CN103826662A - 评估急性肾损伤等级的方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供诊断和预后哪些表现正常水平的尿钠肽的主体是否具有心衰和肾衰。本发明也提供一种评估具有AKI的主体是否敏感为AKI阶段的方法。本发明也提供一种评估具有CKD的主体是否敏感为CKD阶段的方法. 本发明部分涉及到：基于，至少部分基于从主体中体液样本中的WAP4C的测定结果来评估心衰和或肾衰和或危险的结果（例如心或肾功能的恶化或者死亡的危险）。

Description

评估急性肾损伤等级的方法和试剂

本申请要求了申请号为61/504,844，2011年7月6日申请的美国临时专利申请的优先权，其完整的内容作为参考被包含在本申请中。

技术领域

本发明涉及与心脏衰竭和或肾衰竭有关的检测方法、检测组分、诊断试剂盒、预后和监测。本方法也涉及一种方法、组分，和试剂用于评估具有急性肾损伤（AKI）的主体具有容易发展为更恶化级别AKI的可能性。

背景技术

接下去讨论的本发明的背景仅仅用来帮助读者理解，而不是本发明的描述或组成本发明的现有技术。

心力衰竭

充血性心力衰竭（CHF）是一种致命的疾病，它具有5年死亡率，是死亡率最高的恶性疾病。例如，在心脏研究的危险评分中，心力衰竭发作后的生存中值是，男人1.7年，女人3.2年。总的来说，第一年和第5年的存活率分别是男人57%和25%，女人64%和38%。此外，40岁或更大年纪的人在1/5的生命时间内有机会患上充血性心力衰竭。心力衰竭典型的发生在其他损失心脏的情况发生后。冠状动脉疾病、特别是心肌梗死是最普遍的心脏疾病，也最常见的引起心力衰竭的疾病。

对患有心力衰竭病人的适当的治疗方式是多种多样的。如：利尿剂常用来监视心力衰竭增加的流体负载特性；血管紧张肽转化酶（ACE）抑制剂是一类血管扩张药用来降低血压，促进血液流动和减少心脏工作负荷；血管紧张素II受体阻断剂（ARBs）与ACE抑制剂一样有很多相同的作用；β阻断剂可以减少心力衰竭症状并改善心脏功能。

近些年，利尿钠肽测定已经戏剧性的改变了心脏疾病的诊断和管理方式，包括心力衰竭和急性冠状动脉综合症。特别是B型钠尿肽（BNP，人类前体Swiss-Prot P16S60），各种起源于共同前体ProBNP（如NT-ProBNP）相关多肽，和ProBNP本身已经被用于诊断心力衰竭，确诊严重程度，预测病情。另外，BNP和它的相关多肽也被用来展示对不稳定型心绞痛、非ST升高的心肌梗死和ST-升高的心肌梗死的诊断和预测。

BNP和它的相关多肽也被用于其他心脏状态的检测，如纽约心脏协会。然而很多具有慢性稳定无症状心力衰竭病人的钠尿肽水平会在正常诊断范围内（如BNP水平少于约100pg/mL；NT-proBNP水平少于约400pg/mL）。对这些标记有一个权衡选择诊断临界水平，因为降低临界值虽然减少了假阴性率（如，增加敏感性和减少漏诊率）但却增加了假阳性率（如减少特异性和增加误诊率）。

肾衰竭和肾病

肾脏的衰竭或肾衰（有时被称为肾功能不全）指一种医学上的身体状态的描述，在此状态下，肾脏不能有效地过滤来自血液的毒素和废物。肾衰竭分为急性（急性肾损伤）和慢性（慢性肾病）两种；很多其他疾病或健康问题可以引起2种肾衰竭中的任意一种发生。

肾衰竭被描述为肾小球滤过率减少。从生物化学角度，肾衰竭通常可以通过血清肌酐水平的升高来进行检测。在肾功能不全经常遇到的问题包括不正常的体液水平，失调的酸水平，非正常钾、钙、磷酸盐，和（长期）的贫血，也包括骨折的延期愈合。不同情况下，可以会发生血尿（血液流失在尿里）和蛋白尿（蛋白流失在尿里）。长期肾问题会对其他疾病发生严重的影响，如心血管疾病。

最近，慢性肾衰竭（CKD）已经被认为是一种美国重要公共健康问题。直到过去几年，肾衰竭，渐进式发展为肾脏疾病的晚期，已经成为CKD的最明显的结果。美国肾脏数据服务（USRDS）对进行透析和移植的肾病晚期,又称为肾病晚期（ESRD）的肾衰竭病人持续统计分析。结果显示，自1990年开始，在美国ESRD的发病率已经翻了一倍。虽然以较低的速度发展，但是这一趋势很可能继续下去。更早阶段的慢性肾衰竭（CKD）的发生率被推断出来。基于第三次全国健康和营养调查（NHANES III）的数据，在美国有8,000,000人的肾功能显著下降，他们被估计肾小球滤过率（GFR）小于60毫升/分钟/1.73平方米。

更多有肾损伤临床表现（特别是蛋白尿）的人没有明显的肾功能下降。按照目前每年100,000个E新SRD病例的发病率，显然大多数有CKD的病人没有发展成为ESRD，但很多却变成心血管病人，这也是哪些处于晚期肾病（ESRD）患者持续透析后死亡的主要原因。

目前还没有治愈慢性肾病的方法。治疗的目标是：减缓疾病的进展；治疗潜在的诱因和诱发因素，治疗疾病的并发症，并进行肾脏的移植能。减缓慢性肾病的进展和诱因的策略包括：控制血糖，高血压控制，和饮食。

在肾脏病终末晚期，肾功能只能靠透析或肾移植来替代，透析和移植计划，通常开始于慢性肾脏病的第4阶段。大多数患者都是采用血液透析和腹膜透析。

最近，基于估计的肾小球滤过率以及尿蛋白与肌酸酐的比率，并结合慢性肾病标记物肌酸酐与具有生物标志物半胱氨酸蛋白酶抑制剂C相结合，用来提供末晚期肾病和其他全因死亡的预测预报。

目前，基于被估算的肾小球滤过率（eGFR）或尿白蛋白与肌酐的比率（ACR）上的肌酸酐，慢性肾病（CKD）被定义为5个独立阶段。尽管因为这几个因素，血清肌酐可能会对个体产生误判，但是临床检验会定期报告估计的GFR值和电子病案也会单独提醒临床医生在估计的GFR中的CKD的存在。因为，常规的ACR的评估只是对糖尿病的人采用，在常规的操作规程中，初步的CKD的检测也局限于对血清肌酸酐的测试。作为肾功能的标记物质的血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（cystatin C）也不是临床实践中常规使用的标记物质。

根据肾脏词义上理解的作用和表观功能，CKD被CKD执行委员会定义为几个阶段（见《美国肾病杂志》39（2）增刊1（2月）2002，S17-S31）（见：AmericanJournal of Kidney Diseases,Vol39,No2,Suppl1(February)2002,ppS17-S31）。其全部内容作为本发明的参考。

一些发明者已经识别了一些标记物质，这些标记物质可以被用来对患有或被怀疑可能患有心脏和/或肾衰竭病人的进行诊断和风险分级；进一步对被诊断为CKD的病人进行CKD恶化等级的风险评估。

发明内容

本发明包括对患有或估计可能正在发展为心脏和/或肾衰竭的主体提供诊断、预后和治疗方案确定的方法、提供诊断、预后和治疗方案确的检测组分和试剂盒。在另一方面，本发明提供评估心脏衰弱和/或肾衰竭恶化风险等级的方法；评估与心脏和/或肾衰竭情况下再次住院的风险的方法；评估与心脏和/或肾衰竭的情况下死亡率的风险的方法，监控心脏和/或肾衰竭的方法；和适用于这些方法的各种装置和试剂盒。

在第一个具体的实施例中，本发明包括对主体风险分级的方法（如评估出一个风险结果）。这些方法包括进行从主体获得的体液样品中的WAP四二硫化物核心域蛋白2（又称为“WAP4C”和”HE4”；人类前体Swiss-Prot entry Q14508）的测试分析，然后提供一种或多种检测结果；基于获得的检测结果获得一个风险结果。

在某个实施例中，每一个检测结果与相应的基线水平进行比较（例如，一个诊断的或预后的“临界值”），基线水平被作为得出“阳性”或“阴性”结果的水平。本领域的熟练技术人员可以使用各种方法获得期望的基线水平值。在进一步的优选的实施例中，基线检测结果是可以从同一个主体更早的检测结果中获得。也就是说，即经过一段时间，生物标记浓度会改变，和，浓度的增加表示主体心脏和/或肾衰竭的发作或恶化的开始。

在可选择的实施例中，基线检测结果是从很多主体人群中测定获得的。在使用本发明标记物质作为诊断的情况下，这些人群可以包括许多患有心脏和/或肾衰竭的主体，和许多不患有心脏和/或肾衰竭的主体；在利用标记进行预后测试的时候，这些人群可能包含患有很多结果（如心脏和/或肾死亡；心脏和/或肾衰竭恶化；心脏和/或肾衰竭改善等结果）的主体，但是有些主体却没有这些结果。如下面所述，被选定的临界值是一个特异性和灵敏性的可接受值，相对于没有表现出这些属性的“第二”类亚群，用这个值可以把人群区分为展现具有特定属性的“第一”类亚群（如心脏和/或肾衰竭恶化风险增加）。正如下的描述，通过一次或多次精度测试，一个优选的临界值能够区分出第一和第二亚群：

让步比（odds ratio）至少约2或更大，或约0.5或更小，更优选的至少约3或更大，或约0.33或更小，更优选的，至少约4或更大，或约0.25或更小，甚至更优选的至少约5或更大或约0.2或更小，最优选的至少约10或更大，或约0.1或更小；

至少75％的敏感性，并结合至少75％的特异性；

ROC曲线面积至少是0.6，更优选的是0.7，还更优选的是至少0.8，甚至更优选的是至少0.9，最优选的至少是0,95，和/或，

阳性似然比（likelihood ratio）（计算方式为：灵敏度/（1-特异性））至少为5，更优选的至少为10，并且最优选的至少为20，或阴性似然比（计算方式为（1-灵敏度）/特异性）小于或等于0.3，更优选小于或等于0.2，最优选的小于或等于0.1。术语“大约”一词在此上下文中是指给定测量的正负5％。

当前所述的风险分级方法更优选的是评估心脏衰竭和/或肾衰竭或心血管死亡率的“近期”风险。“近期”指30天内。下面所描述的方法更优选的是设定7天内的风险，更优选的是在5天内，甚至更优选的是在3天内。

