CN103614135B - 一种双光子荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中双光子荧光探针的结构由下式表示：

Description

一种双光子荧光探针及其制备方法和用途

一、技术领域

本发明涉及一种双光子荧光探针、其制备方法及其用途，可以通过双光子成像定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸。

二、背景技术

氨基酸比如半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱甘肽在生物系统中发挥着重要的作用。他们有着相同的结构式，当这些氨基酸的浓度达到一定程度时，会导致一系列的疾病，比如增长放缓、头发褪色、水肿、嗜睡、肝损伤、肌肉和脂肪减少、皮肤病变和阿尔茨海默氏症。如何检测他们是非常重要的并且引起很多科学家的兴趣。然而定性地在细胞中检测氨基酸分子还是很少，因此在体内外检测氨基酸小分子尤为重要。

荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号能发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便，灵敏等优点在痕量检测中展现了优越的性能。

喹啉具有良好的光谱特性和水溶性，并且对细胞也是低毒性。因此喹啉是一个很好的荧光报告基团。喹啉作为荧光团已报道的文献很多，但大部分局限于单光子荧光探针，双光子荧光探针报道甚少。荧光探针对半胱氨酸/高半胱氨酸检测的双光子荧光探针更为稀少。

目前半胱氨酸/高半胱氨酸检测荧光探针大部分为单光子荧光探针，然而单光子荧光探针不仅易使生物本体产生自发荧光干扰，而且短的激发波长还会对细胞产生光致毒。近几年来，双光子荧光探针作为一个科学家感兴趣的研究课题，开始逐步替换单光子荧光探针，双光子荧光探针具有近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率、降低生物组织吸收系数及降低组织自发荧光干扰等优点。

三、发明内容

本发明旨在提供一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计遴选合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸，具有选择性专一、灵敏度高、检测浓度低的优点，细胞毒性测试表明本发明对细胞几乎没有毒性作用。

本发明双光子荧光探针，是以喹啉为母体，简称荧光探针或荧光探针分子（NQ），其结构由下式表示：

本发明双光子荧光探针的制备方法，按以下步骤操作：

（1）将对碘苯胺15g(68.49mmol)和6mol/L的盐酸100mL加入反应器中，升温至105℃，待固体完全溶解后向反应器中滴加巴豆醛12g(171mmol)，保温反应并用TLC跟踪至原料反应完毕，反应结束后冷却至室温，反应液倒入200mL水中，用乙酸乙酯萃取以除掉未反应的巴豆醛，水相用氨水中和至pH值为8，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并旋蒸后得到粗产物，重结晶（溶剂为乙酸乙酯和石油醚按体积比1:20构成的混合溶剂）后得到中间体1；

（2）将中间体18g(29.74mmol)加入圆底烧瓶中，加入1,4-二氧六环溶解，随后加热至60℃，每隔十分钟加一次二氧化硒0.82g(7.43mmol)，二氧化硒的加入总量是4.95g，升温至80℃反应2.5小时，反应结束后冷却至室温，过滤并用1,4-二氧六环洗涤，收集有机相，旋蒸后得到粗产物，粗产物用柱层析分离提纯（二氯甲烷作为洗脱剂）得到中间体2；

（3）将中间体24g(14.13mmol)、4-（N,N-二甲基）苯乙炔2.08g(14.13mmol)、三苯基磷二氯化钯0.1g(0.14mmol)、碘化亚铜0.5g（2.6mmol）以及三乙胺10mL加入圆底烧瓶中，加入甲苯溶解，室温反应8小时，过滤后收集滤液，将滤液旋蒸后得到粗产物，重结晶（溶剂为乙酸乙酯和石油醚按体积比1:5构成的混合溶剂）后得到双光子荧光探针NQ。

本发明荧光探针分子NQ的合成过程如下：

本发明双光子荧光探针在定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸时作为检测试剂的应用。

将本发明荧光探针分子溶于DMSO中制得1mM的母液，取250μL的该母液于10mL容量瓶中，再用DMSO定容，配制成25μM。同样方法取250μL的母液于10mL容量瓶中，然后加入5倍当量的半胱氨酸（Cys）或高半胱氨酸（Hcy）。荧光探针单光子和双光子的激发波长分别为395nm和800nm，检测485-700nm范围内的荧光光谱变化，随着时间的变化，550nm发射峰逐渐增强（图3）。

本发明荧光探针检测半胱氨酸或高半胱氨酸的机理是荧光探针分子上醛基与半胱氨酸或高半胱氨酸反应形成环状的四氢噻唑，荧光探针分子本身存在强的ICT过程，因此受溶剂的影响，荧光探针分子本身表现出很弱的荧光。加入半胱氨酸或高半胱氨酸后，ICT过程消失，溶剂效应明显减弱，并伴随着在550nm左右的发射峰逐渐增强。这样设计目的以实现半胱氨酸或高半胱氨酸的检测。

