CN103627638B - 一种用于裂解红细胞的组合物、红细胞裂解试剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于裂解红细胞的组合物、红细胞裂解试剂及应用。本发明首先提供一种用于裂解红细胞的组合物，其是由氯化铵、碳酸氢盐、乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐、裂解辅助剂组成的，其质量比为800-820：80-100：0.3-3：2-10。本发明还提供了一种红细胞裂解试剂，其是由上述的用于裂解红细胞的组合物溶解于水得到的。本发明还提供了上述红细胞裂解试剂在裂解生物样本中的红细胞中的应用。本发明的技术方案不仅解决了单独使用NH₄Cl时红细胞裂解效率和样本兼容性低的问题，而且还消除了单独使用表面活性剂对血细胞表面和内部抗原检测的不良影响，并提高了操作的可控制性。

Description

一种用于裂解红细胞的组合物、红细胞裂解试剂及应用

技术领域

本发明涉及一种用于裂解红细胞的组合物、红细胞裂解试剂及应用，属于生物材料技术领域。

背景技术

血液和造血组织中的细胞与功能分子是血液学、生物化学、细胞生物学、分子生物学等领域的主要研究对象。近些年来，随着基础科学的飞速发展和实验技术的日新月异，这些领域的研究内容和范畴不断地深入与扩大，为临床诊断水平的提高奠定了坚实基础。其中，以流式细胞术（FlowCytometryMethod,FCM）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-TimeFluorescenceQuantitativePolymeraseChainReaction,RT-PCR）、荧光原位杂交（FluorescenceinsituHybridization,FISH）为代表的一系列先进技术，已逐渐成为实验室检测，以及临床诊断中不可或缺的重要技术手段之一，发挥着血液分析仪等常规诊断设备无法实现的、更为精准的检测用途。

FCM技术在免疫功能评价、血液肿瘤的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、药物敏感性筛选和发病机理研究等方面都发挥着重要作用；特别是干细胞研究及临床应用中，FCM检测与监测CD34+细胞群比例是最为常规和必需的技术手段。RT-PCR技术则在基因水平对机体病毒感染实现了高灵敏度和高特异性的体外筛查。FISH技术不仅可用于已知基因或序列的染色体定位，还可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究，在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中具有明显优势。这些高新技术在为实验室和临床提供重要参数的同时，其自身作为检测方法的准确性，特别是其在诊断应用中的质量控制成为了关键环节。卫生部临床检验中心专家在《分子诊断质量控制面临的问题》（胡丽涛等，临床检验杂志，2012，30(6):466-467）一文中详细阐释了这一问题。此外，美国病理学家学会（CollegeofAmericanPathologists,CAP）作为诊断检验的权威机构，制定了一整套较为完整的检测技术质量控制程序指南和实验室质量监控条例，该指南和条例从取材送材，到样本前处理、上机等，对检测所涉及技术的各个环节都作了详细规定。

所谓样本前处理，是指在实施检测方法之前，必须对生物样本在体外进行适宜的前处理操作，这一操作是保证这些技术实施效果的关键性步骤，将对检测结果的准确性产生较大影响。以上述三种最为常用的新型技术为例，生物样本的前处理操作主要涉及对样本中大量红细胞的有效去除，这一目标可以通过两种途径得以实现：（1）选用合适的红细胞裂解试剂（RedBloodCelllysisagent），以一定比例的浓度与生物样本共孵育10-15分钟，成熟红细胞将发生裂解，其它细胞受到最小程度的影响；（2）密度梯度离心法分离处理，将血液或经过消化后的组织单细胞悬液小心铺在密度梯度介质上，经历30-45分钟离心后收获细胞层。由于裂解法操作简单，并最大程度保持原始白细胞各项生物学参数和形态，是目前应用最多的方法。例如，刘广印等报道了不同白细胞提取方法对于RT-PCR法检测巨细胞病毒的对比研究，结果显示氯化铵裂解法和密度梯度离心法得到的结果没有显著性差异，但前者由于操作简便，用时短，而成为了优选（刘广印等，实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒两种白细胞提取方法对比分析，淮海医药，2007，25(2)：95-96）。又例如，田志华等人在研究大鼠前体脂肪细胞分化过程中波形纤维形态结构的变化和波形纤维蛋白基因表达的研究时，使用基于氯化铵配方的红细胞裂解液对大鼠脂肪组织进行红细胞裂解操作，然后对培养后的脂肪细胞进行免疫荧光观察和原位杂交（田志华等，大鼠前体脂肪细胞分化过程中波形纤维形态结构的变化和波形纤维蛋白基因表达的研究，遗传学报，2003，30(12)：1113-1117）。

红细胞裂解试剂的应用范围很广，不仅包括人的外周血、脐带血、骨髓等临床样本，还包括小鼠、大鼠、犬类、灵长类动物的外周血、骨髓、脾脏等动物类样本。实现快速、有效、完全的去除红细胞，并提高样本类型的兼容性是这一试剂在应用上追求的目标。此外，红细胞裂解试剂应在最大程度裂解红细胞的同时，对白细胞造成最小程度的影响。

