[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN103524613A - 皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品 - Google Patents

皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品 Download PDF

Info

Publication number
CN103524613A
CN103524613A CN201210229686.2A CN201210229686A CN103524613A CN 103524613 A CN103524613 A CN 103524613A CN 201210229686 A CN201210229686 A CN 201210229686A CN 103524613 A CN103524613 A CN 103524613A
Authority
CN
China
Prior art keywords
skin
somatomedin
skin renewal
renewal
growth factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201210229686.2A
Other languages
English (en)
Inventor
罗文政
陈韦弘
林佐文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Crystalline Substance Light Source Sheng Ji Limited-Liability Co
Original Assignee
Crystalline Substance Light Source Sheng Ji Limited-Liability Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Crystalline Substance Light Source Sheng Ji Limited-Liability Co filed Critical Crystalline Substance Light Source Sheng Ji Limited-Liability Co
Priority to CN201210229686.2A priority Critical patent/CN103524613A/zh
Publication of CN103524613A publication Critical patent/CN103524613A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供一种皮肤更新生长因子，该皮肤更新生长因子是由猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，然后经过离心以及冷冻干燥而得之；本发明更提供一种前述的皮肤更新生长因子促进皮肤细胞再生的用途；本发明再提供一种前述的皮肤更新生长因子抑制黑色素分泌的用途；本发明再提供一种用于皮肤保养的保养品，其包含前述皮肤更新生长因子。本发明的皮肤更新生长因子可长时间保存，且由猪血获得利于大规模制造，相当具有经济效益，并可用于保养皮肤的保养品，由此促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌。

Description

皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品
技术领域
一种皮肤更新生长因子，尤指一种由猪全血分离血小板，并通过活化剂激活血小板以及离心及冷冻干燥的方法而得的皮肤更新生长因子。
背景技术
血小板(platelets)于医学上应用已有很长的一段时间，尤其是血小板所衍生的生长因子，可应用于组织工程以及伤口愈合。其中血小板丰富血浆(platelet-rich plasma，PRP)是由聚集血小板(aggregated platelets)释放血小板颗粒(platelet granules)所得的富含生长因子(growth factors，GFs)浓缩液，其生长因子包括血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrow factor，PDGF)、转化生长因子(transforming growth factor β，TGF-β)、基本纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、类胰岛素生长因子I、II(insulin-like growth factor-I、II，IGF-I、II)以及与类胰岛素生长因子I、II结合的类胰岛素生长因子结合蛋白(IGF binding protein，IGFBPs)，并且上述生长因子具有促进伤口愈合、修补组织以及血管新生等特性，血小板丰富血浆被广泛应用矫型外科学(orthopaedics)、运动相关伤害(sport-relatedinjuries)、肿瘤生物学(cancer biology)以及皮肤学(dermatology)等。