优选的检测方法包括用来检测靶生物标记的免疫测定。在检测过程中使用的抗体可以特异结合靶标记物，如下面所述的与相关的标记物有关，抗体可以随意的结合一个或多个与标记物“相关”的多肽。本领域里的一般技术人员知晓，虽然并不要求用固相形式来进行检测，但是免疫测定可以包括让体液样品与包含抗体的固相接触用来检测靶标记物，和，检测与抗体的结合。虽然本发明是在免疫测定方面进行了一般性地描述，但是不是基于免疫结合的方式的其它结合方式（例如，核苷酸适配体）也可以用来代替抗体结合方式进行检测。优选地，所述体液样品从尿，血液，血清和血浆组合中进行选择。

这里所述的，在单独使用WAP四硫化物核心域蛋白2的时候，不是有意限制预后评估必须唯一根据WAP四硫化物核心域蛋白2的检测结果来进行。相反，本领域技术人员将会理解，诊断，预后，监控等等也会考虑是很多其他的临床变量，可如下文所述，如果在诊断过程中检测结果被认为是变化的；即，这些测定结果被用于评估受试主体具有增加或减少患有心脏和/或肾衰竭的概率。如下文的详细描述，组合检测各种标记（均包括源于主体和物理特性）的测定方法，包括：检测各种利尿钠肽如Β Ν Ρ，NT-proBNP，和proBNP；炎症相关的标记物，如髓过氧化物酶，可溶性FLT-1，C-反应蛋白和胎盘生长因子；相关的心肌损伤标记，如心脏肌钙蛋白和CK-MB；肾损伤标记，如血清肌酸酐，肌酸酐清除率，胱抑素C，和肾小球滤过率；和其他变量，如尿输出水平，年龄，存在或不存在各种心血管疾病的危险因素，如糖尿病，高血压，体重，吸烟状况，等等。

在另一个实施例中，本发明包括用于监测心脏和/或肾脏疾病的方法，特别是针对一个患有心脏和/或肾功能的衰竭的患者。这些方法包括用于检测从受试者获得的连续采集的体液样品中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的测试，从而提供了多个测定结果。如果这些一个或多个检测结果随着时间的增加而增加，患者可能会被评估为心脏和/或肾脏疾病状态的恶化。可选择的，如果这些一个或多个测定结果是随时间下降，患者可能会被评估为心脏和/或肾脏疾病状态的改善。

在一些实施例中，在检测装置中提供执行该检测的试剂，该检测装置也被包括在一个试剂盒中。优选的试剂包括一种或多种固相的抗体，该固相抗体包括检测被捕获到固体支撑物上的靶标记物质的抗体。在三联体免疫检测中，该试剂可以包括一种或多种可检测的带有标记的抗体，可检测的带有标记的抗体包括一抗体，该抗体可以检测结合到可被检测标记物上的靶标记物质。在检测装置中提供的其他可选元素如下文所述。

在其他一些实施例中，本发明包括评估主体肾功能的方法，该方法包括检测从主体中获得体液样品中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2，然后提供一个检测结果；让检测结果与主体或患者的肾功能相关联。

在另一个实施例中，本发明包括对怀疑具有肾损伤的主体进行肾功能评估的方法；包括：从所述的主体中获得的生物样品中进行检测WAP四二硫化物核心域的蛋白2的数量；和让WAP四二硫化物核心域的蛋白2的数量与主体的肾功能相关联。

在一些实施例中，相关的或相关联的步骤包括确定WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度和让所述浓度与主体的急性肾损伤的出现或不出现相关联。在实施例中，相关联的步骤包括当WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度大于WAP四二硫化物核心域的蛋白2的预设值或临界值时，给出主体会发生急性肾损伤的结果，或，当WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度小于WAP四二硫化物核心域的蛋白2的预设基线时，给出主体没有发生急性肾损伤的结果。在其他实施例中，预设的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的基线浓度是通过一个检测方法来决定的，这个检测方法就是检测从上述患者中获得液体样品中WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度，但是基线检测结果所使用的体液样品要比提供检测结果的液体样品采集时间要更早。在一些实施例中，预设的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的基线浓度是从患有急性肾损伤的第一主体人群和不患有急性肾损伤的第二主体人群中获得的。

在一些实施例中，使用至少为2或更多，或，0.5或更少的让步比，预设的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的基线浓度能把第一人群从第二人群中区分出来。

在一些实施例中，使用至少为3或更多，或0.33或更少的让步比，预设的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的基线浓度能把第一人群从第二人群中区分出来。

在一些实施例中，使用至少为70%的特异性，预设的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的基线浓度能把第一人群从第二人群中区分出来。

在一些实施例中，使用至少为70%的灵敏度，预设的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的基线浓度能把第一人群从第二人群中区分出来。

在一些实施例中，体液样品选自尿液、血液、血清和血浆。

在某些实施方案中，WAP四二硫化物核心域的蛋白2极限值浓度为约15钠克/毫升至约25钠克/毫升之间。在其它实施例中，WAP四二硫化物核心域的蛋白2极限的浓度为约20.2钠克/毫升。

在某些实施方案中，WAP四二硫化物核心域的蛋白2极限值浓度通过测定生物样品中的蛋白浓度来进行测定的。在某些具体实施方式中，蛋白的水平通过ELISA的方法进行测定。

在某些实施方案中，WAP四二硫化物核心域的蛋白2极限值浓度通过测定生物样品中的编码WAP四二硫化物核心域的蛋白的mRNA来进行测定的。在某些具体实施方式中，mRNA的水平通过RT-PCR的方法进行测定。

在另外的一些实施方式中，本发明提供评估主体肾功能的方法，该方法包括：

a.从主体上获得生物样本；

b.测定生物样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度；

c.把测定的样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度与WAP四二硫化物核心域的蛋白2的极限浓度进行比较；

d.如果样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度在某种极限浓度范围内，则确定主体是否具有肾损伤的可能性。

在另外的一些实施方式中，本发明提供检测主体WAP四二硫化物核心域的蛋白2的极限值浓度的方法，该方法包括：

a.从主体上获得生物样本；

b.测定生物样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度；

c.把测定的样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度与WAP四二硫化物核心域的蛋白2的极限值浓度进行比较；

d.如果样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度在某种极

限浓度范围内，则确定主体是否具有肾损伤的可能性。

在一些实施例中，本方法进一步包括对上述患者测定BNP,NT-proBNP,proBNP,髓过氧物酶，可溶性FLT-1，C反应蛋白，心肌肌钙蛋白，NGAL，血清肌酸酐，肌酐清除率，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，和肾小球滤过率组合中的一个或多个标记物质的变量。

在一些实施例中，本方法还进一步包括测定上述患者的尿排出量，年龄，存在或不存在糖尿病，和存在或不存在高血压中一个或多个附加的变量。

在某些实施方案中，急性肾损伤的标记物的浓度为约15钠克/毫升至约25钠克/毫升之间，或，约17钠克/毫升至约22钠克/毫升之间。在其它实施例中，急性肾损伤的标记物的浓度为约20.2钠克/毫升。

另一个方面，本发明包含一个试剂盒，该试剂盒中包含用于测试WAP四二硫化物核心域的蛋白2的试剂，和一个装置，该装置包括用于校正上述测试结果为WAP四二硫化物核心域的蛋白2浓度的编码的校正曲线，其中上述校正曲线的浓度范围包含正常的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度和用于诊断急性肾损伤的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的临界值浓度。

在另一些实施例中，本发明提供一种用来对患有CKD的主体评估达到CKD更高级别的可能性增加的方法，该方法包括：从上述主体获得体液样品；对上述样品进行一种或多种检测，测定与CKD等级有关的一个或多个生物标记，从而提供一个或多个检测结果；基于检测结果评估出上述主体具有CKD级别的增加或减少的可能性。

在一些实施例中，与CDK级别有关的一个或多个生物标记物从下列组中进行选择，这些标记物质为TNFR1a,Troy,NT-proCNP,NGAL1621-99741,RAGE,半乳糖凝集素-3,WAP4C,血管生成素,ESAM,和PIGR。

在实施例中，评估步骤包括：把获得的每一检测结果与相应的临界水平比较；当检测结果大于临界水平时，相对于当检测结果小于临界水平时，被评估的风险性来讲，给出主体具有CDK级别增加的可能性，或者，当检测结果小于临界水平时，相对于当检测结果大于临界水平时候，被评估的风险性来讲，给出主体具有CDK级别降低的可能性。

在一些实施例中，临界值水平是从诊断患有CDK和哪些怀疑可能达到CDK更高级别的第一主体人群中获得，和，临界水平是被选择可以从未患有CDK的第二人群中区分出上述人群。

在实施例中，从所述的第二人群中区分出所述的第一人群的临近值的让步比值比至少为2或更多或0.5或更少。

在实施例中，从上述第二人群中区分出上述第一人群的临界值的让步比的比值比至少为3或更多或0.33或更少。

在实施例中，体液样品选自尿液、血液、血清和血浆组合。

在另一个实施例中，本发明提供一种评估以前就诊断出患有CDK的主体具有CDK等级增加的可能性的方法，该方法包括：对从上述主体中获得的体液样品进行一个或多个CDK等级相关的生物标记的检测，然后提供检测结果；让检测结果与主体可能的CDK等级相关联。

在实施例中，与CDK等级相关的一个或多个生物标记是选自TNFR1a,Troy,NT-proCNP,NGAL1621-99741,RAGE,半乳糖凝集素-3,WAP4C,和血管生成素中的一种或几种。

在另外的一些实施例中，相关联的步骤包括：测定一个或多个与CKD等级关联的生物标记浓度，和让上述浓度与主体的CKD等级的可能性相关联。

在实施例中，相关联步骤包括：当与CKD等级有关的一个或多个生物标记浓度大于预设置的CKD等级的生物标记基线值时，评估为CKD等级增加的可能性。

在实施例中，CKD等级有关的生物标记的基线值是采用从体液样品中检测一个或多个CKD等级有关的生物标记物质决定的，所述用于检测基线值的体液样品的采集时间比用于提供检测结果的体液样品采集时间要早。

在一些实施例中，CKD等级的生物标记的预测基线值是由诊断出CKD的第一主体人群和未诊断出CKD的第二主体人群获得的。

在实施例中，体液样品选自尿液、血液、血清和血浆组合。

在实施例中，大于基线值2倍的CKD等级的生物标记水平表示CKD等级增加的可能性。

在实施例中，大于基线值4倍的CKD等级生物标记水平表示CKD等级增加。

在实施例中，从后来样品中获得的上述主体的CKD级别相关的生物标记水平比之前样品中的CKD生物标记水平的增加，说明CKD等级增加的可能性。

在另一个实施例中，本发明提供试剂盒，包括：用于测试与CKD等级相关的一个或多个生物标记物质水平的试剂，和一个装置，该装置包括用于校正上述测试结果为校正结果的编码的校正曲线，其中，上述校正曲线的浓度范围包含正常的与CKD等级相关的一个或多个生物标记物质的浓度和用于评估CKD等级增加的可能性的生物标记物的临界值浓度。

