CN103596588A - 用于犬呼吸道疾病综合征的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一个包括犬流感病毒和犬呼吸道冠状病毒的组合物。其还可以进一步包括支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，百日咳杆菌粘附素(pertactin)，犬副流感病毒(canine parainfluenza virus)和犬腺病毒血清型2型(canine adenovirus serotype2)。该组合物可以有效的治疗或者预防包括犬传染性呼吸道疾病综合征在内的犬呼吸道疾病。

Description

用于犬呼吸道疾病综合征的组合物

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别是免疫原性和疫苗的组合物。其涉及用于防治包括犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)在内的犬呼吸道疾病的组合物。本发明还涉及在犬体内接种疫苗、治疗、或者预防犬呼吸道疾病的方法。

背景技术

犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)是一种传染性极强的疾病，常见于住在拥挤的条件下，如领养中心和登机或培训犬舍的狗。许多狗仅仅表现出轻微的咳嗽，然后在很短的时间内就恢复了。但是在某些情况下，可能会发展成严重的支气管肺炎。

CIRDC的发病机理被认为是多因素的，涉及一些病毒和细菌。已知的CIRDC病原体的传染原包括犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)(Erles等,Virology,310(2):216-223,2003)、犬流感病毒(CIV)(Crawford等,Science,310(5747):482-485,2005)、犬副流感病毒(CPIV)(Binn等,Exp.Biol.Med.,126:140-145,1967)、犬腺病毒2型(CAV-2)(Ditchfield等,Can.Vet.J.,3:238-247,1962)、犬支原体(Chalker等,Microbiology,150:3491-3497,2004)，和细菌支气管炎博德特氏菌(Bemis等,Lab.Anim.Sci.,29:48-52,1977)。

CRCoV可以引发高度传染性呼吸道疾病，其通过犬类和犬类的直接接触、呼吸道分泌物的悬浮微粒、以及和污染的环境和人接触而传播。患病轻微的狗的症状包括咳嗽、打喷嚏、鼻涕。一些狗有亚临床感染，并没有任何临床症状，但是他们可以传播病毒从而使其他狗感染。一些感染了CRCoV的狗会发展成为肺炎，特别是如果还同时感染了其他的呼吸道病原体。

有关CIV，从大约1956年开始，马流感病毒被认为是马中主要的呼吸道病原体。马流感病毒可以引发严重的疾病症状，并经常继发细菌感染。两种马流感病毒的亚型已经别确定，命名为亚型-1(原型为A/Equine/Prague/1/56(H7N7))和亚型-2(原型为A/Equine/Miami/1/63(H3N8))。目前，主要的病毒亚型是亚型-2，H3N8菌株。H3N8马流感病毒可以感染犬类，一些情况下致死率高达36%。一种解释是马流感病毒全部或部分种间转移至犬类，会产生一种新的与急性呼吸道疾病有关的犬类特殊流感病毒(Crawford等,2005)。

CPIV引起的疾病通常在上呼吸道。单独由CPIV引发的疾病是十分轻微的或者表现为亚临床，如果并发感染其他呼吸道病原体则症状将会变得越发严重。

CAV-2导致呼吸系统疾病，严重的情况下，可以包括肺炎和支气管肺炎。

据报道，支气管炎博德特氏菌(B.Bronchiseptica)是呼吸道疾病气管支气管炎或“犬舍咳”中的主要病原。它使狗易受其他呼吸剂的影响，并且经常和它们同时存在。犬舍咳通常发生在上呼吸道，特点是流鼻涕和咳嗽。至目前为止，一些疫苗可以用于治疗由支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)引发的气管支气管炎，包括Nobivac

Bronchi-Shield、BronchicineCAe、Vanguard

B、Univac2、Recombitek

KC2、Naramune^TM-2和Kennel-Jec^TM2。然而，大多数现有的商业疫苗需要繁琐的鼻腔给药以及加入佐剂，这可能会导致有害的副作用，如烧灼和刺激。Viera Scheibner等,Nexus Dec 2000(Vol8,No1)。亚单位疫苗，如那些涉及使用支气管炎博德特氏菌的p68蛋白(百日咳杆菌粘附素)，已经被研究，但是至今没有被包括在任何商业犬类疫苗中，可能是因为免疫原性不足，不良反应，和/或制剂的稳定性。

CIRDC的病理学表明其涉及肺损伤，在某些情况下，导致支气管肺炎，但是其与犬舍咳(主要病原：支气管炎博德特氏菌B.bronchiseptica)不同，犬舍咳主要涉及上呼吸道变化。犬舍咳是一种相比于CIRDC更加轻微的综合病症，并且不具有在CIRDC中指出的广泛的病变。CIRDC也以增加的严重程度和死亡率为特征。

CIRDC很少致命，但是会延迟救援中心的狗被领养，打乱狗舍的训练安排，导致相当大的治疗费用和福利问题。疫苗可以用于治疗一些与CIRDC有关的传染原。但是，尽管使用这些疫苗，CIRDC仍然在世界范围内盛行，其可能是因为缺乏相对于与CIRDC有关的所有的病原体的有效疫苗。

因此，仍然需要可以安全使用于犬类的免疫原型组合物，在提供相对于引发CIRDC的病原长期有效的免疫保护的同时，并没有有害的副作用或者在和其他疫苗一起使用时并不干扰其他抗原。本发明将满足这些和其他相关的需要。

发明内容

本发明主要涉及可以提供用于治疗或者预防CIRDC的抗原的免疫原性组合物。在一个实施例中，免疫原性组合物包括犬流感病毒(CIV)和犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。在另一个实施例中，该免疫原性组合物进一步包括支气管炎博德特氏菌。在另一个实施例中，该免疫原性组合物进一步包括单独的百日咳杆菌粘附素抗原。在另一实施例中，该免疫原性组合物包括p68百日咳杆菌粘附素抗原。在另一个实施例中，百日咳杆菌粘附素抗原是一种重组蛋白。在又一个实施例中，百日咳杆菌粘附素抗原在大约1μg至大约30μg之间。在另一个实施例中，所述的百日咳杆菌粘附素抗原通过将百日咳杆菌粘附素抗原包涵体溶解在尿素中以及任选的通过色谱柱纯化而制备得到。所述的百日咳杆菌粘附素抗原是可溶的，并且优选地基本没有聚集体。在另一个实施例中，支气管炎博德特氏菌是疫苗或者细菌提取物。

在一个实施例中，免疫原性组合物包括CIV、CRCoV、支气管炎博德特氏菌、以及选自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一种或两种抗原。在另一个实施例中，所述的免疫原性组合物进一步包括p68百日咳杆菌粘附素抗原。在另一个实施例中，支气管炎博德特氏菌是疫苗或者细菌提取物。

另一个实施例中提供的免疫原性组合物包括CIV、CRCoV、包含支气管炎博德特氏菌的支气管炎博德特氏菌组分，单独的百日咳杆菌粘附素抗原，以及选自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一种或两种抗原。在一个进一步的实施例中，该免疫原性组合物同时包括CPIV和CAV-2。

在另一实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物进一步包括单独的Bsp22抗原。

在另一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物是无佐剂的。在另一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物包括佐剂。

在另一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物不含有非呼吸道抗原。

在又一个实施例中，上述实施例中的任一种免疫原性组合物诱导在犬体内对于犬呼吸道病原体的免疫应答。在另一个实施例中，所述的犬呼吸道病原体是CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌和犬支原体(Mycoplasma cynos)中的至少一种。

本发明的另一个实施例中提供了将上述实施例中的任一种免疫原性组合物用于治疗或者预防犬类对于犬呼吸道病原体的感染。在另一个实施例中，所述的犬呼吸道病原体是CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌、和犬支原体中的至少一种。在另一个实施例中，所述的组合物在约6个月或更长的时间内预防所述的感染。在另一个实施例中，所述的组合物在约1年的时间内预防所述的感染。在另一个实施例中，本发明提供了将上述实施例中的任一种免疫原性组合物用于制造药物的用途，该药物用于治疗或者预防在犬体内感染犬呼吸道病原体。

本发明的另一个实施例中提供了上述实施例中的任一种免疫原性组合物，其中所述的组合物在犬体内治疗或者预防犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)。本发明的另外一个实施例中提供了一种在犬体内治疗或者预防CIRDC的方法，包括给所述犬类用上述实施例中的任一种免疫原性组合物。在另一个实施例中，所述组合物可以在约6个月或更长的时间内预防CIRCD。在另一个实施例中，所述组合物可以在约1年的时间内预防CIRCD。另一个实施例提供了将上述实施例中的任一种免疫原性组合物用于制造药物的用途，该药物用于在犬体内治疗或者预防CIRDC。

附图简要说明

图1.抗CRCoV的血清中和抗体反应。

当狗被用盐水、加入佐剂的氢氧化铝(AlOH)或加入佐剂的Emulsigen

组分进行疫苗接种时，测量血清中和相对于犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)的抗体反应。

图2.攻击后自鼻中流出的病毒。狗被用盐水、加入佐剂的氢氧化铝(AlOH)或加入佐剂的Emulsigen

组分进行疫苗接种，接着用CRCoV进行攻击，测量从鼻道中流出的CRCoV。

图3.在攻击后第4日对于CRCoV组织病毒为阳性的动物百分比。用盐水、加入佐剂的氢氧化铝(AlOH)或加入佐剂的Emulsigen

组分进行疫苗接种，接着用CRCoV进行攻击，评估呼吸道组织中对于CRCoV呈阳性的狗的数量。

具体实施方式

下面的定义用于本公开。其取代任何包含在本发明引用的每个单独的参考文献中相矛盾的定义。没有定义的词具有本领域技术人员通用的意思。进一步，除非本文中特别提及，单数的名词包括复数的情况，复数的名词包括单数的情况。

“大约”和“将近”，当与可测量的数值变量关联使用时是指变量的指示值和所有变量值在指示值的实验误差内(如在平均值的95%置信区间内)或在指示值的10%(或大于10%)以内。如果“大约”用于指以周记的时间间隔，“大约3周”是17至25日，“大约2周至大约4周”是10-40天。

“佐剂”指的是可以作为免疫反应中非特异性刺激物的任何物质。参见下面关于佐剂的进一步描述。

本发明中所用的术语“动物”，包括可以被犬呼吸道疾病综合症感染的任何动物，包括驯养的和野生的哺乳动物。

“抗体”，是指包括抗原结合位点的任何多肽，不考虑其来源、生产方法和其他特征。其指的是免疫球蛋白分子或者其中可以与抗原特异性结合从而对抗原产生免疫反应的片段。免疫球蛋白是具有“恒定”及“可变”区的“轻”及“重”多肽链组成的血清蛋白，且基于恒定区的组成而分为若干类(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。对于给定抗原“特异性”的抗体指的是抗体的可变区可以特异性地识别和结合特殊的抗原。该术语包括，但是不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、单一特异性抗体、多特异性抗体(polyspecific antibody)、人源化抗体、四聚体抗体、多特异性抗体(multispecific antibody)、单链(single chain)抗体、特定域(domain-specific)抗体、单域抗体、域缺失(domain-deleted)抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单链(single-chain)抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体以及CDR移植抗体。抗体可以是来自天然来源或者重组来源的完整的免疫球蛋白，也可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应性部分。“抗体”可以被转换成与抗原结合的蛋白，其包括但不限于抗体片段，其中包括但是不限于，Fab、F(ab’)₂、Fab’片段、Fv片段、单链Fv(ScFv)、Fd片段、dAb片段、双抗体、CDR3多肽、受约束的FR3-CDR3-FR4多肽、纳米抗体、二价的纳米抗体、小型模块化免疫制药(SMIPs)、低分子抗体(minibody)，以及上面所提及的片段、其化学或者遗传操作的配对、和保留抗原结合功能的其他抗体片段。通常情况下，这样的片段包括结合抗原的域。如本领域技术人员所知的，该分子可以被设计(如种系的(germlined))以减少其免疫原性，提高亲和力，改变其特异性，或者用于其他目的。