自体血小板丰富血浆虽可避免传染性疾病的缺点，但自体可萃取的血小板有限，且萃取所得的血小板为液状，以及血小板生命周期短(约为7天至10天)，而使得保存血小板丰富血浆相当困难，并使得血小板丰富血浆应用于大面积的伤口以及保养品大规模量产相当有限，而且现有技术的血小板丰富血浆仅应用于伤口愈合以及修补组织。
现有技术的血小板丰富血浆保存不易、且源于自体所萃取而得的血小板丰富血浆相当有限。因此，研发出一种可长时间维持活性的血小板丰富血浆，并使其应用于保养品，仍是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种由猪全血(porcine whole blood)分离血小板，并通过活化剂激活血小板，以及离心及冷冻干燥的方法而得的皮肤更新生长因子(skin renewal growth factors，SRGF)，该皮肤更新生长因子可长时间维持活性，并将该皮肤更新生长因子应用于皮肤保养等相关领域。
为达上述目的，本发明提供一种皮肤更新生长因子，该皮肤更新生长因子是由猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，然后经过离心以及冷冻干燥而获得该皮肤更新生长因子，其中该皮肤更新生长因子具有促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
依据本发明，“活化剂激活血小板”如此处所指是利用活化剂与与血小板共培育，而与血小板反应，释放出适当细胞激素。优选地，是通过将活化剂与血小板置于一容器中，摇晃该容器使得血小板细胞质中的细胞器的阿法颗粒(αgranule)被活化而释放皮肤更新生长因子。
在上述皮肤更新生长因子中，优选地，所述活化剂为牛凝血酶以及氯化钙。
在上述皮肤更新生长因子中，更优选地，所述牛凝血酶在所述血小板中的浓度为20U/mL至30U/mL；氯化钙在所述血小板中的质量浓度为7.5％至15％。
依据本发明，“冷冻干燥”如此处所指是将皮肤更新生长因子经过瞬间降温使其凝固，并于缓慢回复至室温环境下连续抽真空并析出水分所制得。
在上述皮肤更新生长因子中，优选地，所述冷冻干燥是经过将一诸如经培育的培养基的样品瞬间降温凝固呈固态；缓慢上升温度，使得样品内水气升华至空气中；连续低压令水分从样品中升华；提升温度，使样品回温过程中避免水分再次渗入样品；维持环境温度，使样品适应环境温度时的湿度，达到平衡状态，以取得所欲的皮肤更新生长因子。
依据本发明，优选地，“适应环境温度时的湿度，达到平衡状态”如此处所指是样品于平均湿度为60％至70％的无菌室中，封装并冷藏于-20℃以下，即可长时间保持皮肤更新生长因子的品质。
依据本发明，所述的皮肤更新生长因子的品质包括皮肤更新生长因子可以促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
在上述皮肤更新生长因子中，更优选地，所述冷冻干燥包含以下7个区段：区段1是于零下20℃保持5小时；区段2至区段4是于32小时内，缓慢地将温度由零下10℃提升4℃；区段5是于10℃保持16小时，并连续抽真空；区段6是于25℃保持15小时；区段7是维持于27℃一段时间，以达到平衡状态；该达到平衡的时间可无限延长至经冷冻干燥的含有皮肤更新生长因子的样品被使用之前。
本发明更提供一种皮肤更新生长因子促进皮肤细胞再生的用途，其包含：
齐备一如前述的皮肤更新生长因子，其通过促使皮肤细胞的纤维母细胞数量增多、促进胶原蛋白表现、增加蛋白多糖(proteoglycan)合成以及抑制角质细胞分化以达到促进皮肤细胞再生。换而言之，本发明提供一种皮肤更新生长因子在具有促进皮肤细胞再生作用的保养品中的应用。
依据本发明，“促进皮肤细胞再生”如此处所指意指能够促使皮肤细胞的纤维母细胞数量增多、促进胶原蛋白表现、增加蛋白多糖合成以及抑制角质细胞分化，根据本发明的具体实施方案，促进皮肤细胞再生可透过活体外细胞增生倍率、蛋白多糖合成增加以及角质细胞相关基因表现予以测定而得。
在上述方法中，优选地，所述抑制角质细胞分化是指抑制包括，但不限于基膜素V(lamininV)及角蛋白10(keratin 10)的基因表现。
在上述方法中，优选地，以总重量为基础，所述促进皮肤细胞再生的皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06wt％至0.3wt％。
本发明再提供一种皮肤更新生长因子抑制黑色素分泌的用途，其包含：
齐备一如前述的皮肤更新生长因子，其通过抑制皮肤的黑色素细胞增殖以及抑制黑色素生成的相关基因或蛋白酶表现以达到抑制黑色素分泌。换而言之，本发明提供一种皮肤更新生长因子在具有抑制黑色素分泌作用的保养品中的应用。
依据本发明，“抑制黑色素分泌”如此处所指意指能够抑制皮肤的黑色素细胞增殖以及抑制黑色素生成的相关基因或蛋白酶表现，根据本发明的具体实施方案，其可抑制PAX3(paired box 3)基因表现、抑制小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associtatedtranscription factor，MITF)基因表现、抑制酪胺酸酶(tyrosinase)表现以及抑制黑色素分泌，并可透过活体外细胞抑制增生倍率以及抑制上述相关基因表现予以测定而得。
在上述方法中，优选地，以总重量为基础，所述抑制黑色素分泌的皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06wt％至0.3wt％。
本发明再提供一种用于皮肤保养的保养品，其包含如前述的皮肤更新生长因子。
