CN103767975B - 桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用；桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为30～90%（重量%），所述苯乙醇总苷包括毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。桂花苯乙醇苷提取物中毛蕊花糖苷含量为25～80%（重量%），苯乙醇总苷中毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的重量之比为48:1～300:1。

Description

桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及农副产品精深加工及综合利用领域。更具体地涉及一种从桂花中提取的苯乙醇苷提取物的用途—用于制备美白化妆品。

背景技术

桂花，又名木樨、岩桂,是中国传统十大花卉之一，广泛栽种于淮河流域及以南地区，目前我国已形成浙江杭州、安徽六安、湖北咸宁、湖南桃源、江苏苏州、广西桂林、湖北武汉和四川成都等几大桂花商品生产基地。桂花品种繁多，大约有152个品种，可分为四个品系，即四季桂、丹桂、银桂、金桂。桂花除了观赏美化以外，还具有较高的营养和药用价值。中医认为桂花为百药之长，用桂花酿制的酒开胃醒神、健胃补虚，能达到“饮之寿千岁”的功效，桂花茶具有美容养颜、舒缓喉咙、改善多痰咳嗽等功效。桂花还被做成糯米桂花藕、桂花糕、桂花杏仁豆腐等美食，为广大老百姓所喜欢。

然而，迄今为止人们对桂花中的许多功能成分的研究还非常少，主要集中在桂花赋香成分和少数几个药用成分，如芳樟醇、γ-癸内酯、β-紫罗兰酮、4-氢-β-紫罗兰酮、棕榈酸、α-亚麻酸。还有部分对桂花中的黄酮类组分和多酚类组分进行分离提取纯化的研究，但仅限于粗提物的研究，未见单体化合物的分析。

本发明人前期的发明专利201310169455.1公开了一种桂花多酚提取物，其酚酸的重量含量为0.5％～2％，苯乙醇苷的重量含量为50％～80％，其中绿原酸的重量含量为40%～70%，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为25～50：5～15：6～10，苯乙醇苷中毛蕊花苷的重量含量为80％～95％；同时该专利还公开了一种制备方法-高压微波提取法。但是随着研究的深入，我们发现桂花中还含有除了毛蕊花糖苷之外的其他的苯乙醇苷类化合物。此外，传统的桂花多酚提取中，没有关注苯乙醇苷化合物的稳定性，因此对提取得率和提取物纯度有所影响，因此，需要在提取过程中采取措施防止苯乙醇苷的氧化和分解。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种含有异毛蕊花糖苷的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的改进：

桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为30～90%（重量%），所述苯乙醇总苷包括毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进：所述桂花苯乙醇苷提取物中毛蕊花糖苷含量为25～80%（重量%），苯乙醇总苷中毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的重量之比为48:1～300:1。

备注说明：毛蕊花糖苷约占苯乙醇总苷含量的90%左右。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进：所述桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为40～80％；

所述桂花苯乙醇苷提取物中毛蕊花糖苷含量为35～70%，苯乙醇总苷中毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的重量之比为48:1～150:1（例如为48:1，77:1，80～150:1）。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进：桂花苯乙醇苷提取物的制备方法包括以下步骤：

（a）、将桂花干花（水分含量≤10%）破碎（约20～40目的粉末），加入至乙醇水溶液中，再加入抗氧化剂或抗氧化剂的水溶液，然后加入弱酸直至pH为4～6，得提取溶液；

所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为30～99.9%（v/v）；上述浓度较佳为50～90%；

所述每1KG桂花干花配用10～15L的乙醇水溶液；

所述抗氧化剂与桂花干花的重量比为：0.05～10%；上述重量比较佳为0.2%；

（b）、将提取溶液于50～80℃下进行浸提1.5～3.0小时，冷却至室温后，过滤或离心，得到提取液；

（c）、将提取液直接经减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；再将浓缩液用水稀释，直至所得稀释液的pH为4-6；

（d）、将稀释液经吸附树脂吸附，用体积浓度为20～50%的乙醇水溶液洗脱；

（e）、洗脱液减压浓缩后，干燥（例如为喷雾干燥、低压烘干或微波干燥），得到桂花苯乙醇苷提取物。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进：

