CN103849637A

CN103849637A - O型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103849637A
Application number: CN201210499507.7A
Authority: CN
Inventors: 于力; 杨德成
Original assignee: Individual
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-11-29
Also published as: CN103849637B

Abstract

本发明公开了O型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因，本发明还公开了决定O型口蹄疫病毒耐酸特性的关键氨基酸位点及应用。本发明将O型口蹄疫病毒亲本株在酸压力下进行连续传代筛选，获得了一株具有较强耐酸能力的突变株，分析发现决定O型口蹄疫病毒耐酸特性的关键氨基酸为VP1 N17D突变，仅携带有该位点突变的口蹄疫病毒具有与突变株相似的耐酸能力，且具有良好的复制能力和免疫原性。本发明发现的耐酸性决定位点可应用于口蹄疫疫苗种毒的耐酸性改造以及新一代口蹄疫基因工程疫苗的开发。本发明耐酸突变株rN17D可作为优质灭活疫苗生产种毒，能够提高灭活疫苗中146S有效抗原的含量，增加疫苗的免疫效力。

Description

O型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒耐酸突变株及其携带的衣壳蛋白和编码基因，尤其涉及O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆以及用该O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆所拯救的O型口蹄疫病毒耐酸突变株，本发明还涉及决定O型口蹄疫病毒耐酸毒株耐酸特性的VP1 N17D突变位点及应用，属于口蹄疫病毒防治领域。

背景技术

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth DiseaseVirus,FMDV）引起的，主要侵害偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病一旦爆发会对社会经济造成严重影响，因此在国际上被称为政治经济病，历来受到各国政府的高度重视。

FMDV是微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，属于单股正链RNA病毒。FMDV对酸高度敏感，最适PH值为7.4-7.6，在PH值略低于中性条件下衣壳即会解聚。FMDV的酸敏感性是病毒衣壳裂解所必需的，病毒进入细胞后内体的酸性环境诱导衣壳分解，从而使RNA基因组在感染的细胞中释放（Carrillo et al.,1985）。FMDV利用内体酸化作用进行脱壳的现象虽然很早就被发现，但是酸介导FMDV脱壳的分子机制至今尚不清楚。

口蹄疫病毒对酸敏感的特性一直是灭活疫苗生产中的技术难题。对于口蹄疫疫苗来说，146S病毒粒子是灭活疫苗诱导中和抗体的最有效抗原。然而，由于FMDV对酸性环境极其敏感，在体外繁殖FMDV时，细胞代谢产酸很容易使得FMDV培养环境的pH下降，当pH值略低于中性条件时，FMDV的衣壳就会裂解，导致FMDV的有效抗原量降低，由此制备的灭活疫苗其免疫效力就会下降（Doel,T.R.,and W.K.Chong.1982.Comparative immunogenicity of 146S,75S and 12S particles of foot-and-mouth diseasevirus.Arch Virol 73:185-191.）。此外，FMDV衣壳对温度也比较敏感，造成FMDV灭活疫苗运输和储存过程中需要完善的冷链系统，导致成本大幅上升。因此，开发高度耐酸的口蹄疫疫苗株对提高灭活疫苗免疫效力具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是构建O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆；

本发明目的之二是提供用所述O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆拯救的O型口蹄疫病毒耐酸突变株病毒；

本发明目的之三是提供决定O型口蹄疫病毒耐酸特性的关键氨基酸；

本发明目的之四是将所述的O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒及所拯救的耐酸突变株病毒应用于预防或治疗口蹄疫领域。

本发明目的之五是将决定O型口蹄疫病毒耐酸特性的关键氨基酸应用于预防或治疗口蹄疫领域。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆（pYS-N17D），所述O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆的核苷酸全长序列为SEQ ID No.1所示;其微生物保藏编号为：CGMCC NO.6868；保藏时间为：2012年11月22日；该重组质粒的分类命名为：O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA克隆质粒pYS-N17D；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明首先将O型FMDV O/YS/CHA/05株在酸压力下进行传代连续传15代，筛选获得一株具有高度耐酸特性的O型FMDV突变株，将其命名为O-AR株,该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码基因为SEQ ID No.2所示。本发明分别提取酸压力筛选获得的O型口蹄疫病毒P5、P10和P15三个代次的病毒RNA，对这三个代次病毒的耐酸性进行比较。试验结果发现，P5、P10和P15毒株均为O型FMDV耐酸毒株且具有相似的耐酸特性，这表明亲本毒株在体外筛选至第5代即获得耐酸表型，并且这种耐酸表型稳定存在至第15代。

为分析决定FMDV耐酸特性的氨基酸位点，对P5、P10、P15三个代次毒株及其亲本株的基因组序列进行测定并比较结构蛋白编码区序列。序列比对分析发现，P5耐酸毒株结构蛋白基因拥有三个点突变分别是G218A、A512C、A1618G，这些核苷酸突变导致3个氨基酸突变，分别是衣壳蛋白VP4的第73位丝氨酸突变为天冬酰胺（S73N）、衣壳蛋白VP2的第80位天冬氨酸突变为丙氨酸（D86A）以及衣壳蛋白VP1的第17位天冬酰胺突变为天冬氨酸（N17D）。P10和P15耐酸毒株也仅存在这三个变异位点，并没有因酸压力筛选代次的增加而增加其它氨基酸突变。另外，第5代耐酸毒株在没有酸压力的条件下，连续传10代后经测序分析这三个突变的氨基酸同样能够稳定存在，且该毒株的耐酸能力不变。这些结果表明，上述三个变异氨基酸，可能与O型FMDV的耐酸特性有关。