本发明通过猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，并经过离心以及冷冻干燥所得的皮肤更新生长因子经证实具有促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌的功效；相较于现有技术的血小板丰富血浆，本发明经特定浓度的活化剂激活血小板后，可释放较多皮肤更新生长因子，且该皮肤更新生长因子经由冷冻干燥可避免冷冻或\及解冻过程中形成冰晶而破坏生长因子的结构以及可降低污染的机率，而使得本发明的皮肤更新生长因子可长时间保存并具有较高的活性，且由猪血获得较利于较大规模制造，相当具有经济效益，是以能作为一种新颖的、用于皮肤保养的保养品，由此来促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌。
附图说明
图1为实施例的皮肤更新生长因子于不同活化剂比例的活性表现图。
图2为实施例的皮肤更新生长因子以冷冻干燥处理的区段所需时间与温度的曲线图。
图3为实施例的经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子粉末与溶液状态的皮肤更新生长因子的活性曲线图。
图4为实施例的经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子再经研磨处理与研磨前的活性比较的柱状图。
图5为实施例的经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子于零下20℃保存4年后，与新鲜制备的皮肤更新生长因子的活性比较的柱状图。
图6A为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于促进人类皮肤纤维母细胞增殖的柱状图。
图6B为实施例的对照组的人类皮肤纤维母细胞状态图。
图6C为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子的人类皮肤纤维母细胞状态图。
图7为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于促进人类皮肤纤维母细胞的胶原蛋白次型的增加倍率的柱状图。
图8A为实施例的含有0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于促进人类皮肤纤维母细胞的蛋白多糖合成的柱状图。
图8B为实施例的以艾尔逊蓝染色评估含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液对于促进蛋白多糖合成影响的人类皮肤纤维母细胞染色图。
图9A为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类表皮角质细胞增殖的柱状图。
图9B为实施例的对照组的人类表皮角质细胞状态图。
图9C为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子的人类表皮角质细胞状态图。
图10为实施例的含有0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类表皮角质细胞的基膜素V的柱状图。
图11为实施例的含有0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类表皮角质细胞的角蛋白10的柱状图。
图12A为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞生长的柱状图。
图12B为实施例的对照组的人类黑色素细胞状态图。
图12C为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子的人类黑色素细胞状态图。
图13为实施例的含有0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞的PAX3基因表现的柱状图。
图14为实施例的含有0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞的MITF基因表现的柱状图。
图15为实施例的含有0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞的酪胺酸酶表现的柱状图。
图16为实施例的含有0.3wt％皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞分泌黑色素的柱状图。
具体实施方式
本发明将由下列的实施例作为进一步说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。所述领域的一般技术人员，可以做些许的改良与修饰，但不脱离本发明的范畴。
制备例
材料与方法
1.化学药品与试剂