所述抗氧化剂为抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠、维生素E、类胡萝卜素、竹叶抗氧化剂或茶多酚；

所述弱酸为甲酸、乙酸、羟基乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、抗坏血酸、肉桂酸、苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、没食子酸或磷酸。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进：所述桂花为金桂、银桂、四季桂或丹桂。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进：制备方法包括以下步骤：

（a）、将1kg丹桂干花破碎（水分含量≤10%）破碎至能过20目的筛，加入至10L体积浓度为90%的乙醇水溶液中，再加入竹叶抗氧化物溶液2L，利用1mol/L乙酸水溶液调整pH为5，得提取溶液；

所述每升竹叶抗氧化物溶液中含有1g竹叶抗氧化物；

（b）、将提取溶液于50～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤或离心，得到提取液；

（c）、将提取液直接经减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；再将浓缩液用水稀释，直至所得稀释液的pH为4；

（d）、将稀释液经吸附树脂吸附，用体积浓度为30%的乙醇水溶液洗脱；

（e）、洗脱液减压浓缩后，经喷雾干燥、低压烘干或微波干燥，可得到桂花苯乙醇苷提取物。

作为本发明的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用的进一步改进，制备方法包括以下步骤：

（a）、将1kg金桂干花破碎（含水率≤10%）破碎至能过20目的筛，加入至15L体积浓度为80%乙醇水溶液中，再加入异抗坏血酸钠水溶液2L，利用1mol/L甲酸水溶液调整提取溶液pH为5，得提取溶液；

每升异抗坏血酸钠水溶液中含有1g异抗坏血酸钠；

（b）、将提取溶液于50～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤或离心，得到提取液；

（c）、将提取液经减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；再用水稀释，直至所得稀释液的pH为5；

（d）、将稀释液经吸附树脂吸附，用体积浓度为30%的乙醇水溶液洗脱；

（e）、洗脱液减压浓缩后，经喷雾干燥、低压烘干或微波干燥，得到桂花苯乙醇苷提取物。

在本发明中，室温一般是指10～25℃。

本发明人经过多年深入研究，对桂花的各种成分进行了提取分离，获得了桂花苯乙醇苷提取物，对该提取物的研究表明，该提取物主要含毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等成分。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，桂花（Osmanthusfragrans）指桂花树的花朵。

本发明采用的原料可以进行预处理，也可以不经过预处理。一种优选原料是粉末形式的桂花。例如，收集鲜桂花，打成浆压榨或收集桂花干花，将其粉碎到约20～40目的粉末。

可用于本发明的桂花品种没有特别限制，可以是不同品种的桂花，优选金桂、银桂、四季桂、丹桂。

本发明的桂花苯乙醇苷提取物是一种以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷为主的混合物。用分光光度法检测，以毛蕊花糖苷为标准品，测得提取物中苯乙醇总苷的含量为30～90%(较佳地为40～80％)；用HPLC技术分析，提取物中毛蕊花糖苷含量为25～80%(较佳地为35～70％)，毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷含量之比为48:1～300:1(较佳地为48:1～150:1)。

在常规的化妆品中，加入0.05%-20%(w/w)的桂花苯乙醇苷提取物，即可得美白化妆品；优选用量为0.5-10%(w/w)。使用时按照该化妆品的常规用法和用量进行涂抹即可。

本发明的主要优点是：

(a)提供了一种来源广阔、组成明晰、品质优良、质量可控、用途广泛并具有美白用途的桂花苯乙醇苷提取物。

(b)通过本发明技术实现了桂花中苯乙醇苷的高效提取，并且工艺操作简便，得到的桂花苯乙醇苷提取物质量好，品质稳定。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是桂花苯乙醇苷提取物的液相色谱图。

图2是毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的液相色谱图。

图3是毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的化学结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用方法

1）苯乙醇总苷含量测定：

将50.0mg桂花苯乙醇苷提取物溶解于甲醇，定容至100ml，取3ml加入石英比色皿中用紫外分光光度计在338nm处检测其吸光值，重复测定3次，以毛蕊花糖苷为标准品，根据标准曲线计算得到苯乙醇总苷含量。

