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CN103554234A - 基于口蹄疫a型vp1蛋白及其单抗的竞争elisa方法 - Google Patents

基于口蹄疫a型vp1蛋白及其单抗的竞争elisa方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，同时涉及口蹄疫A型VP1蛋白制备、及其单抗制备方法，属于动物免疫学检测技术领域。本发明利用引物对C1、C2和引物对E1、E2扩增得到口蹄疫A型VP1蛋白的基因序列，通过表达质粒构建、表达质粒导入原核表达宿主，诱导纯化得到口蹄疫A型VP1蛋白，以口蹄疫A型VP1蛋白为抗原，通过杂交瘤技术获得口蹄疫A型VP1蛋白单抗，并基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗建立了能够用于检测口蹄疫A型抗体的竞争ELISA方法。本发明检测方法特异性强、稳定性好，可用于口蹄疫A型血清抗体的检测，结果与液相阻断ELISA检测试剂盒比对，符合率为95.8%。

Description

基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法
技术领域
本发明属于动物免疫学检测技术领域，特别是涉及一种口蹄疫A型VP1蛋白及其制备方法，以及一种基于制备得到的口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的高传染性且具有重要经济意义的动物疫病，感染牛、猪、绵羊、山羊和其他的偶蹄动物。动物感染口蹄疫后，口、蹄、乳头等部位会出现水泡形成糜烂，发病的动物一般是呈良性经过。口蹄疫虽然死亡率低，但是由于其发病率高几乎达到100%，且传播速度很快，制约了畜牧业的发展以及国家之间参与动物和动物产品的国际贸易，OIE将其列为A类动物疫病。
口蹄疫存在着七个血清型（O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和 Asia1）和80多个亚型，每个血清型中有各自的抗原性和流行特征，不存在交叉免疫，即免疫一种血清型疫苗不能抵抗另外一种血清型；各血清型中还有其不同的基因型，抗原性也存在一定程度的不同。这种多样性主要由于病毒的高突变率和重组性，也给口蹄疫疾病的诊断、控制和根除带来了困难。O型是全球范围内最流行的血清型，遍及中东南亚国家； Asia1开始只局限于亚洲，近年来已经逐步入侵到了中东国家；A型抗原最具多样性，相对其它血清型更容易发生重组，主要在亚洲、欧洲、非洲和拉丁美洲分布；南非1、2、3型（SAT1-3）主要在非洲流行。
我国自从1958年首次报道发生O、A、Asia-I这三种血清型的口蹄疫，其后偶尔有发生。A型口蹄疫在1964年从苏联传入了新疆地区再次引起流行，而后没有发生大规模的流行。直到2009年在湖北武汉暴发A型口蹄疫，这次流行的毒株根据口蹄疫VP1基因遗传进化分析证实与2008-2009年在东南亚国家分离的毒株相似（泰国、马来西亚），同属于A/ASIA/Sea-97谱系；同年在中国的上海、山东、江苏、广西、贵州和新疆六个省也报道了A型口蹄疫的暴发，2010年在无口蹄疫非免疫地区的韩国也同样出现了。Nick J. Knowles[20]等报道近年来东南亚国家A型口蹄疫的流行继O和Asia1型之后再次引起了东亚地区的暴发，口蹄疫这种跨国的传播，使我国的口蹄疫疫情更为复杂，防疫工作更为严谨，对A型口蹄疫的研究应更为深入。广西地处中国大陆的南端，与东南亚国家相邻，东盟贸易区的自由化，面临着入侵的威胁，这需要我们做好口蹄疫监测和防控工作。
ELISA是enzyme linked immuno-sorbent assay的缩写，即酶连免疫吸附实验，是当今口蹄疫抗体检测的一个重要方法，该方法分为液相阻断ELISA（LPB-ELISA），和固相竞争ELISA（SPC-ELISA）。其中SPC-ELISA以其高敏感性和高相关性，正逐渐成为主流的口蹄疫抗体检测方法。但是SPC-ELISA的弱点是操作比较复杂，即使是有经验的操作人员也得需要4-5小时才能完成。目前对于口蹄疫方面的研究情况，如专利CN201110001730.X，该发明将口蹄疫抗体通过包被技术结合在ELISA板上，然后通过抗原-抗体结合反应将口蹄疫抗原牢固结合ELISA板孔内，经稳定剂处理和干燥后进行真空包装，最后置低温长期保存，当需要检测口蹄疫抗体时，可以将该ELISA板直接用于实验，但该发明的ELISA板长期保存，将对于该检测方法产生一定的误差，并且不能将O、A、Asia-I这三种血清型的口蹄疫区分开，不利于推广使用。
发明内容
本发明的目的是针对现有口蹄疫A型血清的检测技术存在检测成本高、检测操作麻烦、结果误差大等不足，提供一种基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，发明涉及到A型口蹄疫蛋白VP1单克隆抗体的制备，及其运用于病原、抗体的检测和疫苗的研制等；建立了单抗竞争ELISA的方法来检测A型抗体，形成A型口蹄疫免疫监测技术平台。
本发明实现的技术方案为：一种口蹄疫A型VP1蛋白，包括两种不同表达方式得到的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2，口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示。
一种制备口蹄疫A型VP1蛋白的方法，以口蹄疫病毒FMDV基因组为模板，利用一对克隆引物和一对表达引物进行PCR扩增得到FMDV-A-VP1基因，将FMDV-A-VP1基因分别与pET-32a、pGEX-6p-1质粒连接构建得到表达质粒PET-32a-VP1、pGEX-6p-1-VP1，再将表达质粒PET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1分别转入原核表达宿主大肠杆菌BL21中诱导表达得到分别融合蛋白1和融合蛋白2，融合蛋白1和融合蛋白2分别经纯化得到氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2。
作为本发明制备口蹄疫A型VP1蛋白的方法的进一步限定，所述一对克隆引物包括引物C1：5’-TACCAAATTACACGGGAA-3’，引物C2：5’-GACATGTCCTCCTGCATCTG-3’。
作为本发明制备口蹄疫A型VP1蛋白的方法的进一步限定，所述一对表达引物包括引物E1：5’-CCGGAATTCACCACCACTGTTGAGAACTACG-3’，引物E2：5’- CCGCTCGAGTCATTACAGGAGTTGCTTTGCAGGTGC-3’。
作为本发明制备口蹄疫A型VP1蛋白的方法的进一步限定，所述的PCR扩增过程中退火温度为54.5~57.5℃；所述的融合蛋白纯化为经过His和GST柱层析纯化。
为使本发明公开充分，本发明的中涉及到的构建重组基因表达载体、诱导表达重组基因、色谱纯化获得口蹄疫A型VP1蛋白方法步骤，按照实验室常规现有方法即可实现，其中所述PCR扩增的具体步骤如下：