附图说明

图1示例说明了一个Basel V AKI(连续性)的ROC（工作特征曲线）曲线，Dt=0:特异性和敏感性与入院（admission）[WAP4C]的比较，其中，ROC曲线的水平轴代表1-特异性（它的值随假阳性率而增加），曲线的纵轴代表敏感性（值随真阳性率二增加），ROC曲线下面的区域是一种概率性的测定，就是被测定的标记水平能够正确识别疾病或状态的概率性，根据此结果可以测定检测的效果。

详细描述

本发明包括对患有肾衰竭的主体进行诊断、预后和确定治疗方案的方法和组分。

这里所述，本发明部分涉及，基于，至少部分基于，对采自主体的体液样本进行WAP四二硫化物核心域的蛋白2的检测结果来对主体设定或评估一种结果风险（如，肾功能恶化的风险，重住院的风险，和/或死亡的风险）

如果检测的样品是在t时间时从主体上获得的，术语“短期风险”指从t时间开始的7天（168小时）内的时间。这样，风险是指，从t时间开始到168小时结束的窗口时间内，主体将会遭受有一种或多种可测量的肾功能恶化，需要重新住院，或将死亡的可能性。可测量的心脏功能包括以下的一种或多种：呼吸困难（在休息或劳动），端坐呼吸，肺水肿，血氧饱和度水平，头晕或晕厥，胸痛，收缩压，低灌注，水肿，补偿状态（即，从补偿到完全补偿，或反之亦然的变化），倾向-舒张功能，最终收缩功能，心室充盈，流过的MIRAL阀，左室射血分数（LVEF），压力测试，成像的研究成果，如心脏CT，超声，或MRI，纽约心脏协会或美国的结果心内科心脏衰竭的分类等。对这些特征和方法的评议是本领域所熟知的，例《哈里森的内科学》，第16版.麦格劳希尔集团，005,1361-1377（Harrison’s Principles of Internal Medicine,16th ed.,McGraw-Hill,2005,pages 1361-1377），其被完整的列入参考文献中。本条例并不限于此。

更优选的，风险是指，从t时间开始的96小时窗口时间内，主体将会遭受有一种或多种可测量的肾功能恶化，需要重住院，或将死亡的可能。最优选的，风险是，从t时间开始的48到84小时内的窗口时间内，主体将会有遭受一种或多种可测量的肾功能恶化的可能性，或者将死亡的可能性。这里所说的术语“恶化”指，相对于同一主体相同参数以前的测量结果来讲，在之后时间里，该参数的变坏的改变，与“改善”的意思相反。例如，这里所述的“肾功能恶化”指主体从无症状到之后的变化。

这里所述的“标记物”和“生物标记物”指蛋白、多肽、糖蛋白、蛋白多糖、脂肪、脂蛋白、糖脂、磷脂，核酸，碳水化合物，等；或用来从主体上获得样本进行靶标筛查的小分子。本发明作为标记物的“蛋白或多肽”假设可以包括任何片段，特别，是免疫可检测的片段。标记物可以包括临床“指数”如，验前概率评估，肺动脉高压“丹尼尔”（Daniel）指数、NIH中风指数、Elebute和Stoner败血症指数(Elebue and Stoner)、杜克标准感染性心内膜炎、曼海姆腹膜炎指数、阿帕切指数等。

这里所用的术语“WAP四二硫化物核心域蛋白2”、“WAP4C”或“HE4”指来存在于生物样本中来自WAP四二硫化物核心域蛋白2前体的一种或多种多肽。WAP四二硫化物核心域蛋白2的人类前体(Swiss-Prot entry Q14508)具有下列序列（SEQ ID NO:1）：

    10         20         30        40         50         60

PACRLGPLA AALLLSLLLF GFTLVSGTGA EKTGVCPELQ ADQNCTQECV SDSECADNLK

    70         80         90        100        110        120

CCSAGCATFC SLPNDKEGSC PQVNINFPQL GLCRDQCQVD SQCPGQMKCC RNGCGKVSCV

以下的域被识别为WAP四二硫化物核心域的蛋白2:

残基     长度      域名（Domain ID）

1‐30    30       信号序列

31‐124  94       WAP四二硫化物核心域蛋白2

来自WAP四二硫化物核心域蛋白2前体的下列的可选择形式如下：

因为标记物片段的产生是一个持续的过程，他可能是共用的时间之间的一个函数，该时间可以是：触发标记物释放到组织的时间和获得样品或分析样品的这段时间之间，和获得样本的时间和分析样本的时间之间；不同组织的组织样本；储存条件；存在的水解酶的数量等；当同时设计对一种或多种标记物的检测和执行这个检测时，为了提供一个精确的预测或诊断结果，有必要考虑到这些降解因素的影响。另外，个别能从多种标记物片段中区分的抗体可以单独用来分别检测不同片段的存在或数量。这个针对个体的单独的检测可以提供比在单个分析中检测多个片段的结果具有更精确的预测或诊断结果。

这里所用的术语被测物“相关信号的存在或数量”反映了这种理解。通过已知浓度的靶标被分析物质或被测物来制作标准曲线，分析信号与被测物的存在或存在的数量相关联。如同这里所用的术语，如果分析产生一种可检测的信号，则说明存在被测物，或存在与被测物类似生理浓度的被测物，这个测试就”可以被用来进行检测”。

因为抗体的表位在8个氨基酸的序列顺序上，用于检测感兴趣的标记物的免疫检测也会检测与标记物序列有关的多肽，只要这些多肽含有与分析中所用的一种抗体或多种抗体结合的必需表位。

这里所用术语“有关的标记物”是指生物标记物，如这里本发明描述的标记物是指能被检测到的特殊标记物或其生物合成亲本中的一个或多个片段，变体等，它可以代替标记物本身或成为独立的生物标记物。术语也指存在于生物样品中来自生物标记物前体的一种或多种多肽，这种前体可能额外带有一些基团，如结合蛋白、受体、肝素，脂类，糖类等。

就这一点而言，本领域的熟练技工知道获得免疫分析信号是复合物产生的直接结果，复合物是由一种或多种抗体和靶标生物分子（如被测物）和包含与抗体结合的必需表位的多肽形成的。当这种分析检测全长的生物标记物时，测试结果表示为靶标生物标记物的浓度，分析产生的信号实际上是样品中存在的所有这种“免疫活性”多肽作用的结果。除了免疫检测，生物标记物也可以通过分析蛋白（如点杂交，蛋白质印迹，层析法，质谱分析法等）和分析核苷酸（mRNA）的方法来测定。这里所用的技术包括但不限于所列出技术。

最优选的分析是“被配置来检测”一个特定的标记物。“被配置来检测”一种标记物的分析意味着分析过程中能够产生一种可检测信号，这种信号说明存在目标标记物的存在，或存在与目标标记物的生理类似物的存在。在这个分析过程中可以特异地，但并不是必要的，检测分析一种特殊标记物（如检测一种标记物，但不是部分或所有相关标记物）。因为一个抗体表位大约在8个氨基酸上，一个免疫检测可以检测其他多肽（如相关标记物物），只要其他多肽包含与检测使用抗体（多个抗体）相结合的必要表位。其他多肽就是指分析中的“免疫可检测的”，它们可以包括各种亚型（如剪接的变异体）。在三明治免疫分析中，相关标记物必须含有至少2个能与本检测过程中使用的抗体结合的表位，才能被检测到。最优选的免疫检测片段包含至少8个标记物上相临近的残基或与其亲本的相临近的残基。

这里所用的“检测样本”指从目标主体，例如一个病人，获得的用于诊断、预后或评价的体液样本。在实施例中，这个样本可以为了确定持续状态的结果或这种状态的治疗效果而获得。优选的检测样本包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰和胸腔积液。另外，使用本领域的分馏或提纯技术可以让一些检测样本更加容易被分析，例如把全血分成血清和血浆。

这里所用“多数”是指至少为2。优选的多数指至少3，更优选的至少5，更优选的至少10，更优秀的至少15，最优选的至少20。在一个特定实施例中，多数是一个大数字，如至少100。这里所用的术语“主体”指一个人类或非人类的有机体。

因此，本发明描述的方法和组分同时适用于人类和兽类疾病。更优选的本发明适用主体是活的组织时，本发明也可以被用于验尸。优选的主体是“患者”（如正在接受疾病或状态的医疗护理的活的人类）。这包括了那些具有正在调查病原的未定义疾病的人。

这里所用的术语“诊断”指本领域熟练技术人员用来明确或决定一个病人是否患有一种已知疾病或状况的方法。技术工人通常基于一种或多种诊断指标（例如标记物质），如一种标记物的存在、不存在、数量或数量的改变来说明某种状态或疾病的存在、不存在或严重程度。术语“诊断”对患有或没有患有某种特定疾病不具有100%的准确性，或者，甚至在制定的过程中，只是相对于没有发生而给出一个可能发生的结果。实际上，技术人员明白术语“诊断”指主体患某种疾病的可能性的增加。

类似的，预后常常通过监测一种或多种“预后指标”来检测的。在病人（或从病人获得的样品中）存在标记物或标记物的数量表示给出的治疗程序或可能发生的信号指示。

例如从病人采集的样本中一种或多种预后指标达到一个足够高的水平，相比具有低标记物水平值的类似病人来讲，这个水平表示具有高标记物指的病人可能具有更高的患病率或死亡率。预后指标的水平或预后指标水平的改变是指病人“向不好的结果靠近的可能性增加”，反过来也与患病率或死亡的可能性增加有关。

这里所用的术语“关联”或“相关联”与标记物质的使用有关，是指患者存在标记物质或存在标记物质的量与已知患有指定状态或已知处于指定状态风险中的人的存在该标记或存在该标记物质的量比较；或与已知未具有指定状态的人比较。如上所述，患者样品中标记水平可以与已知的特定诊断有关的标记水平进行比较；即，本领域熟练技术人员会用标记物质的水平来测定患者是否患有特异类型疾病的诊断，并做出相应反应。也可选择的，样品的标记水平与已知好的结果（如未患有疾病等）有关的标记水平进行比较。在优选的实施例中，标志水平的轮廓是与一个全局概率或使用ROC曲线的特定结果相关联。

在一个实施例中，这里描述的方法包括把检测结果与相应基线结果进行比较。这里所用术语“基线结果”指用作比较值（也就是说，被用来与检测结果比较的值）的检测值。实际上，这意味着主体样品中的标记物被检测，检测结果与基线结果比较。检测值大于基线值说明诊断或预后的第一种可能性，检测值小于基线值说明诊断或预后的第二种可能性。

