CN103667219A

CN103667219A - 一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法

Info

Publication number: CN103667219A
Application number: CN201310664188.5A
Authority: CN
Inventors: 石贤爱; 薛原楷
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明提供一种能够获得高酶活回收率的β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法，包括以下步骤：（1）将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；（2）加入戊二醛；（3）向混合液中加入还原剂，振荡后，离心，收集沉淀；整个反应过程的反应温度控制在4~6℃，pH值为5.0~5.5；其中，步骤（1）的沉降剂为1,4-二氧六环，1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为2~3:1；步骤（2）中戊二醛的浓度为38~43mM，交联时间为8~12min；还原剂为硼氢化钠（NaBH₄），NaBH₄的浓度为20~25mM。

Description

一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法

技术领域

本发明属于固定化酶生产领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法。

背景技术

游离β-葡萄糖糖苷酶在工业生产中存在稳定性差、重复利用率低等问题，严重制约着生物合成红景天苷的工业化生产。而交联酶聚集体既不需要对酶进行结晶化操作，又能最大限度保留酶活回收率，是无载体固定化酶技术中最优良的一种。随着交联聚集体技术在酶固定化领域的迅速发展，近年来，有人研究了β-葡萄糖糖苷酶交联聚集体的制备方法（详见：欧杰，交联β-葡萄糖糖苷酶聚集体制备及其生产大豆异黄酮活性苷元的研究，合肥工业大学，硕士论文，2007年6月），该β-葡萄糖糖苷酶交联聚集体的制备方法为：首先，将沉降剂（乙醇或异丙醇或正丙醇）加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；然后，加入交联剂（戊二醛）交联；最后，向混合液中加入还原剂（硼氢化钠），振荡后得到交联β-葡萄糖苷酶聚集体（即β-葡萄糖苷酶CLEAs）。并分别对β-葡萄糖苷酶CLEAs制备过程中的制备条件（如沉降剂的选择、沉降剂与酶液的体积比、PH、温度、沉降时间等）、交联条件（如戊二醛浓度、温度、交联时间等）进行了优化，在最优的制备条件以及交联条件下制得的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为77.4%（可达到的最高值），依然较低，无法满足工厂化经济利益最大化的要求。

发明内容

本发明旨在提供一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体（β-葡萄糖苷酶CLEAs）的制备方法，通过该方法制得的β-葡萄糖苷酶CLEAs体能够解决现有技术的固定化糖苷酶在工业生产过程中酶活回收率低的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法，包括以下步骤：

（1）将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；

（2）加入戊二醛；

（3）向混合液中加入还原剂，振荡后，300~500rpm离心5~10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体；

其中，整个反应过程的反应温度控制在4~6℃，pH值为5.0~5.5；步骤（1）的沉降剂为1,4-二氧六环，1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为2~3:1，β-葡萄糖苷酶溶液的β-葡萄糖苷酶浓度为1.5~2.5mg/ml；步骤（2）终戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min；步骤（3）的还原剂为硼氢化钠，硼氢化钠的终浓度为20~25 mM。

所述的β-葡萄糖苷酶为杏仁β-葡萄糖苷酶。

本发明的优点在于：常见的用于酶交联聚集体制备方法的沉降剂有：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和饱和硫酸铵。而，1,4-二氧六环一般被用作色谱分析试剂及乙酸纤维及其衍生物的溶剂来使用，至今为止，未见将其用作酶交联聚集体制备方法的沉降剂的报道。本发明首次以1,4-二氧六环作为β-葡萄糖苷酶CLEAs制备方法的沉降剂。再结合优化的交联条件以及还原条件，使得最终制得的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率可高达80%以上（最高可达81.78%），而采用现有技术的制备方法在最优反应条件下制得的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率仅为77.4%（此酶活回收率为现有技术所达到的最高值），即本发明制得的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率远远高于现有技术的最高值。在酶的固定化中不可避免的会出现部分酶残留在溶液中或酶蛋白部分失活的现象，因此，要想在现有技术酶活回收率最高值77.4%的基础上继续提升，具有非常大的难度。而本发明所制备的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率却可将酶活回收率提高2~5个百分点。