目前在售的红细胞裂解试剂既有进口试剂也有国产试剂，其配方较多，但主要是基于Saas等人于1979年所开发的以氯化铵为主成分的水溶液。这类配方多为三元组分，其中氯化铵在各配方中比例有所不同，其它添加成分多为碳酸氢盐和乙二胺四乙酸或其衍生物，例如碳酸氢钾和乙二胺四乙酸二钠。然而，红细胞裂解试剂的多种配方在使用上均存在一定的问题，这也在大量文献中得到了报道。此外，由于产品标准和配方各异，对于样本的前处理而言，使用不同厂家、不同配方所得到的处理效果也差别较大，这对于细胞样本下游的检测分析和应用存在不良影响，特别对于检测和分析检验实验室内部质量控制的可实施性和室间质量评价（ExternalQualityAssessment,EQA）是十分不利的。

红细胞裂解试剂在使用上的第一个问题是红细胞去除不完全和样本兼容性不佳，这对于细胞样本下游的检测分析和应用存在明确的不良影响。例如专利申请201210379985.4中所提及的细胞免疫荧光标记时，抗体识别很容易受到血液中残留红细胞的影响；又例如宋文刚等也报道了流式细胞术进行CD34+细胞监测时，关键是保证红细胞的裂解完全，否则很难分清有核细胞和红细胞的界限，容易使数据发生偏差（宋文刚等，动员外周血CD34阳性细胞流式细胞术测定中的策略探讨，中国实验血液学杂志，2002，10(4)：347-350）；又例如ALDAGEN公司的干细胞检测产品ALDEFLUOR说明书中明确提示使用氯化铵配方的红细胞裂解试剂对外周血进行红细胞裂解时需要执行两次，以确保红细胞被完全去除，不影响后续试验；然而，本领域技术人员熟知的是，执行两次裂解及相应的洗涤，将会造成部分细胞丢失，进而造成实验误差，例如刘艳荣在“流式细胞术计数CD34阳性细胞标准化与质量控制，中国实验血液杂志，2000,8(4):302-306.”中明确指出了这一问题，并提出样本制备过程的这些差异将会影响CD34阳性细胞标准化与质量控制。此外，现有的红细胞裂解试剂在样本兼容性上也存在一定问题，不同类型的血液样本对红细胞裂解试剂的表现相差迥异，例如BautistaML等在研究红细胞渗透脆性的研究中，发现丙三醇诱发的溶血试验中，脐带血比成年人外周血发生50%溶解的时间要显著更长，P<0.0001（BautistaML等，Cordbloodredcellosmoticfragility:acomparisonbetweenpretermandfull-termnewborninfants,EarlyHumDev,2003,72(1):37-46）；这提示对于不同生物样本，红细胞裂解的难易程度存在较大差异，脐带血中的红细胞比外周血可能更难于发生裂解，这不仅在红细胞裂解试剂的品种选择上引入了困难，也为实验操作的标准化带来了障碍。又例如专利申请200880024758.1中所提及的现象，即由于红细胞裂解试剂无法裂解有核红细胞而给白细胞分析带来误差。再例如ALDAGEN公司的干细胞检测产品ALDEFLUOR说明书中明确指出，为保证红细胞的有效去除，使用氯化铵配方的红细胞裂解试剂对骨髓和脐带血样本进行处理时，条件是不同的，应严格按产品配套的不同实验方案进行操作。再例如Lonza公司的著名产品ACKlysingbuffer的产品说明书中明确指出，这一产品是针对人或小鼠的淋巴细胞制备液设计，而不是针对全血设计的；瑞士Lonza公司的产品ACKlysingbuffer的配方是氯化铵-碳酸氢钾-乙二胺四乙酸二钠，Lonza对其产品做出明确的适用性限制是有其原因的，这一配方的红细胞裂解试剂很难同时满足有效性和样本兼容性。综上，如何提高红细胞裂解试剂的样本兼容性，实现快速、稳定、完全的去除不同类型生物样本中的红细胞是本领域亟待解决的问题。