根据耐酸毒株结构基因序列比对分析获悉其氨基酸残基的变异，本发明利用定点突变技术分别构建与S73N、D86A以及VP1 N17D这三个突变位点相对应的单位点和组合位点突变的感染性cDNA克隆质粒pS73N、pD86A、pN17D、pS73N/D86A、pS73N/N17D、pD86A/N17D和pS73N+D86A+N17D，并成功拯救了这7个突变株病毒。在BHK-21细胞上连续传5代稳定后，经全基因组测序验证突变位点正确，然后对这些拯救的突变株病毒及其亲本病毒的耐酸性进行比较分析。试验结果发现，含有N17D突变的病毒株（rN17D、rS73N/N17D、rD86A/N17D和rS73N+D86A+N17D）在pH6.0与pH7.4条件下处理30min后病毒滴度没有明显变化，且这些病毒与P5毒株具有相似的耐酸能力。而rS73N、rD86A、rS73N/D86A突变株在pH6.0条件下处理30min后比在pH7.4条件下处理的病毒滴度下降10000倍，与亲本毒在此条件下处理后下降的滴度相近。以上试验结果表明，仅有VP1 N17D突变(VP1蛋白的第17位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸)是决定O型FMDV耐酸表型的分子因素,突变后的VP1蛋白(VP1 N17D)的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码基因如SEQ ID No.4所示。

仅携带有VP1 N17D突变(VP1 N17D)的口蹄疫突变株病毒(N17D)与亲本毒O/YS/CHA/05在中性（pH7.4）环境中作用后具有相似的免疫原性，但是在酸（pH6.0）环境下处理30min后N17D突变病毒的免疫原性明显优于亲本毒O/YS/CHA/05。上述实验结果表明，VP1蛋白的第17位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸（N17D突变）不但不影响病毒的抗原性，反而赋予病毒及其抗原的抗酸能力，使其在酸环境中仍然具有良好的免疫原性。鉴于口蹄疫病毒对酸的敏感特性，在微酸环境下146S病毒粒子的衣壳就会裂解、导致FMDV的有效抗原量降低、制备的灭活疫苗免疫效力下降。本发明通过O型口蹄疫病毒耐酸株的制备及其分子决定因素的确定，为其作为O型口蹄疫病毒灭活疫苗的生产种毒提供了理论和实验依据、为解决口蹄疫灭活疫苗生产中有效抗原酸性灭活的技术难题打下物质基础。

附图说明

图1O型口蹄疫病毒酸压力筛选不同代次毒株的耐酸能力的比较。

图2pH 6.0酸性环境预处理的O型口蹄疫FMDV突变株感染BHK-21细胞的免疫荧光检测。

图3突变株病毒在不同pH环境下作用30min的病毒滴度。

图4突变株病毒rN17D与亲本毒复制能力的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

1.细胞、病毒和质粒

BHK-21细胞（美国ATCC菌种保藏中心，ATCC Number:CCL-10）；O型FMDVO/YS/CHA/05毒株(GenBank登录号：HM008917)及该病毒的感染性cDNA克隆可按照文献所公开的方法进行构建（中国发明专利公开号：CN 101838658A；发明名称：O型口蹄疫病毒变异株及其编码基因和应用）；pOK-12载体由Messing（1991）惠赠（pOK-12载体的GenBank登录号：AF223639）。

2.试剂

PrimeSTAR DNA聚合酶、Primerscript II反转录酶、各种限制性内切酶，均购自TaKaRa公司。T4 DNA连接酶购自NEB公司。Simply P Total RNA Extraction kit提RNA试剂盒购自Bio Flux公司。体外转录采用Promega公司的RiboMAXTM Large ScaleRNA ProductionSystems-T7试剂盒。转染试剂采用QIAGEN公司的

Transfection Reagent转染试剂盒。羊抗鼠IgG荧光抗体购自Sigma公司。

3.不同pH值PBS的配制

PBS的配方是50mM NaH₂PO₄、100mM NaCl，用浓盐酸调节缓冲液的pH值分别至7.4、6.0和5.0。

实施例1 O型口蹄疫病毒耐酸突变株的筛选及鉴定

1.O型口蹄疫病毒耐酸突变株的筛选

取10μL（10⁶TCID₅₀/100ul）O型FMDV O/YS/CHA/05株加入到300μL PBS（pH6.0）室温作用1h，用100μL 1M Tris(pH 7.4)中和后接种BHK-21细胞，待80%细胞出现CPE后反复冻融三次收毒并测病毒滴度。以此病毒作为种子进行下一轮酸压力筛选直至第15代。亲本毒用pH7.4的PBS以相同方式处理，连续传15代。在pH6.0条件下筛选15代后，取第5代（P5）、第10代（P10）和15代（P15）病毒，检测其对pH6.0和pH7.4酸度的耐受性。

2.耐酸突变株的间接免疫荧光分析

取10μL拯救的突变株病毒加入到300μL PBS（pH6.0）于室温作用1h后，用100μL Tris-HCL（pH7.6）中和。将BHK-21细胞接种96孔板,生长到90%单层时接种经pH6.0酸性条件处理好的病毒，12h后，将感染BHK-21细胞用预冷的无水乙醇固定15min,加入O型FMDV特异性单克隆抗体8E8，37℃作用1h，PBST洗涤,加入荧光标记羊抗鼠IgG(Sigma)于37℃作用45min,PBST洗涤后，用70%甘油封片，在荧光显微镜下观察。

实验结果如图1所示，pH7.4处理条件下处理30min，亲本毒（O型FMDVO/YS/CHA/05株）、P5、P10和P15病毒滴度均为10^5.75TCID₅₀/100uL。pH6.0处理条件下处理30min，P5、P10和P15的病毒滴度与pH7.4处理条件下相同，仍为10^5.75TCID₅₀/100uL，而亲本毒O/YS/CHA/05株在此处理条件下病毒滴度仅为10^1.75TCID₅₀/100uL，相比pH7.4条件下处理降低10000倍。间接免疫荧光试验也进一步证实了此结果(图2)。以上试验结果表明，P5、P10和P15毒株均为O型FMDV耐酸毒株，亲本毒株在体外筛选至第5代即获得耐酸表型，并且这种耐酸表型稳定存在直至实验的终点第15代。

本发明将所筛选得到的具有高度耐酸特性的O型FMDV命名为O-AR株,该O-AR株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示,其编码基因为SEQ ID No.2所示。

实施例2 O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA克隆质粒pYS-N17D的构建及O型口蹄疫病毒耐酸突变株病毒的拯救及耐酸特性分析