“抗原”或者“免疫原”是指包括一个或多个抗原决定基的分子，在其暴露于受检者后将诱发对于该抗原具有特异性的免疫反应。抗原决定基是抗原的特异性部位，其与T-细胞受体或者特异性抗体结合，且通常含有大约3个氨基酸残基至大约20个氨基酸残基。术语抗原是指亚单元抗原-从与抗原性质相关的整个有机体中抗原分离和离散-以及被杀死的、减毒的或者灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。术语抗原还指抗体，如抗个体基因型抗体或其片段，可以模拟抗原或者抗原决定簇(抗原决定基)的合成肽模拟表位。术语抗原还指在体内表达抗原或者抗原决定簇的寡核苷酸或者多核苷酸，如在DNA免疫中的应用。

本文中所用的“抗原性”是指蛋白质或者多肽免疫特异性结合为了防御蛋白或者多肽而增加的抗体的能力。

术语“支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)”或者“支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)”是指，支气管炎博德特氏菌的减毒活细胞、支气管炎博德特氏菌的灭活全细胞提取物(疫苗)或者支气管炎博德特氏菌的细胞细菌提取物。

“缓冲液”是指一种化学系统，其可以防止另一种化学物质的浓度变化。质子供体和受系统起缓冲作用，防止氢离子浓度(pH)明显改变。一个缓冲液的例子是含有弱酸和它的盐(共轭碱)或者弱碱和它的盐(共轭酸)的混合物。

本文中所用的“犬类”包括通常被称作的狗，但是还包括犬科家族的其他成员。

本文中所用的术语“细胞系”或“宿主细胞”是指病毒可以复制或者被供养的原核或者真核细胞。

本文中所用的术语“培养”，是指在没有其他种类或者类型存在的情况下生长的细胞或微生物的群体。

“剂量”是指给予受检者的疫苗或者免疫原性组合物。“第一剂量”或者“初给剂量(priming dose)”是指在第0日所给予的组合物的剂量。“第二剂量”或者“第三剂量”或者“年剂量”是指该组合物在给予第一次剂量以后所给予的量，其可能为但是不要求与第一次剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。

“抗原决定基”是指抗原上的特异性位置，其可以与T-细胞受体或特异性抗体结合，通常包括大约3个至大约20个氨基酸残基。

本发明中所用的“赋形剂”是指非抗原的疫苗或免疫原性组合物的非活性载体组分。

“片段”是指蛋白质或者基因被截断的部分。“功能性片段”和“生物活性片段”是指保留有全长蛋白质或者基因的生物性能的片段。

“同源性”或“百分比同源性”是指候选序列的核苷酸或氨基酸残基的百分比，其与在对其序列和引入空隙后比较器序列的残基相同或相似，如果必要，为了获得最大的百分比序列同源性，也可以考虑作为序列同源性的一部分进行保守的取代。

“同系物”或者“物种同系物”，包括在具有相当含量多核苷酸序列同源性，并具有相同或相近的生物功能和/或性能的2个或更多不同的物种中发现的基因。代表物种同系物的优选的多核苷酸序列在相当严格的条件下发生杂交，如在实施例中所描述的，并且具有相同或者相似的生物活性和/或性能。另一方面，代表物种同系物的多核苷酸共享大于约60%的序列同源性，大于约70%的序列同源性，大于约80%的序列同源性，大于约90%的序列同源性，大于约95%的序列同源性，大于约96%的序列同源性，大于约97%的序列同源性，大于约98%的序列同源性，大于约99%的序列同源性。

“同一性”或“百分比同一性”是指与在序列和引入的空隙排序后的比较器序列中的残基相同的候选序列的核苷酸或氨基酸的百分比，如果必要，为了获得最大百分比的序列同一性，不考虑任何作为序列同一性部分的保守的代替。

本发明中所用的“免疫反应”，在受试者中是指对于抗原的体液免疫反应、细胞免疫反应、或体液和细胞免疫反应的发展。“体液免疫反应”是指通过抗体介导的免疫反应。“细胞免疫反应”是指由T-淋巴细胞或其他白血球或两者介导的免疫反应，且包括由活性T-细胞，白血球细胞，或者两者所产生的细胞因子、趋势因子即类似分子的产生。可使用此项技术中已知的标准免疫检定及中和检定确定免疫反应。

本发明中所用的“免疫原性”是指蛋白或者多肽由抗原特异性引发的产生免疫反应的能力。

“免疫原性组合物”是指制备含有免疫原，包括例如蛋白质，多肽，全细胞，灭活、亚基或者减毒的病毒、或者多糖、或他们的组合物，给药刺激受体相对于免疫原性组合物中一种或多种发生体液和细胞免疫系统。“免疫”是指将免疫原性组合物给药，从而刺激宿主中对于抗体的免疫或免疫原性反应的过程。优选的宿主是哺乳动物，如狗。优选地，免疫原性组合物是疫苗。

本文中所用的“免疫保护量”是指有效诱发受体免疫原性反应的抗原的量，该免疫反应能够预防或者改善疾病的信号或者症状，包括不利健康影响或并发症。可以诱发体液免疫或者细胞调节免疫或者两者。动物对于组合物的免疫原性反应可通过测量抗体滴度、淋巴增殖检定来间接评估或者通过监控野生型菌株攻击之后的病症和症状来直接评估。由组合物或者疫苗赋予的保护性免疫可通过测量，例如攻击微生物脱落物的减少，受检者的死亡率、发病率、温度值、整体身体情况、及整体健康和表现的临床病症的减少。免疫反应包括，但是不限于，细胞和/或体液免疫的诱发。可以有效治疗的组合物或者疫苗的量是变化的，其与所用的特定生物，或者进行治疗或者免疫的动物的条件有关，可以由兽医决定。

本文中所用的“鼻内”给药，是指通过或经由鼻将诸如疫苗或其组合物的物质引入受检者的身体，其包括主要经鼻粘膜运输该物质。

本文中所用的“分离的”，是指从其自然存在的环境中取出，无论是单独或者在异源宿主细胞中，或者染色体，或者载体(如质粒，噬菌体等)。“分离的细菌”、“分离的厌氧菌”、“分离的细菌菌株”、“分离的病毒”、“分离的病毒株”、和类似物，是指组合物，在其中只有细菌或者病毒，没有其他微生物，如当从其自然存在的环境中分离后进行培养。“分离的”，当用于描述任何特别定义的物质，如多核苷酸或多肽，是指从最初的细胞环境中分离出来的物质，其中如多肽或者核酸等物质通常被发现。如本文中所用，仅通过示例的方式，用本发明中多核苷酸构建的重组细胞系利用了“分离的”核酸。可选地，如果特殊的蛋白质或者特异的免疫原性片段被声称或者使用作为疫苗或者其他组合物，其会被认为是分离的，因为它已经被识别，分离并且与其在自然中存在相比较在一定程度上纯化。如果蛋白质或者特异性免疫原性片段在重组细菌或者真核细胞表达载体(其可以生成抗体)中生成，其被认为作为分离的蛋白或者核酸存在。例如，用多核苷酸构建的重组细胞系利用“分离的”核酸。

“药剂”是指可以用于预防、治疗或者改善医疗条件，或者用于预防某些生理情况或者突发病症的试剂。

本文中所用的“单克隆抗体”，是指由单一系的杂交瘤细胞生产的抗体，都指向在一个特殊抗原上的抗原决定基。用于制备单克隆抗体的抗原能够作为一个分离的病原体的蛋白质或者整个病原体被提供。“杂交瘤”是一个克隆细胞系，包括由骨髓瘤细胞和特异性抗体产生细胞融和形成的杂交细胞。一般情况下，单克隆抗体是鼠源。但是，单克隆抗体也指对于相对于特殊的抗原决定基的抗体的克隆群体，该抗原由噬菌体展示技术或者等效于噬菌体展示或者非鼠源杂交细胞的方法生成。

本文中所用的“口服(oral)”或者“口服(peroral)”施药是指通过或经由口将诸如疫苗或者其他组合物的物质引入受检者身体，并且包括吞咽或经由口腔黏膜(例如，舌下或者颊内吸收)输运或者两者。气管内也是一种口服(oral)或者口服(peroral)施药的方式。

本文中所用的“口鼻”施药是指通过或经由鼻及口将诸如组合物或者疫苗的物质引入受检者身体，如通过在鼻内置放一或多滴进行。口鼻施药包括与口服及鼻内施药相关的输送过程。

本文所用的“非经肠施药”是指通过或经由不包括消化道的途径将诸如组合物或者疫苗的物质引入受检者的身体。非经肠施药包括皮下施药、肌肉内施药、动脉内施药和静脉内施药。出于该公开的目的，非经肠施药不包括主要包括口、鼻、气管及肺中的黏膜组织输送物质的施药途径。

本文中所用的术语“病原体”或者“病源微生物”是指微生物，例如，CPIV、CAV-2、CRCoV或者支气管炎博德特氏菌，其能够诱发或者引发疾病、生病、或者其宿主动物的非正常状态。

本文中所用的“百日咳杆菌粘附素”是指支气管炎博德特氏菌的外膜蛋白。百日咳杆菌粘附素优选的来自支气管炎博德特氏菌，最优选的是“p68”，由基因，pmA编码。百日咳杆菌粘附素可以从支气管炎博德特氏菌的天然形式分离出来，或者其可以重组产生。序列和百日咳杆菌粘附素的例子由美国专利No.7736658提供，其内容被引入本发明作为参考。百日咳杆菌粘附素的抗原包括蛋白的脂化形式。

“药物可接受”是指在合理医学判断范畴内德物质，其适用于与受检体组织接触而无不适当的毒性、刺激、过敏性反应极其类似情况，其等同具有合理的利益与风险比例，且对于其所欲的用途有效。

本文中所用的“多克隆抗体”是指相对于特殊病原体或者抗原的抗体的混合群。一般来说，群体包含多种抗体组，每一组指向病原体或者抗原的特殊抗原决定基。为了制作多克隆抗体，整个病原体，或者分离的抗原，通过接种或者感染被引入宿主内，诱导宿主产生相对于病原体或者抗原的抗体。

本文中所用的术语“多核苷酸”是指包括共价结合在一条链上的核苷酸单体的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同的生物功能的多核苷酸的例子。

