CN103830115A - 表没食子儿茶素没食子酸脂在保护牙本质方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了表没食子儿茶素没食子酸脂在保护牙本质方面的应用。牙齿保健品中添加茶多酚由来已久，但是因其具体的作用机理尚不明确，且茶多酚有多种结构不同、功效不一的功能成分，这都限制了其应用。本发明中EGCG的应用可以抑制牙本质中MMPs的活性，通过维持牙本质胶原支架的结构达到保护牙本质的作用，目前尚未见此机制作用的相关齿科保健品；EGCG是所有的茶多酚提取物中，唯一的且最有效的抑制MMPs的成分，发明中选择EGCG作为齿科保健品中的有效成分，可以以最低的药物浓度达到最好的治疗效果，并避免可能的副作用。
Description
技术领域
本发明涉及表没食子儿茶素没食子酸脂在保护牙本质方面的应用。
背景技术
口腔微环境复杂，细菌、酶类以及食物等反复、长期的刺激会导致牙齿硬组织结构的损伤。牙本质是不含血管和细胞的组织结构，不能像人体其他硬组织一样自我修复，因为结构中富含有机质和胶原，受到攻击时会快速、进行性的形成大面积缺损。目前用于保护牙本质的保健预防品主要是各种含氟制剂，通过诱导再矿化提高牙本质的耐脱矿能力发挥作用。近年来的研究发现，牙本质的胶原纤维网结构，是提高牙本质的耐脱矿能力、维持牙本质结构完整的一个天然屏障。牙本质中包含了大量的基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinases，MMPs)，MMPs的激活是牙本质胶原降解的必须过程，采用有效的MMPs抑制剂，通过抑制MMPs的活性来保护牙本质胶原，是一条可有效保护牙本质结构的新途径。
没食子儿茶素没食子酸脂(Epigallocatechingallate，EGCG)是从中国绿茶中提取的茶多酚的主要活性成分，EGCG是一种有效的MMPs抑制剂，因此EGCG具有抑制胶原降解和提高牙本质耐脱矿能力的作用，目前国内尚未见到其应用于齿科保健品的研究或商品。
发明内容
本发明的目的是利用EGCG的生物学特性，有针对性的通过靶向抑制牙本质中MMPs的活性，起到提高牙本质耐脱矿能力、保护牙本质的目的，EGCG可应用于开发牙膏、漱口水等齿科保健类产品。
表没食子儿茶素没食子酸脂其结构式如下：
分子式为C22H18011，分子量为458.4克／摩尔。
所述的表没食子儿茶素没食子酸脂在保护牙本质方面的应用。
表没食子儿茶素没食子酸脂通过单独或与一些含氟制剂合用作为保护牙本质的齿科保健品。
本发明的有益效果是：牙齿保健品中添加茶多酚由来已久，但是因其具体的作用机理尚不明确，且茶多酚有多种结构不同、功效不一的功能成分，这都限制了其应用。本发明中EGCG的应用可以抑制牙本质中MMPs的活性，通过维持牙本质胶原支架的结构达到保护牙本质的作用，目前尚未见此机制作用的相关齿科保健品；EGCG是所有的茶多酚提取物中，唯一的且最有效的抑制MMPs的成分，发明中选择EGCG作为齿科保健品中的有效成分，可以以最低的药物浓度达到最好的治疗效果，并避免可能的副作用。
附图说明
图1是不同浓度EGCG对牙源性MMPS的抑制作用
图2是本发明的一个实施例的pH循环流程图
图3是本发明的一个实施例的PH循环后各处理组的表面超微结构(SEM，×1000，×5000，×20000倍)
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本具体实施包括如下步骤：
1)确定EGCG抑制牙本质中MMPs的有效浓度
每个样本称取0.2g牙本质粉，用1ml10％磷酸在4℃下脱矿6小时，3000rpm／2min4℃离心后弃掉上清液，牙本质粉用1ml100mMTris-HCl冲洗，3000rpm／2min4℃离心后弃掉上清液，重复3次，然后加入250μl十二烷基硫酸钠(SDS)溶液[100mMTris-HCl(pH6.8)，4％SDS，20％甘油]从脱矿的牙本质粉中提取出MMPs，14000rpm／10min4℃离心后提取上清液备用。首先向96孔板中每孔加入100μl的提取液，随机分为6组(n=36)，分别添加80μl不同浓度的EGCG溶液(100μg／ml，200μg／ml，300μg／ml，400μg／ml)，去离子水(阴性对照组)，和0.2％CHX(阳性对照组)，然后向每孔中加入20μl荧光胶原底物(100μg／ml)。震荡30秒后，用酶标仪在时间点为0、2、4、8、12、24、36、48小时检测其荧光值强度，实验结果见图1。
