CN103805649A

CN103805649A - 制备塔格糖的方法

Info

Publication number: CN103805649A
Application number: CN201210458165.4A
Authority: CN
Inventors: 刘璐; 于鸿晶; 汪忠慧; 王莎莎; 王树海; 张军东
Original assignee: SHANGHAI SINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2014-05-21

Abstract

制备塔格糖的方法。提供了一种制备D-塔格糖的方法，所述方法包括以下步骤：（1）用嗜酸乳杆菌CCTCC NO: M98004催化半乳糖得到D-塔格糖。

Description

制备塔格糖的方法

技术领域

本发明涉及D-塔格糖的制备方法，具体利用涉及利用嗜酸乳杆菌转化半乳糖合成D-塔格糖的方法。

背景技术

随着现代生活水平的提高，人体的糖摄入量也在不断增加，而由此带来的健康问题也日益凸显，尤以肥胖、糖尿病及龋齿为主，因此研发低热量的甜味剂以替代蔗糖正在引起人们的重视。D-塔格糖是是一种自然界中少量存在的稀有糖，是果糖和D-半乳糖的异构体。D-塔格糖理化性质稳定，无任何不良异味，甜度约为蔗糖的92%，而热量仅为蔗糖的1/3左右（蔗糖4kcal/g,D-塔格糖1.5kcal/g），同时药理学和毒理学研究证明D-塔格糖具有改善肠道菌群、降低血糖、防止龋齿等多种益生功效，用于人体安全、无毒。2001年4月，美国FDA确定D-塔格糖为公认安全食品（GRAS），随后，韩国、澳大利亚、新西兰、欧盟都批准D-塔格糖用于食品。联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）联合食品添加剂委员会（JECFA）2004年57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂。另外，美国Spherix公司将D-塔格糖用于治疗Ⅱ型糖尿病，目前正在进行三期临床。

D-塔格糖的生产方法包括自然分离、化学催化和生物转化。由于D-塔格糖的含量在自然界中的含量较为稀少，因此自然分离方法用于工业规模生产塔格糖是不可行的。化学催化合成D-塔格糖存在副反应多、杂质多、难以分离、安全性不高等诸多问题。目前生物转化合成D-塔格糖主要是通过基因工程手段在大肠杆菌内表达耐热L-阿拉伯糖异构酶，然后将酶纯化并固定化以催化D-半乳糖生成D-塔格糖来进行，该方法存在稳定性较差、成本高的问题。此外，由于宿主菌采用大肠杆菌，用于人体直接服用的产品生产时存在一定的风险。除利用重组大肠杆菌生产D-塔格糖外，专利CN200610085922.2公开了一种利用乳酸菌发酵生产D-塔格糖的方法，但是发酵法往往存在杂质较多、含量较低且不稳定的问题，该方法最高产率为450mg/100mL。

因此，为解决上述现在D-塔格糖生产技术存在的问题，建立一种高效、经济、环保的D-塔格糖生产方法是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的D-塔格糖的制备方法。

本发明一方面提供了一种制备D-塔格糖的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）用嗜酸乳杆菌CCTCC M98004催化半乳糖得到D-塔格糖。

在本发明的一个优选实例中，所述方法还包括用培养基培养嗜酸乳杆菌CCTCC M98004的步骤。

在本发明的一个优选实例中，所述方法还包括将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成静息状态菌体的步骤。

在本发明的一个优选实例中，所述方法还包括将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成固定化菌体的步骤。

在本发明的一个优选实例中，所述方法包括以下步骤：

（1）用培养基培养嗜酸乳杆菌CCTCC M98004；

（2）将步骤（1）的培养后的嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成静息状态菌体和/或固定化菌体；以及

（3）用步骤（2）得到的静息状态菌体和/或固定化菌体催化半乳糖得到D-塔格糖。

在本发明的一个优选实例中，在催化半乳糖得到D-塔格糖的步骤中可加入硼酸或硼酸盐。

在本发明的一个优选实例中，所述硼酸盐选自硼酸碱金属盐和二价金属阳离子的硼酸盐。

在本发明的一个优选实例中，催化半乳糖得到D-塔格糖时的温度为40-90℃，较好为50-80℃，更好为60-70℃，最好为60-65℃。

在本发明的一个优选实例中，催化半乳糖得到D-塔格糖时的时间为1-100小时，较好为10-80小时，更好为24-72小时，最好为48小时。

本发明另一方面提供了嗜酸乳杆菌CCTCC M98004在制备D-塔格糖中的用途。

本发明所述的方法可有效地制备D-塔格糖。

附图说明

图1表示HPLC检测D-塔格糖含量(A为D-半乳糖和D-塔格糖标准品图；B为实施例1所示静息状态菌体检测塔格糖结果)。

图2表示实施例2所示反应温度和时间对固定化菌体催化合成D-塔格糖的影响。

图3表示固定化菌体连续批次催化合成D-塔格糖。

具体实施方式

在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。

在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。

在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

（1）用嗜酸乳杆菌CCTCC M98004催化半乳糖得到D-塔格糖。

本发明所用的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus嗜酸乳酸杆菌YIT2004（L））已经于1998年2月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M98004。保藏单位地址：中国武汉武汉大学。