红细胞裂解试剂在使用上的第二个问题是对红细胞以外的细胞造成较大影响，特别对于丰度较低的细胞研究而言是非常不利的。例如，Menendenz等1998年报道了BectonDikinson公司的产品FACSLysingSolution在裂解样本中红细胞的同时，可造成CD34+细胞的选择性丢失，该配方主要成分为二乙烯乙二醇（MenendezPetal,Comparisonbetweenalyse-and-then-washmethodandalyse-non-washtechniquefortheenumerationofCD34+hematopoieticprogenitorcellscytometry,1998,34(6):264-271.）。巩文玉等在研究骨髓移植前动员外周血CD34+细胞相对计数时发现，使用BectonDikinson公司的产品FACSLysingSolution裂解处理后的粒细胞和淋巴细胞的FSC、SSC信号强度均弱于BeckmanCoulter公司的产品IOTest，且前者处理的标本CD45+细胞在所有收集的信号中的百分比要高于后者，这提示IOTest的裂解作用较为温和，但会导致红细胞污染，IOTest的配方为氯化铵、碳酸氢钾和乙二胺四乙酸；此外，该研究还发现裂解后所得总白细胞数与CD34+细胞数并不存在相关关系，这些现象均提示裂解液的配方对于预测输注给受者的CD34+细胞量存在重大影响，主要原因在于CD34+细胞含量很低，其检测结果可能对任何可能造成微小变异的因素均很敏感，特别是红细胞裂解这一操作（巩玉文等，红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数的影响，中国实验血液学杂志，2010，18(3)：762-765.）。崔巍等人在分析小鼠外周血免疫细胞的研究中尝试了自行配制的红细胞裂解试剂，其配方为8.3g氯化铵、1.0g碳酸氢钾和1.8ml5%乙二胺四乙酸溶解于800ml水中，结果显示其适用于免疫细胞表型研究和细胞内因子研究，但对裂解时间要进行严格控制，且很难掌握，需肉眼观察红细胞悬液从模糊至清晰，即立即停止裂解，否则会影响粒细胞分析（崔巍等，流式细胞术分析小鼠外周血免疫细胞全血裂解试剂比较研究，中国实验血液学杂志，2011，19(2):491-495.）。SueChow等人对多种非离子型表面活性剂对红细胞的裂解作用做了尝试，结果显示TritonX-100、NP-40、Brij-58三种表面活性剂在孵育10分钟后表现出了裂解红细胞的能力，但当这些表面活性剂超过0.2%浓度时会对白细胞的光散射角产生不良影响，而小于0.1%的浓度又会导致红细胞裂解不完全，由此得到结论0.1%浓度的上述表面活性剂孵育30分钟效果最好（SueChowetal,Wholebloodfixationandpermeabilizationprotocolwithredbloodcelllysisforflowcytometryofintracellularphosphorylatedepitopesinleukocytesubpopulations,CytometryPartA,2005,67(1):4-17.），在其他浓度范围下的效果相对差一些；而且这一方案效率较低，用时和密度梯度离心法相当。SueChow等人也把使用纯水裂解红细胞作为尝试用于其研究中，具体方法是将外周血用纯水裂解30秒，然后加入高渗的溶液进行终止（SueChowetal.,MeasurementofMAPkinaseactivationbyflowcytometryusingphospho-specificantibodiestoMEKandERK:potentialforpharmacodynamicmonitoringofsignaltransductioninhibitors.Cytometry2001;46:72-78.），但这种方法的稳定性不佳，对于不同生物样本的操作更是缺乏普遍适用的试验方案。

对于裂解液的配方优化在一些文献报道或专利申请中有所涉及，特别是依靠表面活性剂单独直接发挥溶血作用的方案见诸报道，但其往往由于作用剧烈，对白细胞的多种生物学参数造成不良影响。例如专利申请200910177186.7中公开了一种白细胞分类计数试剂、试剂盒以及白细胞分类计数的方法，该试剂包括花菁类阳离子化合物、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，其目的在于溶解红细胞和血小板，并损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，对白细胞内部核酸物质进行荧光标记；专利申请200910109215.6中公开了类似的白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法，该试剂包括花菁类荧光染料、糖苷类化合物等，该试剂的组成同以上所述的专利申请200910177186.7中的试剂的组成均用于白细胞的分类和计数，属于单一用途的专属试剂，其目的在于区分多类白细胞，因此对白细胞的散射光信息造成较大影响。具有类似用途的试剂在专利申请200880024758.1中也有所记载，该发明申请包含第1试剂和第2试剂，前者含有阳离子型表面活性剂、非离子表面活性剂和芳香族羧酸，第2试剂含有能够将核酸染色的荧光色素，然而与前面几件申请相似的是，第1试剂的用途在于使红细胞发生溶血的同时，对白细胞的细胞膜造成能让荧光色素透过程度的损伤，其质量分数在0.03%-0.9%之间，用量较大，因此对白细胞影响较大。专利申请200810115932.5中公开了一种可兼用作溶血剂的破膜剂及其用法，其配方由皂角苷、叠氮化钠、多聚甲醛、磷酸盐缓冲液组成，当用作破膜剂时，皂角苷的质量分数在0.1-0.5%，而用作溶血剂时，皂角苷的质量分数为0.05%，其用作溶血剂时通过流式细胞术数据可知，粒细胞侧向散射角与对照组发生明显变化，鉴于该试剂的组成具有双重用途，实验结果提示单纯依靠皂角苷进行破膜作用，可能会对白细胞产生不良影响，其浓度很难控制，操作可控性也相对不强。