1.病毒RNA的提取、cDNA合成以及DNA序列比对

为分析决定FMDV耐酸特性的氨基酸位点，对P5、P10、P15三个代次毒株及其亲本株的基因组序列进行测定并比较结构蛋白编码区序列。

按Simply P Total RNA Extraction kit说明书分别提取实施例1酸压力筛选获得的O型口蹄疫病毒P5、P10和P15三个代次的病毒RNA，用26μL的DEPC水溶解提取的RNA。

以提取的病毒RNA为模板、O1igo-dT(15T)为反转录引物，在反转录酶PrimeScript作用下合成cDNA。反应条件是：25℃10min，42℃60min，4℃20min。反应体系为50μL，包括：病毒RNA 26μL；dNTP(25mM)6μL；PrimeScript反转录酶1μL；5×PSRT-Buffer 10μL；Oligo-dT 6μL；RNA Inhibitor 1μL。以反转录产物为模板，用O型FMDV结构蛋白区的一对引物扩增病毒结构蛋白编码区。这一对引物是pU（5'ACC CCA GCA CGG CAA CTT TAT 3'）和pL（5'CCC AGG TCA TCC ATTACT ACA AC 3'）。PCR反应体系为50μL，包括：ddH₂O 28μL；5×PS buffer 10μL；dNTP 4μL；PU(10pmol/μL)2μL；PL(10pmol/μL)2μL；模板3μL；Prime STARHS DNA聚合酶1μL。PCR的反应条件是：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经胶回收纯化后进行序列测定,测序所用引物为PCR引物PU和PL以及p2297L 5'CCG TTGAAC TGA TTC CCC ACT 3',p2129U 5'TGT GCA GGC AGA GCG GTT CTT 3',p3575L 5'GCC GTT GGA TTG GTG GTG TTG 3'和p3335U 5'TGG TGA GAC ACA GGT CCA GAG 3'。测得的序列与亲本株O/YS/CHA/05的相应序列进行比对分析。

序列比对分析发现，P5耐酸毒株结构蛋白基因拥有三个点突变分别是G218A、A512C、A1618G，这些核苷酸突变导致3个氨基酸突变，分别是衣壳蛋白VP4(GenBank登录号：HM008917)的第73位丝氨酸突变为天冬酰胺（S73N突变）、衣壳蛋白VP2(GenBank登录号：HM008917)的第80位天冬氨酸突变为丙氨酸（D86A突变）以及衣壳蛋白VP1(GenBank登录号：HM008917)的第17位天冬酰胺突变为天冬氨酸（N17D突变）。

P10和P15耐酸毒株也仅存在这三个变异位点，并没有因酸压力筛选代次的增加而增加其它氨基酸突变。另外，第5代耐酸毒株在没有酸压力的条件下，连续传10代后经测序分析这三个突变的氨基酸同样能够稳定存在，且该毒株的耐酸能力不变。这些结果表明，上述三个变异氨基酸，可能与O型FMDV的耐酸特性有关。

根据耐酸毒株结构基因序列比对分析获悉其氨基酸残基的变异，利用定点突变技术分别构建单位点和组合位点突变的感染性cDNA克隆质粒pS73N、pD86A、pN17D、pS73N/D86A、pS73N/N17D、pD86A/N17D和pS73N+D86A+N17D，并成功拯救了这7个突变株病毒。在BHK-21细胞上连续传5代后稳定，经全基因组测序验证突变位点正确，然后对这些拯救的突变株病毒及其亲本病毒的耐酸性进行比较分析。结果如图3所示，含有N17D突变的病毒株（rN17D、rS73N/N17D、rD86A/N17D和rS73N+D86A+N17D）在pH6.0与pH7.4条件下处理30min后病毒滴度没有明显变化，且这些病毒与P5毒株具有相似的耐酸能力。而rS73N、rD86A、rS73N/D86A突变株在pH6.0条件下处理30min后比在pH7.4条件下处理的病毒滴度下降10000倍，与亲本毒在此条件下处理后下降的滴度相近。以上试验结果表明，仅有VP1 N17D突变是决定O型FMDV耐酸表型的分子因素。

2.定点突变

按QuikSite-Directed Mutagenesis Kit说明书，用PrimeSTAR DNAPolymerase通过PCR的方法在感染性cDNA克隆上利用引物（S73N-UP-5'ACG ACT GGTTTT CAA AGC TAG CCA ATT CTG CTT TTA GCG GTC TTT TCG G 3'，S73N-Low-5'CCG AAAAGA CCG CTA AAA GCA GAA TTG GCT AGC TTT GAA AAC CAG TCG T 3'；D86A-UP-5'TGCTAC CTG CTG GAA CTC CCA ACT GCC CAC AAA GGT GTC TAC GGT AGC C 3'，D86A-Low-5'ACC GTA GAC ACC TTT GTG GGC AGT TGG GAG TTC CAG CAG GTA GCA CCG T 3'；N17D-UP-5'GTA ACT GCC ACC GTT GAG GAC TAC GGT GGT GAG ACA CAG GTC CAG AG 3'，N17D-Low-5'ACC TGT GTC TCA CCA CCG TAG TCC TCA ACG GTG GCA GTT ACG GGG TCAGC 3'）分别引入点突变。在感染性cDNA克隆上进行单位点突变和组合位点突变，获得的克隆分别命名为pS73N、pD86A、pN17D、pS73N+D86A、pS73N+N17D、pD86A+N17D、pS73N+D86A+N17D。PCR程序是：95℃5min；95℃30s,68℃9min，18个循环；72℃10min。然后用DpnI降解PCR产物中被甲基化的模板pOK-C（37℃，1h），将处理过的PCR产物转化感受态细胞DH5a，提取并鉴定阳性质粒。经测序鉴定正确后，用于拯救突变株病毒。