步骤A：以口蹄疫A型病毒基因DNA为模板，利用第一对克隆引物C1、C2扩增得到包含FMDV-A-VP1基因的序列（886bp），然后用第二对表达引物E1、E2扩增此序列得到FMDV-A-VP1基因（639bp）。
步骤B：以步骤A扩增得到的FMDV-A-VP1基因（639bp）进行纯化，连接pMD18-T 载体，构建pMD18-T-VP1克隆载体。
步骤C：以步骤C构建pMD18-T-VP1为模板，利用表达引物E1、E2进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，用EcoRⅠ和XholⅠ内切酶对此PCR纯化产物和表达载体pET-32a、pGEX-6p-1分别进行双酶切。
以上所述的PCR扩增的实现过程依靠现有的PCR技术，通过多次PCR扩增，以及基因工程双酶切技术，实现蛋白的原核表达。
一种制备以上所述口蹄疫A型VP1蛋白单抗的方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤a)动物免疫：利用表达质粒PET-32a-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白1免疫5~7周龄的BALB／c雌性小鼠，经过3次免疫后，筛选出免疫测定效价＞1:12800的小鼠。
步骤b)细胞融合：取步骤a)得到的免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，利用表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2作为包被抗原，对融合后的细胞进行间接ELISA筛选得到杂交瘤细胞。所述的口蹄疫A型VP1蛋白1、口蹄疫A型VP1蛋白2为不同表达方式得到的相同序列蛋白，两者蛋白氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示。
步骤c)单抗的大量克隆：将步骤b)得到的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，饲养注射后的小鼠1~3周，收集腹部膨大的小鼠腹水，对腹水进行纯化得到口蹄疫A型VP1蛋白单抗。
一种基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，该竞争ELISA检测方法步骤包括：
步骤1）样品稀释：血清样品的稀释为原体积的2~4倍，得到待测血清样品。
步骤2）抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.5~0.7ug/mL。作为本发明基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法的进一步限定，所述的口蹄疫A型VP1蛋白2其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
步骤3）封闭：用封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为40~60min，得到封闭后的酶标板。
步骤4）加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:300~1:500的口蹄疫A型VP1蛋白单抗，使口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板。
步骤5）加酶标记抗体：在步骤4）得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:4500~6000，酶标记抗体与口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记单抗后的酶标板。
步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10~20min进行显色，再每孔加入终止液，混匀孵育5~10min终止反应，得到可进行测定的溶液。
步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD450nm处的吸光值A450nm；
步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A450nm计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率 PI%=（1-A450样品/A450阴性对照）×100。
作为本发明基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法的进一步限定，所述封闭液为1%BSA溶液、1%明胶溶液、5%胎牛血清溶液、5%脱脂奶粉溶液中任一种。
作为本发明基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法的进一步限定，所述酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP，即酶标记抗体中的抗体为以口蹄疫A型VP1蛋白单抗为抗原注射到山羊后分离出的抗口蹄疫A型VP1蛋白单抗的二抗体山羊抗小鼠IgG-HRP；所述的A450阴性对照为用未感染FMDV病毒的血清测定出来的吸光值A450。
本发明的实质性特点和显著进步是：
（1）本发明利用RT-PCR和蛋白原核表达技术成功制备得到纯度较高且具有良好特异性和免疫原性的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2。本发明的获得的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2可作为其单抗的制备，由于采用两种不同表达方式获得的口蹄疫A型VP1蛋白，使得单抗制备过程效率更高，获得单抗的机率更大。
（2）采用杂交瘤技术，以口蹄疫A型VP1蛋白1为免疫原，口蹄疫A型VP1蛋白2为包被抗原建立了间接ELISA筛选方法，筛选、制备得到了抗口蹄疫A型VP1蛋白的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株单抗均能被口蹄疫A型阳性血清阻断，单抗生物特性的鉴定结果表明可选用该单抗作为竞争ELISA的检测抗体，解决了竞争ELISA检测方法的特异性识别的单抗获得难题。
（3）以口蹄疫A型VP1蛋白1为包被抗原，口蹄疫A型VP1蛋白的单抗为竞争抗体，建立优化了检测口蹄疫A型血清抗体的单抗竞争ELISA方法，得到一种特异性强、稳定性高、快速便捷的口蹄疫A型的抗体检测方法。
（4）确定了竞争ELISA阴阳判定抑制率临界值，抑制率 (PI) ≥30%为阳性，抑制率（PI）＜30%为阴性。本发明基于口蹄疫A型VP1蛋白及其抗体区分口蹄疫A型感染的竞争ELISA方法，与液相阻断ELISA检测试剂盒比对，符合率为95.8%，这说明本发明检测方法特异性强、稳定性好等优点，可用于口蹄疫A型血清抗体的检测，这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。
附图说明