综上所述，红细胞裂解试剂存在如下问题：

（a）进口在售产品价格昂贵，货期长，不利于广泛使用，且各品牌试剂配方不同、作用机制和标准各异，导致红细胞裂解的标准化操作很难实现；

（b）裂解试剂配方对红细胞裂解不完全，或裂解时间很难控制（操作可控制性差），对于后续实验产生不利影响；

（c）裂解试剂配方对红细胞以外的细胞造成较大影响，特别对于丰度较低的细胞研究而言是非常不利的，例如CD34+造血干细胞；

（d）裂解试剂的兼容性差，对于脐带血等难于裂解的样本表现不佳，缺乏普遍通用的配方可供选择。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于裂解红细胞的组合物，通过采用该组合物制成的红细胞裂解试剂能够快速、有效、完全地去除红细胞，并且具有良好的生物样本兼容性以及操作的可控制性。

本发明的目的还在于提供一种采用上述组合物制成的红细胞裂解试剂。

本发明的目的还在于提供上述红细胞裂解试剂在裂解红细胞中的应用。

为达到上述目的，本发明首先提供了一种用于裂解红细胞的组合物，其是由氯化铵、碳酸氢盐、“乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐”、裂解辅助剂组成的，其质量比为800-820：80-100：0.3-3：2-10。

在上述用于裂解红细胞的组合物中，优选地，所采用的碳酸氢盐为碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵等。

在上述用于裂解红细胞的组合物中，优选地，所采用的乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸二钠等。

在上述用于裂解红细胞的组合物中，优选地，所采用的表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基氯化铵等；更优选为十四烷基三甲基溴化铵。

在上述用于裂解红细胞的组合物中，优选地，该组合物是由氯化铵、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠和十四烷基三甲基溴化铵组成的，其质量比为800：100：0.3：2。

本发明还提供了一种红细胞裂解试剂，其是由上述用于裂解红细胞的组合物溶解于水得到的。该红细胞裂解试剂能够用于体外裂解红细胞。

在上述红细胞裂解试剂中，优选地，以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有0.80-0.82%的氯化铵、0.08-0.10%的碳酸氢盐、0.0003-0.003%的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐、0.002-0.01%的裂解辅助剂，余量为水。

在上述红细胞裂解试剂中，优选地，以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有0.80%的氯化铵、0.10%的碳酸氢钾、0.0003%的乙二胺四乙酸二钠、0.002%的十四烷基三甲基溴化铵，余量为水。

本发明还提供了上述红细胞裂解试剂在裂解生物样本中的红细胞中的应用。

在上述应用中，优选地，上述生物样本是指哺乳动物的血液和组织细胞样本，更优选地，上述生物样本包括人骨髓、人外周血、人脐带血、小鼠骨髓样本或小鼠脾脏样本等。

本发明还提供了一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其中，该试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有一个裂解试剂放置区和一个洗涤试剂放置区。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述盒体中还设有一个固定试剂放置区。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述裂解试剂放置区设有一裂解试剂管。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述裂解试剂管的容积为50mL或100mL。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述洗涤试剂放置区设有至少两个洗涤试剂管。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述洗涤试剂管的容积为100mL或200mL。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述固定试剂放置区设有至少两个固定试剂管。

在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述固定试剂管的容积为100mL或200mL。

在上述试剂盒中，裂解试剂管用于盛装十倍浓度（10×）的红细胞裂解试剂。该红细胞裂解试剂可以是本发明提供的红细胞裂解试剂，其可以具有以下成分组成：以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有8.0-8.2%的氯化铵、0.8-1.0%的碳酸氢盐、0.003-0.03%的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐、0.02-0.1%的裂解辅助剂，余量为水。其中，碳酸氢盐的实例包括碳酸氢钠、碳酸氢钾等；乙二胺四乙酸盐的实例包括乙二胺四乙酸二钠等；裂解辅助剂的实例包括十二烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、聚山梨酯-80等。裂解辅助剂可以有效通过增加红细胞膜渗透性而达到提升样本兼容性的目的，这不仅提高了红细胞的裂解效率，对不同类型的生物样本也提供了普遍通用的配方可供选择，有助于提高分析检验实验室内部质量控制的可实施性。洗涤试剂管用于盛装十倍浓度（10×）的洗涤试剂，上述洗涤试剂可以是平衡盐溶液（PBS溶液、Hanks溶液等）或生理盐水。该洗涤试剂同样可以用作样本稀释试剂。固定试剂管用于盛装固定试剂，上述固定试剂可以是浓度为0-4%（w/v）的多聚甲醛或甲醛的水溶液。高兼容性红细胞裂解试剂与统一标准的洗涤试剂和固定试剂的组合形式为红细胞裂解操作提供了系统化解决方案，这为获得跨越时间和空间可比性的检测数据奠定了坚实基础。