本文中所用的术语“多肽”，是指在包括在一个链中键合的两个或更多氨基酸的有机聚合分子。

本文中所用的“预防感染”是指预防或者阻止可以引发确定的疾病的细菌或者病毒的复制，阻止细菌或者病毒的传输，预防细菌或者病毒在宿主中建立起来，或者减轻由感染引发的疾病的症状。如果减少了细菌或者病毒的负载，则治疗被认为是有效的。

本文中所用的“保护(protection)”，“保护(protecting)”，“保护性免疫”及类似词语，相对于疫苗或者他组合物，是指疫苗或者组合物可以预防或者减少由生物体(从中可以得到所用的疫苗或者组合物)所引发的疾病的症状。术语“保护(protection)”，“保护(protecting)”，及类似词语，是指疫苗或者组合物可以被用于“治疗”疾病，或者已经存在于受检体的疾病的一种或多种症状。

本文中所用的“吸入”施药，是指通过或者经由雾化(喷雾的)的物质吸入将诸如疫苗或者其他组合物的物质引入到受检体的身体。在吸入施药中，主要的运输机理包括通过气管、支气管和肺的黏膜吸收喷雾化的物质，其不同于鼻内或者口服施药。

术语“特异性结合(specific binding)”，“特异性结合(specific binds)”以类似词语，是指形成在生理或者测定条件下可计量的并且具有选择性的复合物的两个或者更多分子。抗体或者其他抑制剂被认为特异性结合到蛋白上，如果在适当选择的条件下，这种结合基本上不可抑制，而同时的非特异性结合可以抑制。特异性结合具有高亲合性的特点，对化合物或者蛋白质具有选择性。非特异性结合通常亲合力较低。例如，与lgG抗体结合，通常具有至少大约10^-7M或更高、或至少10^-8M或更高、或至少10^-9M或更高、或至少10^-10M或更高、或至少10^-11M或更高、或至少10^-12M或更高的亲合力。例如，当结合抗原的结构域对一个特殊的不由许多抗原所携带的抗原决定基具有特异性时，该术语也适用，在该种情况下，携带抗原结合结构域的抗体通常不结合其他抗原。

本文中所用的“特异性免疫原性片段”是指由对该序列具有特异性的抗体或者T细胞识别序列的一部分。

本文中所用的“受检体”，是指具有免疫系统的任何动物，包括哺乳动物，例如狗。

本文中所用的“基本相同”，是指在一定程度上至少大约90%、至少大约95%，至少大约96%，至少大约97%，至少大约98%，或者至少大于99%序列同一性。

本文中所用的“亚单元疫苗”或者“亚单元组合物”，是指包括一种或多种抗原的疫苗或者组合物类型，但是并不必须在疫苗或者组合物中具有所有的抗原，其源自目标病原体的抗原或者与其同源，如病毒、细菌、寄生虫或者真菌。在完整的病原体细胞中，或者治病的颗粒、或者该细胞或者颗粒的溶胞产物中基本不存在该组合物或者疫苗。亚单元疫苗或者亚单元组合物可以由来自病原体或者其类似物的至少部分纯化、或者基本上纯化的免疫原性多肽制备。在亚单元疫苗或者亚单元组合物中得到单个抗原或者多个抗原的方法包括标准纯化技术、重组生产、或者化学合成。“亚单元疫苗”或者“亚单元组合物”是指包括病毒、细菌或者其他免疫原的定义的抗原成分的疫苗或者组合物。

“TCID₅₀”是指“组织培养感染剂量”，其定义为感染50%的制定接种细胞培养物时所需的病毒稀释度。可使用各种方法测定TCID₅₀，包括Spearman-Karber法，其用于整个说明书中。关于Spearman-Karber发的描述，参见B.W.Mahy&H.O.Kangro,Virology Methods Manual25-46(1996)。

本文中所用的“治疗剂”是指可以辅助治疗病毒、细菌、寄生虫或者真菌的感染、治疗或者由此造成的条件的分子、化合物、病毒或者治疗，优选减毒或死亡的病毒，或者亚单元或者化合物。

本文中所用的“治疗有效量”是指可在接受抗原或者疫苗或者组合物的受检体(如狗)中诱发免疫反应的抗原或者疫苗的量，该量足以改善或者预防包括诸如病毒、细菌、寄生虫或者真菌的病原体感染所引发的不利健康影响或其他并发症的疾病的病症或者症状。可诱发体液免疫或者细胞介导免疫或者体液与细胞介导免疫两者。动物对于抗原，疫苗或者组合物的免疫原性反应能够经由测量抗体滴定，淋巴细胞增殖检定来间接评估，或者通过监控野生型菌株攻毒之后的病症即症状来直接评估。疫苗或者组合物所赋予的保护性免疫可通过测量，攻击微生物脱落物的减少，和/或诸如受检者的死亡率、发病率、温度值、整体身体情况、健康和表现的临床病症的减少。疫苗或者组合物的治疗有效量是变化的，与所用的特殊的免疫原或者受检体的条件有关，其可以有本领域技术人员决定。

本文中所用的“治疗(treat)”或者“治疗(treating)”是指逆转、减轻、抑制进程、或者预防该术语所应用的紊乱、病状或者疾病，或者预防该紊乱、病状或者疾病的一种或多种症状。

本文中所用的“治疗法(treatment)”是指以上所以所定义的“治疗”的行为。

本文中所用的“疫苗”或者“疫苗组合物”，是指从病毒、或者细菌中选择出来的免疫原性组合物，其或为该活性、衰减、或者死亡、或者亚单位的疫苗，或者其组合物。将疫苗施药给受检体导致免疫反应。疫苗可以通过已知的施药路线被直接引入受检体，包括非经肠、口入或者类似方式。该术语意味着可以预防或者减弱感染、或者预防或者减弱一个或多个感染症状的组合物。疫苗组合物相对于病原体的预防效果通常通过在受检体中引发免疫反应完成。通常来讲，取消或者减少感染的发病率，改善病症或病状，或者加速受感染的受检体的微生物的消除，都对该疫苗组合物的预防效果具有指示作用。本发明中的疫苗组合物对于由犬呼吸道疾病综合症引发的感染提供预防效果。

本文中所用的“兽医学可接受的”是指在合理的医学判断的范围内，该物质适用于与兽医的受检体组织接触，没有不适当的毒性、刺激性、过敏性反应及类似情况，其等同具有合理的利益与风险比率，对于其所欲的用途有效。

本文中所用的“兽医学可接受的载体”，是指不干扰活性成分的生物活性效力的载体介质，对于施药的兽医学受检体是无毒的。

抗原、免疫原性组合物、疫苗

本公开提供了包括一种或多种病毒和细菌的免疫原性组合物和疫苗。本公开提供了包括一种或多种病毒和细菌，或适用于施药给犬类治疗CIRDC的亚单元的免疫原性组合物和疫苗。

这里描述的犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)可以被定性为一种患有传染性呼吸道疾病的狗的呼吸道中出现的冠状病毒。CRCoV系统发育上最接近牛冠状病毒(BCoV)，人冠状病毒(HCoV)菌株OC43和血凝性脑脊髓病毒(HEV)；肠犬冠状病毒(CCoV)仅是CRCoV的远亲。适用于本发明的CRCoV的代表性例子包括确定为CRCoV菌株4182(Erles等,Virus Res.,124:78-87,2007)的菌株。

本发明中包含的流感病毒抗原可是是任何确认的来自鸟类或者哺乳动物的流感病毒株，包括但是不限于，具有H3亚型血凝素和N8亚型神经氨酸酶，或者H3N8亚型的流感病毒，更通常被称作H3N8病毒。流感可能是哺乳动物或者鸟类起源，包括但是不限于猪，马或者犬类起源。犬流感抗体被用于一个实施例中。马流感抗原被用于一个实施例中。具有H3亚型或N8亚型糖蛋白的菌株被用于一个实施例中。具有H3亚型和N8亚型的糖蛋白被用于一个实施例中。

本发明中包含的流感抗原从野生和家养的狗、马、猪和家禽中分离得到。选择用于样品采集的动物应该展示急性和/或亚急性的临床症状，其可以包括从轻度到严重的呼吸道症状和发烧。动物也可以表现出厌食和嗜睡的症状。使用本领域公知的病毒分离方法，其包括：接种哺乳动物或者禽类细胞培养，与从临场样品中的鼻或咽部粘液样品(通过擦拭鼻道或者咽喉采集，或者通过采集如脾、肺、扁桃体、肝、肺洗涤液的组织采集)接种含胚卵。可以在细胞培养中观察到病毒的细胞病变效应。可以测试尿囊液或者细胞裂解液凝聚人、鸡、伙计或豚鼠的红细胞的能力，作为流感病毒存在的推定证据。

适用于本发明的流感病毒株的一个代表性示例包括确认为A/Canine/lowa/9A1/B5/08/D12的菌株，其于2006年6月29日马纳萨斯大学大道(University Boulevard)10801的美国典型培养物保藏中心(ATCC)作为PAT-7694进行保藏，遵守国际承认的用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约。CIV抗原的代表性菌株为一种商业疫苗中的CIV病毒菌株，VanguardCIV(Pfizer,Inc)。本发明还包括包含确认为马流感菌株A/Equine/2/Miami/1/63的疫苗。该菌株保藏于ATCC，保藏号为VR317，遵守国际承认的用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约。

用于本发明的流感病毒的其他示例为A/canine/lowa/13628/2005、A/Equine/Kentucky/1998、A/Equine/Kentucky/15/2002、A/Equine/Ohio/1/2003、A/Equine/Kentucky/1/1994、A/Equine/Massachusetts/213/2003、A/Equine/Wisconsin/2003、A/Equine/NewYork/1999和A/Equine/Newmarket/A2/1993。其他优选的菌株和/或分离的CIV包括美国专利Nos.7959929(特别是已经确认为Jacksonville/2005,Miami/2005,FL/242/03和Florida/43/04的菌株和HA序列)，7384642,7572620和7468,187中报道的，其内容包括所有的序列，特别是HA序列，以及菌株，在此引入作为参考，如同其完全包括在本发明的记载中。除此之外，适用于本发明的CIV菌株包括Colorado CIV分离菌(如在Barrell等,J.Vet.Intern.Med.,24(6),1524-1527(2010)所描述的)，保藏号为ADW41784。

本发明中包含的犬副流感病毒(CPIV)可被表征为是已知是与犬舍咳有关的致病因素的病毒中的一种。CPIV抗原的代表性菌株是商业疫苗中的一种减毒的CPI病毒株，Vanguard

Plus 5(Pfizer)。CPIV抗原的另外一个代表性菌株是具有“NL-CPI-5”(National Veterinary ServiceLaboratory,Ames,IA)标记的减毒的CPI病毒株。

本发明中包含的犬类2型病毒(CAV-2)可被表征为已知是与犬舍咳有缘的致病因素的病毒的一种。CAV-2抗体中代表性的菌株是商业疫苗中一种减毒的CAV-2病毒株，Vanguard

Plus 5(Pfizer)。CAV-2抗原中代表性的菌株标记为“Manhattan”菌株(National Veterinary ServiceLaboratory,Ames,IA)的减毒CAV-2菌株。

本发明中包含的犬支原体(M.cynos)如在Chalker等,Microbiology,150:3491-3497,2004中描述的，且仅为通常伴有呼吸道疾病的支原体种类。对于M.Cynos的免疫原性组合物如在US2007/0098739中所描述的，通过引用并入本文。

