CN103695464A - 一种微rna表达载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微RNA表达载体及应用。本发明克隆了miR-596表达基因片段，并构建U6-miR-596表达载体，实验证明载体能够抑制肺癌肿瘤细胞的增殖，对肺癌肿瘤细胞的增殖具有杀伤作用，引起肺癌细胞系的凋亡，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因治疗学领域，尤其涉及的是一种微RNA表达载体及其在抑制肺癌肿瘤细胞增殖和转移中的应用。
背景技术
microRNAs(miRNAs)通常为21-23个核苷酸，是一类重要的小分子非编码RNA。miRNAs表达具有重要作用，控制着细胞的生长、分化和凋亡，与肿瘤发生密切相关。miRNAs通常是由RNA聚合酶II转录生成，最初产物是被称为pri-miRNA的大的前体分子。pri-miRNAs在细胞核内被Drosha(RNase III)和双链RNA结合蛋白Pasha处理成约70m组成的pre-miRNA，该分子为一个碱基不完全配对的茎环状结构。RAN-GTP和Exportin5可将pre-miRNA分子输送到细胞质中。随后该茎环状结构被Dicer(另一种RNaseIII)加工成约22个核苷酸长度的成熟miRNA双链。接下来这种成熟的双链miRNA会很快整合到miRISC复合体中(复合体中含有Argonaute蛋白)。成熟miRNA结合到与其序列互补的mRNA位点，通过两种依赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。其抑制翻译还是降解发挥作用是由miRNA和它的目的mRNA之间的错配程度决定的，匹配程度高的目的mRNA将被降解。
miRNAs可以起到肿瘤抑制基因作用，miR-15a／miR-16可负调控BCL2，因此，这两个miRNAs的缺失或下调，导致了BCL2表达的升高，能促进白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。let-7c家族的表达水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中显著下调，而且肺癌和乳腺癌中let-7的表达水平与患者的生存时间呈正相关。miR-99也可以作为抑癌miRNA抑制肿瘤的增殖，导致肿瘤细胞的凋亡。但有关miR-596研究报道较少，功能还需要进一步研究。miRNA作为一种转录后的调节因子与肿瘤的发生密切相关，克隆抑癌miRNA基因在肿瘤的基因治疗方面具有重要的价值。
现有治疗肺癌、胃癌和子宫颈癌等肿瘤的方法主要有药物化疗、放疗及手术治疗，但是上述的方法都有缺陷，尤其对于不能手术治疗的患者，化疗达不到满意的治疗效果。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在治疗肿瘤中存在的缺陷，提供了一种微RNA表达载体及其在抑制肺癌肿瘤细胞中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种微RNA表达载体，其特征是，该微RNA表达载体具有ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCGGGACTTACAGGGAACAGCACAGCCTGGGGGCCATCGCAGATGCCCTCCAGGAAAGCAGGATGCTCTGCAGATAGGACGGCTGTGGCCGCTGCCCCAGGAAACAGCCCAGGACGCTGCCTGAGCTCAGAGGGTTCCGGACACAGACCGCGCTCCCCGCTTTGCAAACCACACCCAGTCCATTTCCTAGTGTGAGTTTGTCTCTACTCATCGGTTTGTGTCTTTATAAGAGTTCTAAAGTAAAACAAAAACACACAAGGACAGTGACCTAGACAGCACCCAGGGATGGGTCGGGTCGGCCTCCGAAGGGCAGCAGCTGCCATGCGGGAGGCAGGTTCCCGAGGAGCCGGGCAGGCTTCGGAGAGGCCGTGCTCGCTTTCCCGACTGTGGCGACGGATCCACCTGCTATGCGTTCCTCAGAACTCACTGAACCGCCCACGTTAATGACGCGCAGTTCGCCGTGTGCCAATGACGCCTCAATCAAGCTGCTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC基因片段。
所述的微RNA表达载体在抑制肺癌肿瘤细胞增殖和转移中的应用。
本发明克隆了miR-596表达基因片段，并构建U6-miR-596表达载体，实验证明载体能够抑制肺癌肿瘤细胞的增殖，对肺癌肿瘤细胞的增殖具有杀伤作用，引起肺癌细胞系的凋亡，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。
附图说明
图1为U6-miR-596表达载体构建示意图；
图2为定量PCR检测miR-596表达。
图3为MTT分析对细胞的生长抑制情况。
图4为A549细胞转染载体后细胞凋亡的检测。
图5为显微镜检测细胞迁移结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本发明中，所使用的技术，包括基因测序、PCR扩增与检测、细胞转染、载体构建等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、质粒和载体、细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1U6-miR-596表达载体的构建
