酸酯施用已在小鼠中显示出与增加的对于流感病毒感染的抗性相关（Azuma等人,1988）。可以如在美国专利4,579,945中描述的那样来制备海藻糖二霉菌酸酯。

由于其免疫刺激特性，BCG是重要的临床工具。BCG所起的作用为刺激网状内皮系统，激活天然杀伤细胞，并增加造血干细胞的增殖。已证明BCG的细胞壁提取物具有极好的免疫佐剂活性。用于分枝杆菌的分子遗传工具和方法已经提供了将外来基因引入到BCG中的手段（Jacobs等人,1987；Snapper等人,1988；Husson等人,1990；Martin等人,1990）。

活的BCG是世界范围内用于预防结核病的有效且安全的疫苗。BCG和其他分枝杆菌是高度有效的佐剂，并且已经广泛地研究了对于分枝杆菌的免疫应答。以将近20亿次免疫接种，BCG具有长的在人中的安全使用记录（Luelmo,1982；Lotte等人,1984）。它是少数几种可以在出生时给予的疫苗之一，它以仅单个剂量产生长期的免疫应答，并且存在具有BCG疫苗接种经验的世界范围的分布网络。一种示例性的BCG疫苗以TICE BCG（Organon Inc.,West Orange,NJ）进行销售。

在本发明的一个典型的实施中，使牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）-BCG的细胞生长，并且通过本领域中已知的方法来收获。例如，可以使它们作为表面薄膜在Sauton培养基上或者在包含处于Dubos培养基中的分散培养物的发酵容器中进行生长（Dubos等人,1947；Rosenthal,1937）。在大约37℃下培育14天后收获所有培养物。作为薄膜进行生长的细胞通过使用铂环来进行收获，而那些来自发酵罐的细胞则通过离心或切向流过滤来进行收获。将所收获的细胞重悬浮在水性无菌缓冲介质中。典型的悬浮液包含大约2×10¹⁰个细胞/ml至大约2×10¹²个细胞/ml。向该细菌悬浮液添加包含所选择的酶的无菌溶液，所述酶将会降解覆盖材料的BCG细胞。搅动所得的悬浮液，例如通过搅拌，以确保BCG生物体的最大分散。然后，制备更浓缩的细胞悬浮液，并去除在该浓缩物中的酶，通常通过用水性缓冲液进行洗涤，采用已知的技术例如切向流过滤。用冷冻保护剂溶液将没有酶的细胞调整至最佳的免疫学浓度，之后将它们装填入小瓶、安瓿瓶等之中，并进行冻干，从而产生BCG疫苗，其在用水重构之后即可用于免疫接种。

两亲性的和具表面活性的试剂，例如皂苷和衍生物例如QS21（Cambridge Biotech），构成了另外一组用于与本发明的免疫原一起使用的佐剂。还可以采用非离子的嵌段共聚物表面活性剂（Rabinovich等人,1994；Hunter等人,1991）。寡核苷酸是另一有用的一组佐剂（Yamamoto等人,1988）。Quil A和蘑菇多糖是可以在本发明的某些实施方案中使用的其他佐剂。

用于在本发明中使用的一组优选的佐剂是去毒内毒素，例如美国专利4,866,034的精制的去毒内毒素。这些精制的去毒内毒素在哺乳动物中产生佐剂应答方面是有效的。当然，可以将去毒内毒素与其他佐剂相组合以制备掺入了多佐剂的细胞。例如，特别考虑了去毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯的组合，如在美国专利4,435,386中所描述的。还考虑了去毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯和内毒性糖脂的组合（美国专利4,505,899），如同去毒内毒素与细胞壁骨架（CWS）或者CWS与海藻糖二霉菌酸酯的组合那样，如在美国专利4,436,727、4,436,728和4,505,900中所描述的。仅CWS与海藻糖二霉菌酸酯而没有去毒内毒素的组合也被预想是有用的，如在美国专利4,520,019中所描述的。

在其他实施方案中，本发明考虑了可以在细胞的膜中使用各种不同的佐剂，从而导致经改善的免疫原组合物。通常，唯一的要求是所述佐剂能够掺入到所研究的细胞的细胞膜中、与所研究的细胞的细胞膜物理地相联合或者缀合至所研究的细胞的细胞膜。本领域技术人员将会知晓不同种类的可以与根据本发明的细胞疫苗相缀合的佐剂，并且这些尤其包括烷基溶血磷脂（ALP)；BCG；和生物素（包括生物素化的衍生物）。某些被特别地考虑使用的佐剂为来自革兰氏阳性细胞的磷壁酸。这些包括脂磷壁酸（LTA）、核糖醇磷壁酸（RTA）和甘油磷壁酸（GTA）。与本发明相关地，还可以采用它们的合成对应物的活性形式（Takada等人,1995a）。

各种佐剂，甚至那些通常不在人中使用的佐剂，仍然可以在动物中使用，当例如希望产生抗体或随后获得经激活的T细胞时。可能由于佐剂或细胞而引起的毒性或其他副作用（例如，如在使用未经辐射的肿瘤细胞时可能出现的那样）在这样的情况下是不相关的。

一组对于在本发明的一些实施方案中的使用来说优选的佐剂是可以由核酸（例如，DNA或RNA）编码的那些。考虑了，这样的佐剂可以编码在编码所述抗原的核酸（例如，表达载体）中，或者编码在分开的载体或其他构建体中。可以直接递送这些编码佐剂的核酸，例如用脂质或脂质体。

7.赋形剂、盐和辅助物质

可以将本发明的抗原组合物与一种或多种另外的药学上可接受的且与至少一个活性成分（例如，抗原）相容的组分（例如，赋形剂、盐等）相混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇以及其组合。

可以将本发明的抗原组合物配制成以中性或盐形式的疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐（与所述肽的游离氨基基团形成）和与无机酸（例如，盐酸或磷酸）或有机酸（例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等）形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱例如异丙基胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因，以及其组合。

另外，如果希望，抗原组合物可以包含少量的一种或多种辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其增强所述抗原组合物或疫苗的效用。

P.疫苗制剂

一但产生、合成和/或纯化，就可以将抗原或其他疫苗组分制备成用于向患者施用的疫苗。疫苗的制备通常是本领域充分了解的，如由美国专利号4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230和4,596,792所例示的，其全部通过提及而合并入本文。鉴于本公开内容，此类方法可以用于制备包含抗原组合物的疫苗，所述抗原组合物包含一种或多种尿枝原体抗原作为活性成分。在优选的实施方案中，将本发明的组合物制备成药理学上可接受的疫苗。

本发明的药物疫苗组合物包含有效量的一种或多种尿枝原体抗原或另外的试剂，它们溶解或分散在药学上可接受的载体中。短语“药学上或药理学上可接受的”涉及这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物（例如人，在合适的情况下）时，不产生不利的、变应性的或其他不希望的反应。鉴于本公开内容，包含至少一种尿枝原体抗原或另外的活性成分的药物组合物的制备将会是本领域技术人员已知的，如由Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,MackPrinting Company,1990（其通过提及而合并入本文）所例示的。此外，对于动物（例如，人）施用，将会理解，制剂应当满足由FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂（例如，抗细菌剂、抗真菌剂）、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、矫味剂、染料等，以及其组合物，如本领域技术人员将会知晓的（参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页，其通过提及而合并入本文）。所述尿枝原体疫苗可以包含不同类型的载体，取决于它将会以固体、液体还是气溶胶形式进行施用，和对于诸如注射的施用途径来说它是否需要是无菌的。除非任何常规的载体是与所述活性成分不相容的，否则就考虑其在所述治疗或药物组合物中的使用。

在任何情况下，所述组合物可以包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可以通过防腐剂来防止微生物的作用，所述防腐剂例如为各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类（例如，羟苯甲酯、羟苯丙酯）、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

可以将所述尿枝原体疫苗配制成以游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组分的游离氨基基团形成的那些，或者与无机酸（例如，盐酸或磷酸）或有机酸（例如，乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸）形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱例如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸或普鲁卡因。

在所述组合物以液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等）、脂质（例如，甘油三酯、植物油、脂质体）以及其组合。可以通过下述方式来维持适当的流动性：例如，通过使用包衣剂，例如卵磷脂；通过保持所要求的颗粒大小，这经由分散在载体（例如，液体多元醇或脂质）中来实现；通过使用表面活性剂，例如羟丙基纤维素；或这此类方法的组合。在许多情况下，将会是优选的是，包括等渗剂，例如糖、氯化钠或其组合。

在其他实施方案中，可以在本发明中使用滴眼剂、鼻溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂。此类组合物通常被设计成与靶组织类型相容。在一个非限制性的实例中，鼻溶液通常是被设计成以滴剂或喷雾剂向鼻道施用的水溶液。这样制备鼻溶液，从而使得它们在许多方面与鼻分泌物是相似的，从而保持正常的纤毛作用。因此，在优选的实施方案中，水性鼻溶液经常是等渗的或经轻微缓冲以维持大约5.5至大约6.5的pH。另外，可以在所述配制剂中包括抗微生物的防腐剂（与在眼用制剂中使用的那些相似）、药物或合适的药物稳定剂，如果需要。例如，各种商业鼻制剂是已知的，并且包括诸如抗生素或抗组胺剂的药物。

在某些实施方案中，将所述尿枝原体疫苗制备成用于通过诸如口服摄入的途径进行施用。在这些实施方案中，所述固体组合物可以包含例如溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊（例如，硬或软壳的明胶胶囊）、持续释放配制剂、颊组合物、含锭、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂或其组合。可以将口服组合物与膳食食物直接相掺合。用于口服施用的优选的载体包括惰性稀释剂、可同化的食用载体或其组合。在本发明的其他方面，可以将所述口服组合物制备成糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂可以包含例如至少一种活性试剂、增甜剂、防腐剂、矫味剂、染料、防腐剂或其组合。

在某些优选的实施方案中，口服组合物可以包含一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂以及其组合。在某些实施方案中，组合物可以包含下列中的一种或多种：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；增甜剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；矫味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃调味料、柑橘调味料等；或者上述的其组合。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以包含诸如液体载体的载体。各种其他材料可以作为包衣剂而存在，或者要么修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶、糖或两者进行包衣。

另外的适合于其他施用方式的配制剂包括栓剂。栓剂是具有各种不同重量和形状的固体剂型，其通常加入了药物，用于插入直肠、阴道或尿道。在插入后，栓剂变软、融化或溶解在腔液中。通常，对于栓剂，传统的载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以从包含例如在大约0.5%至大约10%，和优选地大约1%至大约2%的范围内的活性成分的混合物来形成。

无菌可注射溶液通过下述方式来制备：以所需要的量将活性化合物掺入到具有上面列举的各种其他成分（如果需要）的合适的溶剂中，接着过滤灭菌。通常，分散体通过下述方式来制备：将各种经灭菌的活性成分掺入到包含基础分散介质和/或其他成分的无菌载料中。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这些技术从其事先经无菌过滤的液体介质产生活性成分加上任何另外的所希望的成分的粉末。所述液体介质应当适当地进行缓冲（如果需要），并且在用足够的盐水或葡萄糖进行注射之前，首先使液体稀释剂变成等渗的。还考虑了用于直接注射的高度浓缩的组合物的制备，其中预想DMSO作为溶剂的使用导致极其快速的渗透，从而将高浓度的活性试剂递送至小的区域。

所述组合物必须在制造和储存条件下是稳定的，并且免于受到微生物（例如，细菌和真菌）的污染作用的影响。将会理解的是，应当将内毒素污染最低程度地保持在安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。