本发明提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒为实验室检测及临床诊断中“生物样本前处理-红细胞裂解”这一关键技术环节提供普遍适用、效果稳定的系统化解决方案，不仅提高了执行这一步骤的便捷程度，更有助于提高分析检验实验室内部质量控制的可实施性和室间质量评价（ExternalQualityAssessment,EQA）中的表现，以保证检验结果可以最佳地符合受检对象的实际情况，为进一步实验操作和医疗行为提供更为准确的依据。

本发明所提供的用于裂解红细胞的组合物以及红细胞裂解试剂通过向氯化铵、碳酸氢盐、乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐组成的裂解试剂中添加特定量的十四烷基三甲基溴化铵等作为裂解辅助剂，通过增加红细胞膜的渗透性，促进了NH4Cl裂解红细胞的作用效果，实现了快速、有效、完全地去除红细胞，并具备良好的生物样本兼容性和操作的可控制性，对除红细胞外的其它细胞造成最低程度的影响。本发明的技术方案不仅解决了单独使用NH4Cl配方时红细胞裂解效率和样本兼容性低的问题，而且还消除了单独使用表面活性剂对血细胞表面和内部抗原检测的不良影响，并提高了操作的可控制性。在本发明的技术方案中，十四烷基三甲基溴化铵等对NH₄Cl裂解的作用方式是间接辅助性的，而非直接对红细胞发挥裂解作用，这与现有技术存在很大不同。

附图说明

图1a-1h为使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人外周血进行裂解后，用流式细胞术对所得细胞进行光散射角分析结果图；

图2a-2h为使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人外周血进行裂解后，用流式细胞术对所得细胞进行典型的流式细胞术检测结果图；

图3a-3h为使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人脐带血进行裂解后，用流式细胞术对所得细胞进行光散射角分析结果图；

图4a-4h为使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人脐带血进行裂解后，用流式细胞术对所得细胞进行典型的流式细胞术检测结果图；

图5为实施例5提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒的结构示意图；

图6为实施例6提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒的结构示意图。

附图标号说明：

盒体1裂解试剂放置区2洗涤试剂放置区3固定试剂放置区4裂解试剂管5洗涤试剂管6固定试剂管7

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1用于红细胞裂解的组合物和液体试剂的配制通法

本实施例提供了一种用于红细胞裂解的组合物及液体试剂的配制方法，其包括以下步骤：

在温度为20-25℃、湿度小于60%的条件下，用万分之一或十万分之一精密度天平准确称量相应质量的固体原料或液体原料，置于一支50mL无菌离心管中，即得到用于红细胞裂解的组合物；

将上述组合物充分溶解于相应质量的注射用水中，形成无色透明溶液；

在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到另一支50mL的无菌离心管中，即得到用于红细胞裂解的液体试剂，4℃避光保存备用。

实施例2用于红细胞裂解的液体试剂的组成

本实施例提供了一组用于红细胞裂解的液体试剂，其组成如表1所示。其中，编号为LA01、LA02、LA03、LA04、LA05、LA06、LA07、LA08、LA09、LA10、LA11、LA12、LA13、LA14、LA15的液体介质为本发明提供的用于处理生物样本的液体介质--红细胞裂解试剂，编号为LA16、LA17、LA18的液体试剂为对比例，其中LA18即表示不加任何溶质的注射用水。

表1液体试剂的组成（以重量百分比计，余量为注射用水）

实施例3使用对照组和本发明液体试剂裂解人外周血中红细胞及裂解效果评价

人外周血样本取自健康成年志愿者，志愿者年龄在20-40岁之间，性别不限；

使用商购获得的真空采血管收集外周血，真空采血管内预装有抗凝剂，抗凝剂选自EDTAK2、柠檬酸钠或肝素；

以商购获得的裂解试剂产品作为实验对照组，用以说明本发明的裂解试剂的使用效果，包括对照组A（RBCLysisBuffer，美国Biolegend公司）、对照组B（ACKlysingbuffer，瑞士Lonza公司）、对照组C（流式细胞仪用溶血剂，旷博生物公司）；以商购获得的密度梯度介质（Ficoll-Paque^TMPLUS，通用电气医疗集团GEHealthcare）作为另外的实验对照组D，用以说明本发明所述裂解试剂未影响白细胞光散射角参数。

使用商购获得或实施例2中的LA01-LA17的红细胞裂解试剂对人外周血实施红细胞裂解的通用实验操作如下：

如商购获得的裂解试剂产品以10倍浓度（10×）的储存液形式提供，则在使用前先用注射用水稀释10×裂解试剂至1×，得到工作液，并在使用前将裂解试剂在室温平衡；实施例2提供的红细胞裂解试剂均为工作液浓度，可直接使用，不用经过稀释；