本领域人员熟知基线的选择有很多种方式。例如，一种或多种标记（如，在体液浓度，如尿液、血液、血清或血浆中的浓度）数据可以从大量主体中获得。

主体人群被分成至少2个亚群。第一亚群包括那些确认具有某种疾病、结果或更广泛的处于第一种状态的主体人群。例如第一亚群的患者可以是那些被诊断具有肾衰竭，和患有肾功能恶化的主体。为了方便起见，在第一亚群的主体被称为“有病的”，虽然事实上，这个亚群是存在某种特定目标特征而被选择在一起的。第二亚群主体是那些不能归入第一亚群的主体。

第二类主体在下文中被称为“无病的”。然后，基线结果可以利用合理的特异性和敏感性来区分有病的和无病的亚群。在检验中，改变基线仅仅是假阳性结果和假阴性结果的数量之间的交替互换，这是因为特异标记物的使用导致的。具有这种检测的重叠区的有效性经常用ROC曲线（工作特征曲线）来表达。ROC曲线是本领域技术人员熟知的。ROC横轴代表（1-特异性）假阳性率的增加。曲线的纵轴代表敏感性，代表正确率的增加。选定一个特定的阀值，值（1-特异性）会被确定，也就会获得对应的敏感性。ROC曲线下的区域是测量标记物水平能正确识别某种疾病或状态的概率性。当然曲线下的区域也能用来确定检测的有效性。

可选择的，个人主体可选择提供他们自己的基线，那样，暂时的变化就用来说明特定诊断或预测。例如，在最初的时间里，测量一种或多种标记物用来作为一种或多种基线结果，然后，在以后的时间里又测一次，随着时间变化，标记物水平的改变（或相应的缺失）就能被确定或测量。在这些实施例中，标记物从第一次到第二次数值的增加可以暗示特别的预后结果，或特别的诊断结果等。同样的，标记物从第一次到第二次数值的减少也可以暗示特别的预后结果，或特别的诊断结果等。在这样一个实施例中，多数标记物相互间没有变化。一个或多个标记物值的短期变化也可以被共同用来与群体基线的单时间点的标记物值进行比较。

在实施例中，为主体确定一个标记物的基线水平，然后用同样的标记物进行后续的检测分析。后续分析结果与基线结果进行比较，相对于低于基线值来讲，大于基线值说明心功能恶化，肾功能恶化，或者二两都有恶化。类似的，相对于高于基线值，低于基线值说明心功能改善，肾功能改善，或者两个都改善。

在实施例中，为主体确定一个标记物的基线水平，然后用同样的标记物进行后续的检测分析。后续结果与基线结果比较，相对于低于基线值，大于基线值则说明死亡率的风险会增加。类似的，相对于高于基线值，低于基线值则说明死亡率的风险会降低。

这里所述单个标记物水平的测量也可以用附加的其它标记物的测量来扩大或增强。例如，与血压调节有关的其它标记物，包括其它的利尿肽和/或它们的相关标记物，可以与BNP和/或它的相关标记物同时使用，或分开使用。适合的分析包括，但不限于，检测ANP,proANP,NT-proANP,CNP,激肽原,CGRP II,尿紧张素II,BNP,NT-proBNP,proBNP，降血钙素基因相关肽，精氨酸加压素，内皮素-1（和/或大ET-1），内皮素-2（和/或大ET-2），内皮素-3（和/或大ET-3），原降钙素，钙磷蛋白，肾上腺髓质素，醛固酮，血管紧张肽1（和/或血管紧张肽1），血管紧张肽2（和/或血管紧张肽2），血管紧张肽3（和/或血管紧张肽3），缓激肽，速激肽-3，降血钙素，肾素，尿扩张素和胃饥饿素，和/或一个或多个相关的标记物。

本发明所述的方法也可以利用各种临床变量作为变量。例如这些变量包括尿排出量水平、年龄、是否存在如糖尿病，高血压，抽烟等的心血管疾病因子。包括但不限于以上所列出的这些变量。

把多个标记物组合成单一的试剂的值，该值就像单个标记物一样使用的适宜的方法，该方法的内容在2002年12月24日申请的第60/436,392号美国临时专利申请，2003年12月23日申请的PCT/US03/41426，2002年12月27日申请的第10/331,127号美国专利申请和PCT申请，申请号：PCT/US03/41453的申请中有详细描述。上述的每个专利包含有该方法的详细内容，包括所有表格、图片和权利要求的一个的全部作为本发明的一部分。在一个可选的方式中，分析结果可以使用一个“m中包括n的”（“n-of-m”）方式。本方法的一个例子就是使用2个标记物，当任何一个标记物高于对应的基线值就标志着肾衰竭或不好结果的风险增加（在“m中包括n的”方式中，这是2中包括1的（“1-of-2”）结果）。如果两个标记物同时高于相应的基线（一个2包括2的（2-of-2）结果），更能肯定主体所处的状态。

诊断和/或预后测试的敏感性和特异性不仅仅更多依赖检测分析的“质量”——而且他们也依赖是什么造成不正常结果组成的定义。实际上，工作特征曲线，或ROC曲线通常通过一个变量值与其相对在“正常”与“疾病”的人群之间的频率而绘制成的。对少许特殊标记物，有或没有“疾病”的主体中的标记物水平的分布可能会重叠。在这种情况下，检测不能100%的完全精确区分正常人群与疾病人群，重叠区域则说明检测不能区分正常与疾病。这就需要选择一个临界值，高于（或低于，取决于标记物随疾病如何变化）临界值检测被认为是不正常，低于临界值被认为是正常。ROC曲线下的区域是一种概率性的测量，该概率性的测量可以对状态做出正确的识别。ROC曲线甚至能在测量结果不能给出一个确切数字的时候使用。只要对一些结果进行分级，就能造出ROC曲线。例如，根据程度（1=低，2=正常，3=高）对“有病”样本的检测结果进行分级。这个分级与“标准”人群的结果有关，ROC曲线就制作好了。这个方法是本领域技术人员熟知的，见Hanley et al.,Radiology143:29-36(1982).

检测准确性的测量也可以用Fischer等（Intensive Care Med.29:1043-51,2003）所述的方法，测量一个已给定的标记物或多个标记物的有效性。这些测量方法包括敏感性、特异性、预测值、概率比、诊断的让步比（diagnostic odds ratios）和ROC曲线面积。如上面讲述的一样，优选的检测和分析方法展示了用各种测量方法所得的一种或多种结果。

优选的，被选的基线值具有至少约70%的敏感性，更优选的至少约80%的敏感性，更优选的至少约85%的敏感性，更优选的至少约90%的敏感性，最优选的至少约95%的敏感性；同时，被选的基线值具有至少约70%的特异性，更优选的至少约80%的特异性，更优选的至少约85%的特异性，更优选的至少约90%的异性，最优选的至少约95%的特异性。在一个特定的优选实施例中，敏感性和特异性至少都是约75%，更优选的至少约80%，更优选的至少约85%，更优选的至少约90%，最优选的至少约95%。本发明中的术语“大约”指给定测量值的上下5%的范围（+/-5%）。

另一个实施例中，阳性拟然比，阴性拟然比，概率比，或风险比都可以具有用来衡量诊断疾病或预测风险的能力。在利用阳性拟然比时，数值等于1说明“有病”和“对照”群组的主体都是阳性结果的可能性是一样的；数值大于1说明有病群组的主体更可能具有阳性结果；数值小于1说明对照群组更有可能是阳性结果。

在阴性拟然比情况下，数值等于1说明“有病”和“对照”群组的主体都是阴性结果的可能性是一样的；大于1说明有病组的主体更可能具有阴性结果；数值小于1说明对照群组更有可能是阴性结果。在更优选的实施例中，多个标记物或多个标记物组能更好的表示阳性或阴性拟然比，阳性或阴性拟然比分别至少约等于1.5或更大，或约等于0.67或更少；更优选至少约等于2或更大，或约等于0.5或更少；更优选的至少等于5或更大，或约等于0.2或更小；更优选的至少等于10或更大，或约等于0.1或更小；最优选的至少等于20或更大，或约等于0.05或更小。本发明所说的术语“约等于”表示给定检测值的上下正负+/-5%。

在利用让步比的情况下，数值等于1说明“有病”和“对照”群组的主体都是阳性结果的可能性是一样的；数值大于1说明有病群组的主体更可能具有阳性结果；数值小于1说明对照群组更有可能是阳性结果。在更优选的实施例中，多个标记物或标记物组能更好的表示让步比，让步比分贝至少约等于2或更大，或约等于0.5或更少；更优选至少约等于3或更大，或约等于0.33或更少；更优选的至少等于4或更大，或约等于0.25或更小；更优选的至少等于5或更大，或约等于0.2或更小；最优选的至少等于10或更大，或约等于0.1或更小。本发明所说的术语“约等于”表示给定检测值的+/-5%。

在利用风险比的情况下，数值等于1说明“有病”和“对照”群组的终结（如死亡）风险都相等；数值大于1说明有病群组的死亡风险更大；数值小于1说明对照组的死亡风险更大。在更优选的实施例中，多个标记物或标记物组更好的表示风险比，风险比至少约等于1.1或更大，或约等于0.91或更少；更优选至少约等于1.25或更大，或约等于0.8或更少；更优选的至少等于1.5或更大，或约等于0.67或更小；更优选的至少等于2或更大，或约等于0.5或更小；最优选的至少等于2.5或更大，或约等于0.4或更小。本发明所说的术语“约等于”表示给定检测值的+/-5%。

很多方法和装置设备是本领域技术人员熟知的用来检测当前发明中的标记物。关于检测病人样本中的多肽或蛋白，免疫检测设备和方法是经常使用的，见美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792中的具体描述，每一个专利内容都被完整的列入参考文献中，包括所有的表格、图形和权利要求。这些设备和方法可以利用各种被标记的大分子进行三明治检测，以竞争或非竞争检测形式产生与靶标被分析物存在或数量相关的信号。

另外，某种方法和设备，例如生物传感器和光学免疫检测法可以不需要标签的大分子就可以检测靶标被分析物的存在或存在的数量。见美国专利5,631,171和5,955,377，每一个专利内容都被完整的列入参考文献中，包括所有的表格、图形和权利要求。

本领域熟练技术人员认为机械仪器包括但不限于贝克曼，雅培AxSym，罗氏ElecSys，Dade Behring层云系统的免疫检测系统可以进行这里所述的免疫检测。

虽然其他方法也是本领域技术人员熟知的（例如测量标记物RNA水平），但优选，使用免疫检测法，最优选的是三明治免疫检测法，来分析标记物。通过对应标记物的特异抗体及其检测特异性结合通常可以检测到标记物的存在或存在的数量。任何合适的免疫分析方法都可以采用，例如酶联免疫检测法（ELISA），放射免疫检测法（RIAs）,竞争性结合检测，等等。标记物与特异抗体的免疫结合可以被直接检测或间接检测。例如免疫检测法，生物检测分析需要检测的方法，最常用的定量的方法是结合一种酶，荧光基团或其他大分子物质能形成抗体-标签物的复合物。