本发明中包含的支气管炎博德特氏菌组分可被表征为与犬舍咳有关的细菌致病因素。本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗可能是活的减毒支气管炎博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌疫苗或细菌提取物中的一种或多种。此外，优选的组合物还包括一个分离的支气管炎博德特氏菌亚单元抗原。

在实施例中支气管炎博德特氏菌通过将全细胞超声纯化通过色谱柱(如同专利申请号FR2571618，申请日1984年10月12日的专利中提供的)制备。支气管炎博德特氏菌的另外一个代表性示例是细菌提取物Bronchicine^TMCAe(Pfizer)，其利用从支气管炎博德特氏菌细胞中提取的抗原物质制备。支气管炎博德特氏菌的另一个实施例是活的减毒支气管炎博德特氏菌菌株B-C2，存在于Nobivac和/或活的从Intra-Trac

Bronchi-Shield

Naramune^TM、Recombitek

Univac和/或Kennel-Jec^TM的支气管炎/支气管败血症(bronchiseptica)菌株。

此外，亚单元也是优选存在的(例如，补充的)，与支气管炎博德特氏菌组分组合。亚单元的代表性示例为分离的百日咳杆菌粘附素抗原，优选地，支气管炎博德特氏菌p68抗原，特别是重组的支气管炎博德特氏菌p68抗原，其可以由p68-特异性单克隆抗体Bord2-7识别(如在US7736658中描述的，其通过引用并入本发明)，在一个优选的实施例中，具有US7736658中所述的氨基酸序列或者具有其同源性。

重组的支气管炎博德特氏菌p68抗原优选在可溶的形式中制备，从而在加工过程中使类似天然的结构被保存或者恢复。因此，本发明的一个方面是提供重组p68，其基本没有(小于大约80%，90%，95%，甚至99%)聚合体,。在另一个实施例中，重组p68用尿素溶解，优选大于0.1M、0.5M、1M、2M、3M或6M的尿素溶液。此后，p68抗原能够被纯化，如通过色谱柱。Surinder等,J.Bioscience andBioengineering,v.99(4),pgs303-310(2005)中描述了这样一个溶解过程。

本发明中所用的百日咳杆菌粘附素抗原还包括脂化形式。脂化蛋白的生产的示例由Erdile等,Infection and Immunity,(1993)v.61(1),p.81-90提供，其通过引入并入本发明。其所公开的方法可以用于制备翻译后修饰的百日咳杆菌粘附素蛋白，其包含一个附属的脂质部分。

此外，另一个实施例中，免疫原性组合物包括支气管炎博德特氏菌和分离的Bsp22抗原。在另一个实施例中，免疫原性组合物包括支气管炎博德特氏菌，一个分离的百日咳杆菌粘附素抗原，和分离的Bsp22抗原。Bsp22抗原能够如Medhekar等,Molecular Microbiology(2009)71(2),492-504中描述的方法制备。优选地，分离的Bsp22抗原与支气管炎博德特氏菌提取物和分离的百日咳杆菌粘附素，特别是重组的p68，协作(例如，附加地)存在。

“Bsp22”还包括抗原的脂化形式。生产脂化蛋白的示例在Erdile等,Infection and Immunity,(1993)v.61(1),p.81-90中提供，通过引入并入本发明。该公开的方法能够用于制备翻译后修饰的Bsp22蛋白，其包含一个附属的脂质部分。

本发明中包含的病毒是可以在细胞、细胞系、宿主细胞中繁殖。所述的细胞、细胞系、宿主细胞可能是例如，但是不限于，哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞，包括昆虫和植物细胞。

本发明包含的病毒可以繁殖的细胞、细胞系和宿主细胞是已知的，并且是本领域技术人员可以获得的。

在另一个实施例中，本发明中所描述的免疫原性组合物不包括非呼吸道的抗原。因此，本发明的一个实施例中提供了一种组合物，条件是其不包括非呼吸道抗原。非呼吸道抗原不能引起受检体的呼吸道疾病。非呼吸道抗原的非限制性示例包括狂犬病毒、犬细小病毒、肠犬类冠状病毒、钩端螺旋体病种(Leptospira species)和莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)。

本发明包含的细菌能够使用本领域技术人员已知的各种培养基进行培养和繁殖，包括肉汤(液体)和琼脂(固体；半固体)培养基。一些细菌也可以在哺乳动物细胞或者非哺乳动物细胞中培养和繁殖。

本发明中包含的病毒和细菌能够是在用于免疫原性组合物或者疫苗之前减毒或者灭活的。减毒和灭活的方法是本领域技术人员公知的。减毒的方法包括，但是不限于，在合适的细胞系(病毒或者细菌)上在细胞培养中连续传代，在肉汤培养中连续传代(细菌)，紫外线辐射(病毒和一些细菌)，化学突变(病毒和细菌)。用于病毒或者细菌的灭活的方法包括，但是不限于，用福尔马林、β-丙内酯(BPL)或者二乙烯亚胺(BEI)治疗，或者其他本领域技术人员已知的方法。

福尔马林灭活的能够通过将含有微生物的悬浮液与37%的甲醛混合至甲醛的最终浓度为0.5%实现。微生物-甲醛混合物室温下通过不断搅拌大约24小时混合。灭活的微生物混合物通过测试在合适的细胞系或者肉汤培养基中的生长检测剩余活的微生物。

对于某些抗原，由BEI灭活通过将含有本发明中微生物的悬浮液与0.1M BEI(在0.175N NaOH中2-溴-乙胺)混合至BEI的最终浓度为1mM实现。对于其他抗原，BEI的最终浓度为2mM。本领域技术人员指导使用的适当浓度。病毒-BEI的混合溶液通过在室温下连续搅拌大约48h进行混合，然后加入1.0M硫代硫酸钠至最终浓度为0.1mM。将混合液继续搅拌2h。含有灭活的微生物的混合物通过检测在适当的细胞系或肉汤培养基中的生长检测剩余的获得病毒。

本发明包含的免疫原性组合物和疫苗能够包括一种或多种兽医学上可接受的载体。如本文中所用，“兽医学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、和乳糖，和其他本领域技术人员已知的。稳定剂包括白蛋白、和其他本领域技术人员已知的。防腐剂包括硫柳汞，和其他本领域技术人员已知的。

佐剂是可以代谢的，涉及包含这些可以由目标物种，如植物油基佐剂，代谢的组分的佐剂。代谢的佐剂能够是可代谢的油。可代谢的油是通常发生在植物和动物中的脂肪和油脂，通常包含大量的三酰基甘油的混合物，也成为甘油三酯或中性脂肪。这些非极性的，不溶于水的物质是脂肪酸和甘油三酯。根据其三个脂肪酸残基或者侧链的识别和位置，三酰基甘油是不同的。

佐剂也能够是不可代谢的，涉及这些包含不能被将该乳液施药给的动物受检体的身体代谢的组分的佐剂。适用于本发明的组合物的不可代谢的油包括烷烃、烯烃、炔烃和其相应的酸和醇、醚和他们的酯，以及它们的混合物。优选地，个别的油的化合物是轻质烃化合物，例如，这些具有6-30个碳原子的组分。油能够从石油产品中合成制备或者纯化。优选的用于这里描述的组合物的不可代谢的油包括例如矿物油、石蜡油、环烷烃。术语“矿物油”是指不可代谢的佐剂，其是通过蒸馏技术从凡士林中得到的液态烃的混合物。该术语与“液化石蜡”、“液体石蜡”和“白矿油”是同义的的。该术语还旨在包括“轻质矿物油”，例如，与从蒸馏凡士林得到的类似的油，但是其具有相对于白矿油稍低的比重。矿物油可以通过各种商业来源获得，例如，J.T.Baker(Phillipsburg,PA),USB Corporation(Cleveland,OH)。轻质矿物油从DRAKEOL品牌商业可得的。

佐剂包括，但是不限于，Emulsigen

佐剂系统(MVP实验室;Ralston,NE),RIBI佐剂系统(Ribi Inc.;Hamilton,MT),明矾、氢氧化铝凝胶、水包油型乳剂、油包水型乳剂、例如、弗式完全和不完全佐剂、Block共聚物(CytRx;Atlanta,GA)、AF-M(Chiron;Emeryville,CA),AMPHIGEN

佐剂、皂角苷、奎尔A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.;Cambridge,MA),GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.;Birmingham,AL)或者其他皂角苷组分、单磷酸酯A、Avridine脂胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或者其他)、霍乱毒素、胞壁酰二肽、角鲨烯/据丙二醇与环氧乙烷的加聚物的嵌段共聚物/表面活性剂(SP-油),硫化β环糊精(sulpholipobeta-cyclodextrin)(SL-CD)、含有免疫调控剂的脂体(如CpG或聚l:C)、胞壁酰二肽(MDP)、ISCOMATRIX(Quil A/磷酸酰胆碱)、CpG/DEAE-葡萄糖/矿物油(TXO)、CpG、三萜类化合物(例如、奎尔A或者其他纯化的或者部分纯化的皂角苷制备)、甾酮(如胆固醇)、免疫调节剂(例如、二甲基二(十八烷基)溴化铵-DDA)、聚合物(如、聚丙烯酸、如Bay R1005

)和Th2兴奋剂(例如，糖脂，如Bay R1005

)，以及它们的组合物，包括其他本领域技术人员已知的佐剂。

可以使用的各种组合物的非限制性实施例包括三萜类加上甾酮(例如，奎尔A/胆固醇，也称作QAC)，三萜类化合物加上甾酮、免疫调节剂和聚合物(例如，Quil A/cholesterol/DDA/CARBOPOL

也称作QCDC)，三萜类混合物加上甾酮、免疫调节剂、聚合物和Th2兴奋剂(例如，Quil A/cholesterol/DDA/CARBOPOL

和Bay R1005

也称作QCDCR)。

本发明上下文中用的佐剂和添加剂的用量和浓度能够很容易地由本领域技术人员决定。在一个实施例中，本发明设计了包含从大约20μg至大约2000μg佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施例中，包含了从大约100μg至大约2500μg，或从大约250μg至大约1000μg，或从大约350μg至大约750μg的佐剂。在另外一个实施例中，包含了用量为大约500μg/2ml剂量免疫原性组合物或疫苗的佐剂。

免疫原性组合物和疫苗还包括抗生素。该抗生素包括，但是不限于，选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽、大环内酯类、青霉素类、多肽喹诺酮类、磺胺类和四环素类抗生素。在一个实施例中，本发明设计了包含从大约1μg/ml至大约60μg/ml抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施例中，免疫原性组合物和疫苗包括从大约5μg/ml至大约55μg/ml、或从大约10μg/ml至大约50μg/ml、或从大约15μg/ml至大约45μg/ml、或从大约20μg/ml至大约40μg/ml、或从大约25μg/ml至大约35μg/ml的抗生素。在又一个实施例中，免疫原性组合物和疫苗中包括少于大约30μg/ml的抗生素。