图1.FMDV-A-VP1基因的序列（886bp）的扩增结果，图中左边箭头所指为FMDV-A-VP1基因（886bp）。
图2.FMDV-A-VP1基因（639bp）的扩增结果，图中左边箭头所指为FMDV-A-VP1基因（639bp）。
图3.口蹄疫A型VP1蛋白1的SDS-PAG电泳图，图中右边箭头所指为口蹄疫A型VP1蛋白1条带。
图4.口蹄疫A型VP1蛋白2的SDS-PAG电泳图，图中右边箭头所指为口蹄疫A型VP1蛋白2条带。
具体实施方式
以下结合说明书附图和实施例描述本发明一种基于口蹄疫A型VP1蛋白单抗的竞争ELISA方法及其应用，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中所用到的所有试剂均可通过商业手段购买，以下实施例中的操作步骤如无特别说明均可通过实验室常规操作方法实现。
实施例1口蹄疫A型VP1蛋白的获得
（1）引物设计
根据GenBank已发表的口蹄疫病毒A型基因序列，设计一对克隆引物（C1、C2）扩增包含FMDV-A-VP1基因的序列，大小为886bp；根据原核表达载体及目的基因序列设计一对针对完整VP1基因（639bp）特异性表达引物（E1、E2），并插入EcoRⅠ和XholⅠ两个酶切位点。引物序列送大连宝生物工程公司合成。
表1扩增FMDV-A-VP1基因的引物核苷酸序列
Figure 25036DEST_PATH_IMAGE001
（2）基因克隆
以口蹄疫A型病毒基因DNA为模板，利用第一对克隆引物C1、C2扩增得到包含FMDV-A-VP1基因的序列（886bp），然后用第二对表达引物E1、E2扩增此序列得到FMDV-A-VP1基因（639bp）。FMDV-A-VP1基因的序列（886bp）克隆结果如图1所示，FMDV-A-VP1基因（639bp）克隆结果如图2所示。基因克隆过程中的反应体系以及反应过程如表2所示。
表2.聚合酶链式反应（PCR）体系：
 （3）表达载体构建、诱导表达、纯化
将FMDV-A-VP1基因分别与pET-32a、pGEX-6p-1质粒连接构建得到表达质粒PET-32a-VP1、pGEX-6p-1-VP1，再将表达质粒PET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1分别转入原核表达宿主大肠杆菌BL21中诱导表达得到分别融合蛋白1和融合蛋白2，融合蛋白1和融合蛋白2分别经经过His和GST柱层析纯化得到口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2。融合蛋白的电泳图如图3、图4。口蹄疫A型VP1蛋白1、口蹄疫A型VP1蛋白2为不同表达方式得到的相同序列蛋白，两者蛋白序列均为SEQ ID NO:1所示。
实施例2口蹄疫A型VP1蛋白单抗的获得
步骤a)动物免疫：利用表达质粒PET-32a-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白1免疫7周龄的BALB／c雌性小鼠，经过3次免疫后，筛选出每次免疫测定效价大于1:12800的小鼠。
步骤b)细胞融合：取步骤a)得到的免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，利用表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2作为包被抗原，对融合后的细胞进行间接ELISA筛选得到杂交瘤细胞。
步骤c)单抗的大量克隆：将步骤b)得到的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，饲养注射后的小鼠1周后，收集腹部膨大的小鼠腹水，对腹水进行纯化得到口蹄疫A型VP1蛋白单抗。
口蹄疫A型VP1蛋白1、口蹄疫A型VP1蛋白2为不同表达方式得到的相同序列蛋白，两者蛋白序列均为SEQ ID NO:1所示。
实施例3猪口蹄疫A型血清的竞争ELISA检测方法
取6只疑似感染口蹄疫A型的猪血清，对该血清进行阴阳性判定，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，该竞争ELISA检测方法中：
步骤1）样品稀释：血清样品的稀释为原体积的4倍，得到待测血清样品。
步骤2）抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.625ug/mL。
步骤3）封闭：用1%BSA溶液封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为40min，得到封闭后的酶标板。
步骤4）加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:400的口蹄疫A型VP1蛋白单抗，使口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板。
步骤5）加酶标记抗体：在步骤4）得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:4500，酶标记抗体与口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记抗体后的酶标板。所用到的酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP。
步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育20min进行显色，再每孔加入终止液，混匀孵育5min终止反应，得到可进行测定的溶液。
步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD450nm处的吸光值A450nm；
步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A450nm计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率 PI%=（1-A450样品/A450阴性对照）×100。检测结果如表3所示，准确率与液相阻断ELISA检测方法进行比对计算得出。
实施例4牛口蹄疫A型血清的竞争ELISA检测方法
取6只疑似感染口蹄疫A型的牛血清，对该血清进行阴阳判定，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，该竞争ELISA检测方法中：
步骤1）样品稀释：血清样品的稀释为原体积的2倍，得到待测血清样品。
步骤2）抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.7ug/mL。
步骤3）封闭：用1%明胶溶液封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为60min，得到封闭后的酶标板。
步骤4）加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:300的口蹄疫A型VP1蛋白单抗，使口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板。