可检测的标签物包括本身就可被检测的大分子物质（如荧光基团，电化学标签，金属螯合物等），也包括产生可检测反应产物的间接可检测分子（例如如酶像辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等）或被一个可检测的结合分子特异结合（例如生物素，地高辛，麦芽糖，oligohistidine，2,4-二硝基苯，苯基砷酸，ssDNA，dsDNA等）。特别优选的可检测标签是如美国专利5,763,189,6,238,931,和6,251,687和国际出版物WO95/08772中所述的荧光乳胶粒，上述的专利和出版物都被完整的列入参考文献中。颗粒中的示范共轭会在下文中提到。包括荧光或发冷光标签，金属，染料，放射性核素和类似物的直接标签被与抗体结合，间接标签包括各种本领域数值的酶，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶和类似物。

利用被固定的抗体来特异检测标记物也属于本发明的一部分。这里所用的术语“固相”是一个广义物质，它包括固体，半固体，凝胶，胶片，薄膜，网状物，毛毡类，复合物，微粒，试纸和类似物等，本领域技术人员通常可用于吸附大分子的物质。固相物质可以无孔或有孔。适宜的固相包括那些成熟的和/或在固相结合检测中作为固相的物质。例如，《免疫分析》的全部作为本发明的参考或一部分（见：例chapter9ofImmunoassay,E.P.Dianiandis and T.K.Christopoulos eds.,Academic Press:New York，1996）。适宜的固相例子包括膜，滤器，纤维素纸，玻璃珠（包括聚合的，乳胶的和顺磁的颗粒），玻璃，硅片，微粒，纳米粒子，例如Tenta凝胶，Agro凝胶，PEGA凝胶，SPOCC凝胶，和多孔盘（见,例,Leon et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.8:2997,1998;Kessler et al.,Agnew.Chem.Int.Ed.40:165,2001;Smith et al.,J.Comb.Med.1:326,1999;Orain et al.,Tetrahedron Lett.42:515,2001;Papanikos et al.,J.Am.Chem.Soc.123:2176,2001;Gottschling et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2997,2001）。抗体可以被固定在各种固体载体上，例如磁性或色谱级的基质颗粒，检测板表面（如微孔板），固体基片材料或膜（如塑料，尼龙，纸）等等。通过在固相载体上涂上一种抗体或多种矩阵式排列的抗体，形成测试条。这些测试条随后浸入检测样品中，然后通过快速冲洗和检测步骤产生可测量信号，例如色斑。当采用多种检测方式时，在单个固相载体上可以产生很多分开地可设定地址的位置，每一个位置都对应不同的标记物，每一个位置都包括与这些标记物结合的抗体。这里所述的术语“离散”指不连续的表面区域。那就是说，如果不属于任一个区域的边界完全围绕两个区域中的每一个区域，即两块表面区域是相互独立的，离散的。这里所用的术语“独立地址”指相互离散的表面区域，在这些区域上可以获得特异信号。

为了单独或连续检测标记物，适宜的装置包括临床检验分析仪，例如ElecSys(Roche),the AxSym(Abbott),the Access(Beckman),the ADVIA

CENTAUR

(Bayer)免疫分析系统，NICHOLS ADVANTAGE

(Nichols Institute)免疫分析系统等。优选的装置能用单个检测装置可以同时进行多种标记物的检测。

特别有用的物理形式包括具有多个离散的表面，能在可寻地址的位置上检测多种不同被分析物。这些形式包括蛋白基因芯片，或“蛋白质芯片”(见,例,Ngand Ilag,J.Cell Mol.Med.6:329-340(2002)和毛细管设备（见,例美国专利号6,019,944）。在这些实施例中，每一个离散的表面位置包括用来固定一种或多种被分析物（例如标记物）的抗体。

离散的表面可有选择性地包含一种或多种离散粒子（例如微粒或纳米粒子），这些离散粒子被固定在表面的离散位置上，那些离散的表面位置上的微粒子可以包括用来固定一种被分析物（例如标记物质）的抗体。

为了一种或多种检测，本发明中优选的检测装置包括与固相结合的第一种抗体，与信号发生元件结合的第二抗体。这些检测设备配制在一起形成三明治式来检测一种或多种被分析物。更优选的这些检测设备可以进一步包含一个样本施加样区，和一个从样本施加区到第二设备区域的流动路径，流体路径中包含了与固相结合的第一种抗体。

检测装置中样本可以沿着流动路径可以被动地（例如通过毛细管，流体静力学，或一旦样品进入设备不需要进一步操作就有的其他动力），积极地（例如机械泵产生的力作用下，电渗透驱动泵，离心力，增加的空气压力等），或通过一种积极的和被动的组合形成的驱动力来被驱动。最优选的，加入样品施加区的样本沿着流体路径既可以和与固相结合的第一种抗体接触，又可以和信号发生元件结合的第二抗体接触（三明治式检测形式）。另外的元件，例如把血液分成血清和血浆的过滤器，混合室等，如有需要可以让技术人员增加到以上的装置中。

典型的装置如在免疫检测手册第二版第41章，题为“靠近病人的检测：Triage

Cardiac系统”，David Wild编辑，自然出版集团，2001中有具体（“NearPatient Tests:Triage

Cardiac System,”in The Immunoassay Handbook,2^nd ed.,David Wild,ed.,Nature Publishing Group,2001）的描述，该内容已在参考文献中完整列出并作为本发明的一部分。

标记物的分析也可以在各种物理形式中进行。例如，利用微孔板或自动化的设备可促进大量样品的检测过程。可选的，单个样品可进行实时的即时检测和诊断，例如在流动门诊或急诊室设备。在另一个实施例中，本发明提供一个分析标记物的试剂盒来。优选的试剂盒包括至少分析一个测试样本的装置和试剂，以及执行检测的说明书。试剂盒可选择的包含一种或多种方法使用，通过免疫检测标记物组获得的信息来控制或排除某些诊断或预测结果。这里采用的其他测量方法包括色谱分析法（例如HPLC），质谱法，基于受体检测法和上述方法的组合。

这里所用的术语“抗体”指一个肽或多肽，源自一个或多个免疫球蛋白基因或具有特异结合抗原或表位能力的部分片段，大量编码或仿造获得。例如免疫学基本原理，第3版，W.E.Paul编辑.，乌鸦出版社，纽约(1993);Wilson(1994)免疫性方法，175:267-273;Yarmush(1992)生物化学与生物物理方法，25:85-97（见,例Fundamental Immunology,3^rd Edition,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993);Wilson(1994)J.Immunol.Methods175:267-273;Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97）。术语抗体包括抗原结合部分，例如，保留与抗原结合能力的“抗原结合点”（例如，片段，子序列，互补决定区（CDRs）），它包括（i）Fab片段，一个由VL,VH,CL和CH1域组成的单价片段；（ii）F（ab’）2片段，由一个二硫键链接的2个Fab片段组成的二价片段；（iii）Fd片段，包括VH和CH1域的Fd片段；（iv）由抗体一个单臂的VL和VH域组成的Fv片段；（v）由VH域组成的dAb片段（Ward et al.,(1989)Nature341:544-546）；和（vi）一个单独的互补决定域（CDR）。参考文献中“抗体”也包含单链抗体。当本发明详细描述了用免疫检测方法检测分析物，其他标记结合对，如寡核苷酸适配子，受体，结合蛋白等，可以与抗体以类似的方式结合，从而进行一个检测。

优选的，抗体或其他结合试剂能特异的与靶标的标记物结合。术语“特异结合”不是为了说明抗体/结合试剂与它的预定的目标物质专一的结合，而是当抗体/结合试剂与它的预定目标结合的亲和力比非目标的亲和力大5倍时所指的“特异结合”的抗体/结合试剂。优选的抗体对目标分子的亲和力比非目标分子的亲和力至少约大5倍，更优选的为10倍，更优选的为25倍，更优选的为50倍，最优选的为100被或更多。在优选的实施例中，目标结合试剂与不妙分子结合的亲和力至少为1X10^-6摩尔/升。优选的，亲和力至少为1X10^-7摩尔/升，更优选的，为1X10^-8摩尔/升，更优选的，为1X10^-9摩尔/升，更优选的为1X10^-10摩尔/升。在一些优选的实施方式中，抗体或其他结合试剂与抗原之间的结合特异性意思是指结合的亲合力致死奥为10⁶M^-1.优选的，抗体的亲合力至少为10⁷M^-1，或者至少为大约10⁸M^-1到大约10⁹M^-1之间，或者大约10⁹M^-1到大约10⁴¹M^-1之间，或者大约10¹⁰M^-1到大约10¹¹M^-1之间。

亲和力的计算方法为K_d=k_off/k_on（k_off是解离速率常数，k_on是结合速率常数，k_d是平衡常数。亲和力由平衡常数决定，平衡常数通过测量各种浓度（c）下标记物配合基的分数范围（r）得到。数据利用Scatchard方程作图：r/c=K(n-r）

其中，

r=平衡时，结合配体/平衡时受体的摩尔数

c=平衡时自由的配合基的浓度

K=平衡常数

n=每个受体分子的配体结合位点数。

通过图形分析，Y轴绘制了r/c，对应的X轴绘制r，然后形成一个斯卡查德图。亲和力是线的负斜率。非标签的过量配体竞争结合贴有标签的配体决定k_off数值（见例美国专利第6,316,409）。用于目标分子的目标试剂的亲和力优选的是至少1x10^-6摩尔/升，更优选的至少是1x10^-7摩尔/升，更优选的至少是1x10^-8摩尔/升，更优选的至少是1x10^-9摩尔/升，最优选的至少是1x10^-10摩尔/升。

通过斯卡查德图形分析抗体亲和力在本领域是公知的。见《免疫测定杂志》和《生物化学的计算，方法和程序》等（van Erp et al.,J.Immunoassay12:425-43,1991;Nelsonand Griswold,Compute.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988.）。可以用几种方法生产和选择抗体。例如一种是纯化目的多肽或用本领域熟知的如固相肽合成方法来合成目的多肽。见《蛋白质纯化指南》；《固相肽合成》；(参见,Guide to Protein Purification,Murray P.Deutcher,ed.,Meth.Enzymol.Vol182(1990);Solid Phase Peptide Synthesis,GregB.Fields ed.,Meth.Enzymol.Vol289(1997);Kiso et al.,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)38:1192-99,1990;Mostafavi et al.,Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids1:255-60,1995;Fujiwara et al.,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)44:1326-31,1996)。选择的多肽随后被注射到例如小鼠或兔子，来产生多克隆或单克隆抗体。本领域熟练技术人员知道许多方法可以用来生产抗体，例如抗体，实验室规程，Harlow and David Lane编辑，冷泉港实验室（1988），冷泉港，纽约中所述（Antibodies,A Laboratory Manual,Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988),Cold Spring Harbor,N.Y）。本领域熟练技术人员也知道模拟抗体的结合片段或Fab片段可以用各种方法从基因信息中产生（AntibodyEngineering:A Practical Approach(Borrebaeck,C.,ed.),1995,Oxford University Press,Oxford;J.Immunol.149,3914-3920(1992))