3.突变株病毒的拯救

重组质粒pS73N,pD86A,pN17D,pS73N+D86A,pS73N+N17D,pD86A+N17D,pS73N+D86A+N17D用限制性内切酶EcoRV酶切线性化后，按照RiboMAXTM Large ScaleRNA Production Systems-T7系统说明书胞外转录，反应体系为：25mmol/L rNTP 6μL，5×缓冲液4μL，T7RNA聚合酶混合液2μL，EcoR V线性化并进行相应定点突变的pOKT7-O/YS/CHA/05重组质粒8μL(2μg)，总体积为20μL。将反应物充分混匀后，于37℃温育2.5h，用RNase-Free DNase消化15min，除去DNA模板，按酚氯仿抽提方法纯化转录产物。当6孔板中的BHK-21细胞生长至60%～90%单层时，用PBS洗2遍细胞，加1.5mL含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液。将细胞外转录获得的RNA按QIAGEN公司的Effectene R Transfection Reagent转染试剂盒说明书转染BHK-21细胞，进行病毒拯救。转染的细胞在5%CO₂于37℃培养，观察细胞病变，大约3d左右收获病毒，反复冻融3次后传代接种BHK-21细胞，直到病毒能产生稳定的CPE。

4.病毒滴度的测定

用TCID₅₀（组织半数感染量）方法测定病毒滴度。首先选择生长状态良好、形态正常的BHK-21细胞，胰酶消化后，按每毫升培养液中含5-8×10⁵个细胞的量加入2%的DMEM，用吸管吹散细胞，加到96孔板中，每个孔100μL。然后，用无血清的DMEM按10倍系列稀释病毒。取出96孔板培养细胞加入上述病毒稀释液，每孔50μL，每个稀释度做4个重复孔。然后将96孔板放在CO₂培养箱中于37℃培养，3d后显微镜下观察细胞病变情况，依据Karber法计算TCID₅₀/100μL。

在测定病毒的酸敏感性时，病毒滴度也是通过TCID₅₀测定的，在稀释病毒之前先将病毒用不同pH值的PBS处理。将30μL病毒液加入到600μL的不同pH值的PBS（加入病毒后的pH值为最终pH值）中，1h后加入120μL Tris-HCL（pH7.6）中和，此时病毒稀释倍数为25倍；将此管中100μL病毒液加入有300μL无血清的DMEM培养液中上下吹打混匀，此时病毒稀释100倍，然后10倍系列稀释，稀释至10^-7。按上述方法测定酸处理后病毒的滴度。

所拯救的突变株病毒滴度测定结果如图3所示，含有N17D突变的病毒株（rN17D、rS73N/N17D、rD86A/N17D和rS73N+D86A+N17D）在pH6.0与pH7.4条件下处理30min后病毒滴度没有明显变化，且这些病毒与P5毒株具有相似的耐酸能力。而rS73N、rD86A、rS73N/D86A突变株在pH6.0条件下处理30min后比在pH7.4条件下处理的病毒滴度下降10000倍，与亲本毒在此条件下处理后下降的滴度相近。以上试验结果表明，仅有VP1 N17D突变是决定O型FMDV耐酸表型的分子因素。

5.一步生长曲线绘制

为了分析VP1 N17D突变是否影响O型FMDV的生长复制能力，本实验绘制用O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒pYS-N17D所拯救的耐酸突变毒株病毒（以下简称“rN17D突变株病毒”）和亲本毒O/YS/CHA/05株的一步生长曲线。

按5MOI接种量将亲本毒与拯救病毒（rN17D突变株病毒）分别接种对数生长期的单层BHK-21细胞，37℃条件下吸附1h后用PBS洗去未吸附的病毒，加2%FBS DMEM维持培养，在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h时间点收获病毒，测定不同时间点收获病毒的TCID₅₀，每个时间点重复3次。以病毒生长时间为横坐标、以病毒在不同时间点的TCID₅₀平均值为纵坐标，绘制病毒的一步生长曲线。

所绘制得病毒的一步生长曲线的结果如图4所示，rN17D突变株病毒与O/YS/CHA/05病毒具有相似的复制能力，这表明，VP1 N17D突变不影响O型FMDV的体外复制能力。

试验例1 O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒pYS-N17D所拯救的耐酸突变毒株的免疫原性分析

决定O型FMDV耐酸表型的关键氨基酸N17D位于VP1蛋白的N末端，该位点位于O型FMDV 5个抗原位点之外。因此，推测N17D突变不会影响病毒的抗原性。为证实这一推测，本试验将实施例2用O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒pYS-N17D所拯救的仅携带有N17D位点突变的口蹄疫突变株病毒（以下称“rN17D突变株病毒”）和口蹄疫病毒亲本毒的全病毒灭活抗原分别在pH7.4和pH6.0环境中处理30min后，免疫Babl/c鼠，定期采集血清，用中和试验检测抗体滴度。

1、试验方法

(1)、灭活疫苗免疫程序

选用6周龄SPF级BALB/c鼠75只（购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心），将其随机分成A-E 5个组，每组15只。A和B组每只小鼠分别免疫20μg经过提纯并且在200μl pH7.4PBS处理30分钟的rN17D突变株病毒或亲本毒株的病毒蛋白。C和D组每只小鼠分别免疫20μg经过提纯并且在200μl PBS(pH6.0)处理30分钟的上述两种病毒。E组则免疫200μl PBS(pH7.4)作为对照。在第一次免疫后4周以相同剂量加强免疫，并分别在一免后第3周、6周、9周、12周，对免疫小鼠进行尾静脉采血并测定血清中和效价。

(2)、微量细胞中和试验

按常规方法使用BHK-21细胞测定FMDV O/YS/CHA/05病毒的TCID₅₀；然后，采用固定病毒稀释抗体方法进行微量细胞中和试验：首先抗体经56℃灭活30min后，用PBS做倍比稀释；然后，用200 TCID₅₀的病毒分别与等体积不同稀释度的抗体混合，37℃温箱中抚育1h；然后在上述抗体-病毒混合液分别接种BHK-21细胞，每孔100μL，每滴度设8孔重复，于37℃5%CO₂培养箱中培养，每日观察细胞，72h后做最终判断。另外，设病毒阳性血清和正常细胞对照，根据细胞病变效应(CPE)情况按Reed-Muench方法计算抗体中和滴度，即能保护50%BHK-21细胞不出现CPE的血清抗体的稀释浓度。

2、试验结果

试验结果如表1所示，rN17D突变株病毒与亲本毒O/YS/CHA/05在中性（pH7.4）环境中作用后具有相似的免疫原性，但是在酸（pH6.0）环境下处理30min后,rN17D突变株病毒的免疫原性明显优于亲本毒O/YS/CHA/05。