牛凝血酶(bovine thrombin)购自美国SIGMA公司；氯化钙(CaCl2)购自美国SIGMA公司；酵素免疫分析套组(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)购自德国Quantikine公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国GIBCO公司；青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)购自美国GIBCO公司；杜氏改良英格尔培养基(Dulbecco′sModified Eagle′s medium，DMEM)购自美国GIBCO公司；M154基础培养液(M154basalmedium)购自美国Cascade Biologics公司；含有人类黑色素细胞生长添加剂(humanmelanocyte growth supplement-2，HMGS-2)的254培养液(254medium)购自美国CascadeBiologics公司；3-(4，5-二四基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐{3-[4，5-Dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT}购自德国Roche公司；试剂以及
Figure BDA00001851185500052
III反转录酶(reverse transcriptase)购自美国Invitrogen公司；Taq脱氧核糖核酸聚合酶(Taq DNA polymerase)购自美国Invitrogen公司；洋菜胶(agarose gel)购自美国AMRESCO公司。
2.细胞培养
成人人类皮肤纤维母细胞(adult human dermal fibroblast，hDFa)购自美国CascadeBiologics公司，细胞以每毫升5×105密度培养于含有体积浓度10v/v％胎牛血清、1v/v％的靑霉素-链霉素的DMEM培养液，并于37℃含有体积浓度5％二氧化碳的培养箱培养。
人类表皮角质细胞(human dermal keratinocyte，HEK)购自美国Cascade Biologics公司，细胞以每毫升5×105密度培养于含有体积浓度10v/v％胎牛血清、1v/v％的靑霉素-链霉素的M154基础培养液，并于37℃含有体积浓度5％二氧化碳的培养箱培养。
人类黑色素细胞(human epidermal melanocytes)购自美国Cascade Biologics公司，细胞以每毫升5×105密度培养于含有体积浓度10v/v％胎牛血清、1v/v％的靑霉素-链霉素以及含有人类黑色素细胞生长添加剂的254培养液，并于37℃含有体积浓度5％二氧化碳的培养箱培养。
3.方法
(1)制备皮肤更新生长因子(skin renewal growth factors，SRGF)
将猪全血收集后，通过MCS+血浆收集系统(MCS+plasma collection system)(购自美国Haemonetics公司)分离血小板。
表1以不同浓度、种类活化剂所使用的浓度
  编号   0   1   2   3   4
  牛凝血酶(每毫升)   0   25U   25U   25U   25U
  氯化钙(wt％)   0   7.5   10   12.5   15
如表1所示，以无(0U/mL)或25U/mL的牛凝血酶以及不同质量浓度(0％至15％)的氯化钙(CaCl2)作为活化剂以活化血小板；将已活化的血小板以每分钟100转(rpm)历经30分钟(min)，再以3500rpm离心历经10min，即可于上清液获得皮肤更新生长因子。
(2)冷冻干燥及研磨保存
表2冷冻干燥皮肤更新生长因子的程序表
Figure BDA00001851185500061
将皮肤更新生长因子如上述表2及图2所述的参数设定进行冷冻干燥，其中区段1是将含有皮肤更新生长因子的培养液的各样品瞬间降温至零下20℃并保持5小时，使各样品凝固成固态；区段2至区段4是于32小时内，依据表2所示的温度及时间缓慢地将温度提升，并使各样品所含的水气升华至空气中；区段5是于10℃保持16小时，并以连续抽真空的方式使水分由各样品中析出；区段6是于25℃保持15小时，并于该时间内使温度逐渐上升而使各样品回温，其过程中亦避免水分再次渗入各样品；区段7是将各样品维持于接近室温的27℃，且图2区段7所述的“t hr”是指不限制保持时间，并使各样品适应室温的湿度，使各样品与室内湿度达到平衡状态，避免各样品在室温下受潮影响质量。
依据本发明，“与室内湿度达到平衡状态”如此处所指是于平均湿度为60％至70％的无菌室中，将经冷冻干燥而得的皮肤更新生长因子粉末封装并冷藏于-20℃以下，即可长时间保持皮肤更新生长因子的质量。
并依据不同细胞所需的细胞培养液将冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子以基础培养液进行回溶，以总重量为基础，并分别添加至含有体积浓度1v/v％胎牛血清的培养液，以分别形成质量浓度为0.06wt％、0.15wt％以及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液；再将含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液于不同时间点(1个月、2个月及3个月)进行活性测量。
此外，更进一步将经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子研磨成粒径为10微米(μm)至20μm的粉末，并进行活性测量。
(3)评估细胞存活率
本制备例是以MTT分析法(MTT assay)，通过光谱仪显示的光密度(optical density，OD)与活细胞数目成正比的原理，进而推算细胞的存活率。