在特别的实施方案中，可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂（例如，单硬脂酸铝、明胶或其组合）来达到可注射组合物的延长的吸收。

V.示例性的疫苗施用

疫苗的施用方式可以宽广地变化。任一种用于施用疫苗的常规方法都是可应用的。例如，疫苗可以常规地以静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、膀胱内、粘膜、心包内、口服、直肠、鼻、局部表面、在滴眼剂中、局部、使用气溶胶、注射、输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的局部化灌注、通过导管、通过灌洗、在霜剂中、在脂质组合物（例如，脂质体）中、或者通过其他方法或上述的任何组合这些方式进行施用，如本领域技术人员将会知晓的（参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990，其通过提及而合并入本文）。

疫苗接种计划安排和剂量可以基于患者之间的差异而变化，其中例如考虑诸如下列的因素：患者的体重和年龄，正在治疗的疾病的类型，疾病状况的严重度，先前的或同时发生的治疗干预，施用方式等等，其可以由本领域技术人员容易地确定。

将疫苗以与剂量配制剂相容的方式和以诸如将会是治疗有效的且免疫原性的量进行施用。例如，在具有短的体内半衰期的情况下，肌内途径可能是优选的。待施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体的免疫系统合成抗体的能力，和所希望的保护程度。疫苗的剂量将取决于施用途径和将会根据宿主的大小而变化。对于进行施用所需要的活性成分的精确的量取决于医师的判断。在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少大约0.1%的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物例如可以占该单位剂量的重量的大约2%至大约75%，或大约25%至大约60%，和任何从其中可导出的范围。然而，合适的剂量范围可以例如是每次疫苗接种几百微克活性成分的级别。在其他非限制性的实例中，剂量也可以包含每次疫苗接种从大约1μg/kg体重，大约5μg/kg体重，大约10μg/kg体重，大约50μg/kg体重，大约100μg/kg体重，大约200μg/kg体重，大约350μg/kg体重，大约500μg/kg体重，大约1mg/kg体重，大约5mg/kg体重，大约10mg/kg体重，大约50mg/kg体重，大约100mg/kg体重，大约200mg/kg体重，大约350mg/kg体重，大约500mg/kg体重，至大约1000mg/kg体重或更多，以及从其中可导出的任何范围。在从本文所列数字中可导出的范围的非限制性实例之中，可以施用大约5mg/kg体重至大约100mg/kg体重，大约5μg/kg体重至大约500mg/kg体重等的范围，基于上面所描述的数字。关于初始施用和加强施用（例如，接种）的合适的制度也是可变的，但典型的是进行初始施用，接着为随后的接种或其他施用。

在许多情况下，将会希望的是具有多次的疫苗施用，通常不超过六次疫苗接种，更通常地不超过四次疫苗接种，和优选地，一次或多次，通常至少大约三次疫苗接种。疫苗接种通常将会以两周至十二周的间隔，更常见地三周至五周的间隔。以1-5年（通常三年）的间隔的定期加强免疫对于维持保护水平的抗体来说将会是所希望的。

免疫接种的过程之后可以为用于对于上清液抗原的抗体的测定法。所述测定法可以通过用常规标记物（例如，放射性核素、酶、荧光剂等）进行标记来进行。这些技术是众所周知的，并且可以在各种各样的专利中找到，例如美国专利号3,791,932、4,174,384和3,949,064，作为这些类型的测定法的举例说明。在免疫接种之后，可以进行其他免疫测定法，并且可以进行免于用尿枝原体疫苗进行的攻击的保护作用的测定法。

A.免疫应答的增强

本发明包括在受试者中增强免疫应答的方法，所述方法包括使一种或多种淋巴细胞与尿枝原体抗原组合物相接触的步骤。在某些实施方案中，所述一种或多种淋巴细胞包含在动物（例如，人）中。在其他实施方案中，所述淋巴细胞可以分离自动物或该动物的组织（例如，血液）。在某些优选的实施方案中，所述淋巴细胞是外周血淋巴细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种淋巴细胞包含T-淋巴细胞或B-淋巴细胞。在特别优选的方面，所述T-淋巴细胞是细胞毒性T-淋巴细胞。

所述增强的免疫应答可以是主动的或被动的免疫应答。备选地，所述应答可以是过继免疫治疗方法的一部分，其中从动物（例如，患者）中获得淋巴细胞，然后用包含抗原组合物的组合物进行脉冲刺激。在一个优选的实施方案中，可以向相同或不同的动物（例如，相同或不同的供者）施用所述淋巴细胞。

B.细胞毒性T淋巴细胞

在某些实施方案中，通过与本发明的抗原组合物相接触来特异地激活T-淋巴细胞。在某些实施方案中，通过与抗原呈递细胞相接触来激活T-淋巴细胞，所述抗原呈递细胞与或者已经与本发明的抗原组合物相接触。

T细胞在其膜上表达独特的抗原结合受体（T细胞受体），其可以仅识别在其他细胞的表面上的与主要组织相容性复合物（MHC）分子相关的抗原。存在有几个T细胞群体，例如辅助性T细胞和细胞毒性T细胞。辅助性T细胞和细胞毒性T细胞主要通过它们分别展示膜结合型糖蛋白CD4和CD8而相区别。辅助性T细胞分泌各种淋巴因子，它们对于B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和免疫系统的其他细胞的激活是关键的。相反地，识别抗原-MHC复合物的细胞毒性T细胞进行增殖并分化成称为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应细胞。CTL通过产生导致细胞裂解的物质来去除展示出抗原的身体细胞。

CTL活性可以通过本文中所描述的方法或者本领域技术人员将会知晓的方法来进行评估。例如，可以使用标准的4小时⁵¹Cr释放微量毒性测定法，在新鲜分离的外周血单核细胞（PBMC）中，在从PBMC建立的经植物凝集素刺激的经IL-2扩展的细胞系（Bernard等人,1998）中，或者通过从先前经免疫接种的受试者中分离并用被包含抗原的腺病毒载体感染的DC再刺激6天的T细胞来评估CTL。在另一种为了检测由细胞介导的细胞毒性而开发的荧光分析测定法中，所使用的荧光团是非毒性的分子alamarBlue（Nociari等人,1998）。alamarBlue是荧光猝灭的（即，低的量子产率），直至线粒体还原发生，其然后导致alamarBlue荧光强度的剧烈增加（即，量子产率的增加）。据报道该测定法是极其灵敏的、特异性的，并且要求比标准的⁵¹Cr释放测定法显著更低的效应细胞数目。

在某些方面，辅助性T细胞应答可以通过用肽、多肽或蛋白质来进行的体外或体内测定法来测量。体外测定法包括通过酶、放射性同位素、生色团或荧光测定法来测量特定的细胞因子释放。体内测定法包括称为“皮肤试验”的延迟型超敏性应答，如本领域技术人员将会知晓的。

C.抗原呈递细胞

一般地，术语“抗原呈递细胞”可以是通过帮助增强针对本发明的抗原（例如，尿枝原体抗原或免疫学功能等价物）或抗原组合物的免疫应答（即，来自免疫系统的T-细胞或B-细胞兵种）而实现本发明目的的任何细胞。此类细胞可以由本领域技术人员通过使用本文中和本领域中所公开的方法来进行定义。如本领域技术人员所理解的（参见例如，Kuby,1993，其通过提及而合并入本文)，和如在本文中某些实施方案所使用的，通常或优选地与II类主要组织相容性分子或复合物一起将抗原展示或呈递给免疫细胞的细胞是“抗原呈递细胞”。在某些方面，可以将细胞（例如，APC细胞）与另一个细胞（例如，表达所希望的抗原的重组细胞或肿瘤细胞）相融合。用于制备两个或更多个细胞的融合物的方法是本领域熟知的，例如在Goding,第65-66,71-74页,1986；Campbell,第75-83页,1984；Kohler和Milstein,1975；Kohler和Milstein,1976；Gefter等人,1977（每篇文献通过提及而合并入本文）中所公开的方法。在一些情况下，抗原呈递细胞展示或呈递抗原所指向的免疫细胞是CD4+TH细胞。在APC或其他免疫细胞上表达的另外的分子可以帮助或改善免疫应答的增强。分泌的或可溶的分子，例如免疫调节剂和佐剂，也可以帮助或增强针对抗原的免疫应答。此类分子是本领域技术人员熟知的，并且在本文中描述了各种实例。

D.抗体产生

在某些实施方案中，考虑经分离的针对本发明的抗原组合物的抗体对于纯化、诊断和治疗应用是有用的。例如，考虑了可以将抗体用作疫苗组分以结合尿枝原体抗原。本文所使用的术语“抗体”意欲广义地指任何免疫学结合试剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，IgG或IgM是优选的，因为它们是在生理情况下最常见的抗体并且因为它们是在实验室背景下最容易制备的。术语“抗体”用于指任何具有抗原结合区域的抗体样分子，并且包括抗体片段例如Fab’、Fab、F(ab’)₂、单结构域抗体（DAB）、Fv、scFv（单链Fv）等。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域熟知的。用于制备和表征抗体的手段也是本领域熟知的（参见例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；和Antibody Engineering,第二版,Oxford University Press,1995，每篇文献通过提及而合并入本文）。

在某些实施方案中，还考虑了一种或多种“人源化的”抗体，如同包含来自各种来源的组分的抗体那样，例如一种或多种来自小鼠、大鼠或其他物种的携带一个或多个人恒定区和/或可变区结构域的嵌合抗体；一种或多种双特异性抗体；或者一种或多种重组的和经改造的抗体和/或其片段。用于开发一种或多种为患者的疾病“量身定制的”抗体的方法同样地是已知的，并且也考虑了此类量身定制的抗体。

公认单克隆抗体（MAb）具有某些优点，例如可再现性和大规模生产，并且它们的使用通常是优选的。可以通过使用熟知的技术来容易地制备MAb，例如在美国专利4,196,265（其通过提及而合并入本文）中所例示的那些技术。

在某些诊断或疫苗组分纯化方面，可以使用针对一种或多种疫苗组分（例如，尿枝原体抗原）的抗体。这样的免疫检测方法的非限制性实例包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）、免疫放射分析测定法、荧光免疫测定法、化学发光测定法、生物发光测定法和Western印迹法，这只是提及几个。在科学文献中已经描述了各种有用的免疫测定方法的步骤，例如Doolittle MH和Ben-Zeev O,1999；Gulbis B和Galand P,1993；De Jager R等人,1993；和Nakamura等人,1987，每篇文献通过提及而合并入本文。经常地，可以将抗体与成像试剂相缀合以增强与抗体相结合的疫苗组分配体的检测，如本领域技术人员将会知晓的。许多合适的成像试剂是本领域中已知的，如同用于将它们附着至抗体的方法那样（参见例如，美国专利号5,021,236、4,938,948和4,472,509，每篇文献通过提及而合并入本文）。

通常，免疫复合物形成的检测是本领域中熟知的，并且可以通过应用众多方法来达到。这些方法通常基于标记物或标志物的检测，例如那些放射性的、荧光的、生物学的和酶促的标签中的任一种。涉及此类标记物的使用的美国专利包括3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，每篇文献通过提及而合并入本文。当然，可以通过使用次级结合配体（例如，二抗）和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合布置而发现另外的优点，如本领域中已知的。