本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗能够包括一种或多种为病毒、或者细菌、或者病毒或细菌的蛋白质编码的多核苷酸分子。DNA或者RNA分子能够用于免疫原性组合物或者疫苗。DNA或者RNA分子可以在不存在其他药物的情况下施药，或者其可以与促进细胞摄取(例如，脂质体或者阳离子脂质体)的试剂一起被施药。免疫原性组合物或疫苗中总的多核苷酸在大约0.1μg/ml至大约5.0mg/ml之间。在另一个实施例中，免疫原性组合物或疫苗中总的多核苷酸能够在大约1μg/ml至大约4.0mg/ml之间、或在大约10μg/ml至大约3.0mg/ml之间、或在大约100μg/ml至大约2.0mg/ml之间。利用核酸(DNA或者RNA)的疫苗和疫苗接种程序在现有技术中已经记载，例如，U.S.Pat.No.5703055,U.S.Pat.No.5580859，和U.S.Pat.No.5589466，其全都通过引用并入本发明。

除了上述的病毒或者细菌，本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗包括其他添加的抗原。抗原能够是以制备的微生物的全部或部分灭活的形式、或者以通过基因工程技术或者化学合成获得的抗原分子的形式。其他适用于本发明的抗原包括，但是不限于，来自于如犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、犬流感病毒、狂犬病毒的致病性病毒，如支气管炎博德特氏菌、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、流感伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血螺旋体、波摩那钩端螺旋体、牛哈德焦钩端螺旋体、卟啉单胞菌属、拟杆菌属、疏螺旋体属、链球菌属的病原性病毒，包括马链球菌兽瘟亚种、埃里克体属、支原体属，包括宜诺斯支原体和犬小孢子菌。抗原还来自于致病性真菌，如假丝酵母，原生动物，如隐孢子虫、犬新孢子虫、刚地弓心虫、艾美球虫属、八倍虫属、贾第虫属、利什曼原虫属，或寄生虫，如绦虫、黄蝇、棘球绦虫和并殖吸虫属。

形式，剂量和施药途径

本发明中包含的免疫原性组合物和疫苗能施药给动物，从而诱发对CIRDC有效的免疫反应。因此，本发明提供了通过施药给动物治疗有效量的这里所描述的免疫原性组合物或疫苗从而刺激有效的免疫反应的方法。

这里描述的免疫原性组合物和疫苗能够施药给动物，从而使动物受检体接种对于CIRDC的疫苗。免疫原性组合物和疫苗能够施药给动物从而预防或者治疗动物的CIRDC。因此，这里描述的是给动物接种对于CIRCD的疫苗、和预防或者治疗CIRCD的方法，包括施药给动物治疗有效量的这里描述的免疫原性组合物或者疫苗。

本发明包含的免疫原性组合物和疫苗能够根据施药途径的需要以各种形式制备。例如，免疫原性组合物好疫苗能够以适用于注射用的无菌水溶液或分散体的的形式制备，或者用冷冻干燥技术以冻干形式制备。冻干的免疫原性组合物和疫苗通常保持在大约4℃，能够在一个稳定的溶液，如盐水或HEPES中，存在或者不存在佐剂，进行重组。免疫原性组合物和疫苗还能够以悬浮液或者乳液的形式制备。

本发明包含的免疫原性组合物和疫苗包括治疗有效量的一种或多种上面描述的微生物。纯化的病毒和/或微生物能够直接用于免疫原性组合物或者疫苗，或者能够是进一步减毒或者灭活的。通常，免疫原性组合物或疫苗包含在大约1×10²至大约1×10¹²之间的病毒或者细菌微粒，或在大约1×10³至大约1×10¹¹之间的微粒，或在大约1×10⁴至大约1×10¹⁰之间的微粒，或在大约1×10⁵至大约1×10⁹之间的微粒，或在大约1×10⁶至大约1×10⁸之间的微粒。在可以有效的提供保护效力的免疫原性组合物或者疫苗中微生物的准确含量可以由本领域技术人员决定。

百日咳杆菌粘附素抗原在大约1μg至大约30μg之间。更具体的，所述的百日咳杆菌粘附素在大约5μg至大约20μg之间，更具体，在大约7μg至大约15μg之间，再更具体，为大约5μg、10μg、15μg或者20μg。

免疫原性组合物和疫苗通常含有兽医学上可接受的载体，为在大约0.5ml至大约5ml之间的体积。在另一个实施例中，载体的体积在大约1ml至大约4ml之间的，或者在大约2ml至大约3ml之间。在另一个实施例中，载体的体积为大约1ml，或者为大约2ml，或者为大约5ml。适用于免疫原性组合物和疫苗的兽医学可接受的载体能够是上面描述的任意一种。

本领域技术人员能够很容易的确定在施药前病毒或者细菌是否需要减毒或者灭活。在本发明的另一个实施例中，病毒或者细菌可以不经过附加的减毒直接施药给动物。治疗有效量的微生物量是变化的，取决于所用的特殊的微生物、动物的条件和/或感染的程度，可以由本领域技术人员确定。

根据本发明的方法，可以单剂量给动物施药，或者，选择地，2次或多次疫苗接种在大约2至大约10周的间隔内发生。可以要求刺激方案，给药方案能够被调整从而提供最佳的免疫。本领域技术人员能够容易地确定最佳的给药方案。

免疫原性组合物和疫苗能够直接给药进入血液、肌肉、内部器官中，或者在皮下。非经肠施药的适合方法包括静脉内、动脉内、肌肉内、和皮下给药。用于非经肠施药的合适的装置包括针(包括微针)型注射器和无针注射器。

不经肠的制剂通常是含有赋形剂，如盐、碳水化合物、蛋白质和缓冲溶液(优选pH从大约3至大约9，或从大约4至大约8，或从大约5至大约7.5，或从大约6至大约7.5，或从大约7至大约7.5)的水溶液，但是，在一些应用中，其能够更合适的表现为无菌非水溶液或者干燥的形式，其用于与合适的赋形剂，如无菌、无热源的水或盐水，配合。

不经肠的制剂的制备在无菌条件下，例如，通过冷冻干燥，能够容易的用本领域技术人员已经的标准制药技术完成。

用于不经肠溶液制备的物质的溶解性能够通过使用本领域技术人员一直的合适的制剂技术提高，例如掺入溶解性增强剂，包括缓冲液、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精等等。

用于非经肠施药的组合物能够配制成直接或者改性释放。改性释放制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、针对性、和编程释放。因此，免疫原性组合物和疫苗能够配制成固体、半固体、或者触变性液体，用于作为注入站，提供改性释放该免疫原性组合物和疫苗。

免疫原性组合物或疫苗施药的其他方法包括通过微针或者无针(例如，Powderject^TM,Bioject^TM等)注射释放。

在使用皮下或者肌肉内注射的情况，优选等渗制剂。一般来说，用于等渗性的添加剂能够包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在特定的情况下，等渗溶液，如磷酸盐缓冲盐水，被使用。制剂能够进一步包括稳定剂，如明胶和白蛋白。在一些实施例中，血管收缩剂被加入配方中。根据本发明的药物制剂一般在无菌和无热原的条件下提供。但是，本领域技术人员已知的用于药物可接受的载体的制剂是由美国农业部颁布的法规批准的药物载体，或者由外国等效的政府机构，如加拿大、墨西哥、或者任何一个欧洲国家，用于犬类疫苗、多肽(抗原)亚单元免疫原性组合物和疫苗、重组病毒载体疫苗、和DNA疫苗。因此，用于商业生产免疫原性组合物或疫苗的药物可接受的载体是已经由或者即将由美国或者外国相应的政府机构批准的载体。免疫原性组合物和疫苗能够进一步用药物可接受的佐剂混合。在某些免疫原性组合物和疫苗的制剂中，免疫原性组合物或疫苗和其他犬类免疫原性组合物或者疫苗结合生成多价的产物，其可以保护犬类免受由其他犬类病原体引发的多种疾病。

这里描述的免疫原性组合物能够预防犬呼吸道病原体感染或者能够在大约3个月或更长的时期内预防犬类感染CIRCD。组合物能够预防所述的犬呼吸道病原体的感染，或者预防在大约6个月或更长的时期内预防犬类感染CIRCD。组合物能够预防所述的犬呼吸道病原体的感染，或者预防在大约1年或更长的时期内预防犬类感染CIRCD。

检测和诊断的方法

诱发动物免疫反应的程度和性质，能够使用各种技术评估。例如，通过从被接种的动物中采集血清，然后检测针对免疫原的抗体存在或者不存在。检测淋巴组织中响应T-淋巴细胞(CTLs)，其表示诱发了细胞免疫反应，能够通过检测如T细胞增殖完成。相关的技术在本领域中已经报道。

试剂盒

因为需要将免疫原性组合物或者疫苗与附加的组合物或者化合物结合施药-如，出于治疗特殊疾病或者病症的目的-以下包括在在本发明的范围内，免疫原性组合物或者疫苗能够便利的包含在或者合并在，适用于将组合物给药或者同时给药的试剂盒的形式。

因此，本发明包含的试剂盒能够包括一种或多种独立的药物组合物，其中至少一种是根据本发明的免疫原性组合物或者疫苗，和用于分别保持所述组合物的工具，如容器、分瓶，或者分割的铝箔包。该试剂盒的一个实例为注射器和针头，及类似物。本发明的试剂盒特别适用于给予不同剂型，例如，口服或者非经肠，适用于按照不同剂量间隔给予单独的组合物，或者用于滴定彼此独立的成分。为了协助使用本发明中包含的组合物，试剂盒通常包括服药说明。

本发明包含的另外一个试剂盒能够包括一种或多种用于检测受感染动物的试剂。试剂盒能够包括用于分析样品中全部微生物、多肽、抗原决定基或者多核苷酸序列存在的试剂。病毒、细菌、多肽、或者多核苷酸序列的出现能使用抗体、PCR、杂交、和其他本领域中已知的检测方法确定。

本发明包含的另外一个试剂盒能够提供用于检测对于特殊抗原决定基的抗体的试剂。该试剂用于分析样品中抗体的存在，其为本领域技术人员熟知并可利用的。抗体的存在能够用本领域技术人员已知的标准检测方法确定。

在某些实施例中，试剂盒能够包括一组打印的说明书、或者标示该试剂盒用于检测受感染动物的标签。

抗体

抗体能够是单克隆抗体、多克隆抗体、或者重组体。能够制备对于免疫原或其一部分的抗体。例如，基于免疫原氨基酸序列合成的多肽，或者通过克隆技术制备的重组体，或者天然基因产物和/或其部分，能够被分离并且用作免疫原。免疫原能够被用于通过本领域技术人员熟知的标准抗体生产技术生产抗体。抗体片段也能通过本领域技术人员熟知的方法从抗体中制备出来，包括F(ab′)₂和Fv片段。

在抗体的生产中，筛选所需的抗体能够能过通过本领域中已知的免疫学的标准方法完成。一般情况下，ELISAs和Western印记是免疫检测的优选类型。两种检测方法都是本领域技术人员熟知的。多克隆抗体和单克隆抗体都能过用于检测。抗体能够与固体支撑物结合、与可检测的部分共轭、或者按照本领域熟知的同时结合和共轭。将抗体与固体支撑物结合也是本领域中熟知的。设计用于本发明中的可检测部分能够包括，但是不限于，荧光的，金属的，酶的和放射性的标记物，如生物素，金，铁蛋白，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，过氧化物酶，脲酶，荧光素，若丹明，氚，¹⁴C，和碘化。