另外，很多出版物都报道利用噬菌体展示技术来生产和筛选多肽文库用于结合选定的靶标（参见例如：Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,6378-82,1990;Devlin et al.,Science249,404-6,1990,Scott and Smith,Science249,386-88,1990;和Ladner et al.,U.S.Pat.No.5,571,698）。噬菌体展示技术的基本定义是筛选DNA编码的多肽和多肽间的物理关联。这种物理关联是噬菌体颗粒提供的，展示了多肽作为包被编码多肽的噬菌体基因组的部分噬菌体衣壳蛋白。多肽与基因材料间的物理关联是通过同时大量筛选具有不同多肽的噬菌体建立的。噬菌体展示与靶标有亲和作用的多肽与靶标结合的过程，这些噬菌体通过与靶标的亲和力富集起来。从这些富集的噬菌体中通过他们不同的基因组鉴定多肽。用这些方法鉴定具有与预期靶标结合的多肽，并通过常规手段批量合成这些多肽。见例美国专利6,057,098，该专利的所有表格、图形和权利要求都被完整的列在参考文献中并作为本发明的一部分。

然后，通过噬菌体展示方法产生的抗体可以再次通过纯化的目的多肽进行亲和力和特异性的筛选，如果有必要，比较抗体与被排除不能结合的多肽的亲和力和特异性。筛选程序包括固定纯化多肽在微量滴定板的隔开的不同孔中。

含有可能抗体或抗体组的溶液接着放入各自的微量滴定孔中，培养月30分钟到2小时。然后冲洗微量滴定板的孔，在孔中加入标签物的第二抗体（例如，与碱性磷酸酶偶联的鼠抗抗体，如果培养的抗体是鼠抗体）然后培养30分钟并冲洗。碱性磷酸酶底物加入到孔中，接着结合有抗体的多肽的孔中就发生颜色反应。

鉴定的抗体进一步在设计好的检测中进行亲和力和特异性分析。用免疫检测分析靶标蛋白，纯化的靶标蛋白作为标准来评断使用选定抗体的免疫检测的敏感性和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能不同；某些抗体对可能在空间上干扰其他的抗体（如在三明治检测中），抗体检测性能的衡量比其绝对亲和力和特异性的衡量更加重要。

本领域的技术人员认为许多途径都可用来生产抗体或结合片段，筛选和选择各种多肽的亲和力和特异性，但这些途径都不能改变本发明的范围。

核酸适配体是已通过反复多轮的体外选择或等同过程被改造，SELEX（配体指数富集的系统进化）绑定到不同的分子靶标，如小分子，蛋白，核苷酸，甚至细胞，组织和生物体。肽适配体是被设计来干扰细胞内的其他蛋白质相互作用的蛋白质。它们由两端连接到蛋白质支架的可变肽环组成。

这种双重结构的约束大大提高了肽适配体的亲和力，可以与抗体（纳摩尔范围）水平的亲和力相媲美。核酸适体在生物技术和治疗应用中非常有用，因为它们提供了分子识别的属性，与常用的生物分子，抗体竞争。除了其判别识别（能力），适配体优于抗体因为它们可以完全在试管中进行工程化生产，可容易地通过化学合成产生，具有理想的存储性，并在治疗应用中引起很少或没有免疫原性。因为适配体的发现，许多研究人员已经使用适配子，作为产生合适的结合配偶体的手段用于结合测定方法。

在一些实施方式中，某种生物标记物水平阀值的测定可以用来指示主体某种疾病的状态。例如，肾损伤的标记物质，血清肌氨酸酐，肌氨酸酐的清楚率，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，和肾小球滤过率可以被用来急性肾损伤的诊断和/或预后

在一些实施例子中，主体具有进行心衰的预兆症状（例如呼吸困难），从不同时间段获取的血液样本中的血清肌氨酸酐（sCr）值来评估每个主体的急性肾损伤（AKI）的状态或阶段。例如，血清肌氨酸酐的水平从入场的时间（T=0，等同于入场的时间）开始后的0,24,48;72,和96的时间测量.血清肌氨酸酐（sCr）也在离场后进行测量，和基线值（没有入场）也被测量.在每个点的sCr与在基线水平的sCr之间的不同可以用来评估AKI的状态（例如，临床上感兴趣的终点点就是AKI的状态）

可以用不同的方法来评估患者的急性肾损伤的状态。如，在一个模型中，在临近相对于sCr,sCr(SSB)基线点水平上的超过两个或多个sCr值的提高，就可以认为是AKI的阳性结果。

在一些方式中，如果sCr(T)/sCr(SSB)之间的比值大于或等于2.5，优选的，sCr(T)/sCr(SSB)之间的比值大于或等于2.0，更优选的，sCr(T)/sCr(SSB)之间的比值大于或等于1.5的时候，肌氨酸酐的值在时间T,sCr(T),的值就被认为是被提高了。在另外的一些的方式中，如果sCr(T)/sCr(SSB)的比值大于1.4、1.3、1.2、或1.1，就认为sCr(T)的值在时间T的时候被提高了。

在另外的一些方式中，如果sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于1.5ng/dL，sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于1.0ng/dL，sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于0.5ng/dL，sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于0.4ng/dL，sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于0.3ng/dL，sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于0.2ng/dL，sCr(T)-sCr(SSB)的差值大于或等于0.1ng/dL，就认为在时间T的，sCr(T)，的肌氨酸酐的值被提高了。

在这里，术语“持续的”是指sCr值的上升被连续两次或更多的被提高。在一些优选的方式中，在连续被提高中，上升被认为是在早期时间T就已经发生。例如，在T-0,72,96小时的时间时病人表现出sCr的上升，可能只有在T=72小时，而不是在T=0的时候被认为是AKI阳性状态。在某些情况下，患病（D）的患者被认为在t=0时进场的人具有AKI阳性（例如，进场并且T=24小时的点一定被提高了）。

在这里，术语“非病患者”是这样的患者，他们可能没有两个或多个连续的提高的sCr值，但是他们还是被统计进去作为缺少的点值。例如，一个患者从进场到出场之前测试点的结果值为【N/A，-+-+-】(+=提高，-=不被提高)，他将被认为是AKI阴性结果（ND），是因为没有两个连续被提高的点的值获得，不管进场的点的值。另一方面，【N/A，+----】将被忽略，是因为连续提高点的值的存在或出现将会依靠缺少点的状态。

在另外一个模型中（例如，暂时模型中），sCr(T)-sCr(SSB)>0.1mg/dl,sCr(T)-sCr(SSB)>0.3mg/dl,sCr(T)-sCr(SSB)>0.4mg/dl,sCr(T)-sCr(SSB)>0.5mg/dl,sCr(T)-sCr(SSB)>0.6mg/dl,sCr(T)-sCr(SSB)>1,0mg/dl,或者sCr(T)-sCr(SSB)>1.5mg/dl的患者被认为在T时间的sCr的值是被提高了。在某些事实方式中，患病的患者就这些在T=0时间的sCr的值被高的这些人，不管这些保留点的值。例如，非病主体就是那些已经知道在入场时没有Cr的值是被提高的患者，不管这些保留点的值。在某些实施方式中，这也指那些主体，他们随着入场时候的点具有提高的Cr的值（但是并不是在入场时候的点），但是他们被认为是ND。具有缺少sCr(0)值的患者被忽略。

本领域技术人员将认识到，可采取许多方法产生抗体或其它结合配偶体，并在生物标记物测定法中用亲和力和特异性筛选和选择，但这些方法不改变本发明的范围。

具体实施例子

下面的实施例用来说明本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例子1. 生化检测分析

使用标准免疫分析技术测定标记物的浓度。这些技术包括使用抗体特异性结合靶标的被分析物。

免疫分析是使用磁珠法，或使用微量滴定检测方法，或采用Biosite公司生产的微流体装置，如WO98/43739，WO98/08606，WO98/21563，和WO93/24231中所述。被分析物可以采用三明治夹心免疫测定或竞争性免疫测定（如适用）进行测量，这取决于靶标被分析物的特征和浓度范围。

磁珠免疫测定在微量滴定板中对人血浆（或血清）进行多次和单测定。每次测定的第一抗体缀合到从BIOSOLUTIONS获得的改良顺磁性Luminex

珠。无论是第二级抗体（三明治夹心测定）还是抗原（竞争性测定）都进行生物酰化。用链霉亲和-抗-藻红蛋白（SA-PRE：Prozyme PJ31S SA-RPE）产生的荧光信号。所有测定均异构和需要多次洗涤；洗涤在置于96孔磁环上的96孔板中进行（Ambion公司），以保持顺磁珠不被除去。所有液体操作步骤均按BeckmanBiomek FX执行。

通过把抗原与校准曲线的矩阵按照质量比例混合产生8点校正曲线。在三明治检测中，这个矩阵是来自健康的捐赠人的血浆（或血清）；8个点中的一个点包括为了中和存在的内生抗原的自由抗体。在竞争检测中，这个矩阵是CD8缓冲液（10mmol/L Tris-HCl（PH=8.0),150mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,0.1mmol/L ZnCl2,10mL/L聚乙烯醇(分子量为9000–10000),10g/L BSA,and1g/L叠氮钠)。样本被储存在384孔的微孔板中并被保藏在-70℃的温度下。37℃的温度下融化样本盘，然后加入8点校正曲线试剂。

检测在室温下进行。加带有珠子的第一抗体溶液到384孔的检测盘上（10ul/孔），然后加入来自样本盘的融化的样品（10ul/孔），混合，然后培养1小时。注意，在检测盘中的检测时，竞争检测法的操作不同于三明治检测，在把样本转移到检测盘之前先加入生物素偶联的抗原到样本中。为了后续的处理，每一个384孔板被分成4个96孔板。如上所说，清洗板子；三明治检测法中，需要与生物素偶联的第二抗体共培养后再次清洗。混合物的检测需要用SA-RPE进行标签，被清洗，然后用Luminex

LX200读取仪器读取。每次检测的中值信号用于对每个样品的数据的计算。抗原浓度用标准曲线计算，这个标准曲线是由8点校正曲线提供的适合一个5参数逻辑斯蒂函数的信号决定的。