2）桂花苯乙醇苷提取物中毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量测定-高效液相色谱（HPLC）：

桂花苯乙醇苷提取物加入2%（体积%）乙酸溶液溶解，制成500μg/mL溶液，过0.45μm膜，进样。高效液相色谱仪器：岛津LC-2010A高效液相，SPD-20A紫外检测器，BDSC18柱(4.6mm×250mm,5μmi.d.)，流动相：乙腈：2%醋酸溶液（20:80的体积比），检测波长：330nm，流速：0.8mL/min，柱温：35℃，进样体积10μL。以毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷为标准品，根据保留时间定性，根据峰面积外标法定量。

实施例1：

将1kg金桂干花破碎（含水率≤10%，破碎至能过20目的筛），加入15L的80%（体积%）乙醇水溶液中，再加入0.1%的异抗坏血酸钠水溶液（即，所述每升异抗坏血酸钠水溶液中含有1g异抗坏血酸钠）2L，利用1mol/L甲酸水溶液调整提取溶液pH在5左右；在温度50℃～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤得到提取液；将提取液直接经减压浓缩（于0.010～0.100MPa，温度为50～60℃），回收乙醇，得到浓缩液（约4L），再用水稀释，直至稀释液pH为5左右；将稀释液经吸附树脂吸附（吸附树脂为HPD300，用量为1L），用30%（体积%）的乙醇水溶液2L洗脱；洗脱液减压浓缩（于0.010～0.100MPaMPa，温度为75～90℃）后，经喷雾干燥（进风温度为180～200℃，出风温度为85～95℃），即可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末184g。

对提取物进行成分分析，结果为：桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为75.3%，图1-3表明，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（69.4%）和异毛蕊花糖苷（0.9%），毛蕊花糖苷：异毛蕊花糖苷=77：1（重量比）。

对比例1-1、将实施例1中的“15L的80%（体积%）乙醇水溶液”改成“12L的纯乙醇”，其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末171g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为70.5%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（65.6%）和异毛蕊花糖苷（0.9%）。

对比例1-2、将实施例1中的“15L的80%（体积%）乙醇水溶液”改成“20L的60%（体积%）乙醇水溶液”，其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末187g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇苷含量为71.2%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（67.3%）和异毛蕊花糖苷（0.8%）。

对比例2-1、将“0.1%异抗坏血酸钠水溶液2L”改成：0.04%异抗坏血酸钠水溶液（即，所述每升异抗坏血酸钠水溶液中含有0.4g异抗坏血酸钠）2L；其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末123.8g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为25.2%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（23.4%）和异毛蕊花糖苷（0.2%）。

对比例2-2、将“0.1%（质量%）异抗坏血酸钠水溶液2L”改成：1.0%异抗坏血酸钠水溶液（即，所述每升异抗坏血酸钠水溶液中含有10g异抗坏血酸钠）2L；其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末172.7g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为75.3%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（69.4%）和异毛蕊花糖苷（0.9%）。

对比例3-1，将调节pH至5改成调节3.5，其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末160.6g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为64.2%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（60.5%）和异毛蕊花糖苷（0.7%）。

对比例3-2，将调节pH至5改成调节6.5，其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末151.9g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为61.1%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（56.8%）和异毛蕊花糖苷（0.7%）。

对比例4-1、将“50℃～80℃下进行浸提2小时”改成“30℃～49℃下进行浸提4小时”，其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末142.8g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为74%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（68.5%）和异毛蕊花糖苷（0.85%）。

对比例4-2、将“50℃～80℃下进行浸提2小时”改成“90℃～100℃下进行浸提2小时”，其余同实施例1。

最终可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末194.6g。所得的桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为70.5%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（66.8%）和异毛蕊花糖苷（0.9%）。