本发明通过以下实施例进一步说明，但是不仅限于该实施例。

实施例

实施例1.评估含有CRCoV的疫苗

本公开中使用了60只8-9周龄的健康状况大致良好的小猎犬。所有动物抵达后接受体检，并且在第2研究日或者第1日再次体检。动物每日被观察一次其大体的健康情况，从到达第8研究日至第39研究日。从第1研究日开始至接种前采集鼓膜温度。在每次疫苗接种前的第0研究日和第21日用SST管采集用于血清学的血样(大约5mL)。

CRCoV疫苗菌株来自菌株CRCoV.669，其根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约保存在ATCC，保存号为PTA-11444。CIV疫苗菌株来自用于在Vanguard

疫苗系(Pfizer)制备疫苗的病毒种子。抗原在病毒的最高通道(Master See Virus+5)制备。疫苗组合物含有包括Quil A(20μg)、胆固醇(20μg)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA；10μg)和Carbopol

(聚丙烯酸，0.05％体积/体积)的佐剂。CRCoV抗原按目标每剂量1.3相对抗原单元(RAU)配制。实验疫苗进行灭菌。

异源CRCoV分离体(“Max”菌株；通道1)用于作为攻击材料。病毒储存材料在HRT18G细胞上被繁殖和滴定，被确定具有10^7.1TCID₅₀/mL的滴度。攻击材料经测试并确认是令人满意的无菌，没有支原体或者犬类/猫的体外试剂。

在第21日一只动物被进行接种；其余动物在第22研究日进行接种。动物根据如表1所示的实验设计皮下接种适当的疫苗或者安慰剂。第一次接种被施药在右肩区域(第0研究日)，第二次接种施药在左肩区域(第22研究日)。

表1.实验设计

¹研究用兽医产品(IVP)通过皮下(SC)施药。

²鼻内在第1通道CRCoV Max分离体的攻击剂量。

RTU：即用液体疫苗

第一次接种后，每日观察动物(从第1研究日至第8日)接种后注射肿胀。第二次接种后，每日观察动物接种后注射肿胀至第29日。每周连续观察2次在超出上面列出的天数具有注射部位肿胀/疼痛的动物，直至肿胀/疼痛消失。在每次注射后的一周每日采集鼓膜温度。

在攻击前的第42研究日用SST管采集用于血清学的血样(大约8mL)。在攻击前于40、41、42研究日采集鼓膜温度。2种类型的咽拭子(用于病毒分离的VTM(病毒传输介质)，和用于细菌分离的Amies)在攻击前第42研究日从每只狗被采集。在攻击前的第40、41、42研究日每日观察动物的呼吸道疾病临床症状，建立基线值。

在第42研究日，所有动物被用CRCoV攻击病毒在目标攻击剂量10⁶/mL/狗进行鼻内攻击。所有动物在攻击施药前通过静脉注射Domitor进行镇静。镇静后，每只动物接受10mL攻击病毒，用没有针头的注射器慢慢给予每鼻孔大约0.5mL。在攻击施药后，通过肌肉注射Antisedan逆转镇静。

从攻击后第42-56研究日每日采集鼓膜温度、临床观察和咽拭子。在第46研究日和第56研究日(在尸体剖检前)每日采集用于血清学的血液样品(大约5mL)。

在尸体剖检中，将完整的肺和气管在无菌条件下取出，并放置在无菌的消毒帷上，大略评估肺叶的肺病变(固化)。每个肺叶根据肺的固化百分比打分。一个肺组放血不足，不被评估。气管被横切，管腔评估大体病理，任何发现都被记录。

肺部被评分后，右尾肺叶用大约30.0mL的用于细菌分析和病毒分离的介质冲洗。一对组织样品从气管、和鼻腔中被采集，一个用于病毒分离，第二个用于组织病理学。右颅肺叶分为3个样品，包括一个用于细菌学采样。用于血清学的血样在预先决定的研究日被采集。

结果。所有动物通过IFA检测证实了对相对于CRCoV的抗体(IFA滴度<40)在第0研究日前为阴性。用于评估CRCoV病毒分离的咽拭子别证实所有动物在接种前的第0研究日没有CRCoV。接种安慰剂的对照直至第42研究日仍然具有CRCoV。实验组通过病毒分离在第42研究日被证实没有CRCoV，表示设备中缺少外来的CRCoV。所有的狗在第42研究日被证实没有支气管炎博德特氏菌。

使用ELISA检测测量疫苗中CRCoV抗原浓度，以相对抗原单元(RAU)对特异地一批指定参考抗原CRCoV。CRCoV抗原被确定为0.5RAU/剂。

疫苗接种后，主要的接种的狗，包括接种安慰剂的组，在注射部位发展成了注射肿胀。对于单价的疫苗接种组，肿胀的大小在大多数接种组中通常较小(在长的尺度上为2cm或者更少)。大多数狗的肿胀在2周内消除。在接种的任何一只狗上没有相对于疫苗的疼痛或者全身反应。除了一只狗以外没有观察到临床发热(≥39.5℃)，狗的体温升高与疫苗接种没有关系(在第二次接种前采集温度)。这些研究结果表明，单价的疫苗仅引发了注射肿胀，在使用佐剂疫苗可以预期的范围内。

血清中和滴度被列表并且在组间进行比较。所有的单价疫苗接种的狗(100%)在第二次接种后的3周发展为SN滴度(GMT371)，表明活性免疫。相对于接种安慰剂狗(GMT471)，在联合接种的狗(GMT6915)中明显的攻击后(回忆的)血清中和反应在第56日被检测到。这些研究结果具有统计学显著差异，表明CRCoV疫苗抗原有效的刺激和引发了狗对于CRCoV感染的免疫反应。

在攻击后，所有的接种安慰剂的动物(100%)在在攻击后的第1-6日中的至少一天在他们的呼吸道分泌物中流出病毒，表明引发了CRCoV感染。当与安慰剂(3.3日)相比较，单价疫苗明显降低(p=0.0237)有呼吸道分泌物(2.1日)的平均天数，表明疫苗在减弱CRCoV感染方面是有效的。

所有的接种安慰剂的狗(100%)在攻击后第4日其气管、鼻腔、肺测试相对于病毒分离为阳性，表明呼吸道器官感染CRCoV。在攻击后第14日从任何器官中没有分离的病毒，表明是一个与犬类流感相似的典型的呼吸道病毒感染。与此相反，单价的疫苗分别在接种疫苗的狗的肺部(p-值<0.0001)和气管(p-值<0.0237)的90%和50%可以预防感染。其表明单价的疫苗能够诱导足够的免疫力，从而预防这些关键器官的病毒感染。接种和对照组的鼻腔感染率没有明显区别。

在实验室条件下CRCoV攻击仅仅引发了轻微的临床症状。在狗的各治疗组报道了眼和鼻腔的排出物和结膜炎。在攻击后的期间据报道有5只动物有临床发热(≥39.5℃)，2只在安慰剂组，1只在单价的疫苗组，2只在联合疫苗组。

肺、气管和鼻甲的大体评估在攻击后第4和14日进行。没有显著的严重病变被报道，除了2只狗—一只在T05，一只在T01—具有较低水平的肺固化；2只狗—一只在T01，一只在T03，在鼻甲有重点区域的坏死。

对于组织病理学，肺、气管、鼻腔组织都进行了检测和评分。根据观察到的变化的程度设置了分数(0-4)。由于供给导致的变化在鼻甲是最显著的，然后是在气管，最后在肺部。其与呼吸道的攻击病毒主要影响上呼吸道(鼻甲和气管)，对下呼吸道(肺)具有后来和较弱的影响是一致的。其表明CRCoV感染引发呼吸道器官的组织病理。

以前的研究已经表明，在攻击后第4日气管的纤毛损伤是一种CRCoV感染的特征性病理结果。数据表明，与接种安慰剂(30%)相比较，单价的疫苗在60%的动物中预防气管纤毛损伤，但是降低并不明显(P=0.1538)。在肺和肺灌洗上进行的细菌学诊断证实，所有动物对于支气管炎博德特氏菌、巴氏杆菌属、Staphlyococcus intermedius和犬链球菌是阴性。肺、肺灌洗、或者两者仅在4只动物内对于支原体是阳性。该研究结果表明损伤对于病毒感染是特异地，并且由病毒感染引起。

总之，在T03-T06所有的CRCoV接种疫苗的狗(100%)在第二次接种后的3周发展血清中和滴度，表明活性免疫。单价的疫苗诱发疫苗接种者的免疫反应，其减少病毒在口咽部分泌物和呼吸道器官的流出。其还减少了接种者的气管纤毛损伤，相对于接种安慰剂的对照组。病理组织学检查表明，单价的疫苗在60%的动物中预防气管纤毛损伤，相对于接种安慰剂的动物(30%)。

实施例2.有效检测狗中二价的CRCoV/CIV疫苗

本公开中使用了60只8-9周龄的健康状况大致良好的小猎犬。所有动物抵达后第9研究日接受体检。所有动物，除了一只在第7研究日移除的狗，在第2研究日接受第二次体检，被认为适合用于研究。

从到达第7研究日至第39研究日，每日观察一次动物的大体健康情况。在每次接种疫苗前的第0研究日和第21研究日用血清分离管(SST)采集用于血清学的血液样品。在接种疫苗前第0日从每一只狗上采集2组鼻拭子——一组用于CRCoV，一组用于CIV病毒分离——用于确认没有CRCoV和CIV。在接种疫苗前第1和第0日采集鼓膜温度并记录，用于建立接种疫苗前的基线。在第二次接种前在21日采集鼓膜温度。在接种前第0日和第21日，在动物的肩部区域进行触诊，以确认在注射部位的区域没有预先存在的病变。

T04的一只狗因为在第7研究日呼吸窘迫从研究中被去除。T05中的一只狗因为在接种前第0研究日呼吸窘迫从研究中被去除。此外，2只动物因为与进行研究无关的条件从研究中被去除。T06中一只狗在接受第二次疫苗接种前第21研究日因为呼吸窘迫从研究中被去除。T02中一只狗在接受第二次疫苗接种前第21研究日因为没有治愈的角膜结膜炎和下垂的尾巴从研究中被去除。

两种二价疫苗，辅助5%v/v Emulsigen的灭活的CRCoV/灭活的CIV疫苗、辅助5%v/v(表2)REHYDRAGEL^TM的灭活的CRCoV/灭活的CIV疫苗，被制备。CRCoV疫苗菌株来自保藏在ATCC，保藏号为PTA-11444的菌株。CIV疫苗菌株来自保藏在ATCC，保藏号为PTA-7694的菌株。用于制备疫苗的抗原大部分都在病毒或者细胞的最大通路产生，以满足免疫原性要求。CRCoV抗原按照目标1.55RAU/剂配制。CIV抗原按目标640HA单位/剂配制。