加20mL的1×裂解试剂的工作液至1mL的人外周血中，加毕立即轻轻涡漩离心管，并室温孵育10分钟；

孵育完毕后，将其在20℃、离心力为600g的条件下离心5分钟，弃去上层清液，用PBS缓冲液重悬细胞沉淀。

使用LA18（注射用水）对人外周血实施红细胞裂解的操作如下：

预先配制高渗氯化钠溶液（1.8%w/w）作为这一操作的终止试剂，配制方法参照实施例1。

加20mL的LA18至1mL的人外周血中，加毕立即轻轻涡旋离心管，孵育30秒，即加入上述配制的终止试剂终止裂解反应；将其在20℃、离心力为600g的条件下离心5分钟，弃去上层清液，用PBS缓冲液重悬细胞沉淀。

使用对照组D对人外周血实施单个核细胞富集的操作如下：

将5mL对照组D装入15mL的无菌离心管中，将抗凝人外周血与PBS溶液在离心管中按1：1的体积比混合稀释；

将5mL稀释后的抗凝人外周血用移液管小心加入上一步制备的装有对照组D的离心管中，注意维持血液样本和介质层的界面清晰分明，平稳地将血样铺在介质上，血样加入速度不可过快，应沿管壁缓缓加入等，这些操作要点是本领域技术人员所熟知的；

将完成载样的离心管放入装配有水平转子的低温离心机中，设置离心温度为20℃，离心力为400g，在此条件下离心30分钟；

将离心后的样品管平稳取出离心机，可以观察到血浆层和介质层界面处有“白膜层”，此即得到富集的目的细胞，白膜层越紧密集中，越容易从样本中完整移取出，并且能够尽可能少地带出介质和血浆；

用无菌巴斯德吸管将白膜层完整移取出并转移到一支15mL的无菌离心管中，加入10mLPBS缓冲液形成均匀的细胞悬液，将其在20℃、离心力为600g的条件下离心5分钟完成第一次洗涤，对于得到的细胞可以选择进行第二次洗涤，操作同第一次洗涤；用PBS缓冲液重悬细胞沉淀。

对上述三类处理操作后经过洗涤得到的细胞进行台盼蓝染色、镜下细胞计数及流式细胞术分析，对白细胞的回收率（以美国Biolegend公司产品RBCLysisBufferCat.No.420301作为对照组A计算回收率）、细胞活率、CD45+细胞比例进行计算，对FSC、SSC进行观察，结果如表2所示。

表2使用对照组和本发明液体试剂裂解人外周血中红细胞的效果评价（n=8）

图1a-1h表示使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人外周血进行裂解后，用流式细胞术对所得细胞进行光散射角分析（FSC、SSC）的典型数据。图2a-2h表示使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人外周血进行裂解后，用流式细胞术对所得细胞进行典型的流式细胞术检测结果（免疫荧光检测），即采用CD45-FITC荧光标记抗体（Biolegend公司）对所得的细胞进行染色完成检测的典型数据。由表2所示的裂解效果数据以及图1a-1h、图2a-2h的结果可以看出：本发明提供的液体试剂具有良好的裂解效果，并且对于样本中的其他细胞的影响很小。

实施例4使用对照组和本发明液体试剂裂解人脐带血中红细胞及裂解效果评价

人脐带血样本来自健康足月新生儿，性别不限；

使用商购获得的一次性采血袋采集新鲜脐带血，一次性采血袋内预装有抗凝剂，抗凝剂为柠檬酸钠；

以商购获得的裂解试剂产品作为实验对照组，用以说明本发明的裂解试剂的使用效果，包括对照组A（RBCLysisBuffer，美国Biolegend公司）、对照组B（ACKlysingbuffer，瑞士Lonza公司）、对照组C（流式细胞仪用溶血剂，旷博生物公司）；以商购获得的密度梯度介质作为另外的实验对照组D，用以说明本发明的裂解试剂未影响白细胞光散射角参数。

使用商购获得的红细胞裂解试剂或实施例2中的LA01-LA17的红细胞裂解试剂对人脐带血实施红细胞裂解的通用实验操作如下：

如商购获得的裂解试剂产品以10倍浓度（10×）的储存液形式提供，则在使用前先用注射用水稀释10×裂解试剂至1×工作液，并在使用前将裂解试剂在室温平衡；实施例2提供的红细胞裂解试剂均为工作液浓度，可直接使用，不用经过稀释；

加20mL的1×裂解试剂的工作液至1mL的人脐带血中，加毕立即轻轻涡旋离心管，并室温孵育10分钟；

孵育完毕后，将其在20℃、离心力为600g的条件下离心5分钟，弃去上层清液，用PBS缓冲液重悬细胞沉淀。

使用LA18（注射用水）对人脐带血实施红细胞裂解的操作如下：

预先配制高渗氯化钠溶液（1.8%w/w）作为这一操作的终止试剂，配制方法参照实施例1。

加20mL的LA18至1mL的人脐带血中，加毕立即轻轻涡旋离心管，孵育30秒，即加入上述配制的终止试剂终止裂解反应；将其在20℃、离心力为600g的条件下离心5分钟，弃去上层清液，用PBS缓冲液重悬细胞沉淀。