设计克隆miR-596表达载体的引物序列，通过PCR扩增miR-596基因，使用仪器为Eppendorf mastercycler gradiemPCR仪。
模版为正常人的基因组DNA，提取方法如下：采集1ml外周血，置于1.5ml离心管中(内有适量肝素抗凝剂)，3000rpm离心5分钟弃上清。加入800μl生理盐水，颠倒混匀，1000rpm离心5分钟，弃上清，重复3次。加入相当于压积细胞5.5倍体积的溶血试剂(裂解红细胞用)，充分混匀后-20℃静止10min，随后放入4℃放置30min，此时溶液变为透明状红棕色。将此溶液1000rpm离心5min，弃上清。加入400μl STE缓冲液悬浮白细胞，使之均匀分散。同时加蛋白酶K(终浓度为100μtg／ml)和10％SDS，37℃消化过夜。加入等体积饱和酚，充分混匀，4℃下13,000rpm离心12min；吸取上清至另管。加入等体积酚／氯仿，充分混匀，4℃下13,000rpm离心8min；吸取上清至另管。加入等体积氯仿／异戊醇(V：V=24：1)，充分混匀，4℃下13,000rpm离心5min。吸取上清至另管，加1／10体积的3M NaAc及2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后-20℃静置30min，4℃，13,000rpm离心5min，弃上清。加入1ml80％乙醇，颠倒混匀，4℃13,000rpm离心5min，弃上清，室温晾干，加入适量100μl TE溶解过夜，分光光度计检测DNA浓度和纯度，-20℃存放。
扩增条件如下：变性94℃45s、55℃45s、延伸72℃60s，共30个循环。上游引物Sence：5′-TAGCAGCTTGATTGAGGCG-3′；下游antisense：5′-CGGGACTTACAGGGAACAG-3′。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，分析结果。然后分别将上述片段连接至pMD-19T(Takara公司)载体上，构建miR-596，送至上海博尚生物技术有限公司测序，结果正确(SEQ ID NO：1序列表)。然后，利用BamHI和HindIII两酶(Takara公司)切位点切T-miR-596及pRNAi-U6.1／Neo(南京金思特科技有限公司)载体，将miR-596接至pRNAi-U6.1／neo载体上，得到U6-miR-596载体，用同样的酶切位点，构建U6-miR-596载体。载体构建流程见图1。
实施例2U6-miR-596载体对肿瘤细胞凋亡的影响
1、细胞培养和转染
A549肺癌细胞用含10％胎牛血清的F12(GIBICO)培养基培养。细胞购自上海中科院细胞所，于37℃5％CO2培养。
细胞转染：U6-miR-596质粒提取方法按EndoFree plasmid Maxi kit protocol(Qigen公司产品)操作。采用六孔培养板培养，每孔5×105个细胞转染1μg的质粒。转染方法用脂质体转染法，质粒与脂质体的比例为1：3(1μg：3μl)，转染72小时后，进行指标的检测。
2、miR-596表达的检测
miRNA检测如下：收集细胞，应用miRNA提取试剂盒(Ambion)提取小RNA，用Polymerase A(Ambion)加尾后进行RT反应(RT引物：5'-AACATGTACAGTCCATGGATGd(T)30-3’)，分别使用miR-596引物扩增相应的miRNA，并且用human5S rRNA引物扩增作为参照基因(上游引物见表1，下游引物为5'-AACATGTACAGTCCATGGATG-3’)。扩增条件为：94℃30s；54℃退火30s；72℃30s，29个循环。产物经2％的琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现，肿瘤细胞转染U6-miR-596载体后，miR-596的表达量明显升高。
定量PCR检测miRNA的表达：用ambion公司检测试剂盒qRT-PCR miRNA DetectionKit检测miRNA表达，步骤参考说明书，5srRNA作为参照物。用RG3000系统分析。反应体系为20μl体系，包含上、下游引物、10×缓冲液、dNTP、高保真DNA聚合酶、SYBR GreenI染料等。定量反应条件为94℃20s，54℃退火20s，72℃20s，各扩增40个循环。在每个循环的72℃时测定荧光量。结果发现，肿瘤细胞转染U6-miR-596载体后，miR-596的表达量明显升高。*p<0.05：与control相比，统计有显著差异。(参见图2)。
3、细胞凋亡的检测方法
3.1凋亡细胞的形态观察
转染U6-miR-596载体48h后。用倒置显微镜检测A549细胞的凋亡改变。
3.2MTT(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，SIGMA公司)
转染U6-miR-596载体48h后，每孔细胞中加入MTT溶液10μl，继续培养4小时，收集细胞，4000rpm离心5分钟，弃去上清液，每孔加DMSO100μl，摇匀后，使用酶标仪测定光密度值(570nm)，检测细胞生长抑制率。
3.3凋亡试剂盒Annexin V-FITC(宝灵曼公司产品)检测
贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)；用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×105细胞；加入400μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Propidium Iodide(PI，SIGMA公司)，混匀；室温、避光、反应5-15min；在1hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
3.4流式细胞检测(PI染色)
用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nn；发射波长Em=530nm。PI红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测，使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
4、肿瘤细胞凋亡的检测结果
4.1miRNA对细胞生长形态及增值的影响
转染U6-miR-596载体48h后，U6-miR-596表达组，与对照相比，细胞增殖受到明显的抑制。用MTT检测细胞的增殖情况，结果表明：转染U6-miR-596载体组，细胞生长受到明显抑制(图3)。
4.2凋亡细胞PI染色及流式细胞检测结果
转染U6-miR-596载体48h后，用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞的凋亡改变，PI染色用来分析细胞内DNA的断裂改变。用荧光纤维镜检测细胞凋亡的改变，在U6-miR-596处理组，细胞出现明显的凋亡。而对照组细胞并未出现明显的凋亡。流式细胞技术分析发现U6-miR-596处理组，细胞出现明显的凋亡(图4)。
4.3Transwell迁移实验检测细胞迁移结果
细胞转染U6-miR-596载体后，于Transwell板中培养24h，显微镜下观察下观察迁移的细胞数目。发现转染U6-miR-596组迁到下室的细胞数目明显少于空白对照组和阴性载体对照组的细胞数目(图5)。将迁移到下室的细胞消化，用流式细胞仪计数细胞数目(均数±标准差)表示，取3次计数结果平均数：空白对照组568±42.8；阴性载体对照组361±32.1；转染U6-miR-596组99±11.5，同样可见转染U6-miR-596组迁移细胞数明显少于空白对照组和阴性载体对照组。
表1：检测miRNAs所需要的上游引物
SEQ ID NO：1miR-596序列表
ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCGGGACTTACAGGGAACAGCACAGCCTGGGGGCCATCGCAGATGCCCTCCAGGAAAGCAGGATGCTCTGCAGATAGGACGGCTGTGGCCGCTGCCCCAGGAAACAGCCCAGGACGCTGCCTGAGCTCAGAGGGTTCCGGACACAGACCGCGCTCCCCGCTTTGCAAACCACACCCAGTCCATTTCCTAGTGTGAGTTTGTCTCTACTCATCGGTTTGTGTCTTTATAAGAGTTCTAAAGTAAAACAAAAACACACAAGGACAGTGACCTAGACAGCACCCAGGGATGGGTCGGGTCGGCCTCCGAAGGGCAGCAGCTGCCATGCGGGAGGCAGGTTCCCGAGGAGCCGGGCAGGCTTCGGAGAGGCCGTGCTCGCTTTCCCGACTGTGGCGACGGATCCACCTGCTATGCGTTCCTCAGAACTCACTGAACCGCCCACGTTAATGACGCGCAGTTCGCCGTGTGCCAATGACGCCTCAATCAAGCTGCTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种微RNA表达载体，其特征是，该微RNA表达载体具有ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCGGGACTTACAGGGAACAGCACAGCCTGGGGGCCATCGCAGATGCCCTCCAGGAAAGCAGGATGCTCTGCAGATAGGACGGCTGTGGCCGCTGCCCCAGGAAACAGCCCAGGACGCTGCCTGAGCTCAGAGGGTTCCGGACACAGACCGCGCTCCCCGCTTTGCAAACCACACCCAGTCCATTTCCTAGTGTGAGTTTGTCTCTACTCATCGGTTTGTGTCTTTATAAGAGTTCTAAAGTAAAACAAAAACACACAAGGACAGTGACCTAGACAGCACCCAGGGATGGGTCGGGTCGGCCTCCGAAGGGCAGCAGCTGCCATGCGGGAGGCAGGTTCCCGAGGAGCCGGGCAGGCTTCGGAGAGGCCGTGCTCGCTTTCCCGACTGTGGCGACGGATCCACCTGCTATGCGTTCCTCAGAACTCACTGAACCGCCCACGTTAATGACGCGCAGTTCGCCGTGTGCCAATGACGCCTCAATCAAGCTGCTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC基因片段。
2.根据权利要求1所述的微RNA表达载体在抑制肺癌肿瘤细胞增殖和转移中的应用。
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