这些检测可以被纯化的蛋白来校准（该蛋白要么与选择的被分析物相同，要么相关，并能在分析过程能够被检测到），对被稀释到含有EDTA的血浆的蛋白与来自人群中的样本进行相同的处理。在加入纯化的标记蛋白前，测量血浆中存在的内生被分析物的水平，该内生被分析物的水平在校准的时候也被考虑进去计算标记物的值。当有必要减少校准过程中的内生被分析物的水平时，可以用标准免疫亲和性方法从血浆中除去该内生被分析物。校准曲线的测试与来自人群中的样本的测试方法是相同，用获得的结果绘制一个“剂量反应”曲线（检测信号与分析物浓度的方程），用这个曲线可以根据采自主体样本的检测信号来确定样本中被分析物质的浓度。

在微量滴定板中进行三明治夹心免疫测定，直接对应选定被分析物的一个单克隆抗体用羟基琥珀酼亚胺生物素（NHS生物素）生物酰化，比率约每个抗体5个NHS-生物素集团。然后抗体-生物素缀合物加到384另一个直接对孔的微量滴定板中的含有标准生物素蛋白的孔中，未连接到板上的抗体缀合物被洗掉。这样在微量滴定板中形成了“抗-标记”。直接对应同样被分析物的另一种单克隆缀合到碱性磷酸酶上，例如，用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸叔丁酯（SMCC）和N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯（SPDP）（Pierce,Rockford,IL）。

吸取预先包被抗生素蛋白的生物酰化抗体到微量滴定板上培养60分钟。去除含有未结合抗体的溶液，孔用洗涤缓冲液清洗，洗涤缓冲液（PH7.42）中含有20mM的硼酸盐，150mM的NaCl，0.1%叠氮化钠和0.02%吐温-20（ICI美洲,Inc.）。吸取加入HAMA抑制剂的血浆样品（10微升）到微量滴定板上，培养60分钟。然后去除样品，用缓冲液冲洗孔。抗体与碱性磷酸酶偶联物被加入孔中，继续培养60分钟，之后去除抗体偶联物，用洗涤缓冲液清洗孔。在孔中加入底物（

Promega,Madison,WI），荧光产物的形成比率与检测样品中被分析物的浓度有关。

用微流体装置检测的情况下，用于检测的装置实质与免疫分析手册最中，41章中，题目为“病人边的检测：Triage

心血管系统”中的所述的装置一样（第2版.,David Wild,编辑,自然出版集团,2001）。

在三明治免疫检测中，把血浆样品加入包含所有必需检测试剂的微流体装置中，该微流体装置中包括干燥的人抗鼠抗体（HAMA）抑制剂。血浆通过一个过滤器，去除悬浮颗粒。通过毛细管作用进入一个“反应室”。这个反应室包含适用于靶标分析物的荧光乳胶颗粒-抗体的偶联体（后面名为FETL-抗体偶联体），也可以包含适用于几种选定分析物的FETL-抗体的偶联体。FETL-抗体的偶联体被溶解到血浆后形成反应混合物，反应混合物在反应室培养一段时间（约1分钟），从而使血浆中的目标被分析物与抗体结合。培养后，反应混合物通过毛细管作用继续在检测通道中下移。用于检测目的被分析物的抗体被固定在离散的捕获区里，捕获区位于“检测通道”的表面上。

在反应腔内形成的被分析物/抗体-FETL复合物被捕获在适当的检测区域上形成三明治复合物，然后，哪些没有被捕获的FETL-抗体被多余的血清从检测区域上被冲洗进入冲洗腔体内。

在反应室被捕获的大量被分析物/FETL-抗体的复合物用荧光计（

MeterPlus,Biosite Incorporated）计数，其与血浆样品中选择的被分析物数量有关。

实施例子2.生物标记的预后用途

下列研究利用一个来自心力衰竭咨询公司（COACH）的协调研究结果的专利，1023个因为心力衰竭（HF）而住院病人的一个多通道，随机的对照试验，见Arch.Intern.Med.168:316-24,2008（See,Arch.Intern.Med.168:316-24,2008）。病人被分成1-3组：一个对照组（心脏病专家跟进研究）和2个干预组，他们是具有心力衰竭（HF）的病人，并使用附加的基本或加强措施，通过护士专门管理。研究进行18个月。由于心力衰竭（HF），死亡或再住院天数数量，主要终点为死亡或再住院的时间。

从心里衰竭咨询公司（COACH）的主体获得WAP4-硫化物核心域蛋白2的基线测量值。基线的划分是如上所述的随机到谨慎或积极干预，病人进入HF状态2天后开始算起。下列表格中列出了这些测量值的描述性统计内容。N”是每一组中主体的数量；“25^th”,“50^th”,和“75^th”指分别在第25个，第50个和75个百分位的值；“SD”是标准偏差；均值的SE指均值的标准误差。

表1:

WAP4-硫化物核心域蛋白2测量值作为基线的作用可以区分所确定风险结果被测试了。通过4分标记水平计算CVD和CHD死亡调整相对危险性比率（AOR），标准化第一个4分位数。对于第四个四分位，AOR可以表示为下面的等式计算：

$\mathrm{AOR}\left(Q4\right)=\frac{\frac{P(+|Q4,X)}{P(-|Q4.X)}}{\frac{P(+|Q1,X)}{P(-|Q1,X)}}$

在等式中，P(+|Q4,X)是死亡的概率，设定主体的标记水平在第四分位数内，对所有主体用该算式时，协变量值X（如年龄，性别）需要被调整。相对于存活，分子和分母分别为第四和第一四分位数的死亡概率。我们也用关于临床CVD和CHD死亡的数据来计算经验概率。我们也用COX比例风险模型（CPH）模拟数据，用来评估标记水平、年龄、性别等对存活率的影响。用Kaplan-Meier方法计算存活概率的经验估计值作为被查验的数据（（除了兴趣的终点，如由于某种原因下主体退出研究）。来分析的适宜方法可以在下列文献中找到，例如杜德利（William Dudley）杜邦；医学研究中的统计模型：分析复杂数据的简要介绍（参见Cambridge University Press;2002;Collett,David;Modeling survival data inmedical research;CRC Press;2003;and Bender,Ralf,Augustin,Thomas and Blettner,Maria;Statistics in Medicine;24;1713;2005.）

表2：

表3:

实施例子3.CKD级别

下列研究利用一个来自心力衰竭咨询公司（COACH）的协调研究结果的专利，1023个因为心力衰竭（HF）而住院病人的一个多通道，随机的对照试验，见Arch.Intern.Med.168:316-24,2008（See,Arch.Intern.Med.168:316-24,2008）。测定患者样本来评估几种生物标记在帮助指定诊断患有CKD患者的CKD级别增加可能性的用途。从每一个患者上获得的样本用免疫测定分析来决定每一种生物标记水平。免疫测定以三明治夹心测定方式（为了确定标记穿透素3,ANP前肽,BNP,D-二聚体,ESAM,半乳凝素3（Galectin3）,GDF-15,LTBR,间皮素,MPO,神经毡蛋白1,NGAL特殊血浆,NTProCNP,骨调素,骨膜蛋白,PIGR,PSAP-B,RAGE,ST-2,蛋白聚糖-1,TNFR1A,Troy,VEGFR1,WAP4C）或如下文详细描述的竞争性测定方式（为了确定标记血管生成素,CRP,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,NGAL,NRP-1）。

在微孔盘（microtiter plates）中进行人血浆（或血清）样本。每一次检测中，第一抗体与Radix Biosolutions公司生产的并经修饰过的顺磁性珠子（Luminex

）进行偶联。无论第二抗体（三明治免疫检测法）或是抗原（竞争性检测）都被生物素连接。荧光信号用链球菌生物素-R-藻红蛋白（Strept avidin-R-Phycoerythrin）(SA-RPE:Prozyme PJ31S)产生。所有的检测都是不同类型的，需要多次洗涤；为了防止磁珠移动，所有的洗涤都是把96孔的盘放置在96孔磁性环架上进行(Ambion)(magnetic ring stand)的。所有的液体操作步骤都用Beckman Biomek的FX完成的。

通过把抗原与校准曲线的矩阵按照质量比例混合产生8点校正曲线。在三明治检测中，这个矩阵是来自健康的捐赠人的血浆（或血清）；8个点中的一个点包括为了中和存在的内生抗原的自由抗体。在竞争检测中，这个矩阵是CD8缓冲液（PH8.0)）（10mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,0.1mmol/L ZnCl2,10mL/L聚乙烯醇(分子量为9000–10000),10g/L BSA,and1g/L叠氮钠)。样本被储存在384孔的微孔板中并被保藏在-70℃的温度下。37℃的温度下融化样本盘，然后加入8点校正曲线试剂。

检测在室温下进行。加带有珠子的第一抗体溶液到384孔的检测盘上（10ul/孔），然后加入来自样本盘的融化的样品（10ul/孔），混合，然后培养1小时。注意，在检测盘中的检测时，竞争检测法的操作不同于三明治检测，在把样本转移到检测盘之前先加入生物素偶联的抗原到样本中。为了后续的处理，每一个384孔板被分成4个96孔板。如上所说，清洗板子；三明治检测法中，需要与生物素偶联的第二抗体共培养后再次清洗。混合物的检测需要用SA-RPE进行标签，被清洗，然后用Luminex

LX200读取仪器读取。每次检测的中值信号用于对每个样品的数据的计算。抗原浓度用标准曲线计算，这个标准曲线是由8点校正曲线提供的适合一个5参数逻辑斯蒂函数的信号决定的。

对主体CKD级别的设定要遵循2个独立方法。第一个方法中从主体出院时开始记录为CKD阶段。从起初离院后的6、12、18个月分别对主体进行跟进调查。在每一次跟进调查时从主体收集样品，（通过样本）来确定他的CKD阶段。在不同情况下，CKD阶段的确定是基于单一的eGFR值（从血浆中的肌酸酐检测值计算获得）。阶段的eGFR临界值来自CKD执行摘要（见American Journalof Kidney Diseases,Vol39,No2,Suppl1(February)2002,ppS17-S31）所规定的。当他们离院时，所有的主体都是CKD阶段3。主体的4个样品点（离院时，离院后6、离院后12或离院后18个月）任意一个点缺失eGFR值时就不被统计在内。

在第一种方法中，在收集样品的4个时间点对主体进行分类有2种途径。在第一种途径中，为“阳性”的CKD级别，如，那些在离院后CKD状态恶化的主体,被定义为这些主体，他们离开医院的6和12个月的CKD阶段为3,4或者5阶段；另外对离院18个月后具有相同CKD状态的定义为4或5阶段。相反，在每一个时间点收集的样品都不符合CKD级别标准的主体被认为是“阴性”。在第二种方法中“阳性”主体的分类方法类似于第一种方法，只是“阴性”用不同的方法定义。在第二种方法里“阴性”被定义为离院后6、12和18个月主体的CKD阶段为1、2或3阶段。