本发明荧光探针分子荧光量子产率较低，与半胱氨酸或高半胱氨酸反应后荧光量子产率升高10倍左右。因此本发明荧光探针分子能更好地应用生物检测中。

本发明荧光探针分子能够对生物细胞体系的半胱氨酸或高半胱氨酸进行专一性的识别，监测分析及跟踪。

本发明荧光探针分子结构简单，易于合成，作用位点和荧光基团为一整体。本发明荧光探针分子与半胱氨酸或高半胱氨酸有明确的作用位点，本发明通过醛基与半胱氨酸或高半胱氨酸反应后形成稳定环状的四氢噻唑。本发明荧光探针分子以荧光强弱的变化来检测半胱氨酸或高半胱氨酸，并且能在可见光下看出前后溶液颜色的变化（溶液颜色从黄色变成无色）。本发明荧光探针分子与半胱氨酸或高半胱氨酸作用后，在紫外灯下，肉眼就可以看出其荧光变化，荧光颜色从无变成黄绿色光，操作简单，快速灵敏。本发明荧光探针分子选择性专一，灵敏度高，检测浓度低（小于10^-7M）。

四、附图说明

图1是本发明荧光探针分子与半胱氨酸或高半胱氨酸反应过程图。

图2是将本发明荧光探针分子（25μM）加入5倍当量的Cys和Hcy的紫外随着时间变化光谱图。从图3a，3b（插图）中可以看出在加入5倍当量的Cys和Hcy后，约半个小时后荧光强度趋于稳定。

图3是将本发明荧光探针分子（25μM）加入Cys和Hcy（0-80μM）的荧光浓度光谱图，每条线的溶液都是静置30分钟后测试。从图3中可以看出在加入3倍当量的Cys和Hcy后，荧光强度趋于稳定。

图4是本发明荧光探针分子NQ（1mM）加入5倍当量半胱氨酸或高半胱氨酸在不同的波长激发下双子吸收截面值的变化。

图5是本发明荧光探针分子在细胞培养24小时后的细胞存活率。从图4中我们可以看出，浓度为10μM时，细胞存活率还有98%左右，说明了本发明荧光探针分子对细胞无毒性作用，因此可以用来做细胞检测及跟踪半胱氨酸/高半胱氨酸。

图6是本发明荧光探针分子的双光子荧光共聚焦成像照片，其中图A为293FT细胞的明场，图B为荧光探针分子（10μM）在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液（pH7.4）冲洗，在双光子荧光共聚焦显微成像，在800nm激发下，荧光发射收集范围500-600nm。图C是在图B相同处理下，再加入Cys（50μM），继续培养细胞培养30分钟，用PBS缓冲液（pH7.4）冲洗，在双光子荧光共聚焦显微成像，在800nm激发下，荧光收集范围500-600nm。从细胞成像可以看出，荧光探针分子NQ在细胞中荧光很弱，用Cys处理后，荧光明显增强。

五、具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：荧光探针分子NQ的合成

1、中间体1的合成

称取对碘苯胺15g(68.49mmol)和6mol/L的盐酸100mL于三口瓶中，装置冷凝管，加热至105℃，直至固体完全溶解，慢慢滴加巴豆醛12g(171mmol)，用TLC跟踪至原料反应完毕，停止反应，冷却至室温，反应液倒入200mL水中，用乙酸乙酯萃取(100mL×2)以除掉未反应完的巴豆醛，水溶液用氨水中和至pH值为8，乙酸乙酯萃取(50mL×2)，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得粗产物，粗产物在乙酸乙酯和石油醚（体积比1:20）的混合溶剂中重结晶得14.45g(53.72mmol)中间体1，收率78.4%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm):δ2.74(3H,d,J=17.5Hz),7.28(1H,t,J=7.3Hz),7.76-7.69(1H,m),7.92-7.86(2H,m),8.13(1H,s).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,ppm):δ25.44,76.75,77.07,77.39,90.87,122.69,128.23,130.39,134.93,136.20,138.08,146.77,159.70.

2、中间体2的合成

称取中间体18g(29.74mmol)于圆底烧瓶中，加入1,4-二氧六环至固体完全溶解，加热至60℃，每隔十分钟加一次二氧化硒0.82g(7.43mmol)，约1个小时加入完毕（总量4.95g），升温至80℃继续反应2.5小时，反应结束后，冷却至室温，抽滤除去沉淀物，用1,4-二氧六环冲洗(5mL×2)，收集合并有机相，有机相旋蒸得粗产物，粗产物用柱层析法提纯（洗脱剂为二氯甲烷）得7.56g(6.61mmol)的中间体2，收率89.9%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm)δ7.96(1H,d,J=8.9Hz),8.05(2H,t,J=9.1Hz),8.20(1H,d,J=8.5Hz),8.32(1H,s),10.20(1H,s).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,ppm):δ76.72,77.04,77.35,95.77,118.14,131.39,131.84,136.15,136.72,139.40,146.82,152.86,193.35.