实施例2：

将1kg四季桂干花破碎（含水率≤10%，破碎至能过20目的筛），加入10L的90%（体积%）乙醇水溶液中，再加入0.2%抗坏血酸水溶液（即，所述每升抗坏血酸水溶液中含有2g抗坏血酸）2L，利用0.5mol/L乙酸水溶液调整提取溶液pH在4左右；在温度50℃～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤得到提取液；将提取液直接经减压浓缩（于0.010～0.100MPa，温度为50～60℃），回收乙醇，得到浓缩液（约1.5L），再用水稀释，直至稀释液pH为4左右；将稀释液经吸附树脂吸附（所述吸附树脂为HPD300，用量为1L），用30%（体积%）的乙醇水溶液2L洗脱；洗脱液减压浓缩（于0.010～0.100MPaMPa，温度为75～90℃）后，经微波干燥（工艺参数为：微波功率500W,微波辐射时间60min），即可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末234g。

对提取物进行成分分析，结果桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为47.3%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（40.5%）和异毛蕊花糖苷（0.2%），毛蕊花糖苷：异毛蕊花糖苷=203（重量比）。

实施例3：

将1kg丹桂干花破碎（含水率≤10%，破碎至能过20目的筛），加入至10L的90%（体积%）乙醇溶液中，再加入0.1%竹叶抗氧化物水溶液（即，所述每升竹叶抗氧化物水溶液中含有1g竹叶抗氧化物）2L，利用1mol/L乙酸水溶液调整提取溶液pH在5左右；得提取溶液；将提取溶液在温度50℃～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤得到提取液；将提取液直接经减压浓缩（于0.010～0.100MPa，温度为50～60℃），回收乙醇，得到浓缩液（约2.5L），再用水稀释，直至稀释液pH为4左右；将稀释液经吸附树脂吸附（所述吸附树脂为HPD300，用量为1L），用30%（体积%）的乙醇水溶液2L洗脱；洗脱液减压浓缩（于0.010～0.100MPaMPa，温度为75～90℃）后，经微波干燥（工艺参数为：微波功率500W,微波辐射时间60min），即可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末258g。

对提取物进行成分分析，结果桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为74.5%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（68.9%）和异毛蕊花糖苷（1.4%），毛蕊花糖苷：异毛蕊花糖苷=48（重量比）。

实施例4：

将1kg银桂干花破碎（含水率≤10%，破碎至能过20目的筛），加入15L的50%（体积%）乙醇溶液中，再加入0.1%抗坏血酸水溶液（即，所述每升抗坏血酸水溶液中含有1g抗坏血酸）2L，利用1mol/L乙酸水溶液调整提取溶液pH在4左右，得提取溶液；将提取溶液在温度50℃～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤，得到提取液；将提取液直接经减压浓缩（于0.010～0.100MPa，温度为50～60℃），回收乙醇，得到浓缩液（约10L），再用水稀释，直至稀释液pH为4左右；将稀释液经吸附树脂吸附（所述吸附树脂为HPD300，用量为1L），用30%（体积%）的乙醇水溶液2L洗脱；洗脱液减压浓缩（于0.010～0.100MPaMPa，温度为75～90℃）后，经微波干燥（工艺参数为：微波功率500W,微波辐射时间60min），即可得到桂花苯乙醇苷提取物粉末107g。

对提取物进行成分分析，结果桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为86.1%，桂花苯乙醇苷提取物含有毛蕊花糖苷（79.3%）和异毛蕊花糖苷（0.3%），毛蕊花糖苷：异毛蕊花糖苷=264（重量比）。

实施例5、清除自由基

（1）DPPH法

实验前精确称取20mg的DPPH溶于适量甲醇中，定容至500ml。以25-800μMTrolox为对照品，取稀释一定倍数的样品或对照品溶液100ul，加入3.9mlDPPH，37℃避光反应60min，于515nm波长处测吸光度。以Trolox浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线计算样品抗氧化能力，结果以每克提取物中Trolox当量表示（mmolTrolox/gDW）。

（2）ABTS法

分别配置7.4mMABTS以及2.6mM过硫酸钾，临用前等体积混合，37℃避光反应12h，稀释27倍后使用。以25-800μMTrolox为对照品，取稀释一定倍数后的样品或对照品溶液

100ul，加入3.0mlABTS反应液，37℃避光反应60min后于734nm处测吸光度。以Trolox浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线计算样品抗氧化能力，结果以每克提取物中Trolox当量表示（mmolTrolox/gDW）。