首先，将每孔(well)每200微升(μL)4×103细胞培养于96孔培养盘中，将基础培养液以及含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液分别加入培养盘。经由24小时、72小时、120小时以及168小时培养后，将100μL浓度为每毫升0.5毫克(mg/ml)的MTT溶液加入各孔中并将该孔盘培养于37℃保持4小时之后，加入含有0.04mol/L(N)盐酸(HCl)的100ml异丙醇(isopropanol)溶液，再于波长570纳米(nm)下测定吸光值，通过于各孔形成的甲(formazan)，以推算细胞的存活率；并以细胞存活率与培养时间作图。
(4)反转录酶-聚合酶连锁反应(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)
通过
Figure BDA00001851185500081
试剂萃取分离生长中单层细胞的全部RNA，并以反转录酶-聚合酶连锁反应的方法以评估特定基因表现。于反转录(reverse transcription)的过程中，通过
Figure BDA00001851185500082
III反转录酶以及12单元(mer)至18单元的寡核苷酸[oligo-d(T)]进行反转录以合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)；下列试剂被使用于反转录过程中，并利用无菌水调整最终体积至21μL：4微克(μg)RNA、10X RT缓冲液(buffer)、25毫摩尔(mM)氯化镁(MgCl2)、0.1摩尔(M)二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)以及1μL的RNA水解酶(RNase)。于聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction)的过程中，下列试剂被使用，并利用无菌水调整最终体积至50μL：6μg cDNA、2.5mM脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、25mM氯化镁、以及各基因相对检测的引子核苷酸序列。各基因相对检测的引子核苷酸序列编号如表3所示。
表3
Figure BDA00001851185500083
所示的核苷酸序列以及1μL的Taq脱氧核糖核酸聚合酶；聚合酶连锁反应条件为：(循环1次)于95℃，5min历经起始变性(initial denaturation)；(循环35次)于94℃，1min历经变性(denaturation)、于72℃，1min历经延长(extension)；(循环1次)于72℃，5min历经最后延长(final extension)；其中回温温度(annealing temperature)步骤是介于变性与延长之间，且该回温温度是依据不同基因及引子对种类而定，且回温温度为55℃至60℃。
将上述所得聚合酶连锁反应产物于质量浓度1wt％的洋菜胶水溶液进行电泳分离，并以溴化乙菲锭(ethidium bromide)染色后以FloGel-I荧光胶影像系统(fluroescent gelimage system)(购自于台湾TOP BIO公司)进行分析，其中是以甘油醛-3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内部控制(internal control)并进行标准化(normalize)。
(5)艾尔逊蓝染色(Alcian blue stain)检测蛋白多糖(proteoglycan)累积(accumulation)
将人类皮肤纤维母细胞分别培养于基础培养液以及含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液中保存7天后，以质量浓度3.7wt％的甲醛水溶液(formaldehyde)将细胞固定，再以含有质量浓度0.05wt％艾尔逊蓝以及含有0.02M盐酸胍(guanidine hydrochloric acid)的0.018M的乙酸(acetic acid)以及氚核(Triton X-100)历经3小时后，以0.018M的乙酸冲洗未与染剂结合的细胞。并可通过光谱仪(sepctrophotometer)(购自芬兰Thermo公司)于675nm下测定吸光值，并以未与染剂结合的溶液作为对照组(blank)，定量与染剂结合的数量。
(6)黑色素合成(melanin synthesis)定量分析(quantification)
将人类黑色素细胞分别培养于含有基础培养液以及含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液的96孔培养盘保存7天后，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗细胞后，倒转并轻拍细胞培养盘，并将当量为1N的1mL氢氧化钠(NaOH)加入细胞培养盘使细胞溶解(lyse)并以吸管重复吸取(pipet)，以形成细胞萃取液；于各孔分别取200μL细胞萃取液至另一96孔培养盘，并以光谱仪于675nm下测定吸光值，定量黑色素细胞。
(7)数据分析