具体实施方式

实施例1

一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体（β-葡萄糖苷酶CLEAs）的制备方法，包括以下步骤：（1）将2.5ml 1,4-二氧六环加入到1 mL含β-葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液中（即1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为2.5：1），振荡；（2）加入25%戊二醛的，至戊二醛的终浓度为43mM，交联时间10min；（3）再加入硼氢化钠（NaBH₄），至NaBH₄的终浓度为25 mM，进行还原，振荡后，400rpm离心5min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs；整个反应过程的反应温度控制在5℃，pH值为5.5。

β-葡萄糖苷酶CLEAs的回收处理方式为：反应液离心后，将收集得到的β-葡萄糖苷酶CLEAs 沉淀以缓冲溶液洗涤3次，再分别加入1mL缓冲溶液并振荡使之成为悬浊液，各组分别取样测定β-葡萄糖苷酶CLEAs的水解活力，以不经沉降剂、交联剂处理的酶液的酶活为100%，计算β-葡萄糖苷酶CLEAs的相对水解活力（即β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率）。

β-葡萄糖苷酶的水解活力测定方法为：分别取100 μL待测β-葡萄糖苷酶CLEAs溶液与10 mM的2 mL对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）溶液，二者混合后50℃水浴精确保温10 min，之后立即加入1 M的碳酸钠溶液2 mL以终止反应，振荡均匀后室温静置5 min，适当稀释后以紫外分光光度计测定样本在波长410 nm处的吸光值，代入pNP标准曲线计算可得pNP生成量。酶活力单位定义为：每分钟内催化pNPG 生成1 μmoL pNP的酶量。其中， pNP标准曲线制作过程为本领域常见的标准曲线制作方法。

β-葡萄糖苷酶的水解活力测定方法为：分别取100 μL待测β-葡萄糖苷酶CLEAs溶液与10 mM的2 mL对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）溶液，二者混合后50℃水浴精确保温10 min，之后立即加入1 M的碳酸钠溶液2 mL以终止反应，振荡均匀后室温静置5 min，适当稀释后以紫外分光光度计测定样本在波长410 nm处的吸光值，代入pNP标准曲线计算可得pNP生成量。酶活力单位定义为：每分钟内催化pNPG 生成1 μmoL pNP的酶量。其中，pNP标准曲线制作过程为本领域常见的标准曲线制作方法。其中，缓冲溶液一般选用pH为5.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液。

实施例1中β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为81.65%。

实施例2

实施例2与实施例1不同的是：整个反应过程中pH值为5.0，其中，步骤（1）中1,4-二氧六环的体积为2ml（即1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为2:1），β-葡萄糖苷酶溶液含β-葡萄糖苷酶2.5mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为40 mM；步骤（3）中NaBH₄的终浓度为23 mM，300rpm离心10min；测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为81.78%。

实施例3

实施例3与实施例1不同的是：整个反应过程中pH值为5.2，其中，步骤（1）中1,4-二氧六环的体积为3ml（即1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为3:1），β-葡萄糖苷酶溶液含β-葡萄糖苷酶2.0mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为38 mM；步骤（3）中NaBH₄的终浓度为20mM，500rpm离心5min，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为80.11%。

实施例4

实施例4与实施例1不同的是：整个反应过程中pH值为5.4，其中，步骤（1）中1,4-二氧六环的体积为3ml （即1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为3:1），β-葡萄糖苷酶溶液含β-葡萄糖苷酶2mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为10 mM；步骤（3）中NaBH₄的终浓度为20 mM，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为13.21%。