（3）FRAP法

以40mMHCl为溶剂配置10mMTPTZ溶液，20mMFeCl₃水溶液，300mM，pH=3.6乙酸钠缓冲液，三者以1:1:10（v/v/v）混合得FRAP。以FeSO₄为对照品，取稀释一定倍数后的样品或对照品溶液100ul，加入3.0mlFRAP反应液，37℃避光反应60min后于595nm处测吸光度。以FeSO4浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线计算样品抗氧化能力，结果以每克提取物中FeSO4当量表示（mmolFeSO₄/gDW）。

（4）ORAC法

配置pH7.4，浓度为75mM磷酸盐缓冲液，以其为溶剂配制荧光素及AAPH溶液。以0-80μMTrolox为对照品，分别向黑色酶标96孔板中加入20ul样品（稀释一定倍数后）、120ul荧光素，37℃保温5min后加入60ulAAPH，使荧光素和AAPH终浓度分别为70nM和12mM，立即进入荧光酶标仪测定。测定条件为每2min测定一次，持续3h，激发波长及发射波长分别为485nm、530nm。以Trolox浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线计算样品抗氧化能力，结果以每克提取物中Trolox当量表示（mmolTrolox/gDW）。

结果如表1所示，实施例1、3、4制备的桂花苯乙醇苷提取物有较强的清除自由基、抗氧化的能力，并优于发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得桂花多酚提取物。

表1桂花苯乙醇苷提取物清除自由基能力

注：桂花多酚提取物为根据发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得。

实施例6体外酪氨酸酶抑制活性测定

以多巴（L-DOPA）为底物，进行酪氨酸酶的活性测定。先将待测样品用30%（v/v）的乙醇溶解，配成质量浓度为1mg/mL的贮备溶液，再依次稀释成不同浓度的样品溶液。按表1所示，依次准确吸取不同浓度的样品溶液、0.5mol/LpH=6.8的磷酸盐缓冲溶液、0.5mmol/L的L-DOPA溶液和0.15mg/mL的酪氨酸酶溶液，充分混匀，在37℃的水浴锅中孵育反应30min，然后立即测取各个试管中反应溶液在475nm处的吸光值。上述实验均重复3次。根据酶反应活性的定义，在一定的抑制剂浓度下，酶反应活性表示为ACTi，在没有抑制剂时酶反应活性表示为ACT0，则受试样品对酶的相对抑制率（I）可以定义为：I=（1-ACTi/ACT0）×100%=[1-（A3-A4）/（A1-A2）]×100％。式中：A1、A2、A3、A4分别是1、2、3、4号反应液的吸光值。

表2酶活力测定中反应液的组成（mL）

以导致酪氨酸酶活力下降50%的抑制剂浓度（IC50）来表征抑制剂的功效，结果如下表所示，实施例1、3、4制备的桂花苯乙醇苷提取物有较强的酪氨酸酶活性抑制能力，优于发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得桂花多酚提取物，与熊果苷相当。