表1 O型口蹄疫病毒耐酸突变毒株灭活抗原在小鼠体内诱导的中和抗体滴度

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> O型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用

<130> DQXL-0886

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8262

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

ttgaaagggg gcgttagggt ctcatcccta acacgccaac gacagctcct gcgctgcact 60

ctacactcac gtctgtgtgc gcgcggggac cgttggacta ccgttcaccc acctacggtt 120

ggactcacgg caccgcgcgg ccattttagc tggattgtgt ggacgaacgc cacttgcgca 180

ctccgcgtga ctggttaata ctcttaccac tttccgccta cctggtcgtt ggcgctgtcc 240

tgggcactcc cgttgggggc cgtccggtgc tccacggttt ccacgcgtga caaactacgg 300

tgatggagcc gcttcgtgcg agttgatcgc ctggtgtgtt tcggctgtca cccgaagtcc 360

acctttcacc cccccccccc ccccccccca cctctcacaa gtttttaccg cctttcccag 420

cgttaaaggg aggtaaccac aagcttgcgt ctgtcttgct cgacgataaa gggctgtgac 480

cgcaagatga taccgccttt cccggcgtta attggatgta accataagac gaaccttcac 540

ccggaagtaa aacggcaaat tcgcatagtt ttgcccgttt tcaggagaaa cgggacgtct 600

gcgcacgaaa cgcgccgtcg cttgaggagg acttgtacaa acacggtcca ttcaggtttc 660

cacaaccgac acaaaccgtg caacttggaa ctccgcctgg tctttccagg tctagagggg 720

tgacattttg tactgtgctt gactccacgc tcggtccact ggcgagtgct agtaacagca 780

ctgttgcttc gtagcggagc atggtggccg cgggaactcc tccttggtaa cagggacccg 840

cggggccgaa agccacgtcc tcacggaccc accatgtgtg caaccccagc acggcaactt 900

tattgtgaaa accactttaa ggtgacactg atactggtac tcaaccactg gtgacaggct 960

aaggatgccc ttcaggtacc ccgaggtaac acgcgacact cgggatctga gaaggggact 1020

ggggcttctt taaaagcgcc tggtttaaaa agcttctacg cctgaatagg tgaccggagg 1080

ccggcacctt tccttcgaac aactgtcttt aaatgagcac aactgactgt ttcatcgctt 1140

tgttgtacgc tttcagagag atcaaaacac tgtttttatc acgaacgcga ggaaagatgg 1200

agttcacact tcacaacggt gagaagaaaa cattctactc cagacccaac aaccacgaca 1260

actgctggtt gaacgccatc ctccagctgt ttaggtacgt tgatgaacct ttcttcgact 1320

gggtctactg ttcacacgag aacctcacac tcaatgctat aaaacaattg gaagaaatta 1380

ctggtctcga gctccacgag ggtggaccac ccgctctcgt tatttggaac atcaaacacc 1440

tgctcaacac cggaataggc accgcttcgc gacccagcga agtgtgcatg gtagacggga 1500

cggacatgtg cttggctgac ttccatgctg gcatcttcct gcaaggacag gaacacgctg 1560

tgttcgcctg cgtcacctcc aacgggtggt acgcaatcga tgacgaggac ttttacccct 1620

ggacgccgga cccgtccgac gttctggtgt tcgtcccgta cgaccaagaa ccgctcaacg 1680

gagaatggaa aacaaaggtt cagaaacgac tcagaggtgc cgggcaatcc agcccggcga 1740

ctgggtcgca gaaccagtca ggtaacactg gaagcattat caacaattac tacatgcagc 1800

agtaccagaa ctccatggac acacaacttg gtgacaacgc tattagtgga ggctccaacg 1860

aggggtccac ggacaccacc tccacccaca caaccaacac ccaaaacaac gactggtttt 1920

caaagctagc cagttctgct tttagcggtc ttttcggcgc tcttctcgct gacaagaaaa 1980

ccgaggagac cactcttctt gaggaccgca tcctcactac ccgcaacggg cacacgacct 2040

cgacaaccca gtcaagcgtt ggagtcactt acgggtacgc gacagctgag gactttgtga 2100

gcggaccgaa cacgtctggg cttgagacca gggttgtgca ggcagagcgg ttcttcaaaa 2160

cccacttgtt cgactgggtc accagtgacc cgttcggacg gtgctacctg ctggaactcc 2220

caactgacca caaaggtgtc tacggtagcc taactgactc ttatgcttac atgagaaacg 2280

gttgggatgt agaggttact gcagtgggga atcagttcaa cggaggatgt ctgttggtgg 2340

ctatggtacc agaactttgc tctattgaca agagagggct ttaccaactc acgctcttcc 2400

cccaccagtt catcaacccc cggacgaaca tgacggcgca catcactgtg ccttttgttg 2460

gcgtcaaccg ctacgaccag tacaaggtac acagaccttg gactctcgtg gtcatggttg 2520

tggccccgct gactgtcaac actgaaggtg ccccacagat caaggtttac gccaacatcg 2580

cccctactaa cgtgcacgtc gcgggtgagc tcccttctaa ggaagggatc ttccccgtgg 2640