3、荧光探针分子NQ的合成

氮气保护下，称取中间体24g(14.13mmol)，4-（N,N-二甲基）苯乙炔2.08g(14.13mmol)，三苯基磷二氯化钯0.1g(0.14mmol)，碘化亚铜0.5g（2.6mmol）以及三乙胺10mL于圆底烧瓶中，加入甲苯溶解，室温反应8小时，过滤后收集滤液，将滤液旋蒸后得到粗产物，粗产物在乙酸乙酯和石油醚（体积比1:5）的混合溶剂中重结晶得3.5g(12.68mmol)目标产物，收率89.74%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm):δ3.03(6H,s),6.69(2H,d,J=8.4Hz),7.47(2H,d,J=8.5Hz),7.88(1H,d,J=8.7Hz),8.03(2H,d,J=8.6Hz),8.17(1H,d,J=8.8Hz),8.25(1H,d,J=8.3Hz),10.19(1H,d,J=14.5Hz).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,ppm):δ40.26,88.64,94.45,100.70,109.48,111.87,118.03,122.98,125.58,129.93,133.13,136.83,152.46,193.66.

实施例2：荧光探针分子的双光子测试

利用双光子测量技术，测试荧光探针分子（NQ）和荧光探针分子与半胱氨酸反应后（MQ-Cys）的双光子吸收截面，从图4可以看出，荧光探针分子与半胱氨酸或高半胱氨酸反应后（NQ-Cys或NQ-Hcy）的最大吸收截面分别是587和693GM，双光子激发波长均在800nm。实施例3：细胞毒性测试

MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）实验是根据已报道的文章，做一些细胞毒性测试。分别在同一批细胞中加入0，10，30，80μM的荧光探针分子，此条件是在37℃、含5%CO₂的细胞培养箱中孵育24小时，根据细胞存活度的公式：细胞存活率％=OD570（样品）/OD570（对照组）×100，可算得细胞存活率（图5）。从图5中我们可以看出，浓度为10μM时，细胞存活率还有98%左右，说明了本发明荧光探针分子对细胞无毒性作用，因此可以用来做细胞检测及跟踪氨基酸小分子。

实施例4：细胞成像测试

293FT细胞由DEME（invitrogen）培养液培养，成像前一天，293FT细胞放于平底表面皿中，成像时293FT细胞和10μM的荧光探针MQ的DMSO溶液于37℃、含5%CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液或培养液充分洗涤后，用双光子荧光共聚焦成像，得图6b。向上述含荧光探针的细胞培养液中加入（50μM）半胱氨酸溶液，在37℃、含5%CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液或培养液充分洗涤后，再进行双光子荧光共聚焦成像，得图6c。从图5中可以看出，加入半胱氨酸前，500-60nm有微弱的荧光；加入半胱氨酸后，500-600nm荧光明显增强。

Claims (3)

1.一种双光子荧光探针，是以喹啉为母体，其特征在于其结构由下式表示：

2.一种权利要求1所述的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于按以下步骤操作：

(1)将对碘苯胺15g和6mol/L的盐酸100mL加入反应器中，升温至105℃，完全溶解后向反应器中滴加巴豆醛12g，保温反应至原料反应完全，反应结束后冷却至室温，反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取以除掉未反应的巴豆醛，水相用氨水中和至pH值为8，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并旋蒸后得到粗产物，重结晶后得到中间体1；

(2)将8g中间体1加入圆底烧瓶中，加入1,4-二氧六环溶解，随后加热至60℃，加入二氧化硒4.95g，升温至80℃反应2.5小时，反应结束后冷却至室温，过滤并用1,4-二氧六环洗涤，收集有机相，旋蒸后得到粗产物，粗产物用柱层析分离提纯得到中间体2；步骤(2)中二氧化硒均分为六次加入，每次加入的间隔时间为10分钟；

(3)将4g中间体2、4-(N,N-二甲基)苯乙炔2.08g、三苯基磷二氯化钯0.1g、碘化亚铜0.5g以及三乙胺10mL加入圆底烧瓶中，加入甲苯溶解，室温反应8小时，反应结束后过滤，收集滤液，将滤液旋蒸后得到粗产物，重结晶后得到双光子荧光探针NQ。

3.一种权利要求1所述的双光子荧光探针的用途，其特征在于：在定性检测细胞中半胱氨酸或高半胱氨酸时作为检测试剂的应用。