VI.蛋白质、多肽和肽

本发明还提供了纯化的（在优选的实施方案中，基本上纯化的）尿枝原体蛋白质、多肽或肽。本文所使用的术语“纯化的蛋白质、多肽或肽”意指从哺乳动物细胞或重组宿主细胞中可分离的蛋白质组合物，其中将所述至少一种蛋白质、多肽或肽相对于其天然可获得的状态而言（即相对于其在细胞提取物中的纯度而言）纯化至任何程度。因此，纯化的蛋白质、多肽或肽还指摆脱了在其中它天然出现的环境的野生型或突变型蛋白质、多肽或肽。

先前已经公开了关于各种基因的核苷酸以及蛋白质、多肽和肽序列，并且可以在本领域技术人员已知的计算机化的数据库中找到它们。一个这样的数据库是国家生物技术信息中心的

和GenPept数据库。这些已知基因的编码区可以通过使用本文中所公开的技术或通过本领域技术人员将会知晓的任何技术来进行扩增和/或表达。另外，可以通过本领域技术人员已知的方法，例如使用自动肽合成仪（例如从Applied Biosystems(Foster City,CA)可得到的那些）的肽合成，来合成肽序列。

通常，“纯化的”将涉及已经经历了分级分离以去除各种其他蛋白质、多肽或肽的特定的蛋白质、多肽或肽组合物，并且该组合物基本上保持其活性，如可以例如通过蛋白质测定法（如在本文下面所描写的，或者如本领域技术人员对于所希望的蛋白质、多肽或肽将会知晓的）来评估的。

当使用术语“基本上纯化的”时，这将涉及这样的组合物，在所述组合物中，特定的蛋白质、多肽或肽构成所述组合物的主要组分，例如占所述组合物中的蛋白质的大约50%或更多。在优选的实施方案中，基本上纯化的蛋白质将占所述组合物中的蛋白质的大于60%、70%、80%、90%、95%、99%或甚至更多。

如应用于本发明的，“纯化至同质”的肽、多肽或蛋白质意味着所述肽、多肽或蛋白质具有这样的纯度水平，其中所述肽、多肽或蛋白质基本上不含其他蛋白质和生物学组分。例如，纯化的肽、多肽或蛋白质经常将会是充分地没有其他蛋白质组分，从而可以成功地进行降解测序。

鉴于本公开内容，各种用于定量蛋白质、多肽或肽的纯化程度的方法将会是本领域技术人员已知的。这些方法包括例如，测定级分的比蛋白质活性，或者通过凝胶电泳来评估级分内的多肽的数目。

为了纯化所希望的蛋白质、多肽或肽，包含至少一些特定的蛋白质、多肽或肽的天然或重组的组合物将会经历分级分离以从所述组合物中去除各种其他组分。除了在本文下面所详细描述的那些技术之外，适合于在蛋白质纯化中使用的各种其他技术将会是本领域技术人员熟知的。这些技术包括：例如，用硫酸铵、PEG、抗体等或者通过热变性进行沉淀，随后进行离心；色谱法步骤，例如离子交换、凝胶过滤、反向色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝集素亲和色谱法和其他亲和色谱法步骤；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术与其他技术的组合。

另一个实例是使用特异性结合伙伴的特定融合蛋白的纯化。这样的纯化方法在本领域中是常规的。由于本发明提供了关于特定蛋白质的DNA序列，因此现在可以实施任何的融合蛋白纯化。这通过下列内容来举例说明：产生特定蛋白质-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白，在大肠杆菌中进行表达，和通过使用在谷胱甘肽琼脂糖上的亲和色谱法来分离至同质；或者在蛋白质的N或C末端产生聚组氨酸标签，和随后通过使用Ni亲和色谱法来进行纯化。然而，假定许多DNA和蛋白质是已知的，或者可以通过使用本文中所描述的方法来鉴定和扩增，那么现在可以采用任何纯化方法。

尽管对于在某些实施方案中的使用是优选的，但并不存在总是以其最纯化的状态提供所述蛋白质、多肽或肽的一般要求。实际上，考虑了，较不基本上纯化的蛋白质、多肽或肽（其相对于天然状态而言在所希望的蛋白质组合物中仍是富集的）将会在某些实施方案中具有用处。

展示出较低程度的相对纯化的方法可以在蛋白质产物的完全回收中或者在保持表达出的蛋白质的活性中具有优点。无活性的产物在某些实施方案中（例如，在通过抗体产生来测定抗原性中）也具有用处。

VII.药物制剂

本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种本发明的疫苗或另外的试剂，它们溶解或分散在药学上可接受的载体中。短语“药学上或药理学上可接受的”涉及这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物（例如人，在合适的情况下）时，不产生不利的、变应性的或其他不希望的反应。鉴于本公开内容，包含至少一种尿枝原体疫苗或另外的活性成分的药物组合物的制备将会是本领域技术人员已知的，如由Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack PrintingCompany,1990（其通过提及而合并入本文）所例示的。此外，对于动物（例如，人）施用，将会理解，制剂应当满足由FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂（例如，抗细菌剂、抗真菌剂）、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、矫味剂、染料等，以及其组合物，如本领域技术人员将会知晓的（参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack PrintingCompany,1990,第1289-1329页，其通过提及而合并入本文）。除非任何常规的载体是与所述活性成分不相容的，否则就考虑其在所述药物组合物中的使用。

所述组合物可以包含不同类型的载体，取决于它将会以固体、液体还是气溶胶形式进行施用，和对于诸如注射的施用途径来说它是否需要是无菌的。本发明可以以静脉内、真皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部表面、肌内、皮下、粘膜、口服、局部表面、局部、吸入（例如，气溶胶吸入）、注射、输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的局部化灌注、通过导管、通过灌洗、在霜剂中、在脂质组合物（例如，脂质体）中、或者通过其他方法或上述的任何组合这些方式进行施用，如本领域技术人员将会知晓的（参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack PrintingCompany,1990，其通过提及而合并入本文）。

可以将所述组合物配制成以游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组分的游离氨基基团形成的那些，或者与无机酸（例如，盐酸或磷酸）或有机酸（例如，乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸）形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱例如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸或普鲁卡因。一旦形成，就以与所述剂量配制剂相容的方式和以诸如治疗有效的量施用溶液。容易地将所述配制剂以各种各样的剂型进行施用，所述剂型例如为，为了肠胃外施用而配制的那些，例如可注射溶液，或用于递送至肺的气溶胶，或者为了膳食施用而配制的那些，例如药物释放胶囊，等等。

进一步地根据本发明，在药学上可接受的载体（具有或不具有惰性稀释剂）中提供适合于施用的本发明的组合物。所述载体应当是可同化的，并且包括液体、半固体（即糊剂）或固体载体。除非任何常规的介质、试剂、稀释剂或载体对于受者或对于其中所包含的组合物的治疗效用是有害的，否则其在用于在实施本发明的方法中使用的可施用组合物之中的使用是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或其组合。所述组合物还可以包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可以通过防腐剂来防止微生物的作用，所述防腐剂例如为各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类（例如，羟苯甲酯、羟苯丙酯）、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

根据本发明，将所述组合物与所述载体以任何方便的和实用的方式相组合，即通过溶解、悬浮、乳化、混合、包囊、吸收等。这样的程序对于本领域技术人员来说是常规的。

在本发明的一个特殊的实施方案中，将所述组合物与半固体或固体载体彻底地相组合或混合。所述混合可以以任何方便的方式例如研磨来进行。在混合过程中也可以添加稳定剂以便保护所述组合物免于治疗活性的丧失，即在胃中变性。用于在所述组合物中使用的稳定剂的实例包括，缓冲液，氨基酸，例如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物，例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。

在进一步的实施方案中，本发明可以涉及药物脂质载料组合物的使用，所述药物脂质载料组合物包括所述组合物、一种或多种脂质和水性溶剂。本文所使用的术语“脂质”将被定义为包括宽范围的一系列在水中特征性地不溶的且用有机溶剂可提取的物质中的任一种。该宽的化合物类别是本领域技术人员熟知的，并且如术语“脂质”在本文中进行使用那样，它不限于任何特定的结构。实例包括包含长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然出现的或合成的（即，由人设计或生产的）。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、脱脂脂质（lysolipid）、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有经醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质，以及其组合。当然，被本领域技术人员理解为脂质的、除了本文中具体描述的那些之外的其他化合物也被本发明的组合物和方法所包括。

本领域技术人员将会熟悉为了将组合物分散在脂质载料中可以采用的技术的范围。例如，可以将所述组合物分散在包含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质相混合，与脂质相组合，共价键合至脂质，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束或脂质体中或与胶束或脂质体相复合，或者与脂质或脂质结构相联合，通过本领域技术人员已知的任何手段。分散可能导致或不导致脂质体的形成。

向动物患者施用的本发明的组合物的实际给药量可以通过身体的和生理学的因素，例如体重、状况的严重度、正在治疗的疾病的类型、先前的或同时发生的治疗干预、患者的特发病和施用途径来确定。取决于施用的剂量和途径，优选剂量的和/或有效量的施用的次数可以根据受试者的应答而变化。在任何情况下，负责施用的医师将会确定组合物中活性成分的浓度和对于个体受试者的合适剂量。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少大约0.1%的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物例如可以占该单位剂量的重量的大约2%至大约75%，或大约25%至大约60%，和任何从其中可导出的范围。自然，可以以这样的方式来准备在每个治疗有用的组合物中的活性化合物的量，即使得将会在该化合物的任何给定的单剂中获得合适的剂量。在制备这样的药物配制剂的领域中的技术人员将会考虑诸如可溶性、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑的因素，并因此可以希望各种各样的剂量和治疗制度。

在其他非限制性的实例中，剂量也可以包含每次施用从大约1μg/kg体重，大约5μg/kg体重，大约10μg/kg体重，大约50μg/kg体重，大约100μg/kg体重，大约200μg/kg体重，大约350μg/kg体重，大约500μg/kg体重，大约1mg/kg体重，大约5mg/kg体重，大约10mg/kg体重，大约50mg/kg体重，大约100mg/kg体重，大约200mg/kg体重，大约350mg/kg体重，大约500mg/kg体重，至大约1000mg/kg体重或更多，以及从其中可导出的任何范围。在从本文所列数字中可导出的范围的非限制性实例之中，可以施用大约5mg/kg体重至大约100mg/kg体重，大约5μg/kg体重至大约500mg/kg体重等的范围，基于上面所描述的数字。

A.膳食组合物和配制剂

在本发明的优选的实施方案中，将所述组合物配制成通过膳食途径进行施用。膳食途径包括其中所述组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。特别地，本文中所公开的药物组合物可以通过口服、颊、直肠或舌下方式进行施用。如此，可以将这些组合物与惰性稀释剂或与可同化的食用载体一起进行配制，或者可以将它们包封在硬或软壳的明胶胶囊中，或者可以将它们压制成片剂，或者可以将它们与膳食食物直接相掺合。

在某些实施方案中，可以将活性化合物与赋形剂相掺合，并且以可摄取片剂、口含片剂、含锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式来进行使用（Mathiowitz等人,1997；Hwang等人,1998；美国专利号5,641,515、5,580,579和5,792,451，每篇文献特别地通过提及而以其整体合并入本文）。所述片剂、含锭、丸剂、胶囊等还可以包含下列：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；增甜剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；矫味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃调味料、柑橘调味料等。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣剂而存在，或者要么修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶、糖或两者进行包衣。当剂型是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以包含诸如液体载体的载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以包有肠溶衣。肠溶包衣防止所述组合物在其中pH为酸性的胃或上肠道中变性。参见例如，美国专利号5,629,001。在到达小肠后，那里的碱性pH溶解所述包衣，并允许所述组合物被释放并被特化的细胞（例如，肠上皮细胞和派尔淋巴集结M细胞）吸收。糖浆剂或酏剂可以包含活性化合物、蔗糖（作为增甜剂）、羟苯甲酯和羟苯丙酯（作为防腐剂）、染料和调味料（例如，樱桃或柑橘风味）。当然，在制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料应当是药学上纯的，并且在所采用的量之下是基本上无毒性的。另外，可以将活性化合物掺入到持续释放制剂和配制剂中。