在本发明的一个优选实例中，所述嗜酸乳杆菌CCTCC M98004通过培养基培养。因此，在本发明的一个优选实例中，所述方法还包括用培养基培养嗜酸乳杆菌CCTCC M98004的步骤。

在本发明中，所述培养基是常规的，本领域的普通技术人员在阅读本发明的说明书再结合现有技术可以直接推导出哪些培养基可用于本发明。在本发明的一个优选实例中，所述培养基包括氮源、碳源和特殊成分。在本发明的另一个优选实例中，所述培养基是疱肉管培养基，所述疱肉管培养基包括5重量份的trypton（胰蛋白胨）、5重量份的酵母提取物5、5重量份的葡萄糖、2重量份的可溶性淀粉、3重量份的牛肉膏、2重量份的KH2PO4(pH 7.6)。在本发明的另一个优选实例中，所述培养基是发酵培养基，所述发酵培养基包括20重量份的trypton（胰蛋白胨）、5重量份的酵母提取物、15重量份的葡萄糖、5重量份的Polypepton（蛋白胨）、5重量份的乳糖、5重量份的K2HPO4、1重量份的硫酸镁、0.15重量份的硫酸锰、5重量份的碳酸钙、200mL/L的西红柿汁pH 7.0）。在本发明的另一个优选实例中，所述培养基是疱肉管培养基和/或发酵培养基。

在本发明的一个优选实例中，所述嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成静息状态菌体。因此，在本发明的一个优选实例中，所述方法还包括将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成静息状态菌体的步骤。

在本发明中，将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成静息状态菌体的步骤是常规的。本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术中可以直接推导出哪些方法可用于将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成静息状态菌体。

在本发明的一个优选实例中，所述将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成静息状态菌体的方法如下进行：

首先将冻干菌粉加入无菌水稀释涂布在MRS固体培养基上活化生长。在MRS固体培养基上挑取典型菌落，接种入一级种子培养基（同发酵培养基），37℃厌氧静置培养到对数生长期后期，再按照10%的比例接种到二级发酵培养基中，37℃静置培养到稳定器后期终止。培养结束后，4℃离心得到菌泥使用预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）漂洗后，离心重悬于磷酸缓冲液4℃得到静息状态菌体。

在本发明的一个优选实例中，所述嗜酸乳杆菌CCTCC M98004也优选制备成固定化菌体。因此，在本发明的一个优选实例中，所述方法还包括将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成固定化菌体的步骤。

在本发明中，将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成固定化菌体的步骤是常规的。本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术中可以直接推导出哪些方法可用于将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成固定化菌体。

在本发明的一个优选实例中，所述将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004优选制备成固定化菌体的方法如下进行：

首先对冷冻干燥的嗜酸乳杆菌进行活化培养。将其接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧培养2天左右，待典型菌落形成后，接种到一级种子培养基（同发酵培养基），37℃厌氧静置培养到对数生长期后期，再按照10%的比例接种到二级发酵培养基中，37℃静置培养到稳定器后期终止，离心并漂洗后得到固定化菌体。

因此，在本发明的一个优选实例中，本发明还提供了一种制备D-塔格糖的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）用培养基培养嗜酸乳杆菌CCTCC M98004；

在本发明的一个优选实例中，为了提高D-塔格糖的转化率，在用嗜酸乳杆菌CCTCC M98004（或者静息状态菌体和/或固定化菌体）催化半乳糖得到D-塔格糖的步骤中可加入硼酸或硼酸盐，例如硼酸碱金属盐和二价金属阳离子的硼酸盐。所述二价金属阳离子优选为Co2+、Mn2+及其组合。

在本发明中，用嗜酸乳杆菌CCTCC M98004（或者静息状态菌体和/或固定化菌体）催化半乳糖得到D-塔格糖的步骤中的条件是常规的。本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接得到其具体条件。在本发明的一个优选实例中，温度为40-90℃，较好为50-80℃，更好为60-70℃，最好为60-65℃。在本发明的一个优选实例中，时间为1-100小时，较好为10-80小时，更好为24-72小时，最好为48小时。