使用对照组D对人脐带血实施单个核细胞富集的操作如下：

将5mL对照组D装入15mL的无菌离心管中，将人脐带血与PBS溶液在离心管中按1：1的体积比混合稀释；

将5mL稀释后的人脐带血用移液管小心加入上一步制备的装有对照组D的离心管中，注意维持血液样本和介质层的界面清晰分明，平稳地将血样铺在介质上，血样加入速度不可过快，应沿管壁缓缓加入等，这些操作要点是本领域技术人员所熟知的；

将完成载样的离心管放入装配有水平转子的低温离心机中，设置离心温度为20℃，离心力为400g，在此条件下离心30分钟；

将离心后的样品管平稳取出离心机，可以观察到血浆层和介质层界面处有“白膜层”，此即得到富集的目的细胞，白膜层越紧密集中，越容易从样本中完整移取出，并且能够尽可能少地带出介质和血浆；

用无菌巴斯德吸管将白膜层完整移取出并转移到一支15mL的无菌离心管中，加入10mLPBS缓冲液形成均匀的细胞悬液，将其在20℃、离心力为600g的条件下离心5分钟完成第一次洗涤，对于得到的细胞可以进行第二次洗涤，操作同第一次洗涤，用PBS缓冲液重悬细胞沉淀。

对上述三类处理操作后经过洗涤得到的细胞进行台盼蓝染色、镜下细胞计数及流式细胞术分析，对白细胞的回收率（以美国Biolegend公司产品RBCLysisBufferCat.No.420301作为对照组A计算回收率）、细胞活率、CD45+细胞比例进行计算，对FSC、SSC进行观察，结果如表3所示。

表3使用对照组和本发明液体试剂裂解人脐带血中红细胞的效果评价（n=10）

图3a-3h表示使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人脐带血进行裂解后，用流式细胞术对所得到的细胞进行光散射角分析（FSC、SSC）的典型数据。图4a-4h表示使用对照组A、对照组B、对照组C、对照组D、LA01、LA05、LA11、LA16对人脐带血进行裂解后，用流式细胞术对所得到的细胞进行典型的流式细胞术检测结果（免疫荧光检测），即采用CD45-FITC荧光标记抗体（美国Biolegend公司）对所得到的细胞进行染色完成检测的典型数据；由表3以及上述附图所显示的结果可以看出，本发明提供的液体试剂具有良好的裂解效果。

实施例5

本实施例提供了一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其结构如图5所示。

该试剂盒包括一盒体1，该盒体1内设有裂解试剂放置区2和洗涤试剂放置区3，

其中，裂解试剂放置区2内设有一容积为50mL的裂解试剂管5，该裂解试剂管5中盛装有10×的红细胞裂解剂，以重量百分比计，该10×红细胞裂解试剂含有8.0%的氯化铵、1.0%的碳酸氢钾、0.003%的乙二胺四乙酸二钠、0.02%的裂解辅助剂，余量为水；其是通过以下步骤制备的：准确称取EDTA·Na₂·2H₂O0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的乙二胺四乙酸盐母液；准确称取裂解辅助剂0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的裂解辅助剂母液；准确称取一定质量氯化铵、碳酸氢钾，溶解于80.0000g纯水中；使用移液器添加一定量的0.5%的乙二胺四乙酸盐母液以及0.5%的裂解辅助剂母液到配制的裂解试剂中，混匀，添加纯水到100.0000g，得到10×的红细胞裂解试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。

洗涤试剂放置区3内设有两个容积分别为100mL的洗涤试剂管6，该洗涤试剂管6内盛装有10×的洗涤试剂--PBS磷酸盐缓冲液，其是通过以下步骤制备的：准确称取一定质量磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠溶解于800mL纯水中，加入氢氧化钠或者盐酸调节pH值于7.2，调节pH后，使用纯水将溶液定容到1L，得到10×的洗涤试剂，在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。

实施例6

本实施例提供了一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其结构如图6所示。

该试剂盒包括一盒体1，该盒体1内设有裂解试剂放置区2、洗涤试剂放置区3和固定试剂放置区4；

其中，裂解试剂放置区2内设有一容积为50mL的裂解试剂管5，该裂解试剂管5中盛装有10×的红细胞裂解剂，以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有8.0%的氯化铵、1.0%的碳酸氢钾、0.003%的乙二胺四乙酸二钠、0.02%的裂解辅助剂，余量为水；其是通过以下步骤制备的：准确称取EDTA·Na₂·2H₂O0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的乙二胺四乙酸盐母液；准确称取裂解辅助剂0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的裂解辅助剂母液；准确称取一定质量氯化铵、碳酸氢钾，溶解于80.0000g纯水中；使用移液器添加一定量的0.5%的乙二胺四乙酸盐母液以及0.5%的裂解辅助剂母液到配制的裂解试剂中，混匀，添加纯水到100.0000g，得到10×的红细胞裂解试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。