步骤5）加酶标记抗体：在步骤4）得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:6000，酶标记抗体与口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记单抗后的酶标板。所用到的酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP。
步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10min进行显色，再每孔加入终止液，混匀孵育10min终止反应，得到可进行测定的溶液。
步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD450nm处的吸光值A450nm；
步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A450nm计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率 PI%=（1-A450样品/A450阴性对照）×100。检测结果如表3所示，准确率与液相阻断ELISA检测方法进行比对计算得出。
实施例5山羊口蹄疫A型血清的竞争ELISA检测方法
取6只疑似感染口蹄疫A型的山羊血清，对该血清进行阴阳判定，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，该竞争ELISA检测方法中：
步骤1）样品稀释：血清样品的稀释为原体积的3倍，得到待测血清样品。
步骤2）抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.5ug/mL。
步骤3）封闭：用5%胎牛血清溶液封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为60min，得到封闭后的酶标板。
步骤4）加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:500的口蹄疫A型VP1蛋白单抗，使口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板。
步骤5）加酶标记抗体：在步骤4）得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:5000，酶标记抗体与口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记单抗后的酶标板。所用到的酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP。
步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育15min进行显色，再每孔加入终止液，混匀孵育7min终止反应，得到可进行测定的溶液。
步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD450nm处的吸光值A450nm；
步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A450nm计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率 PI%=（1-A450样品/A450阴性对照）×100。检测结果如表3所示，准确率与液相阻断ELISA检测方法进行比对计算得出。
实施例6绵羊口蹄疫A型血清的竞争ELISA检测方法
取6只疑似感染口蹄疫A型的绵羊血清，对该血清进行阴阳判定，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，该竞争ELISA检测方法中：
步骤1）样品稀释：血清样品的稀释为原体积的4倍，得到待测血清样品。
步骤2）抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.6ug/mL。
步骤3）封闭：用5%脱脂奶粉溶液封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为50min，得到封闭后的酶标板。
步骤4）加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:500的口蹄疫A型VP1蛋白单抗，使口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板。
步骤5）加酶标记抗体：在步骤4）得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:5500，酶标记抗体与口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记单抗后的酶标板。所用到的酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP。
步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育15min进行显色，再每孔加入终止液，混匀孵育6min终止反应，得到可进行测定的溶液。
步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD450nm处的吸光值A450nm；
步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A450nm计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率 PI%=（1-A450样品/A450阴性对照）×100。检测结果如表3所示，准确率与液相阻断ELISA检测方法进行比对计算得出。
本发明上述实施例方案仅是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书中指出了本发明的范围，而上述的具体实施例说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应当认为是包括在权利要求书的范围内。
本发明是经过口蹄疫疾病长期工作经验积累，并通过创造性劳动创作而出，其在实际试验检测和口蹄疫A型疾病检测实际应用程中，该方法检测结果可靠，检测准确率高。
表3实施例血清中的口蹄疫A型抗体的竞争ELISA检测结果
 注：“＋”代表待测样品PI%≥30%，“－”代表待测样品PI%＜30%。
 
序列表
<110>  广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120>  基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法
<130>  2013
<160>  1     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  213
