CN103782906B - 一种香樟品种涌金植株再生的方法 - Google Patents

Abstract

一种香樟品种‘涌金’植株再生的方法，包括下列步骤：(1)采集香樟品种‘涌金’当年抽的新梢，带回实验室后去除叶片，剪成带有1～2个带腋芽的茎段，无菌化后接种至含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培养基中诱导腋芽的形成；(2)将长势良好的‘涌金’腋芽连同茎段接种至含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培养基中进行继代和增殖培养；(3)将生长幼嫩、平均芽长为2.0cm左右、长势良好增殖形成的丛生芽用解剖刀切割后接种至含有吲哚丁酸的1/2MS培养基中诱导不定根的形成。本发明克服了腋芽诱导与生长困难、继代与增殖新叶黑死、脱落和生长势衰弱的现象，使得无菌材料长期继代，从而能够大量增殖。诱导产生的丛生芽生势旺盛、遗传性状与母本一致。

Description

一种香樟品种涌金植株再生的方法

技术领域

本发明属于组织培养领域，具体涉及一种香樟品种涌金植株再生的方法。

背景技术

樟树(Cinnamomumcaphora)又名香樟，为樟科樟属的亚热带常绿阔叶乔木。其生长迅速，枝繁叶茂，四季常绿，叶形秀丽而又散发浓香，既是珍贵的芳香油类树种又是城市重要的景观和绿化树种。香樟新品种涌金(Cinnamomumcamphora‘Yongjin’，国家植物新品种权号2009009)系香樟种子变异种，枝干鲜红色，新叶、花呈金黄色，果皮呈黄色，并且枝干、叶、果皮色泽具有季相变化，作为高大的彩叶乔木，具有非常高的园林观赏及推广应用潜力与价值。但涌金种子遗传物质不稳定，育苗后代退化率高达99％以上，为获得优良无性系目前已经开展嫁接实验以期获得保持母本优良性状的子代。采用扦插繁殖，由于母树枝条数量有限，很难满足现实的需求。

组织培养是最具有应用潜力的无性快速繁殖技术，能保持母本的优良遗传特性。通过植物组织培养技术，不但可在短期内提供整齐一致的良种苗木，而且还能树种改良和利用及遗传转化打下基础，已经在许多植物育苗中获得应用。目前国内外对普通香樟组培非常重视，从1992年连方青报道香樟的组培研究成果以来，国内外学者利用伐根萌条、不同龄期的茎段、茎尖、种子、离体胚、幼叶、嫩芽等作为外植体进行了组织培养研究工作并诱导出完整植株。涌金作为普通香樟的变异品种，其组培研究工作国内外尚未见报道。香樟新品种涌金是普通香樟种子变异而来，作为重要的彩叶树种未来推广应用的价值潜力巨大，当前数量稀少，其快速繁殖的研究工作非常迫切。因此，探索涌金植株再生的方法，实现其规模化繁殖，不但可丰富园林彩叶植物品种，满足市场需求，也对樟科其它植物的组培技术研究具有重要的借鉴意义。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明主要填补现有香樟新品种涌金组培技术空白，针对以茎段为外植体的涌金植株再生过程中腋芽的诱导与生长困难、腋芽的继代与增殖过程新叶脱落和黑死、丛生芽生根难度大等问题，研究适合涌金组培快繁各个阶段的培养条件，旨在为实现涌金快速繁殖提供有效帮助。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种香樟品种涌金植株再生的方法，包括下列步骤：

(1)采集香樟品种涌金当年抽的新梢，带回实验室后去除叶片，剪成带有1～2个带腋芽的茎段，用洗洁精清洗4～5min，流水冲洗30min以上。在超净工作台上用75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞根据茎段直径大小消毒8～12min，无菌水冲洗4～5次。滤纸吸干水分，切去茎段褐化部分，接种至无激素的MS培养基中。挑选无菌茎段作为腋芽诱导的外植体，含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培养基中，20d后腋芽开始萌动并逐渐展叶、伸长；

(2)将长势良好的涌金腋芽连同茎段接种至含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培养基中腋芽能够正常生长和增殖，30d后平均有效芽最多可达到6.5个；