表3桂花苯乙醇苷提取物体外抑制酪氨酸酶活性能力的测定

实施例1实施例3实施例4桂花多酚提取物*熊果苷
	IC50（mg/mL）0.130.110.160.350.15

注：桂花多酚提取物为根据发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得。

上述浓度为的反应体系（3.5ml）中的浓度。

实施例7、黑色素细胞测试

小鼠B16黑色素细胞的培养：用含质量分数为10%小牛血清的1640培养液在37℃、5%CO₂条件下培养B16黑色素细胞，细胞接种量为3×10⁶个/L，每三天传代一次。细胞增殖率的测定：选择对数生长期的B16黑色素细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为2×10⁴个/L，接种于96孔培养板，每孔180μL，置于37℃、5%CO₂的培养箱内培养24小时。镜下观察生长状态良好，分别加入不同浓度受试物20μL/孔，继续培养48h。于结束前4h加入MTT30μL/孔，4h后弃去上清液，再加入DMSO150μL/孔，振荡10min左右，用酶联免疫检测仪测定475nm波长处的吸光度。细胞内酪氨酸酶活力测定：取B16黑色素细胞接种于25cm²的培养瓶，接种量为2×10⁵个/瓶，培养48h后更换成加受试物的培养基，继续培养48h，以不加活性物作为对照。0.25%胰酶消化后，用pH值6.8的PBS（磷酸缓冲液）吹打成细胞悬液，低温离心后弃上清液，收获细胞团块。加入1mL0.5%的脱氧胆酸钠，冰浴15min，裂解细胞制备含酪氨酸酶提取物。取该不同浓度提取液0.5mL，于37℃预温后加入0.3%多巴溶液，37℃水浴反应5min，用紫外分光光度计在475nm处测定吸光度。以导致酪氨酸酶活力下降50%的抑制剂浓度（IC50）来表征抑制剂的功效。黑色素含量测定：将B16黑色素细胞以1×10⁵个/mL的密度接种于3个6孔板。每孔3mL，置37℃含5%CO₂孵箱中孵育24h后，弃上清液，添加不同浓度的待测药物，每浓度3个孔。药物作用3d后，弃上清液，PBS洗涤，每孔加入0.15mL胰酶消化细胞3min，每孔加2mL维持液终止消化。吹打混匀后,每种浓度取出0.15mL做细胞计数。其余细胞悬液以1500r/min离心10min，弃上清液，加入200μL蒸馏水和体积比为1∶1的乙醇、乙醚混合液(除去一些不透明物质)，摇匀，室温放置15min，3000r/min离心5min。弃上清液，于沉淀中加入1mL含10%(质量分数)DMSO的1mol/LNaOH水溶液。80℃加热30min(具塞)，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测吸光度值。黑色素细胞生长率=(药物孔细胞密度÷对照孔细胞密度)×100%，黑色素合成抑制率=[1-(药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度)÷(对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度)]×100%。以导致黑色素合成下降50%的抑制剂浓度（IC50）来表征抑制剂的功效。数据处理：所有数据均采用SPSS10.0医用统计软件包进行单因素方差分析和趋势检验。

测试结果为，在8mg/L-2000mg/L的范围内，实施例1、3、4制备的桂花苯乙醇苷提取物，对黑色素细胞的增殖的抑制率均低于10%，无显著的抑制效应，而同时熊果苷对黑色素细胞的增殖的抑制率从0.51%增加到67.62%，这说明与熊果苷相比，桂花苯乙醇苷提取物基本无细胞毒性。同时，测试结果发现，实施例1、3、4制备的桂花苯乙醇苷提取物能显著抑制B16黑色素细胞中酪氨酸酶的活性，抑制效果与熊果苷相当，但优于发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得的桂花多酚提取物。此外，还发现实施例1、3、4制备的桂花苯乙醇苷提取物能显著抑制B16黑色素细胞中黑色素的合成，抑制效果与熊果苷相当，但优于发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得的桂花多酚提取物。

表4、桂花苯乙醇苷提取物抑制细胞内酪氨酸酶活性能力的测定

实施例1实施例3实施例4桂花多酚提取物*熊果苷
	IC50（mg/mL）0.930.850.981.750.83

注：桂花多酚提取物为根据发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得。

表5、桂花苯乙醇苷提取物抑制细胞内黑色素合成的抑制率

实施例1实施例3实施例4桂花多酚提取物*熊果苷
	IC50（mg/mL）0.820.750.871.650.68

注：桂花多酚提取物为根据发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得。

实施例8人体美白试验

按照本发明技术方案制得的桂花苯乙醇苷提取物，可以作为美白化妆品的功效性原料，其使用形式没有特殊要求，它可以用于水剂、霜剂、油剂、洗液、乳状液等各种不同剂型的化妆品中。

作为本发明应用的典型基质，涉及的已知物质有：动植物油、矿物质油、蜡、高级醇、脂肪醇、硅油、表面活性剂、磷脂、醇类、多元醇类、水溶性聚合物、油溶性聚合物、矿物质、去离子水等，另外，根据需要可适当加入pH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、颜料、防腐剂和香精等。此外，也可以与具有美白作用、抗衰老作用或者护肤功效的其他活性成分结合使用，如防嗮剂、血液循环促进剂、消毒剂、消炎剂、细胞活化剂、维生素类、氨基酸类、湿润剂、角质层分离剂。