catgtagcga cggttacggt ggcctggtga ccactgaccc aaagacggct gaccccgcct 2700

acgggaaagt gttcaatcca cctcgcaaca tgttgccggg gcggttcacc aacttccttg 2760

atgtggctga ggcgtgtcct acgtttctgc attttgaggg tgacgtaccg tacgtgacca 2820

caaagacgga ctcagacagg gtgctcgccc agtttgactt gtctctggca gcaaaacaca 2880

tgtcaaacac cttcctggca ggtctcgccc agtattacac acagtacagc ggcaccatca 2940

acctgcactt catgttcact ggacccactg acgcgaaagc gcgttacatg attgcatacg 3000

ccccccctgg catggagccg cccaaaacac ccgaggcggc cgctcactgc attcatgcgg 3060

agtgggacac agggttgaac tcaaaattca cattttcaat cccttacctt tcggcggctg 3120

actacgcgta caccgcgtct gactccgcgg agaccacaaa cgtgcaggga tgggtttgcc 3180

tgtttcaaat cacacacggg aaggctgacg gcgacgcgct ggtcgttcta gctagtgccg 3240

gtaaggactt tgaactgcgt ttgccagttg atgctcgcac gcagaccacc tctacaggtg 3300

agtcggctga ccccgtaact gccaccgttg aggactacgg tggtgagaca caggtccaga 3360

gacgccagca cacggatgtc tcgttcatac tagacagatt tgtgaaagta acaccaaaag 3420

accaaatcaa tgtgttggac ctgatgcaaa cccctgcaca cactttggta ggcgcgctcc 3480

tccgtactgc cacttactac tttgcagatc tagaagtggc agtgaaacac gaggggaacc 3540

ttacctgggt cccgaatggg gcgcccgagg cagcattgga caacaccacc aatccaacgg 3600

cctaccacaa ggcgccgctc acccggcttg cactgcctta cacggcacca caccgtgtct 3660

tggctactgt ttacaacggg aactgtaagt acggcaagag ccccgtggcc aacgcgagag 3720

gtgacctgca agtgttgacc ccgaaggcgg caagaacgct gcctacctcc ttcaattacg 3780

gcgccatcaa agccactcgg gtgactgaac tgctttaccg catgaagagg gccgaaacgt 3840

actgcccccg gcctcttttg gctattcacc cgagcgaaac tagacacaaa caaaagattg 3900

tggcgcctgt gaagcagctt ttgaattttg atctgctcaa gctggcagga gacgttgagt 3960

ccaaccctgg acccttcttc ttcgctgacg tcaggtcaaa tttttccaag ctggttgaga 4020

ccatcaacca aatgcaggag gacatgtcaa caaaacacgg acccgacttt aaccggttgg 4080

tgtctgcgtt tgaggaactg gccgctggag tgagggctat caggactggt ctcgacgagg 4140

ccaaaccctg gtacaagctc atcaagctac tgagccgcct gtcatgcatg gccgctgtag 4200

cagcacggtc aaaggaccca gtccttgtgg ccatcatgct ggctgacacc ggtctcgaga 4260

tcctggacag tacctttgtc gtgaagaaga tctccgactc gctctccagt ctctttcacg 4320

tgccggcccc cgtcttcagt ttcggagccc cgattttgtt ggccgggttg gtcaaggtcg 4380

cctcgagttt cttccggtcc acgcccgaag accttgagag agcggagaaa cagctcaaag 4440

cacgtgacat caatgacata ttcgccattc tcaagaacgg cgagtggctg gtcaagctga 4500

tccttgccat ccgcgactgg atcaaggcat ggatcgcctc agaggaaaag tttgtcacca 4560

tgacagacct ggtgcccggt atccttgaaa agcagcggga tctcaacgac ccaagcaagt 4620

acgaggaggc caaggagtgg ctcgacaacg cgcgccaagc gtgtttgaag agcgggaaca 4680

tccacatcgc aaacctttgc aaagtggctg ccccagcacc cagcaggtcg aggcccgaac 4740

ccgtggtcgt ttgccttcgt ggcaaatcag gccagggcaa gagtttcctt gcgaacgtgc 4800

ttgcacaagc aatttcaacc cacttcactg gcagaaccga ttcagtttgg tactgcccac 4860

ctgaccctga ccacttcgac ggttacaacc agcagaccgt tgtagtaatg gatgacctgg 4920

gccagaaccc cgacgggaag gactttaagt acttcgccca aatggtttca actacggggt 4980

ttatcccgcc catggcttca cttgaggaca aaggcaaacc tttcaacagc aaggtcatca 5040

tcgccaccac caacctgtac tcgggcttca ccccgagaac tatggtgtgc cctgatgcgc 5100

tgaaccggag gttccacttt gacatcgacg tgagcgctaa ggacggatac aaaattaaca 5160

acaaattgga catcatcaaa gctcttgaag acacccacac caacccagtg gcaatgtttc 5220

aatacgactg tgcccttctc aacggcatgg ccgttgaaat gaagagaatg caacaagaca 5280

tgttcaagcc tcaaccgccc ctccagaacg tctaccagct tgttcaggag gtgattgacc 5340

gggtcgagct ccacgaaaag gtgtcgaacc acccgatctt caagcagatc tcaattcctt 5400

cccaaaaggc tgtgctgtac tttctcattg agaagggcca gcacgaagca gcaattgaat 5460