下面结合实施例细说明本发明，这些实施例只是用于举例说明的目的，并没有限制本发明的范围。

实施例

实施例1：疱肉管培养基的制备

疱肉管培养基（1L）：trypton 5g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉2g，牛肉膏3g，KH2PO42g(pH 7.6)。分装试管7mL/管，加牛肉渣0.4g。115℃30分钟灭菌备用。

实施例2：发酵培养基的制备

发酵培养基（1L）：trypton 20g，酵母提取物5g，葡萄糖15g，Polypepton5g，乳糖5g，K2HPO45g，硫酸镁1g，硫酸锰0.15g，碳酸钙5g，西红柿汁200mL/L（pH 7.0）。115℃30分钟灭菌备用。

实施例3：嗜酸乳杆菌的扩大培养

取冷冻干燥保存的嗜酸乳杆菌CCTCC M98004，用灭菌的无菌水重悬后，稀释到合适浓度后，直接涂布到MRS固体平板。37℃厌氧环境培养48小时。挑取典型的嗜酸乳杆菌菌落，接种到一支疱肉管（包括实施例1的疱肉管培养基）中，37℃厌氧环境培养48小时后再将该支疱肉管分别接种到同一批疱肉管中培养，以获得一批来源相同、生长一致的嗜酸乳杆菌。将一支疱肉管接种到一级种子培养基（同实施例2的发酵培养基）中，用微需氧产气袋保持微氧环境，37℃静置培养到对数生长期后期（11小时左右），再按照10%的比例接种到二级发酵培养基（同实施例2的发酵培养基）培养到稳定期后期（13小时左右）终止培养。

实施例4：静息状态乳杆菌催化合成D-塔格糖

将扩大培养获得的嗜酸乳杆菌置于冰上冷冻，4℃离心得到菌泥使用预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）漂洗后，离心得到的菌泥与100g/L的D-半乳糖溶液混合，置于65℃水浴锅中反应48小时，检测D-塔格糖的含量。结果见图1。积分计算可得D-塔格糖的含量达到17g/L，转化率达到17%。相比较于专利CN200610085922.2结果（450mg/100mL）有3倍提高。

实施例5：固定化嗜酸乳杆菌催化合成D-塔格糖

将扩大培养获得的嗜酸乳杆菌置于冰上冷冻，4℃离心得到菌泥使用预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）漂洗后，得到乳酸菌菌体用1.5-2%浓度的海藻酸钠溶液与乳酸菌菌体充分混匀后，将其滴入1%浓度的氯化钙溶液中，室温放置一段时间后，离心并用无菌水漂洗，加入0.2%浓度的戊二醛溶液，置于磁力搅拌器上，室温放置1小时，纯水漂洗后重悬于磷酸盐缓冲液中4℃备用。将固定化菌体与100g/L的D-半乳糖溶液混合，再加入硼酸使其浓度达到0.3-0.5M，加入Co2+、Mn2+浓度为（0.1%），控制反应pH在7.5-8之间，置于60-65℃水浴锅中反应48小时，检测D-塔格糖的含量。在本实施例中，分别考察了温度（50℃、60℃、65℃、70℃）和时间（12、24、36、48小时）对D-塔格糖合成量的影响。结果见图2，显示反应温度65℃左右，时间48小时左右产量最高，转化率近40%。可见使用固定化菌体，同时添加一定量的硼酸类物质和特定2价金属离子可以提高D-塔格糖的合成量。

实施例6：催化批次对对D-塔格糖合成的影响

为验证固定化细胞催化能力的稳定性，在如实施例5所述一次催化反应完成以后，10000rpm离心10min后，获得固定化菌体小球，用磷酸盐缓冲液充分漂洗后，继续进行下一批次的催化反应，以测试其催化能力有无改变。结果（图3）显示连续7个批次反应固定化菌体的催化能力保持了很好的稳定性。

Claims

1.一种制备D-塔格糖的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）用嗜酸乳杆菌CCTCC M98004催化半乳糖得到D-塔格糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用培养基培养嗜酸乳杆菌CCTCC M98004的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成静息状态菌体的步骤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将嗜酸乳杆菌CCTCC M98004制备成固定化菌体的步骤。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用培养基培养嗜酸乳杆菌CCTCC M98004；

6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，在催化半乳糖得到D-塔格糖的步骤中可加入硼酸或硼酸盐。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硼酸盐选自硼酸碱金属盐和二价金属阳离子的硼酸盐。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化半乳糖得到D-塔格糖时的温度为40-90℃，较好为50-80℃，更好为60-70℃，最好为60-65℃。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化半乳糖得到D-塔格糖时的时间为1-100小时，较好为10-80小时，更好为24-72小时，最好为48小时。

10.嗜酸乳杆菌CCTCC M98004在制备D-塔格糖中的用途。