对于口服施用，备选地可以将本发明的组合物与一种或多种赋形剂相掺合，以漱口剂、牙粉、口含片剂、口腔喷雾剂或舌下口服施用的配制剂的形式。例如，可以通过以所需要的量将活性成分掺入到合适的溶剂（例如，硼酸钠溶液（多贝尔溶液））中来制备漱口剂。备选地，可以将活性成分掺入到口服溶液（例如，包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液）中，或者分散在牙粉中，或者以治疗有效量添加至可以包含水、粘合剂、磨料、矫味剂、起泡剂和湿润剂的组合物。备选地，可以将所述组合物制成可以放置在舌头下面或者溶解在口中的片剂或溶液形式。

另外的适合于其他膳食施用方式的配制剂包括栓剂。栓剂是具有各种不同重量和形状的固体剂型，其通常加入了药物，用于插入直肠。在插入后，栓剂变软、融化或溶解在腔液中。通常，对于栓剂，传统的载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以从包含例如在大约0.5%至大约10%，和优选地大约1%至大约2%的范围内的活性成分的混合物来形成。

B.肠胃外组合物和配制剂

在进一步的实施方案中，可以通过肠胃外途径来施用所述组合物。本文所使用的术语“肠胃外（的）”包括绕开消化道的途径。特别地，本文中所公开的药物组合物可以例如但不限于以静脉内、真皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内方式进行施用（美国专利号6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158、5,641,515和5,399,363，每篇文献特别地通过提及而以其整体合并入本文）。

可以在合适地与表面活性剂（例如，羟丙基纤维素）相混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中和在油中制备分散体。在平常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。适合于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂（美国专利5,466,468，其特别地通过提及而以其整体合并入本文）。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，和必须是流动的，到可容易地进行注射的程度。它必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须免于受到微生物（例如，细菌和真菌）的污染作用的影响。所述载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇（即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等），其合适的混合物，和/或植物油。可以通过下述方式来维持适当的流动性：例如，通过使用包衣剂，例如卵磷脂；在分散体的情况下，通过保持所要求的颗粒大小；和通过使用表面活性剂。微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂（例如，对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等）来达到。在许多情况下，将会是优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂（例如，单硬脂酸铝和明胶）来达到可注射组合物的延长的吸收。

对于例如以水溶液来进行的胃肠外施用，所述溶液应当适当地进行缓冲（如果需要），并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂变成等渗的。这些特别的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。关于这一点，可以采用的无菌水性介质将会是本领域技术人员已知的，鉴于本公开内容。例如，可以将一个剂量溶解在等渗的NaCl溶液中，并且要么添加皮下灌注液要么注射在所提议的输注位点（参见例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,第15版,第1035-1038和1570-1580页）。取决于正在进行治疗的受试者的状况，必然将会出现一些在剂量方面的变化。在任何情况下，负责施用的人员将会确定对于个体受试者的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足由FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

无菌可注射溶液通过下述方式来制备：以所需要的量将活性化合物掺入到具有上面列举的各种其他成分（如果需要）的合适的溶剂中，接着过滤灭菌。通常，分散体通过下述方式来制备：将各种经灭菌的活性成分掺入到包含基础分散介质和所需要的其他成分（来自上面所例举的那些）的无菌载料中。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从其事先经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所希望的成分的粉末。将粉末状的组合物与液体载体（例如，水或盐水溶液）（具有或不具有稳定剂）相组合。

C.各色各样的药物组合物和配制剂

在本发明的其他优选的实施方案中，可以将活性化合物配制成用于通过各种各色各样的途径进行施用，例如局部表面（即，经皮的）施用、粘膜施用（鼻内、阴道等）和/或吸入。

用于局部表面施用的药物组合物可以包含被配制成用于加入了药物的应用（例如，软膏剂、糊剂、霜剂或粉剂）的活性化合物。软膏剂包括所有用于局部表面应用的油质的具有吸附、乳化和水溶解基质的组合物，而霜剂和洗剂是仅包含乳化基质的那些组合物。局部表面施用的药剂可以包含渗透增强剂以促进活性物质穿过皮肤的吸附。合适的渗透增强剂包括甘油、醇类、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮类和月桂氮

酮。关于用于局部表面应用的组合物的可能的基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和矿脂，以及任何其他合适的吸收、乳化或水溶性软膏剂基质。局部表面制剂还可以包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物的防腐剂，作为用于保存活性成分和提供均匀混合物的必需品。本发明的经皮施用还可以包括“贴剂”的使用。例如，所述贴剂可以在固定的时间段期间以预先确定的速率和以连续的方式提供一种或多种活性物质。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气溶胶递送载料来进行递送。用于通过鼻气溶胶喷雾剂将组合物直接递送至肺的方法已经描述在例如美国专利号5,756,353和5,804,212（每篇文献特别地通过提及而以其整体合并入本文）中。同样地，通过使用鼻内微颗粒树脂（Takenaga等人,1998）和溶血磷脂酰甘油化合物（美国专利号5,725,871，其特别地通过提及而以其整体合并入本文）的药物递送也是制药领域中熟知的。同样地，以聚四氟乙烯支持基体的形式的透粘膜药物递送描述在美国专利号5,780,045（其特别地通过提及而以其整体合并入本文）中。

术语“气溶胶”是指分散在液化的或加压的气体推进剂中的微细固体或液体颗粒的胶体系统。用于吸入的本发明的典型气溶胶将会由在液体推进剂或液体推进剂和合适溶剂的混合物中的活性成分的悬浮液组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将会根据推进剂的压力要求而变化。气溶胶的施用将会根据受试者的年龄、体重以及症状的严重度和应答而变化。

VIII.尿枝原体的检测

在本发明的一些实施方案中，将本发明的组合物用于尿枝原体的检测。在特殊的情况下，例如采用抗-MBA单克隆抗体来进行尿枝原体的检测。在特殊的实施方案中，使用针对MBA抗原（例如，MBA抗原的保守部分或5’末端）的抗体来将所述生物鉴定为在培养物、血清和/或其他体液中存在。在某些方面，例如采用针对SEQ ID NO:4的部分的抗体。

在培养物中或在个体中检测到尿枝原体后，就可以用一种或多种本发明的治疗组合物和/或其他治疗手段（包括例如抗生素）处理各个培养物或治疗各个个体。

本领域技术人员认识到，在本领域中存在常规方法用于获得用于检测尿枝原体的测定法的样品。

IX.本发明的示例性试剂盒

可以在试剂盒中包含本文中所描述的任何组合物。在一个非限制性的实例中，可以在试剂盒中包含尿枝原体免疫原组合物，包括疫苗，例如DNA疫苗。

可以在水性介质中或者以冻干的形式包装所述试剂盒的组分。所述试剂盒的容器器具将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器器具，在其中可以放置组分，并且优选地，合适地分成等份。当在试剂盒中存在超过一种组分时，该试剂盒还将通常包含第二、第三或其他另外的容器，在其中可以分开地放置所述另外的组分。然而，可以在小瓶中包含组分的各种组合。本发明的试剂盒还将典型地在紧密封闭下包括用于包含所述组合物的器具和任何其他试剂容器以用于商业销售。这样的容器可以包括注塑或吹塑的塑料容器，在其中保留所希望的小瓶。

本发明的治疗试剂盒包括这样的试剂盒，其包含化学化合物或其药学上可接受的盐，或者蛋白质、多肽、肽、抑制剂、基因、载体和/或其他免疫学效应物。这样的试剂盒通常可以在合适的容器器具中包含下列物质的药学上可接受的配制剂：多条带抗原化学化合物或其药学上可接受的盐，或者蛋白质、多肽、肽、结构域、抑制剂和/或表达前述中的任一个的基因和/或载体，在药学上可接受的配制剂中。所述试剂盒可以具有单个容器器具，和/或它可以对于每种化合物具有不同的容器器具。

当在一种和/或多种液体溶液中提供所述试剂盒的组分时，所述液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是特别优选的。还可以将所述组合物配制成可用注射器注射的组合物。在这种情况下，所述容器器具本身可以是注射器、移液管和/或其他此类器械，从其中可以将所述配制剂施加至身体的被感染的区域，注射到动物中，和/或甚至施加至所述试剂盒的其他组分和/或与所述试剂盒的其他组分相混合。然而，所述试剂盒的组分可以以干燥的粉末形式提供。当以干燥的粉末形式提供试剂和/或组分时，所述粉末可以通过添加合适的溶剂来进行重构。预想了还可以在另一个容器器具中提供所述溶剂。

实施例

下面的实施例被包括用于证明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面的实施例中所公开的技术代表了被发明人发现在本发明的实施中工作良好的技术，并因此可以被认为构成了关于其实施的优选方式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解可以在所公开的特定实施方案中进行许多改变并仍然获得相像或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。

实施例1

围产期尿枝原体感染和脑发育

通过使用发表的关于绒毛膜羊膜炎的鼠类模型，通过直接感染用5000ccu的尿枝原体或盐水感染e13.5天的胎儿。在e17.5天，关于胎盘组织病理学、血液、羊膜液、胎盘尿枝原体培养物和PCR以及炎症介质，在组之间评价尿枝原体的影响。在递送后6周和18周，也有关于在第e17.5天尿枝原体脑感染和炎症的证据的评价，包括脑尿枝原体培养物和PCR；炎症介质；组织病理学和组织化学。胎盘组织病理学由胎盘病理学方面的专家以不知情的方式进行阅读。然后，关于在18周观察期间神经病学和发育表型的发展，相比于在子宫内暴露于盐水的仔鼠而言，评价具有由尿枝原体诱导的绒毛膜羊膜炎的母鼠所生的仔鼠。采用由对组不知情的个体来进行的标准化神经病学和发育检查。在该相同的绒毛膜羊膜炎模型中，可以通过对治疗组分配（rDNA尿枝原体或盐水疫苗）不知情的个体来测定出生前rDNA尿枝原体疫苗对于脑炎症的发展以及神经病学和发育表型的影响。

实施例2

用于治疗哺乳动物感染的尿枝原体DNA疫苗的开发

方法和示例性数据：发明人已经开发出了用于以产生尿枝原体疫苗以及评价效力和其后续的抗体产生的方法。特别地：疫苗开发：在开发该DNA疫苗中，克隆目的尿枝原体基因并插入pVAX1载体中。简而言之，通过PCR产生负责尿枝原体血清型6的多重抗原结合（MAB）区域的DNA片段（386bp），其中使用下述特异性引物：有义（TG TTC ATA TTT TTT ATC AG；SEQ ID NO:2）；反义（CCAAATGACCTTTTGTAACTAGTA；SEQ ID NO:3）。为了增加抗原表达的效率，将Kozak密码子（ANNATGG；SEQ ID NO:1）插入在有义引物的开头。所使用的终止密码子是载体中所提供的那个（TAG）。然后，将来自PCR的DNA片段插入到载体pVAX1（Invitrogen）中。该载体包含早期CMV启动子和牛生长激素多腺苷酸化。将包含抗原基因的质粒载体转化到大肠杆菌（DH5a）中，选择出克隆，并使其在LB培养基中生长。用Qiagen小量制备试剂盒来纯化质粒DNA。通过酶消化来确认插入片段的方向，然后使正确的质粒DNA在LB培养基中生长以用于注射。每个试剂盒允许我们分离出1mg的pDNA。