2)确定EGCG具有提高牙本质耐脱矿能力的作用
截取人冠中部的牙本质，制备2mm×2mm×4mm大小的牙本质试件20个，自凝塑料包埋试件，并使牙本质块靠近牙釉质的表面暴露在外不包埋。在流水降温下依次用600、1200、1500、2000、2500、3000目碳化硅砂纸以120转／分的速度打磨牙本质面光滑平整，确保试件上下表面平行，并以0.3μm粒度的抛光膏抛光表面。在每个试件牙本质表面预留2mm×2mm大小的开窗区。将打磨抛光好试件随机分为两组，每组10个，一组为阴性对照组，用去离子水处理，实验组根据确定的有效浓度选择400μg／ml乙醇溶液用作表面处理，各组试件在37℃条件下如图2所示进行pH循环(脱矿处理)，每天循环2次，共6天。循环结束后收集各试件的总的酸性脱矿液，采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(inductively-coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES)测定酸性缓冲液中钙离子浓度，并按照以下公式计算每个试件在单位酸性脱矿液中的单位时间内单位面积的钙释出率(calcium depletion rate，CDR)：CDR＝脱矿液中钙含量(μg)／酸处理时间(h)×脱矿面积(mm2)，钙释出率越高，说明试件的耐脱矿能力越低，实验结果显示与对照组相比(钙释出率2.93±0.18μg／h mm2)，EGCG处理可以显著提高牙本质的耐脱矿能力(钙释出率1.52±0.24μg／h mm2)。
实例一
EGCG与传统含氟制剂对牙本质耐脱矿能力作用的比较
截取人冠中部的牙本质，制备2mm×2mm×4mm大小的牙本质试件50个，自凝塑料包埋试件，并使牙本质块靠近牙釉质的表面暴露在外不包埋。在流水降温下依次用600、1200、1500、2000、2500、3000目碳化硅砂纸以120转／分的速度打磨牙本质面光滑平整，确保试件上下表面平行，并以0.3μm粒度的抛光膏抛光表面。在每个试件牙本质表面预留2mm×2mm大小的开窗区。采用维式硬度计应用50g力维持15s测定开窗区表面显微硬度(SurfaceMicrohardness，SMH)，每个试件测量5个点，每点相距100μm。计算每个试件的平均SMH，并挑选SMH在(60-80)维氏硬度值(Vickers Hardness Numbers，VHN)范围内的45个试件备用。将45个试件随机分为3组(n＝15)。阴性对照组为去离子水处理，阳性对照组采用0.1％氟化钠(NaF)溶液，实验组采用400μg／ml乙醇溶液。各组试件在37℃条件下如图2所示进行pH循环，每天2次，共6天。PH循环结束后，每组随机选5个试件用场发射扫描电镜观察牙本质表面的超微结构形貌(图3)。每组剩余的10个试件PH循环后再进行显微硬度测试，并计算脱矿前后的显微硬度差值△SMH＝SMH1-SMH2，SMH1及SMH2分别为脱矿前后的显微硬度值，实验结果见表1。
表1：各处理组PH循环前后显微硬度的变化(Mpa，n=15，
注：每一列不同上标字母标记的两组间有统计学差异(P＜0.05)。
综上所述，使用EGCG处理可显著抑制牙本质的显微硬度量的降低，牙本质小管表现为闭锁，牙本质表面及小管内均可观察到大量的矿物质沉积，说明EGCG处理可显著提高牙本质的耐脱矿能力，其作用效果可与传统的NaF溶液相当(△SMH无显著性差异，SEM下超微结构类似)。NaF是一种效果公认的牙本质再矿化液，是通过表面氟离子与牙本质中游离的钙离子结合达到牙本质再矿化保护牙本质的作用，EGCG通过抑制牙本质中MMPs的活性可以达到与NaF相当的保护牙本质的作用，提示其单独或与一些含氟制剂合用作为保护牙本质的齿科保健品具有可靠的效果及广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140604 |