<212>  PRT
<213>  口蹄疫病毒（FMDV）
<400>  1
Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly 
                 5                  10                   15                  20
Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asn Val Gly Phe Ile MET Asp Arg Phe Val 
                25                  30                   35                  40
Lys Ile Pro Ser Gln Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu MET Gln Thr His Gln His Gly 
                45                  50                   55                  60
Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val 
                65                  70                   75                  80
Arg His Asp Asp Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu His Asn 
                85                  90                   95                 100
Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Gly Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr 
                105                 110                  115                120
Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn 
                125                 130                  135                140
Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala 
                145                 150                  155                160
Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Val Ile His Glu Leu Leu Ala Arg MET Lys 
                165                 170                  175                180
Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Lys Val Thr Ser Gln Asp Arg 
                185                 190                  195                200
His Lys Gln Arg Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu
                205                 210         213 
序列表
 
<110>  广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
 
<120>  基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法
 
<130>  2013
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  213
<212>  PRT
<213>  口蹄疫病毒（FMDV）
 
<400>  1
Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly
                 5                  10                   15                  20
Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asn Val Gly Phe Ile MET Asp Arg Phe Val
                25                  30                   35                  40
Lys Ile Pro Ser Gln Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu MET Gln Thr His Gln His Gly
                45                  50                   55                  60
Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val
                65                  70                   75                  80
Arg His Asp Asp Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu His Asn
                85                  90                   95                 100
Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Gly Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr
                105                 110                  115                120
Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn
                125                 130                  135                140
Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala
                145                 150                  155                160
Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Val Ile His Glu Leu Leu Ala Arg MET Lys
                165                 170                  175                180
Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Lys Val Thr Ser Gln Asp Arg
                185                 190                  195                200
His Lys Gln Arg Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu
                205                 210         213

Claims (7)

1.一种口蹄疫A型VP1蛋白，包括两种不同表达方式得到的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2，其特征在于，口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示。
2.一种制备权利要求1所述的口蹄疫A型VP1蛋白的方法，其特征在于，以口蹄疫病毒FMDV基因组为模板，利用一对克隆引物和一对表达引物进行PCR扩增得到FMDV-A-VP1基因，将FMDV-A-VP1基因分别与pET-32a、pGEX-6p-1质粒连接构建得到表达质粒PET-32a-VP1、pGEX-6p-1-VP1，再将表达质粒PET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1分别转入原核表达宿主大肠杆菌BL21中诱导表达得到分别融合蛋白1和融合蛋白2，融合蛋白1和融合蛋白2分别经纯化得到氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2；所述一对克隆引物包括引物C1：5’-TACCAAATTACACGGGAA-3’，引物C2：5’-GACATGTCCTCCTGCATCTG-3’；
所述一对表达引物包括引物E1：5’-CCGGAATTCACCACCACTGTTGAGAACTACG-3’，引物E2：5’- CCGCTCGAGTCATTACAGGAGTTGCTTTGCAGGTGC-3’。
3.根据权利要求2所述的制备口蹄疫A型VP1蛋白的方法，其特征在于，所述的PCR扩增过程中退火温度为54.5~57.5℃；所述的融合蛋白纯化为经过His和GST柱层析纯化。
4.一种制备口蹄疫A型VP1蛋白单抗的方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
步骤a)动物免疫：利用表达质粒PET-32a-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白1免疫5~7周龄的BALB／c雌性小鼠，经过3次免疫后，筛选出免疫测定效价＞1:12800的小鼠；
步骤b)细胞融合：取步骤a)得到的免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，利用表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2作为包被抗原，对融合后的细胞进行间接ELISA筛选得到杂交瘤细胞；
步骤c)单抗的大量克隆：将步骤b)得到的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，饲养注射后的小鼠1~3周，收集腹部膨大的小鼠腹水，对腹水进行纯化得到口蹄疫A型VP1蛋白单抗；
所述的口蹄疫A型VP1蛋白1、口蹄疫A型VP1蛋白2为不同表达方式得到的相同序列蛋白，两者蛋白氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示。
5.一种口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加样与加单抗、加酶标记抗体、显色与终止、测值、数据处理，其特征在于，该竞争ELISA检测方法步骤包括：
步骤1）样品稀释：血清样品的稀释为原体积的2~4倍，得到待测血清样品；
步骤2）抗原包被：所用到的包被抗原为表达质粒pGEX-6p-1-VP1诱导得到的口蹄疫A型VP1蛋白2，包被抗原的包被浓度为0.5~0.7ug/mL；
步骤3）封闭：用封闭液封闭步骤2)包被的抗原，封闭时间为40~60min，得到封闭后的酶标板；
步骤4）加样与加单抗：将步骤1)得到的待测血清样品加入到步骤3)得到的封闭后的酶标板中，使血清抗体与包被抗原结合，再加入稀释度为1:300~1:500的口蹄疫A型VP1蛋白单抗，使口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合未与血清抗体反应的剩余包被抗原，得到样品、单抗反应后的酶标板；
步骤5）加酶标记抗体：在步骤4）得到的样品、单抗反应后酶标板中加入酶标抗体，酶标记抗体的稀释浓度为1:4500~6000，酶标记抗体与口蹄疫A型VP1蛋白单抗结合，而不与血清抗体结合，得到加酶标记抗体后的酶标板；
步骤6）显色与终止：在步骤5）得到的加酶标记抗体后的酶标板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10~20min进行显色，再每孔加入终止液，混匀终止反应，得到可进行测定的溶液；
步骤7）测值：测定步骤6）得到的可进行测定的溶液在OD450nm处的吸光值A450nm；
步骤8）数据处理：利用步骤7）测定的吸光值A450nm计算出待测样品抑制率，所述待测样品抑制率 PI%=（1-A450样品/A450阴性对照）×100；
所述的口蹄疫A型VP1蛋白2其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求5所述的基于口蹄疫A型VP1蛋白单抗的竞争ELISA方法，其特征在于，所述封闭液为1%BSA溶液、1%明胶溶液、5%胎牛血清溶液、5%脱脂奶粉溶液中任一种。
7.根据权利要求5或6任一项所述的基于口蹄疫A型VP1蛋白单抗的竞争ELISA方法，其特征在于，所述酶标记抗体的抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP；所述的A450阴性对照为用未感染FMDV病毒的血清测定出来的吸光值A450。
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