ELISA测定法（全细菌）：这如先前所报道的那样（Echahidi等人,2001）并加以修改来进行。简而言之：在10ml的10B肉汤中使尿枝原体参考株系生长至10⁶ccu/ml。在4℃下以25,000×g使生物体离心30分钟并收获。将粒状沉淀用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤三次，将最终的粒状沉淀重悬浮在100μl PBS中，并用甲醇稀释至10ml。为了包被微量滴定板，向每个孔添加100μl的在甲醇中稀释的抗原制剂，并且在室温下温育过夜直至甲醇完全蒸发。将孔用在PBS中的牛血清白蛋白（3%[重量/体积]）进行饱和并洗涤两次。

洗涤用包含0.1%Tween20的PBS来进行。向孔内添加100ul的在PBS中以1:2稀释的小鼠血清，并且在室温下温育1小时。在洗涤后，向孔内添加100μl的在包含0.05%Tween20的PBS中稀释的经辣根过氧化物酶标记的多克隆抗-小鼠免疫球蛋白，并且将该混合物在室温下温育30分钟。在洗涤后，向孔内添加过氧化物酶底物（邻苯二胺），并且将该混合物在室温下在黑暗中温育15分钟。通过添加H₂SO₄（4N）来终止底物反应，并且在490nm处测量光密度（OD）。通过测试没有添加血清的缀合物来获得阴性对照。空白孔接受ELISA试剂，但没有抗原或血清。使用标准统计学方法来评价数据。结果：通过采用使用关于血清型14的临床株系的ELISA来检测针对尿枝原体的抗体的血清水平。光密度从1.0增加至大于3.3。

小鼠的免疫接种：采用不同的计划安排，用500ug/剂的疫苗以腹膜内（IP）方式对成年雌性FVB白色小鼠进行注射。组1在第0天和第11周接受疫苗。组2在第0天、第4周和第11周接受疫苗。在第一次疫苗接种后每2周从经疫苗接种的小鼠中采集血液，并分离出血清。

细菌杀灭测定法：为了确定通过疫苗产生的抗体是否参与细菌杀灭，我们进行了先前报道的由嗜中性粒细胞介导的细菌杀灭测定法（Weisman和Lorenzetti,1989），其中具有修改。总之，我们使用了20ul的10⁷个细胞/ml的嗜中性粒细胞，其分离自健康的供者（GulfCoast Blood Center,Houston TX）；20ul的10⁶ccu/ml血清型14尿枝原体；10ul的经1:4稀释的人补体血清（Sigma，S1764，其用表皮葡萄球菌（S.epidermidis）预吸附）；20μl的经热灭活的在第一次疫苗注射后12周收集的小鼠血清（作为抗体来源）；和用10B肉汤将最终孔体积补足至200μl。将细菌、血清、补体和嗜中性粒细胞一起添加在微量滴定板孔中，密封，并在37℃下温育5天。其他孔包含单独的细菌，细菌和血清，细菌和嗜中性粒细胞，细菌和补体，细菌与血清和嗜中性粒细胞，细菌与血清和补体，细菌与补体和嗜中性粒细胞。对照孔不包含具有上述组合中的每一个的细菌。对于第一个48小时每2小时在微量滴定板阅读器中在650nm处读取OD，和对于接下来的72小时每24小时进行读取。10B培养基是pH敏感的，并且随细菌的生长而从黄色转变成红色。每6小时还目视评价颜色变化。用阴性对照，没有观察到颜色或吸光度的改变。使用Wilcoxon秩和检验来比较在不同的稀释度下在不同组之间的细菌杀灭。结果：在第12周，给在第0、4和11周接受500ug/剂的疫苗的动物放血。血清证明了在>1:80稀释度下尿枝原体血清型14的临床株系的细菌杀灭的证据。

动物模型：已经在仔鼠中开发出了两种尿枝原体感染动物模型，包括脓毒症模型（Kong等人,2008）和支气管肺发育不良（BPD）模型（Walls等人,2009）。评价了疫苗对于脓毒症模型的效应。BPD模型是更耗费时间的和昂贵的，并且将在当优化疫苗时进行评价。

在仔鼠中针对脓毒症的体内保护作用：在第一次疫苗接种后12周，使所有经疫苗接种的小鼠与雄鼠交配。在15周时生出仔鼠。然后，在一日龄时，用2个剂量的0.1cc的10⁶ccu/ml的小尿枝原体临床株系B079血清型14感染仔鼠。对照幼崽由这样的仔鼠组成，所述仔鼠由未疫苗接种的母鼠所生并且用相同剂量和株系的尿枝原体进行感染。在8天后计算存活率，并其在由经疫苗接种的和未疫苗接种的母鼠所生的幼崽之间进行比较。在研究#2中，在17周在相同的母鼠中开始怀孕。在21周生出仔鼠，并且类似地进行治疗。使用标准的比例分析来评估统计学显著性。结果描述在下面：

疫苗剂量：	两个	三个	对照
				研究1
N=	20	19	27
				48小时之时的存活，N=	16	18	14
48小时之时的存活，%=	80	95	52
				相比于对照而言的P值	0.067	0.0027
研究2：
				N=	8	13	52
48小时之时的存活，N=	5	11	18
				48小时之时的存活，%=	63	85	35
相比于对照而言的P值	0.24	0.0016
				将研究1和2相组合：
N=	28	32	79
				48小时之时的存活，N=	21	29	32
48小时之时的存活，%=	75	91	41
				相比于对照而言的P值	0.0021	0.000001

对于至少两次连续的怀孕，在怀孕前给予小鼠的该DNA疫苗在经疫苗接种的母鼠的仔鼠中在预防脓毒症和死亡方面是有效的。针对与从其开发出所述疫苗的那种不同的感染性生物的尿枝原体株系/血清型，它也是有效的，这暗示了宽范围的效力。

示例性研究：

优化疫苗设计：可以优化疫苗以增强其效力和效用，从而用于进一步的开发和使用。特别地，可以在设计中利用一种或多种下列改变：1)将MPV-CTE+rev添加至目前的疫苗以增加包膜表达和免疫原性；2)在疫苗质粒中用pVAX200-DEST载体调换pVAX1载体；3)在该质粒中表达超过一种免疫原以增强疫苗效力和影响。特别地，表达来自几种（如果不是所有的）尿枝原体血清型的多重结合蛋白（MBP）；4)向终止密码添加N-末端遍在蛋白信号；5)向该质粒添加来自不同病原体的I类MHC表位或寡核苷酸的链串（例如，CpG基序）以产生细胞毒性T-细胞应答；6)向该质粒添加作为免疫增强剂的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）以可能地进一步优化所述疫苗。

优化疫苗递送：鉴于我们迄今已经观察到的对于所述疫苗的成功应答，可以优化疫苗的递送系统以增强其效力和效用，从而用于进一步的开发和使用。因此，可以表征不同的递送系统。疫苗产生的最昂贵和耗费时间的方面是必须产生的pDNA的量，因此可以减小该量而同时保持或增加效力。特别地，可以将疫苗的剂量降低至0.2至200ug。通过使用最小的有效剂量，可以调查所述递送系统，包括：1)使用不同于目前的IP系统（包括IM、ID和SC途径）的方法来递送水溶液；2)通过ED途径递送具有吸附在其表面上的疫苗的金或钨微颗粒。由于该生物是一种性传播疾病，我们还将调查通过阴道粘膜的该方法。然后，将会需要就动物的年龄和性别对于免疫应答的影响来评价最有效的递送系统。

疫苗设计和递送优化的评价：为了评价所提出的疫苗设计和递送改变，我们将会使用一系列方法，包括：1)在体外或在体内将示踪物（例如，LacZ）掺入到靶细胞中（关于方法，参见本文中其他地方）；2)在针对尿枝原体（具有变化的血清型）全细菌的经疫苗接种的动物的血清总抗体方面的改变，如通过ELISA所检测的（参见本文中其他地方）；3)在针对尿枝原体（具有变化的血清型）MBP的经疫苗接种的动物的血清特异性抗体方面的改变，如通过ELISA所检测的（关于方法，参见下面）；4)在针对活的尿枝原体（具有变化的血清型）的经疫苗接种的动物的血清细菌杀灭测定法方面的改变，如在培养物中所检测的（参见本文中其他地方）；6)在多个尿枝原体感染模型（包括脓毒症（参见本文中其他地方），BPD（参见本文中其他地方））中，在经疫苗接种的动物的被感染的仔鼠的存活、菌血症和炎症方面的改变；7)在雄性或雌性小鼠生殖泌尿道和/或胃肠道尿枝原体移殖建群方面的改变（关于方法，参见下面）；8)在雌性的怀孕结果（仔鼠数目，仔鼠大小，妊娠期长度）方面的改变，如果它们或其雄性配偶或两者被感染（关于方法，参见下面）。

LacZ示踪物的掺入：这可以如先前在生物体（体外）（Silva等人,2009）和细胞/组织（体内）（Joussemet等人,2005）中所描述的那样进行使用，并且给我们提供了关于对疫苗的设计和递送两者所做的改变的快速反馈。

关于MBA的ELISA测定法：该MBA测定法如先前所报道的那样（Vancutsem等人,2008）并加以修改来进行。简而言之：从用于所述疫苗的尿枝原体血清型和株系产生重组MBA（rMBA）以测定存在于经疫苗接种的动物或经疫苗接种的动物的幼仔的血清中的MBA特异性抗体的量。产生、克隆、表达、纯化目的MBA基因，并针对动物血清进行评价。另外，可以使用标准的免疫学技术来表征所述抗原和所述抗体（类和亚类）。

细菌粘附测定法：该粘附测定法如先前所报道的那样（Smith等人,1994；Thirkell等人,1989；Torres-Morquecho等人,2010）并加以修改来进行。简而言之：使从ATCC获得的A594细胞在37℃下在补充有10%FBS和没有抗生素的DMEM中生长。以大约10⁵ccu/ml的浓度将在10B肉汤中的尿枝原体添加至6-孔塑料平板的所有孔，向每个孔添加不同稀释度的血清，并进行温育。对照孔可以包含仅10B培养基和未疫苗接种的动物或这些动物的幼仔的血清。所有实验以两次重复进行。

通过使用监测由尿枝原体脲酶从尿素产生的氨的比色方法（Bertholet测定法）来定量尿枝原体的粘附。使用Mann-Whitney U检验来评价由经疫苗接种的动物或这些动物的幼仔的血清所产生的粘附抑制的显著性。

另外的动物模型：可以评价所述疫苗对于另外的仍必须变得能操作的成年雄性和雌性动物模型的影响，至少包括下列。1)生殖泌尿道和胃肠道移殖建群：这先前已经报道过，并且可以调整这些方法（Audring等人,1989；Furr和Taylor-Robinson,1993；Iwasaka等人,1986）。简而言之，向经雌激素（雌性）和睾酮（雄性）处理的小鼠给予口部的和/或生殖泌尿道的尿枝原体接种，并且移殖建群被报道是延长的（>3周）且非常严重（>100ccu/拭子）。2)不育和低出生体重：这先前已经报道过，并且可以调整这些方法（Audring等人,1989；Engel等人,1988；Swenson和O’Leary,1978）。简而言之：使被移殖建群的雄性和/或雌性进行交配。计算相比于在未疫苗接种的对照中而言在经疫苗接种的动物中的交配成功，测量出生体重，并且计数仔鼠数目。一旦这些模型是能操作的，就可以将它们合并到疫苗影响的评价之中。最初可以使用仔鼠脓毒症和BPD模型来评估疫苗干预的临床结果，但可以随后在这些其他模型中使用所述疫苗。