下表是应用本发明获得的桂花苯乙醇苷提取物配制“膏霜”化妆品的具体配料组成。配制时，将表中组分A加热到83℃，融化搅拌均匀，作为油相，将组分B放入容器加热至83℃，搅拌溶解成水相原料，油相原料加入水相原料中搅拌，乳化均质1min后，继续搅拌冷却至45℃时，加入香精、防腐剂等，搅拌均匀，陈化24小时后即可灌装、包装、检验，制得本发明应用之实例产品。

表6“膏霜”配料

采用双盲法测试评价本发明的美白效果：按照上述实例制备含有桂花苯乙醇苷提取物、桂花多酚提取物的美白产品作为待测样品、含熊果苷的作为对比样品、不添加活性物的作为空白样品，随机选择皮肤健康的成人前臂内侧3cm×3cm区域作为受试部位，共10人，检测空白膏体、添加不同浓度桂花苯乙醇苷提取物的膏体、添加含熊果苷的膏体的美白效果，受试者每天涂抹各样品早晚各一次，连续涂抹45天，每周采用Lab色度系统光谱光度计(美能达光谱光度计CM-2002)测量皮肤颜色的变化。在Lab色度系统中，以坐标L、a、b之差ΔL、Δa、Δb来表示二种刺激之间的色差ΔEab，即在色空间两颜色点之间的距离。ΔEab=[(ΔL)²+(Δa)²+(Δb)²]^1/2。式中:由于ΔEab是L、a、b的综合指数，代表了色度的立体变化，所以是评价肤色变化的较合适指标。

结果表明：含有实施例1、3、4桂花苯乙醇苷提取物的美白产品对人体皮肤具有美白功效，随着提取物添加量的增加，皮肤美白效果逐渐增强，同剂量美白效果优于发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得的桂花多酚提取物及熊果苷。

表7、添加桂花苯乙醇苷提取物的美白产品美白效果比较

注：桂花多酚提取物为根据发明专利【201310169455.1】中实施例1制备所得。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用，其特征在于：桂花苯乙醇苷提取物中苯乙醇总苷含量为30～90重量％，所述苯乙醇总苷包括毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷；苯乙醇总苷中毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷的重量之比为48:1或77:1。

2.根据权利要求1所述的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用，其特征在于制备方法包括以下步骤：

(a)、将1kg水分含量≤10％的丹桂干花破碎至能过20目的筛，加入至10L体积浓度为90％的乙醇水溶液中，再加入竹叶抗氧化物溶液2L，利用1mol/L乙酸水溶液调整pH为5，得提取溶液；

每升竹叶抗氧化物溶液中含有1g竹叶抗氧化物；

(b)、将提取溶液于50～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤或离心，得到提取液；

(c)、将提取液经减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；再用水稀释，直至所得稀释液的pH为4；

(d)、将稀释液经吸附树脂吸附，用体积浓度为30％的乙醇水溶液洗脱；

(e)、洗脱液减压浓缩后，经喷雾干燥、低压烘干或微波干燥，得到桂花苯乙醇苷提取物。

3.根据权利要求1所述的桂花苯乙醇苷提取物在制备美白化妆品中的应用，其特征在于制备方法包括以下步骤：

(a)、将1kg含水率≤10％的金桂干花破碎破碎至能过20目的筛，加入至15L体积浓度为80％乙醇水溶液中，再加入异抗坏血酸钠水溶液2L，利用1mol/L甲酸水溶液调整提取溶液pH为5，得提取溶液；

每升异抗坏血酸钠水溶液中含有1g异抗坏血酸钠；

(b)、将提取溶液于50～80℃下进行浸提2小时，冷却至室温后，过滤或离心，得到提取液；

(c)、将提取液经减压浓缩回收乙醇，得到浓缩液；再用水稀释，直至所得稀释液的pH为5；

(d)、将稀释液经吸附树脂吸附，用体积浓度为30％的乙醇水溶液洗脱；

(e)、洗脱液减压浓缩后，经喷雾干燥、低压烘干或微波干燥，得到桂花苯乙醇苷提取物。