第二种分类主体的方法中，“阳性”和“阴性”的定义再一次使用。用到了2种“阴性”定义。被分类为CKD级别“阳性”的主体，指他们在离院后6和12个月的的eGFR值低于他们刚离院时的eGFR值；另外，无论离院后18个月的eGFR值小于离院时eGFR值的一半，或离院时eGFR值少于离院后18个月的eGFR值的量大于25ml/min/1.73m²时均符合“阳性”条件。主体缺失4个样品点（离院时，离院后6、离院后12或离院后18个月）的任意一个eGFR值时不被统计在内。

当主体处于以下情况时被分类为“阴性”，（i）跟进调查的3个点每一个点都获得了样品，但样品均不符合“阳性”条件；或（ii）离院后6个月的eGFR值大于离院时的eGFR值，和离院后12个月的eGFR值大于离院时的eGFR值，和离院后18个月的eGFR值不符合下列条件：即离院后18个月的eGFR值小于离院时eGFR值的一半，或离院时eGFR值小于离院后18个月的eGFR值的量大于离院时的eGFR值，并大于25ml/min/1.73m²（例如eGFR_d离院–eGFR_18个月>25ml/min/1.73m²）。

用上述分析方法分析主体数据结果如表4、5、6和7所示。比较表4和表5结果说明了“阴性”定义的内容，当对主体用ROC分析标记物质的行为来评估主体CKD级别增加可能性时，评估数据导致曲线下方面积少量增加定位为“阴性”。

表6和表7数据显示了用第二种分类主体方法分析主体样品的结果，仅用“阳性”定义（表6）或“阳性”和“阴性”定义（表7）。数据说明第二种方法与第一种方法有很大差异，标记的不同范围就是证明，但更令人关注的是该标记识物质显示了用来区别主体将来状态的可能性。

表4.第一种方法的仅仅定义“阳性”分析的AUC数据

表4

标记物质	AUC	S.E.标准差	P-值
				TNFR1A	0.801	0.055	<0.001
Troy	0.75	0.061	<0.001
				半乳凝素3（Galectin3）	0.73	0.059	<0.001
NTProCNP	0.726	0.059	<0.001
				ESAM	0.708	0.071	0.002
WAP4C	0.703	0.063	<0.001
				PIGR	0.699	0.064	<0.001
NGAL	0.696	0.065	0.001

表5.用第一种方法的“阳性”和“阴性”定义分析的AUC数据

表5

表6.用第二种方法仅仅定义的“阳性”分析的AUC数据

Table6

表7.用第二种方法定义的“阳性”和“阴性”分析的AUC数据

表7

在表4-7中给出的数据表明，和所发生事件的概率一样，因为所用数据分析模型中的任何给定的标记，曲线下的面积有一些变化。例如，当使用第一种方法分析时TNFR1A具有最高等级，但是，当使用第二种方法进行分析时它具有最低的等级。而特洛伊（Troy）在任何分析方法中具有类似的等级。在使用方法1的情况下，所有样品的概率值p小于0.05，表明每个标记的统计概率结果。用第二种方法时就不是这样的，在分析中，只有两个标记物质的P大于0.05，而且他们被定义为“阳性”；从而显示在分析主体样品数据中，同时使用“阳性”和“阴性”定义时分析结果的改善。

实施例子4:急性肾损伤

下面的研究目的是评估第三阶段心音的临床应用，用超声心动图的方法研究收缩压和舒张压（左和右）心室的功能。

具有急性心脏衰竭（如呼吸困难）症状的主体被送到急诊室，血液抽样检测血肌酐（Scr），从入院（T=0被认为入院）时开始T=0，24，48，72和96小时抽取血液样本，离院时也测定血肌酐，确定血肌酐基线（sCr）（非入院时）水平。

每一次（抽取血液中）的血肌酐和血肌酐基线的差异用来评估主体每次的急性肾损伤（AKI）状态。临床终点目的就是AKI状态。

有2种方法用来定义AKI状态：

持续不变的：在临界血肌酐值之上有2个（或更多）连续的描绘点。持续临界的方法：sCr(T)/sCr(基线)≥1.5或者sCr(T)–sCr(基线水平)≥0.5mg/dl(T=任何连续的描绘点)。大于临界值的早期连续点定义为在该描述点主体变成AKI阳性。

短暂的：在任意单个连续描述点上大于临界血肌酐值。短暂临界的方法：sCr(T)–sCr(基线)>=0.3mg/dl.

下面显示的分析结果，旨在评估第3心声的临床应用，用超声心动图的方法探讨收，缩期和舒张期左室功能。具有急性心力衰竭的症状研究对象被送到急诊室。计划从入院时开始T=0，24，48，72和96小时血液抽样检测血清肌酸酐（Scr）。离院时也测定血肌酐。确定恒定的基线水平，sCr(SSB)（与入院前相对应）。用2种不同方法指定急性肾损伤。在第一种方案中（持续方法），在接近基线水平水平sCr,sCr(SSB)的附件，具有血肌酐升高2或更多的患者被确认为AKI阳性。如果在T时间的点上的sCr(T)/sCr(SSB)的比值大于等于1.5或sCr(T)–sCr(SSB)的差值大于等于0.5mg/dl都认为是sCr(T)提高了。如果血肌酐提高2个持续点或更多，则血肌酐的提高被定义为持续的提高。此外，提高被认为发生在持续提高的最早的T。例如，在T=0、72和96小时都表现血肌酐升高的患者只是在T=72小时时被指定具有AKI阳性，但不是在T=0时。持续定义用在ROC表，有病的（D）患者被认为是那些入院（T=0）时（如，入院和T=24小时时点必须已经升高）就是AKI阳性。在同样的表格中，在T大于0时变成AKI阳性的患者被剔除。那些缺失了一些点的患者，由于不可能确定是否存在2个连续上升的血肌酐值，也从检测中剔除。无病的（ND）是那些没有2个或更多连续上升的血肌酐值的患者，也把那些缺失一些点的患者考虑在内。例如，从入院到出院患者的血肌酐点是【N/A-+-+-】(+=升高,-=没有升高)，患者被认为是AKI阴性（ND），因为去掉入院的点值，没有2个连续的上升结果。另一方面，[N/A+----]会被剔除，因为连续上升点的存在是依靠缺失的点所表示的状态。

在第二种方法中（短暂的），在T时间里上升的血肌酐值被定义为sCr(T)–sCr(SSB)≥0.3mg/dl。短暂的定义用在ROC表格，有病的患者是那些在T=0时就具有一个上升的血肌酐值，不管其余的值。无病的主体是那些在入院时就已知具有未上升的血肌酐值，不管其余的值。这意味着继入院的点后具有上升血肌酐值（但不是入院的点）的患者被定义为ND。缺失sCr(0)值的患者被剔除。

表8举例说明了具有持续AKI状态的主体的检测结果

表8

标记物	AUC	SE	p-Value	ND	D	LCI	UCI	敏感
									WAP4C	0.916	0.042	<0.001	41	7	0.835	0.998	1
sCr	0.878	0.048	<0.001	83	9	0.784	0.971	1

表9举例说明了具有短暂AKI状态的主体的检测结果

表9

本领域技术人员将很容易理解，本发明适用于执行对象并获得提到的，也包括固有的结果和优点。这里所提到的例子是优选的实施例，具有示范性，但本发明对本发明的范围做任何限制。

显然本领域技术人员可以在不违背本发明范围和精神的情况下，本发明所公开的是可以做出不同的替换和修改的。

本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。

里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。

其他的实施方式都在如下的权利要求中。

Claims (20)

1.评估怀疑具有肾损伤主体的肾脏功能的方法，该方法包括：

执行检测的方法，该方法包括对来自主体的体液样本中的WAP4C进行检测，从而提供一个分析结果；

把分析结果与主体的肾脏功能进行关联。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，关联步骤包括：检测WAP4C的浓度，和，把所述的浓度与主体发生或不发生急性肾损伤进行关联。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，关联步骤包括：当WAP4C的浓度大于预先设置的WAP4C的基线浓度的时候，就把主体评估为要发生急性肾损伤；或者当WAP4C的浓度小于预先设置的WAP4C的基线浓度的时候，就把主体评估为不发生急性肾损伤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，预先设置的WAP4C的基线浓度是通过测定来自于主体的体液样本中的WAP4C浓度获得的，其中，所述的用来测定基线水平浓度的样本要早于提供分析结果所用的体液样本。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，预先设置的WAP4C的基线浓度是从第一和第二人群的样本中获得的，其中，第一人群个人具有急性肾损伤；第二人群主体不具有急性肾损伤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，预先设置的WAP4C的基线浓度从第二人群中分离出的第一人群的让步比至少为2或更多，或者为0.5或者更少。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，预先设置的WAP4C的基线浓度从第二人群中分离出的第一人群的让步比至少为3或更多，或者为0.33或者更少。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，预先设置的WAP4C的基线浓度从第二人群中分离出的第一人群具有至少大约70%的特异性。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，预先设置的WAP4C的基线浓度从第二人群中分离出的第一人群具有至少大约70%的灵敏度。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，体液样本选自如下组中的尿液、血液、血清和血浆。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括：

测定主体中如下组中的一个或多个指标：BNP水平,NT-proBNP水平,

proBNP水平;髓过氧物酶或绿过氧物酶水平,可溶性的FLT-1水平，C-反应蛋白水平；心脏肌钙蛋白水平,NGAL水平；血清肌氨酸酐水平,肌氨酸酐清除率,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，和肾小球滤过率。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括：测定所述主体中一个或多个如下变量：尿排出量，年龄，存在或不存在糖尿病，和存在或不存在高血压。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，WAP4C的极限值浓度在大约15ng/mL至大约25ng/mL之间。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，WAP4C的极限值浓度在为大约20.2ng/mL。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，WAP4C的极限值浓度通过测定生物样本中的蛋白水平来进行测定。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，蛋白水平的测定通过ELISA来进行测定。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，WAP4C的极限值浓度通过测定生物样本中的编码WAP4C的mRNA进行测定.

18.根据权利要求17所述的方法，其中，mRNA的测定通过RT-PCR测定。

19.评估主体肾功能的方法，该方法包括：

a.从主体上获得生物样本；

b.测定生物样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度；

c.把测定的样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度与WAP四二硫化物核心域的蛋白2的极限值浓度进行比较；

d.如果样本中的WAP四二硫化物核心域的蛋白2的浓度在某种极限浓度范围内，则确定主体是否具有肾损伤的可能性。

20.试剂盒子包括：

用于检测WAP4C的试剂；和装置，该装置带有编号的标准曲线，该标准曲线被用来校正对所述的检测结果获得WAP4C浓度的结果，其中，该标准曲线的浓度范围包括正常的WAP4C浓度和用来诊断急性肾损伤的WAP4C的极限浓度。