生物体：在每次从冷冻的储备溶液（5×l0⁶ccu/ml）的使用之前，使尿枝原体血清型/株系在10B肉汤中生长。针对生物变型小尿枝原体的每种血清变型（因为其看起来最重要）和对于关键的生物变型解脲尿枝原体的血清变型测试每种疫苗的效用（Blanchard等人,1990；Blanchard等人,1993；Brown等人,1981；Cassell等人,1983）。

动物：将FVB白化小鼠用于所有动物实验，并且随意地饲喂无抗生素的水和食物。在动物机构中由于受精而产生怀孕。在每个实验的整个过程中使仔鼠保持与母鼠在一起。在14天时，使存活的仔鼠安乐死或者断奶。

实施例3

围产期尿枝原体感染和乳鼠脑发育

尿枝原体具有下列特征：小的（0.1-0.85um）；没有细胞壁（对于青霉素和革兰氏染色不敏感）；需要尿素用于进行生长，并且产生脲酶（Pollack,1986）；不是叶酸合成者（对于磺胺类或甲氧苄啶不易感）。分离尿枝原体的最灵敏的方法是接种到液体培养基中，通过脲酶活性进行检测，和传代培养至琼脂以用于进行菌落鉴定（Robertson,1978；Taylor-Robinson,1989；Taylor-Robinson等人,1967；Taylor-Robison和Gourlay,1984；Taylor-Robinson,1989）。已开发了简单且快速的尿枝原体鉴定方法（例如，PCR），并且这些方法确认了培养物（Abele-Horn等人,1996；Blanchard等人,1990；Blachard等人,1993；Cunleffe等人,1996；Willoughby等人,1990），但商业试剂盒还不能容易地得到。尿枝原体感染的诊断由于其缺乏革兰氏染色、难养的性质以及需要特殊的生长和运送培养基而复杂化。鉴于在鉴定中的这些困难，除非预期有尿枝原体，否则它可能逃脱检测，并且这可能解释了报道和临床经验的相对贫乏。PCR可以保持阳性数月，并因此可以仅代表无生活力的生物体（Cassell等人,1983；Clifford等人,2010）。因此，需要更费力的、复杂的鉴定方法，而仅少数实验室具有那个能力。

尿枝原体附着至并侵入各种各样的细胞（Busolo等人,1984；Masover等人,1977；Robertson等人,1991；Saada等人,1991；Shepard和Masover,1979；Smith等人,1994；Torres-Morquecho等人,2010）；与细胞凋亡相关（Li等人,2002）；增加炎性细胞因子（McGarrity和Kotani,1986；Smith等人,1994；Torres-Morquecho等人,2010）。

尿枝原体感染的预防或治疗：已经提出从女性和其配偶的泌尿生殖道中根除尿枝原体（Kundsin等人,1996）。然而，尿枝原体在体外对于青霉素类、磺胺类、甲氧苄啶、氨基糖苷类和克林霉素不易感，但通常（大约90%）在体外对于四环素类和可变地对于大环内酯类（例如，红霉素）易感（Cassell等人,1993）。在最近的研究中，这些可变的易感性（Molina等人,2010；Okunola等人,2006；Okunola等人,2007；Weisman等人,2009）。在分娩时的预防性抗生素不影响绒毛膜羊膜的尿枝原体移殖建群（3）。在两个随机对照试验中，在根除生殖道尿枝原体或不利的围产期结果方面，大环内酯类（Eschenbvach,1993；Mazor等人,1993；Romero等人,1993）已经不是可靠的。另外，在前往不育门诊的夫妇中，生殖道尿枝原体持续存在，尽管有抗生素（Hipp等人,1983）。尽管可以证明更新的抗生素（例如，甘氨酰环素类（Kenny和Cartwright,1994）和喹诺酮类（Kenny和Cartwright,1996））是更有效的，但在怀孕期间的安全性和效力还未被证明。鉴于尿枝原体的高的移殖建群和性传播率以及可变的敏感性，不可能的是，目前的抗生素策略在其根除中将会是有效的。

已经暗示但未证实，特异性抗体的缺乏可能对于防止尿枝原体感染来说是关键的，因为特异性抗体可以抑制体外生长（Cassell等人,1993）。低γ球蛋白血症患者具有增加的对于尿枝原体的易感性（Taylor-Robinson等人,1986）；并且低γ球蛋白血症患者（Volger等人,1985）、早产儿（Quinn等人,1983）和具有习惯性自发流产的女性（6.1）的血清学研究支持了这一概念。具有<30周孕龄的婴儿的增加的对于尿枝原体呼吸系统疾病的易感性可能与低γ球蛋白血症（5）或者特异性抗体的缺乏（Cassell等人,1988；Casell等人,1988）有关。已经暗示但未证实，针对尿枝原体的特异性蛋白质抗原的单克隆抗体可以在体外抑制这些生物的生长，并且表明特异性抗体对于宿主防御可能是重要的（Watson等人,1990）。

尿枝原体的神经病学影响：相当多的证据将尿枝原体呼吸系统移殖建群与新生儿肺发病率相联系，但很少有研究调查子宫内的尿枝原体与神经病学发病率，并且在此列出它们。在调整了孕龄后，严重IVH（等级≥3）的风险在血清尿枝原体PCR-阳性婴儿（n=74）中是在PCR-阴性婴儿（n=239）中的2.5倍（Viscardi等人,2008）。小尿枝原体是在所有的具有严重IVH的PCR-阳性婴儿中鉴定出的物种。在具有升高的血清IL1β的PCR-阳性患者中严重IVH的风险增加至5倍。另一个（n=866）报道（Olomu等人,2009）观察到，在28周前在胎盘实质中的尿枝原体与增加的下列项目相关：未足月生产和分娩；胎儿和母体炎症；脑室内出血；无回波区脑损伤。这些损伤预示了运动和认知限制和差的结果（Leviton等人,1999）。另一项研究观察到，在早产的时候羊膜腔的尿枝原体感染（n=67）在2年时与下列相关：异常的PDI得分（OR3.1，CI1.3-7.1）；异常的神经病学结果（OR4.8，CI1.7-13.8）；更高的脑性瘫痪的概率（OR4.8，CI1.4-16.4），相比于具有尿枝原体阴性的羊膜液的对照患者（n=47）而言，不管孕龄或出生体重为何（Berger2009）。几个小组已暗示促炎细胞因子（例如，IL-1β、IL-6和TNFα）可能是围产期感染与新生儿脑损害之间的联系（Dammann等人,1997；Kaukola等人,2006），并且一项对于高风险患者的研究（n=1078）报道了抗生素的时机选择和使用影响无回波区脑影像的发展（Leviton等人,1999）。尽管需要更多的信息来评估尿枝原体对于不利的神经发育的贡献，但暴露于尿枝原体的婴儿看起来在神经病学方面更严重地受到影响。

在小鼠模型的唯一报道中支持了尿枝原体在脑损伤中的作用。在该模型（Normann等人,2009）中，羊膜内的尿枝原体感染导致炎症和被扰乱的脑发育。特别地，他们观察到：降低的钙结合蛋白阳性和钙视网膜蛋白阳性的神经元的密度，这暗示了被扰乱的中间神经元的产生、成熟和/或存活，所述中间神经元在联想和认知功能中发挥关键作用（Mohler,2007）；降低的MBP染色，这最可能反映了降低的髓鞘化，所述降低的髓鞘化也与有限的认知功能相关（Back,2006）；和增加的中枢小胶质细胞激活，作者推测这最可能参与了对于中间神经元和髓鞘的影响。在某些方面，这些观察结果可能已被归因于脑的直接扩散和感染或者次级免疫或炎症效应，或者两者。灵长类模型（Novy等人,2009）表明了两者，因为他们观察到羊膜内的尿枝原体感染导致全身炎症应答，和在一些情况下，包含尿枝原体的脑脊髓液培养物。取决于损伤的机制，治疗可以变化。

存在关于从婴儿的脑中培养出的尿枝原体的报道，其中包括两名死于脑室内出血的早产儿（Ollikainen等人,1993）和一名具有脑脓肿的新生儿（Rao等人,2002）。存在72个报道了尿枝原体脑膜炎的病例（Cassell等人,1988）。七项前瞻性研究估计了在呈现出临床症状的新生儿中尿枝原体的发生率。在关于100名（Waites等人,1988）和313名（Viscardi,2010）和66名（Sethi等人,1999）早产儿的研究中，分别在8%、19.1%和9%的患者中CSF生长出尿枝原体。在关于318名在社区医院出生的新生儿（只有一名是早产的）（Waites等人,1990）和69名具有可变妊娠的新生儿（Olomu等人,2009）的研究中，分别1.6%和1.5%从其CSF生长出尿枝原体。最大的研究在920名婴儿中报道了0.2%的发生率，但方法看起来是有缺点的并且是不灵敏的（Waites等人,1995）。还存在七个病例报道或小病例系列，其将尿枝原体报道为脑膜炎的一个原因（Biran等人,2010；Chung等人,2007；Garland和Murton,1987；Hentschel等人,1993；Neal等人,1994；Singh等人,2003；Stahelin-Massik等人,1994）。在所报道的具有尿枝原体脑膜炎的患者中，86%是早产儿，90%处于生命的第一个2周中，90%是无症状的，和72%是小尿枝原体。尽管描述了在CSF细胞计数、葡萄糖和蛋白质方面的异常，但在许多病例中所有这些或这些中的一些可以是不存在的。仍不清楚的是，尿枝原体是通过血液（15%具有阳性的血液培养物）或直接从呼吸道（33%具有阳性的呼吸系统培养物）越过筛板或者两者进入CSF，还是尿枝原体的影响在围产期期间的移殖建群后通过炎症介质或婴儿的免疫应答而起作用。

发明人已经开发了下列：用于鉴定尿枝原体的测定法（生理学的、培养和PCR），其生物变型、血清变型和抗生素敏感性（Molina等人,2010；Okunola等人,2006；Okunola等人,2007；Weisman等人,2009）；用于评价在脓毒症（Kenny和Cartwright,1996）和BPD（Walls等人,2009）中该生物的影响和抗生素治疗或预防策略的乳鼠模型。最近，发明人开发了尿枝原体rDNA疫苗。

尿枝原体疫苗开发：将编码跨越所有血清型的恒定区域的MBA尿枝原体基因的部分选择作为用于疫苗和抗体开发的靶标。选择血清型6作为基因来源，因为它常常是侵入性的临床血清型（Vancustem等人,2008）。在开发该rDNA疫苗中，克隆目的尿枝原体基因并插入pVAX1载体中。如先前所报道的那样（Echahidi等人,2001）并加以修改来对于来自母鼠的血清样品进行全细菌ELISA测定法，并且存在显著的针对尿枝原体的血清型14临床株系的抗体水平（光密度从1.0增加至3.3），其中具有合适的对照。如我们先前所报道的那样（Weisman等人,1989）并加以修改来进行的细菌杀灭测定法显示了在>1:80稀释度下针对尿枝原体的血清型14临床株系的细菌杀灭的证据，其中具有合适的对照。将先前所报道的脓毒症模型（Kong等人,2008）用于在体内评价对于由母体疫苗所提供的仔鼠的保护。对于至少两次连续的怀孕，在怀孕前给予小鼠的该rDNA疫苗在经疫苗接种的母鼠的仔鼠中在预防脓毒症和死亡方面是有效的（91%对41%，p<0.000001），针对与从其开发出所述疫苗的那种（Biran等人,2010）不同的血清型的尿枝原体感染性生物体（Casell等人,1988），这表明了广泛的效力。