(3)将生长幼嫩、平均芽长为2.0cm左右、长势良好增殖形成的丛生芽用解剖刀切割后成单芽接种至含有吲哚丁酸的1／2MS培养基中诱导不定根的形成，30d后最高生根率为41.3％，继续培养30d后将再生植株移栽至泥炭∶珍珠岩＝3∶1的基质中移栽成活率可达到85％。

上述过程所采用的培养条件为：pH值5.8～6.0，温度24～26℃，光照2000Lux，每日光照时间12h。

其中，在步骤(1)中外植体采集的时间是8月份，所述诱导腋芽的培养基中添加6-BA1.0mg／L、IBA0.02mg／L、蔗糖30％。

在步骤(2)中伸长的腋芽需得连同原茎段一同接入继代与增殖培养基，该培养基中添加6-BA3.0mg／L、IAA0.05mg／L、蔗糖30％。

在步骤(3)中所述促进不定根诱导与伸长的培养基中添加IBA0.05mg／L、蔗糖20％。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明以香樟品种涌金茎段为外植体，通过直接器官发生方式获得了再生植株，并通过激素种类和浓度的调控克服了腋芽诱导与生长困难、继代与增殖新叶黑死、脱落和生长势衰弱的现象，使得无菌材料长期继代，从而能够大量增殖。通过本发明诱导产生的丛生芽生势旺盛、遗传性状与母本一致，为实现优质材料的大规模组培生产奠定基础。

附图说明

图1为涌金腋芽在萌动；

图2为涌金腋芽伸长与展叶；

图3为涌金腋芽新叶黑死、脱落；

图4为涌金腋芽的木质化难以增殖；

图5为涌金腋芽增殖；

图6为涌金丛生芽的生根。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述：若无特殊说明，以下试剂均为市售试剂，以下设备均为本领域常用设备。

实施例1：

本发明的实验材料取自宁波林业局种苗中心邱隘基地生长14年的香樟新品种涌金植株。取发育充实、半木质化的侧梢和顶梢部分，去除叶片，剪成带有1～2个带腋芽的茎段，用洗洁精清洗4～5min，流水冲洗30min以上。在超净工作台上用75％的酒精消毒3min，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞根据茎段直径大小消毒8～12min，无菌水冲洗4～5次。滤纸吸干水分，切去茎段褐化部分，接种至无激素的MS培养基中。挑选无菌茎段作为腋芽的外植体，接种至MS+6-BA1.0mg／L+IBA0.02mg／L的诱导培养基中，20d后待腋芽的茎段开始萌动并继续生长。

将在上述培养条件中获得的高度为2cm左右的腋芽转移至MS+6-BA3.0mg／L+IAA0.05mg／L继代与增殖培养基中，在此培养基上腋芽新叶黑死、落叶、生长逐渐衰弱等问题得到解决，而且每个腋芽可形成6.5个有效芽。

将生长一致、高度为2cm左右的丛生芽切下接种至1／2MS+IBA0.05mg／L的生培养基中，30d后在此培养基中可获得香樟新品种涌金的完整植株。

下面一些具体的实验情况将有助于说明本发明所述涌金茎段再生过程各个发育阶段所用配方的有效性，所有实验至少重复3次。

试验例1，激素对涌金腋芽萌发与生长的影响

在添加有适宜浓度的6-BA与IBA培养基中，无菌化后的涌金茎段20d后腋芽开始萌动、抽长并长出新叶见(图1、图2)。分析表1可知，在单独添加6-BA的诱导培养基中，腋芽的萌发率随6-BA浓度的增加而提高，当6-BA浓度为1.0mg·L^-1及以上时带腋芽的茎段均可萌发，但伸长困难且不展叶，这说明单独添加6-BA不利于涌金茎段的萌发。进一步实验表明，在添加有IBA的诱导培养基中，尽管可以提高茎段萌发率，但6-BA过低或过高都不利于涌金茎段腋芽的生长。当IBA浓度为0.02～0.1mg／L，6-BA为0.5mg／L时，腋芽生长缓慢，难以展叶；6-BA为3mg／L时，腋芽虽可伸长，但是腋芽新叶尖端出现坏死，新叶出现脱落现象，基部愈伤组织增多进而褐化的情况，继代培养表明，腋芽容易衰弱死亡。在MS+6-BA1mg／L+IBA0.02mg／L培养基中诱导芽从平均叶长、平均芽长与其他培养基的诱导均具有显著优势，同时生长势旺盛并伴不定芽的分化(图2)，因此综合分析得出该培养基是本次实验涌金茎段腋芽有诱导的最佳培养基。