tctttgaggg gatggtgtgt gactccatta aggaggagct ccggccccta atccaacaga 5520

cctcatttgt gaagcgcgct tttaagcgcc tgaaggaaaa ctttgagatt gtcgctctgt 5580

gtttgaccct tttggcgaac atagtgatca tgatccgcgg gactcgcaag agacagcaga 5640

tagtggacga tgtagtggac gagtacactg agaaggcaaa catcgccacg gatgacaaga 5700

ctcttgacga ggcggaaaag aaccctctgg aggccagtgg tgccaccact gttggtttca 5760

gagagaaaac tctcccggga cacaaggcgg gtgatgacgt gagctctgag cccgccgaac 5820

ccgtggaagg gcaaccacag gctgaaggac cctacaccgg tccactcgag cgtcaaaaac 5880

ctctgaaagt gagagccagg ctcccacagc aggaggggcc ctacgctggc ccgatggaga 5940

gacagaaacc gctgaaagtg aaagtgaaag ccccggtcgt taaggaagga ccttacgaag 6000

gaccggtgaa gaaacctgtc gctctgaaag tgaaagcaaa gaacttgatt gtcactgaga 6060

gtggtgctcc cccgactgac ttgcaaaaga tggtcatggg caacaccaag cctgttgagc 6120

tcatcctcga cgggaagacg gtggccatct gctgcgccac cggagtgttt ggtaccgcct 6180

accttgttcc tcgccatctt ttcgcagaga agtacgacaa gatcatgttg gacggcagag 6240

ccatgacaga cagtgactac agagtgtttg agtttgagat taaagtgaaa gggcaggaca 6300

tgctctcgga cgccgcgctc atggtgctcc accgtgggaa tcgcgtgcgg gacatcacga 6360

agcacttccg tgatgtggca agaatgaaga aaggcacccc cgtcgtcggc gtggtcaaca 6420

acgctgatgt tgggagactg atcttctctg gtgaggccct tacctacaag gacattgtag 6480

tgtgcatgga cggagacacc atgcccggtc tcttcgccta caaagccgcc accaaggcgg 6540

gttactgtgg aggagccgtt cttgcaaagg acggagccga gactttcatc gtcggcactc 6600

actccgcagg cggcaacgga gttggctact gctcgtgcgt ttccaggtct atgctgctaa 6660

aaatgaaggc acacatcgat cccgaaccac accacgaggg attgatagtt gacaccagag 6720

atgttgagga gcgcgtacat gtcatgcgca aaaccaagct cgcacccacc gtggcatacg 6780

gtgtattcaa ccccgaattt gggcctgccg ccttgtccaa ccaggacccg cgcctgaatg 6840

aaggggttgt cctcgatgaa gttatcttct ctaaacacaa ggaaaacaca aagatgtctg 6900

aggaggacaa agcgctgttc cgccgctgtg ctgctgacta cgcgtcccgc ctgcacagcg 6960

tgctgggtac ggcaaacgcc ccactgagca tttacgaggc aattaagggt gtcgacggac 7020

ttgacgccat ggaaccagac accgcgcctg gcctcccctg ggccctccag gggaaacgcc 7080

gtggtgcgct cattgacttc gagaacggca ctgtcggacc cgaggttgag gctgctttga 7140

agctcatgga gaaaagagag tacaagtttg tatgccagac ctttctgaag gacgagatcc 7200

gtccgatgga aaaggtacgt gccggtaaga ctcgcattgt cgacgtcctg cctgttgaac 7260

acattcttta caccaggatg atgattggta gattttgcgc tcaaatgcac tcaaacaacg 7320

gaccgcaaat tggttcggcg gttggttgta atcctgatgt tgattggcaa agatttggca 7380

cgcactttgc tcagtacaaa aacgtgtggg atgtggacta ttcggccttt gacgccaacc 7440

actgtagtga tgcaatgaac atcatgtttg aggaggtgtt caacacggat ttcggtttcc 7500

acccaaacgc tgagtggatc ttgaaaactc tcgtggacac tgaacacgcc tatgagaaca 7560

aacgcatcac tgttgaaggc gggatgccgt ctggttgttc cgcgacaagc atcatcaaca 7620

caattttgaa caacatctac gtgctctacg ccttgcgcag acactatgag ggagttgagc 7680

tggactctta caccatgatc tcctacggag acgacatcgt ggttgcaagt gatcacgatc 7740

tggactttga ggccctcaag cctcacttca aatcccttgg tcaaaccatc actccagctg 7800

acaaaagtga caaaggtttt gttcttggtc actccattac cgatgtcact ttcctcaaaa 7860

gacacttcca catggactat ggaactgggt tttacaaacc tgtgatggct tcgaagaccc 7920

tcgaggctat cctctccttt gcacgtcgtg ggaccataca ggagaagttg atctccgtgg 7980

caggactcgc cgtccactct ggacctgatg agtaccggcg tctctttgag cctttccagg 8040

gcctcttcga gattccaagc tacagatcac tttacctgcg ttgggtgaac gccgtgtgcg 8100

gtgacgcata atccctcaga tgtcacaact ggcagaaaga cgttgaggcg agcgacgccg 8160

taggagtgaa aagtccgaaa gggcttttcc cgcttcctat ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa 8220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 8262