示例性研究设计和方法：

为了开发出生前尿枝原体绒毛膜羊膜炎的小鼠模型，可以利用最近发表的方法（Normann等人,2009）并稍加修改。简而言之：1)可以使雌性FVB白色小鼠（Charles River,Wilmington,MA）与雄性C57BL6小鼠（Charles River）交配，从而产生仔鼠Fl FVB:C57BL6杂种用于研究。可以产生该杂种，因为FVB白色小鼠在6月龄之前可以发展出失明，并且这会干扰发育测试。在某些情况下，使用FVB小鼠，因为我们的尿枝原体动物调查已经在这些小鼠中进行。2)从冷冻的等分试样，使尿枝原体血清型14的临床株系在选择性培养基中生长。2)在第13.5个胚胎日（e），将怀孕的FVB白色小鼠重新随机分配至两种羊膜液内注射物质之一：a)盐水注射，b)尿枝原体注射（5000ccu）。可以注射在盐水中的尿枝原体（没有培养基），以消除先前报道的培养基的潜在的炎症效应（Normann等人,2009）。在无菌条件下，用异氟烷使怀孕的母鼠麻醉。通过12mm的腹部切口使子宫外露，并将其用预先加温的盐水进行浸泡。10ul研究物质将会注射到每个羊膜囊中。然后，在两层中将腹壁缝合。可以使母鼠恢复，其随意可获得水和食物，以及获得疼痛药物治疗。

为了在该模型中评价绒毛膜羊膜炎的发展，在e17.5，可以获得下列。a)关于尿枝原体的定量血液培养和PCR：获得胎儿血液，并进行关于尿枝原体的定量PCR和培养。在后者中，将血液立即以系列稀释在37℃下在10B肉汤中进行温育，并且培养基的颜色改变将会以信号告知尿枝原体生长，其通过在琼脂上的菌落的可视化和用PCR来确认（Walls等人,2009）。在前者中，分离出血清，并将其冷冻以用于先前报道的尿枝原体PCR的批量分析（Weisman等人,2009）。b)定量羊膜液培养和PCR：吸取羊膜液，并且如对于血液所描述的那样立即进行定量培养和PCR。c)定量胎盘培养和PCR：获得胎盘组织并立即进行研磨，并且如对于血液所描述的那样立即进行定量培养和PCR。d)胎盘组织病理学：获得胎盘组织，并且如先前所描述的那样立即进行加工（Redline等人,1998）。所有样品由对组分配不知情的胎盘病理学家来进行阅读。因此，将组织学绒毛膜羊膜炎分开成母体和胎儿应答，并分配以阶段（Redline等人,1998）。e)血液、羊膜液和胎盘炎症介质水平：将血清、羊膜液和磨碎的胎盘立即在液氮中进行冷冻，然后贮存于-80℃直至进行关于炎症介质IL1α、IL1β、IL6、TNFα、IFNγ、MIP-2、MCP-1和TGF-β1的批量ELISA测定法（Normann等人,2009）。

为了测定尿枝原体绒毛膜羊膜炎对于脑发育的影响，可以使用上面的模型并测定下列。1)脑感染和炎症：为了描述在该模型中的相关的脑感染和炎症，在e17.5和出生后6和18周，我们将会用铡除刀移出仔鼠的头、剥去头皮并获得：a)关于尿枝原体的定量脑培养和PCR：分离左半球，立即研磨碎，并进行加工以用于培养和PCR，如上面所描述的，b)脑炎症介质水平：分离右半球并立即研磨碎，在液氮中进行冷冻，然后贮存于-80℃直至进行批量ELISA测定法，如上面所描述的。2)脑组织学和组织化学：为了描述在该模型中的相关脑病理学，在e17.5和出生后6和18周，可以用铡除刀移出仔鼠的头，剥去头皮，将整个脑放置在福尔马林中并进行常规的组织病理学研究。例如，最初的表征牵涉基础的组织病理学研究，其寻找改变例如皮质厚度、组织丢失的迹象、小头等。如果检测病理学、神经病学或发育表型（参见下面），那么可以通过使用特异的神经元标志物来扩展所述分析。对于突触疾病的证据，可以使用囊泡谷氨酸转运蛋白来标记兴奋性突触。对于神经胶质增生的证据，可以使用针对胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）的抗体。3)神经病学表型：为了测定神经病学表型是否出现，将会在出生时，在3周期间每周，然后在18周期间每3周，对仔鼠进行检查，包括：体重、存活、毛发状态、眼睛状态、脊柱状态、震颤、刻板症、后肢抱握和肌阵挛。这些测试应当提供神经病学症状初现的时间表。大多数评价可以由对于在笼中和在检查者的手掌中的动物进行的观察构成。4)发育表型：为了测定发育表型是否出现，可以使仔鼠在出生后6和18周以下面列出的精确顺序经历相同的一套测试。选择了这些测试，因为它们是稳固的，并且评估多个神经生物学表型，包括运动机能、活动性、平衡和协调、焦虑、社会互动、学习和记忆、以及异常运动。发育测试仅在18周时进行，如果在18周之前观察到神经病学表型或者在6周时观察到发育表型。所有测试由对组分配不知情的调查者来进行。木榫钉测试（Samaco等人,2008）：这通过将动物放置在悬空于有衬垫的表面上方60cm处的0.7cm水平木榫钉的顶上来测试协调和平衡。记录至跌落时的时间。该测试在120秒后结束。金属丝悬挂测试（Samaco等人,2008）：将线绳悬吊在有衬垫的表面上方60cm处并允许小鼠用其前爪悬挂在线绳上。记录至跌落时的时间。任务在60秒后结束。旷场分析（Samaco等人,2008；Spencer等人,2005）：该测试测量运动活动性和焦虑。该器械由40cm×40cm×30cm有机玻璃围栏构成，在那里观察者记录小鼠的水平和垂直活动性。将小鼠放在围栏内并监测30分钟以评估运动和焦虑。行进的总距离和移动所花的时间的量决定了运动量。在场地中心行进的距离与行进的总距离之比表明了焦虑水平；焦虑的动物避开场地中心。垂直活动性也是焦虑的一个间接量度。明/暗箱（Spencer等人,2006）：所述明/暗测试基于受试动物在箱子的暗侧内花费的时间的百分比来测量焦虑。将有机玻璃室分为通过一个小开口相连接的两个区室。“明侧”区室由透亮的有机玻璃制成，而“暗侧”区室是不透明的深色有机玻璃。环境用50勒克斯外界照明和60分贝白噪声来控制。将动物放入产生焦虑的“明侧”，并且记录在10分钟期间在两侧之间转换的次数和在每一侧花费的总时间。转换的总次数、在明侧花费的时间、进入暗处的潜伏期和进入明处的潜伏期将会在组之间进行比较。隔板测试（Samaco等人,2008；Spencer等人,2005）：该测试测量社会互动和行为。该测试器械由通过透亮的有孔隔板分为两半的标准笼子构成。让实验动物独个地住在一侧3天直至该实验之前18小时，当将性别/年龄/体重相匹配的FVB:C57BL6Fl小鼠放在对面一侧时。观察者将会用于测量实验小鼠的接近和花在隔板处的时间。该测试的第一阶段测量与熟悉的小鼠（在开始之前18小时放入的）的互动，和第二阶段测量与新来的小鼠的互动。在该测试结束时，用原来的熟悉的小鼠替代新来的小鼠，并记录实验小鼠的行为。莫里斯（Morris）迷宫（Watase等人,2007）：该测试评估情境的（海马）和基于提示的（杏仁核和海马）学习。在莫里斯水迷宫中训练小鼠去找到隐藏的平台。给每只小鼠每天四次试验，进行连续的5天。在试验20后，给每只动物一次探索试验。在探索试验期间，移走平台，并允许每只动物搜寻水池60秒钟。震颤（Alvarez-Saavedra等人,2007）：将会通过身体检查来测量在生命的6和18周时呈现的震颤的程度。

为了探查出生前母体治疗是否影响与尿枝原体绒毛膜羊膜炎相关的脑改变，相比于未疫苗接种的母鼠而言，在受孕之前接受了我们的尿枝原体rDNA疫苗的被尿枝原体感染的母鼠的仔鼠中重复上述神经病学和发育表型实验。

样本大小：对于血液、羊膜液和胎盘培养，PRC，以及病理学实验中的每一个，使用两只幼崽（一只盐水，和一只尿枝原体）。这些实验是为了描述感染，因此不计算样本大小，但可能的最小的样本大小是每组一只幼崽。对于炎症介质数据实验，使用四只幼崽（两只盐水，和两只尿枝原体）。关于炎症介质数据的样本大小基于先前对于相似模型所发表的差异（Normann等人,2009）。对于在07.5天时的脑培养、脑PCR和脑病理学实验中的每一个，使用两只幼崽（一只盐水，和一只尿枝原体），因为一只幼崽是可以选择的最小的样本大小。对于在e17.5天的炎症介质实验，使用四只幼崽（两只盐水，和两只尿枝原体）。关于炎症介质数据的样本大小基于先前对于相似模型所发表的差异（Normann等人,2009）。在6和18周的脑培养、脑PCR和脑病理学实验，可以使用大约3只幼崽/时间点/组/测试或大约总共6只幼崽。这些实验是为了描述感染和病理学，因此不计算样本大小。在6和18周的脑炎症介质，可以使用大约15只幼崽/时间点/组或大约8只幼崽。神经病学和发育表型实验使用8只幼崽或16只仔鼠/组（具有和没有疫苗的盐水和尿枝原体），其给出0.8的幂（a=0.05），以检测在未疫苗接种的母鼠中在盐水和尿枝原体组之间的标准偏差差异，然后再次为在经疫苗接种的和未疫苗接种的母鼠的尿枝原体组之间的标准偏差差异，基于其他人的先前工作（97）。基于用这些动物的先前的工作，可以假定20%的仔鼠或幼崽的损耗或损失。

数据分析：采用标准的统计学分析。对于连续数据，重新评估数据的分布，并且对于具有正态分布的那些使用ANOVA，和对于具有非正态分布的那些使用Kruskal-Wallis。对于分类数据，进行Fischer精确检验或卡方检验，在合适的情况下。

实施例4

尿枝原体疫苗和相关抗体

本实施例涉及疫苗递送、剂量和计划安排的示例性优化，并且还涉及关于对于所述疫苗的免疫学应答和相关抗体的评价。

示例性方法：

如下来递送DNA疫苗：

1)疫苗制备：纯化包含来自小尿枝原体（血清型6）的MBA DNA保守区段的pDNA，并用生理盐水稀释至所希望的浓度（如上面所描述的）。另外，存在一些关于包含来自小尿枝原体血清型1和血清型6两者的恒定区域的疫苗（导致具有两倍的该DNA的更大的质粒）的数据（病原体特异性IgA、中和抗体和动物存活）。

2)用血清型6DNA疫苗对成年FVB小鼠（雌性和雄性两者，3-4周龄）进行疫苗接种，通过腹膜内（IP），以每次注射在1ml NS中的200ug至500ug的剂量（先前所描述的），或者通过肌内（IM），以在0.1ml NS中的100ng和50ug的剂量。