洗涤试剂放置区3内设有两个容积分别为100mL的洗涤试剂管6，该洗涤试剂管6内盛装有10×的洗涤试剂--PBS磷酸盐缓冲液，其是通过以下步骤制备的：准确称取一定质量磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠溶解于800mL纯水中，加入氢氧化钠或者盐酸调节pH值于7.2，调节pH后，使用纯水将溶液定容到1L，得到10×的洗涤试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。

固定试剂放置区4内设有两个容积分别为100mL的固定试剂管7，该固定试剂管7中盛装有固定试剂，其是通过以下步骤制备的：准确称取一定质量多聚甲醛粉末，置于500mL烧杯中；用量筒量取200mLPBS溶液，置于烧杯中，将烧杯置于约60℃水中水浴，并搅拌；加入1M的氢氧化钠溶液少量，搅拌至溶液澄清，用1M的HCl调节pH值至中性，得到固定试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。

实施例7

本实施例提供了一种利用实施例5提供的试剂盒进行外周血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：

1、使用EDTA·K₂抗凝剂的采血管采集身体健康志愿者外周血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。

2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。

3、将采血管中的样本混匀后取100μL抗凝人外周血，加入流式管中，使用1mL移液器加入2mL的1×红细胞裂解试剂，混匀，室温静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。

4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，用100μL移液器取100μL洗涤试剂加入流式管中重悬细胞，加入相应抗体染色，室温避光孵育20min后，加入2mL洗涤试剂洗涤流式管中的剩余抗体，洗涤操作重复一次，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，将得到的细胞样本于1h内进行流式细胞检测。

实施例8

本实施例提供了一种利用实施例6提供的试剂盒进行外周血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：

1、使用EDTA·K₂抗凝剂的采血管采集身体健康志愿者外周血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。

2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。

3、将采血管中的样本混匀后取100μL抗凝人外周血，加入流式管中，使用1mL移液器加入2mL的1×红细胞裂解试剂，混匀，室温静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。

4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，用100μL移液器取100μL洗涤试剂加入流式管中重悬细胞，加入相应抗体染色，室温避光孵育20min后，加入2mL洗涤试剂离心洗涤流式管中的剩余抗体。

5、洗去流式管中的剩余抗体后，弃去上清液，向流式管中加入500μL固定试剂重悬细胞，4℃避光固定1h后，离心洗去固定试剂，洗涤操作重复一次，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，所得细胞样本可以于24h内进行流式细胞检测。

实施例9

本实施例提供了一种利用实施例5提供的试剂盒进行脐带血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：

1、使用柠檬酸钠抗凝剂的血袋采集人脐带血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。

2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。

3、将血袋中的样本混匀后取100μL抗凝人脐带血加入流式管中，向流式管中加入相应抗体染色，室温避光孵育20min，染色结束后，使用1mL移液器加入2mL1×红细胞裂解试剂，混匀，室温避光静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。

4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，随后加入2mL洗涤试剂离心洗涤流式管中的剩余抗体，洗涤操作重复一次。

5、洗去流式管中的剩余抗体后，弃去上清液，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，将得到的细胞样本于1h内进行流式细胞检测。

实施例10

本实施例提供了一种利用实施例6提供的试剂盒进行脐带血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：

1、使用柠檬酸钠抗凝剂的血袋采集人脐带血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。

2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。

3、将血袋中的样本混匀后取100μL抗凝人脐带血加入流式管中，向流式管中加入相应抗体染色，室温避光孵育20min，染色结束后，使用1mL移液器加入2mL1×红细胞裂解试剂，混匀，室温避光静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。

4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，随后加入2mL洗涤试剂离心洗涤流式管中的剩余抗体。

5、洗去流式管中的剩余抗体后，弃去上清液，向流式管中加入500μL固定试剂重悬细胞，4℃避光固定1h后，离心洗去固定试剂，洗涤操作重复一次，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，得到细胞样本可以于24h内进行流式细胞检测。

Claims (7)

1.一种红细胞裂解试剂，以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有0.80-0.82％的氯化铵、0.08-0.10％的碳酸氢盐、0.0003-0.003％的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐、0.002-0.01％的十四烷基三甲基溴化铵，余量为水。

2.根据权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其中，以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有0.80％的氯化铵、0.10％的碳酸氢钾、0.0003％的乙二胺四乙酸二钠、0.002％的十四烷基三甲基溴化铵，余量为水。

3.根据权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其中，所述碳酸氢盐为碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵。

4.根据权利要求1所述的红细胞裂解试剂，其中，所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸二钠。

5.权利要求1或2所述的红细胞裂解试剂在裂解生物样本中的红细胞中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述生物样本包括哺乳动物血液及组织细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述生物样本包括人骨髓、人外周血、人脐带血、小鼠骨髓样本或小鼠脾脏样本。