表3实验设计

¹研究用兽医产品(IVP)通过皮下(SC)施药。

²CRCoV Max分离体(通道1)的目标攻击剂量，鼻内给药。

AlOH：氢氧化铝凝胶

异源CRCoV分离体(“Max”菌株；通道1)用于作为攻击材料。病毒储存材料在HRT18G细胞上被繁殖和滴定，被确定具有10^7.1TCID₅₀/mL的滴度。攻击材料经测试并确认是令人满意的无菌，没有支原体或者犬类/猫的体外试剂。

在第0日和第21日(表2)动物被接种相应的疫苗或者安慰剂。第一次疫苗接种在第0日从右肩区域施药，第二次疫苗接种在第21日从左肩区域施药。

第一次接种后从第1研究日至第8日，然后在第12、15、19、21、22和26研究日观察动物注射肿胀/疼痛。在第8研究日，18只动物的肿胀观察由于疏忽没有记录。在第21研究日，对于一些动物右肩(第一次疫苗接种)观察的额外观察被记录下来。

在接种后第21研究日，在接种后第21-29研究日，然后在第33、36、和40研究日每日观察动物的注射肿胀/疼痛。至第40研究日所有的因为第二次接种引发的肿胀都消除了。在第0-7接种日和第21至28接种日，在每次接种后大约3小时，采集鼓膜温度。

在攻击前第42研究日用SST管采集用于血清学的血样(大约6mL)。也在攻击前，在第40、41和42研究日采集鼓膜温度，从而建立基线值。在攻击前的第42研究日从每只狗中采集2种类型的鼻拭子(用于CRCoV病毒分离的VTM，用于细菌分离的Amies)。在攻击前的第40、41和42研究日每日观察一次动物的呼吸道疾病的临床症状，用于建立基线值。

所有的治疗组每一组有6只狗，通过在有机玻璃室将19mL攻击物质气雾化大约30分钟将攻击病毒施药。当一次少于六只狗被攻击时，在室中雾化的攻击病毒的体积被相应的调整。在攻击施药后采集的CRCoV攻击样品上进行的病毒滴定证实了在室中雾化的活的攻击病毒的量含有10^5.1TCID₅₀/mL。攻击后，从第42至第56研究日，每日从狗中采集用于病毒分离(VTM管)的鼓膜温度、临床观察和鼻拭子(Sterile Dacron Swabs,Puritan 25-806-1 PD)。在尸体剖检前的第46研究日和第56研究日采集用于血清学的血液样品(大约6mL)。

在尸体剖检中，将完整的肺和气管在无菌条件下取出，并放置在无菌的消毒帷上。用肺叶大略评估肺的病变(固化)。每个肺叶根据肺的固化百分比打分。来自放血不足的2只动物的肺组，不被评估和打分。气管被横切，管腔评估大体病理，任何发现都被记录。肺部被评分后，每个右尾肺叶用大约30.0mL用于诊断细菌分析和病毒分离的VTM(无抗生素)冲洗。

在肺被打分后，从气管、鼻腔和整个左中肺叶采集的组织样本用于组织病理学。从气管、鼻腔、右颅肺叶采集组织样品用于病毒分离和细菌学。

在预先确定的研究日采集用于血清学的血液。

仅在第42研究日(在攻击前)从每只狗上采集鼻拭子(无木炭的Amies传输介质)用于诊断细菌学。这些拭子被测试博德特氏菌、巴斯德菌、葡萄球菌、支原体和犬链球菌是否存在。

结果。

在接种前第0研究日，59只小猎犬通过IFA检测证实对于CRCoV的抗体(IFA滴度<40)呈阴性。血清样品也通过血清中和进行测试，且证实对于CRCoV的抗体呈阴性(SN滴度<20)。用于评估CRCoV病毒分离的鼻拭子证实在接种疫苗前第0研究日所有动物中不存在CRCoV病毒。在第0研究日的CIV病毒和抗体检测证实动物中不存在CIV病毒和CIV HAI抗体(HAI滴度<8)。根据这两个标准，动物被证实是易感染的，因此适用于CRCoV和CIV疫苗的有效性和安全性评估。直至第42研究日，盐水接种的对照组中仍然对CRCoV是血清阴性。通过第42研究日病毒分离研究，所有动物被证实不存在CRCoV，表明设备中缺少外部CRCoV的暴露。在第42研究日(攻击前)所有狗都被证实不存在支气管炎博德特氏菌。

狗接种了2中配方的疫苗，其包含灭活CRCoV和灭活CIV抗原，辅助以Emulsigen

或Rehydragel^TM。疫苗中CRCoV抗原效力通过双抗体夹心ELISA测定，采用CRCoV特异性血清中和单克隆抗体41.1.1。测量相对于指定的参考抗原，效力被确定为1.14RAU/剂。豚鼠的CIVHAI滴度为955。(格标准是HAI滴度>161)

在第一次接种后，接受了Emulsigen

配方(T05和T06)的19只动物中的10只发展成可测量的注射肿胀。在紧随疫苗接种后大多数狗的报道中有抓痕。仅有2只狗被报道有触摸疼痛。除了一只狗，在第二天该组的肿胀消除。在第二次接种后肿胀的大小和频率有轻微的数值增长，但是其在作为典型的佐剂疫苗反应的预期范围内。任何一只接种的狗都没有被报道有全身不良反应，证实缺乏临床发热(39.5℃)。这些研究结果表明，该疫苗配方对于施药给该年龄组的狗是安全的，安全性是在佐剂疫苗的预期范围内。

在每一接种后，接受了Rehydragel^TM配方的大多数狗(T03和T04)发展成注射肿胀。在第一次接种3天后出现肿胀，大多数肿胀在第19研究日消除。在第二次接种后可以看到相似的反应，大多数肿胀在第36研究日消除。注射肿胀在规模上较小，是典型的明矾佐剂反应。没有报道疼痛和发热，证实没有对疫苗产生全身反应。这些研究结果表明，该疫苗配方对于施药给该年龄组的狗是安全的，安全性是在佐剂疫苗的预期范围内。

血清中和滴定已经列表，并进行了组件比较(如图1)。两种疫苗配方在第一次接种后都引发了所有接种的狗中发生血清中和抗体(SN)反应，表明活性免疫(图1)。SN反应(Rehydragel^TM的GMT=552，Emulsigen

的GMT=2030)的结合平均值在第二次接种后增长，表明第二次接种后的促生效果。在攻击后，两种疫苗配方都导致强大的回忆SN反应(在第56研究日实验剩余的狗中，Rehydragel^TM的GMT=10725，Emulsigen

的GMT=11584)，表明有效的免疫记忆反应。注意到对于CRCoV的抗体反应在CIV抗原存在下完成是很重要的，表明在二价疫苗的抗原中缺乏干扰。

实验中剩余的56只狗在第42实验日通过雾化被攻击。攻击后，鼻病毒分离证实接种盐水的狗(100％)在攻击后第1至6日中至少3天流出攻击病毒，表明狗被CRCoV感染，流出物天数的平均值为4.5(图2)。使用Rehydragel^TM和Emulsigen

两种疫苗配方分别明显降低了病毒流出至2.6天(p<0.0001)和3.4天(p<0.0042)。这些研究结果表明，疫苗诱导是有效的，其导致病毒感染的减弱。

组织病毒分离数据表明接种盐水组的狗中90-100%，在攻击后第4研究日，鼻腔、气管和肺组织中对于病毒是阳性，表明呼吸道器官被感染(图3)。与此相反，疫苗都明显降低了肺(P<0.002)中和鼻腔(P<0.002)中对于病毒分离呈阳性的动物百分比。虽然疫苗都减少了气管(Rehydragel^TM组病毒分离体从70%，Emulsigen组从44%)中病毒分离体，但是与盐水对照组(P=0.0089)比较，只有Emulsigen

配方导致的病毒明显减少。在攻击后第14日没有从任何动物中分离的病毒，表明CRCoV感染快速进入和离开了呼吸道组织，类似于犬类流感的方案。病毒分离数据表明两种疫苗配方都显著减少了狗的病毒感染。

在实验条件下CRCoV攻击仅引发了轻微的呼吸道临床症状。所有治疗组的狗都被报道有眼和鼻腔排出物。

除去盐水对照组中第41研究日(攻击前一天)的一只动物，所有动物在攻击前体温正常。盐水对照组有2只动物被报道在攻击后有临床发热。2只狗在攻击后(在44研究日)温度都为39.6℃。其中一只狗在攻击后第4日又表现出发热(40℃)。该狗因为并发性肠胃炎接受治疗。这也许可以解释狗体CRCoV攻击后的发热反应，因为这种病毒在实验条件下先前没有表现出可以引发发热。在接种疫苗的狗中没有报道临床发热。

肺、气管和鼻甲的大致尸检在攻击后第4日和第14日进行。没有明显的严重病变被报道，除了T05中2只狗、T01中2只狗和T02中两只狗出现肺固化。引发该病变的原因还不清楚，但是不太可能是由于CRCoV，因为病变并不一致，且CRCoV没有表现出引发肺固化。组织的诊断细菌学检查没有显示其他病原体的参与。

肺、气管和鼻腔组织切片进行检测和评分。根据观察到的变化的程度，设计一个打分(0-4分)。先前进行的研究表明在攻击后第4日气管上皮的纤毛损伤是与CRCoV感染有关的特征性病理效果。(Priestnall等，2009)病理组织数据显示在攻击后第4日70%的接种盐水的狗经历了一定程度的气管上皮纤毛损伤。与之相反，两种疫苗都能降低感染的狗的数量至Rehydragel^TM(P=0.1184)40%和Emulsigen

(p=0.0003)0%。这表明疫苗诱导在防止或者减少气管粘液纤毛损伤(在感染的狗体中一个重要的先天防御机制)方面的有效性。

为了评估实验中其他呼吸道病原体的潜在参与，动物在攻击前(鼻拭子)和攻击后(肺组织/灌洗)被检测诊断细胞学。得到的结果表明，动物大部分不存在其他呼吸道病原体，表明在攻击后测量的临床结果是特异的由于CRCoV感染。

总之，在第二次疫苗接种后3周，所有接种CRCoV-CIV疫苗的狗(100%)发展出CRCoV血清中和抗体滴度，表明在强烈的攻击后回忆反应后有活性免疫，表明良好的免疫系统。两种疫苗配方明显降低了病毒流出。两种疫苗配方都明显降低了在肺(P<0.0001)中和在鼻腔(P<0.002)中对病毒分离体呈阳性的动物百分比。两种疫苗降低了在气管中的病毒分离体，尽管当与盐水对照组(p0.0089)比较时，只有Emulsigen

的配方导致病毒分离体的明显减少。两种疫苗也都降低了气管上皮纤毛感染的狗的数量。这些疫苗中CRCoV抗原的有效性在CRCoV抗原的出现实现，表明缺少CIV馏分对CRCoV的干扰。

实施例3.含有支气管炎博德特氏菌的疫苗对狗的安全性和有效性

五十(50)只狗，分为5组，被选定为研究对象。动物基于第4日的体检决定其是否用于研究。

在每次接种疫苗前第2、21和28研究日用SST管从所有动物中采集用于血清学的血液样品(大约8mL)。在第2日采集的血清样品用于证实动物是否存在B.Bronchiseptica。在疫苗接种前第0日采集鼻拭子，检测B.Bronchiseptica的存在。从第4日开始采集鼓膜温度，从而建立接种疫苗前的基线。