3)注射频次：

a.500ug×2，以2周的间隔，IP

b.500ug×3，以2周的间隔，IP

c.200ug×3，以2周的间隔，IP

d.50ug×3，以2周的间隔，IM

e.100ng×3，以2周的间隔，IM

f.在第一次注射后12周，用与最初注射相同的量的pDNA对所有动物进行加强免疫。每个组包含5只动物。

结果：

1.经疫苗接种的小鼠和对照小鼠的血清免疫球蛋白水平：用商购可得的ELISA试剂盒来评价总IgA、IgM、IgG，以及亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。程序遵循试剂盒中所提供的实验方案。结果显示在下面。

a.在经疫苗接种的小鼠和对照小鼠血清之间，总IgA水平显著增加，p=0.005，然而，在50ug IM和500ug IP疫苗组之间不存在统计学差异（参见图1，其显示了在经疫苗接种的小鼠中的血清IgA水平）。

b.在经疫苗接种的小鼠和对照小鼠血清之中不存在IgM的显著差异，p=0.5（参见图2，其显示了在经疫苗接种的小鼠中的IgM的血清水平）。

c.在经疫苗接种的小鼠和对照小鼠血清之间，总IgG水平显著增加，p=0.008，然而，在50ug IM和在500ug IP疫苗组之间不存在统计学差异。对于IgG1（p=0.005）、IgG2A（p=0.0002）、IgG2B（p=0.001）、IgG3（p=0.0006），在经疫苗接种的小鼠和对照小鼠血清之间，IgG亚类水平显著增加；但对于IgG2C（p=0.4）则不是。对于IgG2C（p=0.52）和IgG3（p=0.17），在50ug IM和在500ug IP疫苗组之间不存在统计学差异。然而，关于50对500ug剂量，IgG1显著地更低（p=0.03），而关于50ug对500ug剂量，IgG2A（p=0.01）和IgG2B（p=0.02）显著地更高（参见图3，其显示了在经疫苗接种的小鼠中的IgG亚类的血清水平）。

2.经疫苗接种的小鼠和对照小鼠的血清病原体特异性IgG水平：针对小尿枝原体（血清型14）的IgG的血清水平，如通过全病菌ELISA所检测的。在所有疫苗组与对照（正常小鼠）之间，病原体特异性抗体显著增加。结果显示在图4中。注意：在进行测定之前，所有血清进行1:2稀释。

表1:通过ELISA测定的用小尿枝原体（血清型6）进行疫苗接种的小鼠的抗体的血清水平，OD

	正常小鼠	500ug×2	500ug×3	200ug×3	50ug×3	100ng×3
							2周	0.372	1.584	2.06	1.73	1.24
4周	0.372	1.378	2.374	1.515	3.67	1.235
							6周	0.372	1.294	1.874		2.439	0.955
8周	0.372	1.992	1.956
							10周	0.372	2.208	1.956	2.51	2.31	1.202
12周	0.372	2.696	1.652	1.77	1.569	1.344
							16周	0.372	3.432	3.78		2.402
20周				2.721	0.882
							31周	0.167	3.8			0.937
46周				2.61	0.622

3.经疫苗接种的小鼠和对照小鼠的血清病原体特异性IgA水平：针对小尿枝原体（血清型14）的IgA的血清水平，如通过全病菌ELISA所检测的。结果显示在图5中。

4.经疫苗接种的小鼠和对照小鼠的血清中和（细菌杀灭）抗体水 平：该测定法在96-孔细胞培养板上进行。每个孔包含：10B培养基；10²ccu尿枝原体；以不同稀释度的来自经疫苗接种的小鼠或正常小鼠的血清。将平板在37℃下温育5天。对于该体外测定法，使用小尿枝原体血清型1和6，解脲尿枝原体血清型8，和差异尿枝原体血清型A。来自经疫苗接种的小鼠的血清具有针对所有所测试的尿枝原体物种的杀灭活性。在先前的文件内容中，我们具有针对小尿枝原体血清型14的细菌杀灭。黄色表示没有细菌生长。结果中的一些显示在图6中。

5.经疫苗接种的小鼠和对照小鼠在感染后后的动物存活：在第一次pDNA注射后12周，所有动物接受加强免疫注射。2天后安排交配。在生命的第1天，用2个剂量的10⁶ccu尿枝原体（相隔4小时）感染来自这些雌鼠的仔鼠。在紧接着的8天内计算存活率，并且将其与用相同剂量和株系的尿枝原体感染的未疫苗接种的母鼠的仔鼠进行比较。对于感染性尿枝原体的每一个株系，在经疫苗接种的组中仔鼠的存活率比对照组显著更高。然而，以迄今所测试的剂量，在经疫苗接种的组中看起来不存在显著差异。数据展示在图8、9、10、11和12中。动物存活研究在1000、500和200ug/剂的剂量上完成。存活研究在50ug/剂上进行，并且将来计划100ng/剂。

在一些实施方案中，可以开发所述疫苗的蛋白质产物，并且这允许调查下列的效应：蛋白质疫苗；使用该蛋白质作为对于DNA疫苗的加强（蛋白质加强）；开发和表征来自该蛋白质的单克隆抗体。可以检查单克隆抗体在人、动物和培养基/细胞系中作为治疗性靶标的有效性。可以改善用于pDNA疫苗的递送系统/平台/方法，例如通过调查在最佳剂量下的皮下（SC）递送。还可以开发，和如果需要与其他人合作开发平台以用于增强IM或SC疫苗递送。例如，可以开发平台以用于以口服或鼻的方式递送所述疫苗（例如，细胞转染剂）。例如，可以使用电穿孔递送系统来测试所述疫苗。可以表征所述疫苗的作用机制，包括例如，细胞介导的免疫应答。可以表征所述疫苗（pDNA或蛋白质或者两者）对于慢性肺病（BPD）、绒毛膜羊膜炎、阴道炎、慢性前列腺炎、神经病学病症、早产等的动物模型的影响。

参考文献

所有在说明书中提及的专利和出版物表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物通过提及而合并入本文，就如同具体地和单独地指明每一个单个的出版物通过提及而合并入本文一样。

专利和专利申请

美国专利号3,826,364

美国专利号4,284,412

美国专利号4,498,766

美国专利号4,578,770

美国专利号4,596,792

美国专利号4,599,230

美国专利号4,599,231

美国专利号4,601,903

美国专利号4,608,251

美国专利号4,661,913

美国专利号4,774,189

美国专利号4,767,206

美国专利号4,714,682

美国专利号4,857,451

美国专利号4,989,977

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尽管已经详细描述了本发明及其优点，但是应当理解，可以在此处进行各种变化、替换和改变而不背离由所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围。此外，并不意欲将本申请的范围限制于在说明书中所描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特别的实施方案。如本领域技术人员将会容易地从本发明的公开内容中所理解的，根据本发明，可以使用实施与本文中所描述的相应实施方案基本上相同的功能或取得与本文中所描述的相应实施方案基本上相同的结果的、目前存在或待以后发展的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附的权利要求书意欲在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。

Claims (34)

1.DNA疫苗，其包含编码尿枝原体抗原的部分或全部的多核苷酸。

2.权利要求1的疫苗，其中所述抗原为脲酶、UU376基因产物、毒力基因产物或尿素转运蛋白，或者其中所述多核苷酸包含MBA N-末端平行进化同源物、16S rRNA、脲酶A基因上游的区域、脲酶A-脲酶B间隔区、脲酶B-脲酶C间隔区或16S-23S rRNA基因间间隔区。

3.权利要求1的疫苗，其被进一步定义为包含编码至少一种多条带尿枝原体抗原的多核苷酸的DNA疫苗。

4.权利要求3的疫苗，其中所述多核苷酸被进一步定义为如下：

a)包含强的病毒启动子；

b)包含具有或不具有rev的摩-傅猴病毒（MPV）-CTE；

c)包含内含子A或者来自SV40或Raucous肉瘤的内含子；

d)包含强的多腺苷酸化/转录终止信号；

e)表达来自超过一种的尿枝原体物种、生物变型、血清型或株系的多重结合蛋白；

f)包含关于致病性mRNA的密码子；

g)包含免疫增强剂；

h)包含N-末端遍在蛋白信号；

i)包含来自不同病原体的小基因（或Ｉ类MHC表位）或寡核苷酸的链串；

j)包含TH表位；或者

k)其组合。

5.权利要求3的疫苗，其被进一步定义为包含两种尿枝原体抗原。

6.权利要求3的疫苗，其被进一步定义为在起始密码子之前包含ANNATPG（SEQ ID NO:1）。

7.权利要求4的疫苗，其中所述免疫增强剂包括人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

8.权利要求4的疫苗，其中所述来自不同病原体的I类MHC表位或寡核苷酸的链串包括CpG基序。

9.与尿枝原体的多条带抗原发生免疫反应的疫苗，所述疫苗包含在药理学上可接受的赋形剂中。

10.权利要求9的疫苗，其中所述疫苗包含所述多条带抗原的肽或多肽。

11.权利要求9的疫苗，其中所述疫苗包含与所述多条带抗原发生免疫反应的抗体。

12.包含权利要求1或9的疫苗的试剂盒，所述疫苗被储藏在合适的容器中。

13.预防个体中尿枝原体感染或减轻个体中尿枝原体感染的症状的方法，其包括向所述个体递送治疗有效量的权利要求1或8的疫苗的步骤。

14.权利要求13的方法，其中所述个体为人。

15.权利要求13的方法，其中所述个体为牛。

16.权利要求13的方法，其中所述个体为雌性。

17.权利要求13的方法，其中所述个体为雄性。

18.权利要求13的方法，其中所述个体是在第一次性活动之前的雌性或雄性。

19.权利要求13的方法，其中所述个体是在怀孕之前的雌性。

20.权利要求13的方法，其中将所述疫苗递送给怀孕的雌性。

21.权利要求13的方法，其中所述个体是婴儿、儿童或青少年。

22.权利要求13的方法，其中所述疫苗通过注射来进行递送。

23.权利要求22的方法，其中所述注射是肌内的，静脉内的，皮下的，腹膜内的，通过基因枪的，通过气动注射的，或者包含脂质体。

24.权利要求22的方法，其中所述疫苗包含DNA，并且所述基因枪包括经由表皮递送来递送包被有DNA的金珠或钨珠。

25.权利要求22的方法，其中所述疫苗包含DNA，并且所述气动注射经由表皮递送。

26.权利要求13的方法，其进一步包括向所述个体进行多次递送。

27.权利要求26的方法，其中所述多次递送相隔数年、数月、数周或数天。

28.权利要求26的方法，其中所述多次递送相隔一个月或更多个月。

29.权利要求26的方法，其中所述多次递送相隔两年至十年。

30.权利要求12的方法，其中将所述疫苗递送到羊膜腔中。

31.权利要求13的方法，其中所述疫苗经阴道来进行递送。

32.抗体，其与尿枝原体多条带抗原的保守区域或所述多条带抗原的5’末端发生免疫反应。

33.预防个体中尿枝原体感染或减轻个体中尿枝原体感染的症状的方法，其包括向所述个体递送治疗有效量的抗体的步骤，所述抗体识别尿枝原体多条带抗原的保守区域或所述多条带抗原的5’末端。

34.防止细胞培养基中尿枝原体感染的方法，其包括向所述培养基递送有效量的抗体的步骤，所述抗体识别尿枝原体多条带抗原的保守区域或所述多条带抗原的5’末端。

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