<210> 2

<211> 2208

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

ggtgccgggc aatccagccc ggcgactggg tcgcagaacc agtcaggtaa cactggaagc 60

attatcaaca attactacat gcagcagtac cagaactcca tggacacaca acttggtgac 120

aacgctatta gtggaggctc caacgagggg tccacggaca ccacctccac ccacacaacc 180

aacacccaaa acaacgactg gttttcaaag ctagccaatt ctgcttttag cggtcttttc 240

ggcgctcttc tcgctgacaa gaaaaccgag gagaccactc ttcttgagga ccgcatcctc 300

actacccgca acgggcacac gacctcgaca acccagtcaa gcgttggagt cacttacggg 360

tacgcgacag ctgaggactt tgtgagcgga ccgaacacgt ctgggcttga gaccagggtt 420

gtgcaggcag agcggttctt caaaacccac ttgttcgact gggtcaccag tgacccgttc 480

ggacggtgct acctgctgga actcccaact gcccacaaag gtgtctacgg tagcctaact 540

gactcttatg cttacatgag aaacggttgg gatgtagagg ttactgcagt ggggaatcag 600

ttcaacggag gatgtctgtt ggtggctatg gtaccagaac tttgctctat tgacaagaga 660

gggctttacc aactcacgct cttcccccac cagttcatca acccccggac gaacatgacg 720

gcgcacatca ctgtgccttt tgttggcgtc aaccgctacg accagtacaa ggtacacaga 780

ccttggactc tcgtggtcat ggttgtggcc ccgctgactg tcaacactga aggtgcccca 840

cagatcaagg tttacgccaa catcgcccct actaacgtgc acgtcgcggg tgagctccct 900

tctaaggaag ggatcttccc cgtggcatgt agcgacggtt acggtggcct ggtgaccact 960

gacccaaaga cggctgaccc cgcctacggg aaagtgttca atccacctcg caacatgttg 1020

ccggggcggt tcaccaactt ccttgatgtg gctgaggcgt gtcctacgtt tctgcatttt 1080

gagggtgacg taccgtacgt gaccacaaag acggactcag acagggtgct cgcccagttt 1140

gacttgtctc tggcagcaaa acacatgtca aacaccttcc tggcaggtct cgcccagtat 1200

tacacacagt acagcggcac catcaacctg cacttcatgt tcactggacc cactgacgcg 1260

aaagcgcgtt acatgattgc atacgccccc cctggcatgg agccgcccaa aacacccgag 1320

gcggccgctc actgcattca tgcggagtgg gacacagggt tgaactcaaa attcacattt 1380

tcaatccctt acctttcggc ggctgactac gcgtacaccg cgtctgactc cgcggagacc 1440

acaaacgtgc agggatgggt ttgcctgttt caaatcacac acgggaaggc tgacggcgac 1500

gcgctggtcg ttctagctag tgccggtaag gactttgaac tgcgtttgcc agttgatgct 1560

cgcacgcaga ccacctctac aggtgagtcg gctgaccccg taactgccac cgttgaggac 1620

tacggtggtg agacacaggt ccagagacgc cagcacacgg atgtctcgtt catactagac 1680

agatttgtga aagtaacacc aaaagaccaa atcaatgtgt tggacctgat gcaaacccct 1740

gcacacactt tggtaggcgc gctcctccgt actgccactt actactttgc agatctagaa 1800

gtggcagtga aacacgaggg gaaccttacc tgggtcccga atggggcgcc cgaggcagca 1860

ttggacaaca ccaccaatcc aacggcctac cacaaggcgc cgctcacccg gcttgcactg 1920

ccttacacgg caccacaccg tgtcttggct actgtttaca acgggaactg taagtacggc 1980

aagagccccg tggccaacgc gagaggtgac ctgcaagtgt tgaccccgaa ggcggcaaga 2040

acgctgccta cctccttcaa ttacggcgcc atcaaagcca ctcgggtgac tgaactgctt 2100

taccgcatga agagggccga aacgtactgc ccccggcctc ttttggctat tcacccgagc 2160

gaaactagac acaaacaaaa gattgtggcg cctgtgaagc agcttttg 2208

<210> 3

<211> 736

<212> PRT

<213> artifical sequence

<400> 3

Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn

20 25 30

Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn

35 40 45

Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn

50 55 60

Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe

65 70 75 80

Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu

85 90 95

Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln

100 105 110

Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val

115 120 125

Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu

130 135 140

Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe

145 150 155 160

Gly Arg Cys Tyr Leu Leu Glu Leu Pro Thr Ala His Lys Gly Val Tyr

165 170 175

Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val

180 185 190

Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val

195 200 205

Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Asp Lys Arg Gly Leu Tyr Gln

210 215 220

Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr

225 230 235 240

Ala His Ile Thr Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr

245 250 255

Lys Val His Arg Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu

260 265 270

Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile

275 280 285

Ala Pro Thr Asn Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly

290 295 300

Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr

305 310 315 320

Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro

325 330 335

Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu

340 345 350

Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val Thr

355 360 365

Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser Leu

370 375 380

Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr

385 390 395 400

Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly

405 410 415

Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro Gly

420 425 430

Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His Ala

435 440 445

Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr

450 455 460

Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Ser Ala Glu Thr

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys

485 490 495

Ala Asp Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp Phe

500 505 510

Glu Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Thr Gly

515 520 525

Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asp Tyr Gly Gly Glu

530 535 540

Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp

545 550 555 560

Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu

565 570 575

Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala

580 585 590

Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn

595 600 605

Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr

610 615 620

Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu

625 630 635 640

Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn

645 650 655

Cys Lys Tyr Gly Lys Ser Pro Val Ala Asn Ala Arg Gly Asp Leu Gln

660 665 670

Val Leu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr

675 680 685

Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys

690 695 700

Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Ser

705 710 715 720

Glu Thr Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu

725 730 735

<210> 4

<211> 639

<212> DNA

<213> Foot and Mouth Disease Virus

<400> 4

accacctcta caggtgagtc ggctgacccc gtaactgcca ccgttgagga ctacggtggt 60

gagacacagg tccagagacg ccagcacacg gatgtctcgt tcatactaga cagatttgtg 120

aaagtaacac caaaagacca aatcaatgtg ttggacctga tgcaaacccc tgcacacact 180

ttggtaggcg cgctcctccg tactgccact tactactttg cagatctaga agtggcagtg 240

aaacacgagg ggaaccttac ctgggtcccg aatggggcgc ccgaggcagc attggacaac 300

accaccaatc caacggccta ccacaaggcg ccgctcaccc ggcttgcact gccttacacg 360

gcaccacacc gtgtcttggc tactgtttac aacgggaact gtaagtacgg caagagcccc 420

gtggccaacg cgagaggtga cctgcaagtg ttgaccccga aggcggcaag aacgctgcct 480

acctccttca attacggcgc catcaaagcc actcgggtga ctgaactgct ttaccgcatg 540

aagagggccg aaacgtactg cccccggcct cttttggcta ttcacccgag cgaaactaga 600

cacaaacaaa agattgtggc gcctgtgaag cagcttttg 639

<210> 5

<211> 213

<212> PRT

<213> Foot and Mouth Disease Virus

<400> 5

Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

1 5 10 15

Asp Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val

20 25 30

Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile

35 40 45

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala

50 55 60

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val

65 70 75 80

Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

115 120 125

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Lys Ser Pro Val Ala Asn Ala

130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro

145 150 155 160

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

165 170 175

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

180 185 190

Ala Ile His Pro Ser Glu Thr Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

195 200 205

Val Lys Gln Leu Leu

210

Claims

1.O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA克隆质粒，其特征在于：其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1所示。

2.按照权利要求1所述的O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA克隆质粒，其特征在于：其微生物保藏编号为：CGMCC NO.6868。

3.用权利要求1或2所述的O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA克隆质粒所拯救的O型口蹄疫病毒突变株。

4.O型口蹄疫病毒耐酸突变株，其特征在于：其携带的衣壳蛋白VP1的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，编码所述衣壳蛋白VP1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

5.O型口蹄疫病毒耐酸突变株，其特征在于：其携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示,编码所述衣壳蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

6.O型口蹄疫病毒耐酸突变株衣壳蛋白VP1，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNo.5所示，编码所述衣壳蛋白VP1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1或2所述的O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆在制备预防或治疗口蹄疫疫苗或药物中的用途。

8.权利要求3所述的O型口蹄疫病毒突变株在制备预防或治疗口蹄疫疫苗或药物中的用途。

9.权利要求5所述的O型口蹄疫病毒突变株在制备预防或治疗口蹄疫疫苗或药物中的用途。

10.权利要求6所述O型口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1在制备预防或防治口蹄疫疫苗或药物中的用途。