表4.实验设计

¹研究用兽医产品(IVP)通过皮下(SC)施药。

²支气管炎博德特氏菌菌株10^9的生物目标攻击剂量

在接种疫苗后在第0、21和28疫苗接种日观察所有动物的注射部位的反应。在疫苗接种后从第1至7日和第22-35日每日观察其注射反应。在第0-7日和第21-35日采集鼓膜温度。

在攻击前一天，第55日，采集用于血清学的血液样品(大约6mL)。在攻击前第54、55和56日采集鼓膜温度。在攻击前一天，第55日采集鼻拭子，检测支气管炎博德特氏菌的存在。每日观察动物2次其呼吸道疾病的临床症状，在第54日和第55日、第56日上午每次持续大约30分钟，用于建立基线值。

支气管炎博德特氏菌攻击菌株用于制备10⁹CFU/4mL/狗的目标攻击剂量。在第56日，治所有疗组的狗通过在有机玻璃室雾化用支气管炎博德特氏菌鼻内进行攻击，每一次攻击的圈禁的总时间为30分钟。一次从同一圈禁(从每个治疗组的一个)中的5只狗被攻击。

在攻击后从第56-77日每次记录鼓膜温度。每次进行2次临床观察(上午和下午)，在每一个房间每次大约30分钟，从第56日直到第76日，第77日一次(上午)。简单说，用下述打分系统观察咳嗽、流鼻涕、打喷嚏、眼分泌物、干呕、和抑郁症：无(0)，轻微(1)，中度(2)，严重(3)。在第59、62、66、69、74、76和第77日采集鼻拭子，用于确定攻击微生物的流出。

在第77日采集用于血清学的血液样品(大约6mL)。用拭子和传输介质采集用于支气管炎博德特氏菌分离的鼻拭子。

通过微凝集试验(MAT)测定支气管炎博德特氏菌的凝集抗体。在第0、28、55和77日从治疗组T04和T05采集的血清样品通过血清中和和IFA进行滴定CRCoV，以及CIV和HAI。从鼻拭子中获得的支气管炎博德特氏菌分离体根据标准程序进行。每一组样品被定性检测细菌的存在与否。

结果五十(50)只健康的大约8周龄的猎犬幼犬通过鼻拭子培养分离被证实在第0日没有支气管炎博德特氏菌。通过MAT用于评估支气管炎博德特氏菌的凝集抗体的血清样本被证实所有的小狗在第2日用≤8的MAT滴度是易感染的。

所有在本公开中用于评估的实验疫苗在第一次疫苗接种后产生了轻微注射肿胀至没有注射肿胀。对于大部分疫苗接种，注射肿胀限于第0日。在第二次接种疫苗后也报道了轻微注射肿胀至没有注射肿胀。当发生注射部位的肿胀时，其在第二次接种疫苗后第1至3日内消除。在5-种组合组(T04)中主要报道了挠痕。在接种疫苗后没有报道临床发热。在盐水注射组没有报道注射肿胀。该数据证明了疫苗的安全性。

在攻击接种前和后进行的菌落计数证实每只狗平均1.45×10⁸CFU博德特氏菌在雾化室雾化。攻击接种诱发了盐水对照组狗(T02)咳嗽，咳嗽的平均观察百分比为43.5%和咳嗽12.2日。治疗组T05，仅接种4-种病毒(CRCoV/CIV/CPIV/CAV2)没有博德特氏菌抗原发展成类似于盐水对照组的咳嗽，咳嗽的平均观察百分比为43.4%和咳嗽12.2日。这些发现表明攻击是合适的且与评估测试疫苗是一致的。

与对照组(咳嗽12.2日)比较，在治疗组T01的狗接种博德特氏菌疫苗相对于攻击(咳嗽3.6日，p<0.0001)具有明显的被保护。同样的疫苗也明显保护T03组的狗，当给间隔3周的治疗方案(咳嗽5.8天，P=0.0004)。这两组(T01 vs T03)咳嗽打分的减少没有明显差异(p值=0.1883)，表明在间隔3周或4周给予疫苗的保护水平是相似的。

与盐水对照组(咳嗽12.2天)和与接受4-种病毒(CRCoV/CIV/CPIV/CAV2)组合(咳嗽12.1日安，p=0.0019)的T05组相比较，接受没有佐剂的5-种组合疫苗的T04组的狗相对于博德特氏菌攻击(咳嗽6.6天)被明显的(p值=0.0016)保护，表明在缺乏佐剂的组合疫苗中博德特氏菌馏分的效力。

在5-种组合疫苗中的病毒馏分的血清学评估可能仅对2个馏分，CIV和CRCoV，狗被证实在第2研究日血清阴性。在第56研究日，4-种疫苗组(T04)的CIV HAI反应与其在5-种疫苗组(T05)的数值相似，表明在缺乏博德特氏菌馏分对CIV抗原的干扰。在第56研究日的CRCoV SN反应，4-种疫苗组(T04)的数值高于5-种疫苗组(T05)，表明博德特氏菌可能对CRCoV馏分存在干扰。但是，这些研究结果不是决定性的，因为这些疫苗没有加入佐剂，且配制没有进行优化，CRCoV攻击没有进行测试效力。

单价的博德特氏菌疫苗被证实是安全和有效的。当疫苗在在21-或28天的时间间隔给出时，单价疫苗的效力被证实。当以5-种没有佐剂的组合疫苗给出时，博德特氏菌馏分也被证明是有效的。

实施例4.多价血清学研究

40只狗，大约8周龄且健康情况良大致良好，用微凝集试验(MAT)预先筛选支气管炎博德特氏菌，通过间接荧光抗体试验(IFA)预先筛选犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。血清中和(SN)也用于评估抗体水平。在第0日，通过MAT(<16)确定所有狗对于支气管炎博德特氏菌抗体呈阴性，通过IFA(IFA<40)确定对于CRCoV抗体呈阴性。通过在第一次疫苗接种前(第0日)的鼻拭子分离检测确定所有狗没有支气管炎博德特氏菌和CRCoV。

狗被分为5个治疗组，每一组8只，根据表1的实验设计进行接种疫苗。在第一次接种疫苗每只狗在右肩区域进行接种，第二次疫苗接种在左肩区域。

表2.实验设计

¹EMA=乙烯-马来酸酐

第二次疫苗接种后，由于并发症，T04和T05组从研究中被去除。剩余组(T01，T02，T03)的狗在接种疫苗反应后每日被观察，并且在每次接种后7天检测身体(鼓膜)温度。在第0、21、42和56日从狗中采集血液样品用于测量抗体反应。

用MAT检测测试第0、21、42和56日的血液样品对于支气管炎博德特氏菌的凝集抗体。同样日期的血清样品也通过血清中和滴定CRCoV抗体，以及用HAI滴定CIV，用血清中和滴定CAV-2和CPI抗体。从每个治疗组获得几何平均抗体滴度。

在第二剂量后，T02和T03组的测试疫苗在全部(100%)接种疫苗的狗中引发了抗体反应，表明对于病毒抗原的活性免疫。在第二次接种后，绝对多数接种疫苗的狗中抗体反应增加，表明第二次接种疫苗的促生效果。重要的是要注意，在病毒馏分中的抗体反应在多种病毒和细菌(支气管炎博德特氏菌)抗原存在中被完成，表明缺乏免疫干扰。MAT血清学与对于博德特氏菌的保护不相关，但是是一个相当有价值的用于招收合适的研究动物的筛查工具。最后，基于在接种疫苗狗体中的免疫反应，在5-种多价疫苗中预测了病毒抗原的效力。

实施例5.免疫研究的持续时间

该研究的目的是要证明多价的呼吸道组合疫苗在狗体中免疫的持续时间。疫苗包括以下抗原组分：改性-活CAV-2，改性-活CPIV，灭活CIV，灭活CRCoV，以及支气管炎博德特菌提取物，用重组抗原(百日咳杆菌粘附素，或者Bsp22，或者两者)作为补充。

所有动物都是健康状况良好的，没有接受任何用于任何病原体(设计疫苗用于防御该病原体)的疫苗接种。狗被分为多套的治疗组。每一套由2个治疗组、一个接受安慰剂疫苗的对照组、和一个接受测试疫苗的疫苗接种组组成。动物接种疫苗2次，间隔大约2-4周。在每次接种疫苗后观察它们的注射部位反应。

在接种疫苗后大约3-12个月，每套的2个治疗组(免疫组和对照组)用病原体(设计疫苗用于防御该病原体)中的一种进行攻击。在攻击前后进行临床观察。在攻击后的期间采集用于分离攻击病原体的鼻拭子。采集每只动物的血液样品用于得到血清，其用于后续的解析分析。呼吸道疾病的临床症状、在攻击后流出的病原体、以及血清学反应被用于作为判断疫苗效力的标准。

所有上述参考文献通过引用被并入本发明，如同其在本发明中完整描述。

虽然在本发明的各种实施方式中已经详细描述，但是应当理解的是，根据所附权利要求限定的本发明并不限于在上述说明中所述的具体细节，在不背离本发明的精神或范畴的请款下许多明显的变化是可能的。

Claims (22)

1.一种免疫原性组合物，其包括犬流感病毒(CIV)和犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包括支气管炎博德特氏菌。

3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其还包括p68百日咳杆菌粘附素抗原。

4.如权利要求2所述的免疫原性组合物，所述的支气管炎博德特氏菌是一种细菌或细菌提取物。

5.如权利要求2所述的免疫原性组合物，还包括选自犬副流感病毒(CPIV)和犬腺病毒2型(CAV-2)中的一种或两种抗原。

6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，所述的一种或两种抗原是CPIV和CAV-2。

7.如权利要求2至6所述的免疫原性组合物，还包括分离的Bsp22抗原。

8.如上述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述的组合物是没有佐剂的。

9.如权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，还包括佐剂。

10.如上述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物不含有非呼吸道抗原。

11.如上述权利要求中任一所述的免疫原性组合物，所述组合物诱发犬类对于犬呼吸道病原体的免疫反应。

12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，所述犬呼吸道病原体为CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌和犬支原体(M.cynos)中的至少一种。

13.权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物的用途，其用于治疗或者预防犬类感染犬呼吸道病原体。

14.如权利要求13所述的用途，所述的犬呼吸道病原体为CIV、CRCoV、CPIV、CAV-2、支气管炎博德特氏菌和犬支原体(M.cynos)中的至少一种。

15.如权利要求13或14所述的用途，所述组合物在大约6个月或更长的时间内预防所述感染。

16.如权利要求13或14所述的用途，所述组合物在大约1年的时间内预防所述感染。

17.权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物在制造用于治疗或者预防犬类感染犬呼吸道病原体的药物中的用途。

18.如权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物在犬类中治疗或者预防犬传染性呼吸道疾病综合征(CIRDC)。

19.在犬类中治疗或者预防CIRDC的方法，包括将权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物施药给所述犬类。

20.如权利要求19所述的方法，所述组合物在大约6个月或更长的时间内预防CIRDC。

21.如权利要求19所述的方法，所述组合物在大约1年的时间内预防CIRDC。

22.权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物在制造用于在犬类中治疗或者预防CIRDC的药物中的用途。

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