表1不同6-BA与IBA浓度组合对腋芽萌发的影响①

①-：无愈伤组织；+：少量愈伤组织；++：愈伤组织一般；+++：愈伤组织严重

试验例2，激素对涌金腋芽继代与增殖的影响

涌金腋芽在继代容易出现叶片死亡、生长势逐渐衰弱、逐渐木质化而导致难以增殖的现象(图4)。实验结果如表2所示，培养基MS添加不同浓度的6-BA和IBA的培养基中，虽然有部分组合腋芽可以增殖，然后形成的腋芽及其丛生芽在继代过程中逐渐落叶、生长势越来越衰弱最终死亡(图3)。而在添加有不同浓度的6-BA和IAA的培养基中，腋芽增殖形成的丛生芽可正常生长。当IAA浓度为0.02～0.10mg／L时，6-BA为0.5mg／L时腋芽无增殖，同时腋芽逐渐木质化，再生难度增加；随着6-BA由1mg／L增加到3mg／L时，丛生芽从腋芽的基部、叶腋部增殖出来(图5)，且长势旺盛，叶色嫩绿。当6-BA一定时，随着IAA浓度增加，切口基部愈伤组织增加，不利于丛生芽的增殖。在培养基MS+6-BA3.0mg/L+IAA0.05mg/L中腋芽增殖达到的平均有效芽数比其他增殖培养基数量都多，且形成的丛生芽生长状态好。因此，该培养基是本次实验涌金腋芽适宜的继代与增殖培养基。

表2不同6-BA与IBA、IAA浓度组合对腋芽继代与增殖的影响①

①-：无愈伤组织；+：少量愈伤组织；++：愈伤组织一般；+++：愈伤组织严重

试验例3，激素对涌金丛生芽生根的影响

将生长至2cm的涌金丛生芽转移至大量元素减半的添加有不同浓度生长素的生根培养基中。由表3可知，培养基无任何激素时丛生芽没有生根，随着IBA浓度的增加丛生芽的生根率逐渐增加，然而当IBA浓度为0.1mg／L及以上时，丛生芽的切口愈伤组织增多，根从愈伤组织长出，根的维管束组织与茎的维管束组织不相连，不利于生根苗的成活。同时形成的不定根大多数为单根，较少有侧根形成(图6)。丛生芽在1／2MS+IBA0.05mg/L中生根率、平均根数与其他生根培养基存在优势，因此该培养基在本实验中相对适合涌金丛生芽的生根培养。

表3IBA对涌金丛生芽生根的影响

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种香樟品种涌金植株再生的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)采集香樟品种涌金当年抽的新梢，带回实验室后去除叶片，剪成带有1～2个腋芽的茎段，用洗洁精清洗4～5min，流水冲洗30min以上，在超净工作台上用75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞根据茎段直径大小消毒8～12min，无菌水冲洗4～5次，滤纸吸干水分，切去茎段褐化部分，接种至无激素的MS培养基中，挑选无菌茎段作为腋芽诱导的外植体，接种至含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培养基中，20d后腋芽开始萌动并逐渐展叶、伸长；外植体采集的时间是8月份，所述含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培养基的添加配比为6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、吲哚丁酸0.02mg/L、蔗糖30％；

(2)将长势良好的涌金腋芽连同茎段接种至含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培养基中腋芽能够正常生长和增殖，30d后平均有效芽最多可达到6.5个，此步骤中的含有6-苄氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸0.05mg/L、蔗糖30％；

(3)将生长幼嫩、平均芽长为2.0cm、长势良好增殖形成的丛生芽用解剖刀切割后成单芽接种至含有吲哚丁酸的1/2MS培养基中诱导不定根的形成，30d后最高生根率为41.3％，继续培养30d后将再生植株移栽至泥炭∶珍珠岩＝3∶1的基质中移栽一个月；上述过程所采用的培养条件为：pH值5.8～6.0，温度24～26℃，光照2000Lux，每日光照时间12h，此步骤中含有吲哚丁酸的1/2MS培养基中添加吲哚丁酸0.05mg/L、蔗糖20％。