实施例5

实施例5与实施例1不同的是：整个反应过程中pH值为5.0，其中，步骤（1）中1,4-二氧六环的体积为3ml（即 1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为3:1），β-葡萄糖苷酶溶液含β-葡萄糖苷酶1.5mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为50 mM；步骤（3）中NaBH₄的终浓度为25 mM，400rpm离心5min，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为72.37%。

实施例6

实施例6与实施例1不同的是：整个反应过程中pH值为5.5，其中，步骤（1）中1,4-二氧六环的体积为1.5ml（即,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为1.5:1），β-葡萄糖苷酶溶液含β-葡萄糖苷酶1.5mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为38 mM；步骤（3）中NaBH₄的终浓度为25 mM，300rpm离心10min；测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为69.15%。

实施例7

实施例7与实施例1不同的是：整个反应过程中pH值为5.2，其中，步骤（1）中1,4-二氧六环的体积为2.5ml（即1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为2.5:1），β-葡萄糖苷酶溶液含β-葡萄糖苷酶2.0mg/ml；步骤（2）中戊二醛的终浓度为40 mM；步骤（3）中NaBH₄的终浓度为23mM，400rpm离心5min，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为77.37%。

实施例8

按照现有技术的最优制备条件，具体为：取2.0 mg/mLβ-葡萄糖苷酶溶液10ml，在4℃条件下，向其中缓慢加入90%的硫酸铵饱和溶液 90ml，待沉淀 30min后，离心，用pH为5.0的缓冲液溶解；再向溶解液中加入 10mM的戊二醛溶液，在30℃条件下，交联 15min；最后，加入NaBH₄进行还原，300rpm离心10min，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为77.51±0.03。

根据上述实施例1~3与实施例8的对比，可知，本发明所得到的的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率远远高于现有技术（实施例8）的酶活回收率，原因在于：不同的沉降剂使游离酶发生沉淀后，损失的酶活不同，而本发明的采用1,4-二氧六环为沉降剂可使β-葡萄糖苷酶在沉降过程中保持最大的酶活。上述实施例4中的戊二醛浓度采用的是现有技术的交联剂最佳浓度值（戊二醛的浓度为10 mM），但是，对应的β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率仅为13.21%，可见，以1,4-二氧六环为沉降剂所制备的β-葡萄糖苷酶CLEAs在戊二醛交联过程中对交联作用影响较大。因此，本发明具有可制得高酶活回收率β-葡萄糖苷酶CLEAs的技术效果并不仅仅在于沉降剂种类选择上的突破性改变，而且，还要有匹配此特殊沉降剂（1,4-二氧六环）的戊二醛浓度，同时，从实施例4~7也可看出，本发明的1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比以及NaBH₄的浓度对β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率也有一定的影响，因此，本发明人需要经过无数次试验后方可得出一系列相互匹配的最佳组合以及最佳范围值，使得β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率可以达到 80%以上。

本发明的β-葡萄糖苷酶为杏仁β-葡萄糖苷酶，当然也可采用其他的β-葡萄糖苷酶，如现有技术中的西梅籽β-葡萄糖苷酶等。

本发明的对pNPG、pNP、杏仁β-葡萄糖苷酶（6 U/mg）均购自上海源叶生物科技有限公司；本发明的1,4-二氧六环、25%戊二醛、NaBH₄等均购自国药集团有限公司。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；

（2）加入戊二醛；

整个反应过程的反应温度控制在4~6℃，pH值为5.0~5.5；步骤（1）的沉降剂为1,4-二氧六环，1,4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液的体积比为2~3:1，β-葡萄糖苷酶溶液的β-葡萄糖苷酶浓度为1.5~2.5mg/ml；步骤（2）终戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min；步骤（3）的还原剂为硼氢化钠，硼氢化钠的终浓度为20~25 mM。

2.根据权利要求1所述的一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法，其特征在于：所述的β-葡萄糖苷酶为杏仁β-葡萄糖苷酶。