各样品以三重复进行试验并且利用SPSS ver 12.0(购自于美国SPSS公司)进行分析。试验结果均以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，数据的统计分析采用T检定(Student’st-test)的统计方法进行差异性分析，当或然率(probability，p)＜0.05代表与对照组有统计上的显著差异。
实施例
1.活化剂促进皮肤更新生长因子活性
本实施例是利用如制备例所述的“制备皮肤更新生长因子”来评估活化剂促进皮肤更新生长因子活性的能力。
结果如图1所示，当添加活化剂牛凝血酶与氯化钙的比例越高时，可促进皮肤更新生长因子释放生长因子，其中又以25U/mL的牛凝血酶以及15wt％的氯化钙促进生长因子释放的效果最好。
2.冷冻干燥及研磨处理可维持皮肤更新生长因子活性
本实施例是利用如制备例所述的“冷冻干燥保存”，并以制备皮肤更新生长因子的活性作为0天活性，评估冷冻干燥后，不同时间点(1个月、2个月及3个月)对于皮肤更新生长因子活性的影响。
结果如图3所示，皮肤更新生长因子为溶液状态时，活性历经1个月即降为0天活性的60％；而经过冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子的活性历经1个月仍可维持如0天的活性。
本实施例更进一步将冷冻干燥处理所得的皮肤更新生长因子研磨成粒径为10微米(μm)至20μm的粉末分别进行活性测量。
如图4所示，经过冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子再经研磨后，其活性与研磨前并无显著差异，亦表示研磨处理不影响皮肤更新生长因子活性。
本实施例再进一步将冷冻干燥及研磨后的皮肤更新生长因子于低温(零下20℃)长时间(4年)的条件下，进行活性测量。
如图5所示，以新鲜制备的皮肤更新生长因子为对照组，经过冷冻干燥处理及研磨处理的皮肤更新生长因子于零下20℃保存4年与对照组相较之下，于零下20℃保存4年的皮肤更新生长因子的活性分别为对照组的94％与84％，亦表示皮肤更新生长因子历经冷冻干燥、研磨处理以及低温长时间保存并不影响活性。
3.皮肤更新生长因子促进人类皮肤纤维母细胞增殖(proliferation)
本实施例是将制备例“冷冻干燥及研磨保存”所得的皮肤更新生长因子进行制备例所述的“MTT分析法”，以评估皮肤更新生长因子促进人类皮肤纤维母细胞增殖的能力。
结果如图6A、图6B以及图6C所示，是以基础细胞培养液为对照组，含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液可促使人类皮肤纤维母细胞生长，且高于对照组将近4倍。
4.皮肤更新生长因子诱导人类皮肤纤维母细胞的胶原蛋自表现
本实施例是将制备例“冷冻干燥及研磨保存”所得的皮肤更新生长因子进行如制备例所述的“反转录酶-聚合酶连锁反应”，以评估含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液对于胶原蛋白次型(subtype)的RNA表现的影响。
结果如图7所示，以人类皮肤纤维母细胞的甘油醛-3-磷酸去氢酶作为标准化，并以基础培养液为对照组，含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，可促使胶原蛋白第一型、第三型、第四型以及第七型较对照组增加将近两倍。
5.皮肤更新生长因子促进人类皮肤纤维母细胞蛋白多糖合成
本实施例是将制备例“冷冻干燥及研磨保存”所得的皮肤更新生长因子进行如制备例所述的“艾尔逊蓝染色”，以评估基础培养液以及含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液对于促进蛋白多糖合成的影响。
如图8A及图8B所示，以基础培养液为对照组，0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，可促进蛋白多糖合成，且0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液促进蛋白多糖合成是对照组的2.5倍。
6.皮肤更新生长因子抑制人类表皮角质细胞增殖及分化(differentiation)
本实施例是将制备例“冷冻干燥及研磨保存”所得的皮肤更新生长因子进行如制备例所述的“反转录酶-聚合酶连锁反应”，以评估含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液对于人类表皮角质细胞的影响，并以基膜素V(lamininV)作为细胞移动(migration)以及细胞极化(cell polarization)的指标(marker)；角蛋白10(keratin 10)作为细胞分化的指标。
如图9A、图9B以及图9C所示，以基础培养液为对照组，0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，可抑制人类表皮角质细胞增殖。
如图10所示，以基础培养液培养作为对照组，含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，随着皮肤更新生长因子的培养液浓度增加而抑制基膜素V的表现，亦表示皮肤更新生长因子可抑制人类表皮角质细胞移动及细胞极化(cell polarization)。
如图11所示，以基础培养液为对照组，含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，随着皮肤更新生长因子的培养液浓度增加而抑制角蛋白的表现，亦表示皮肤更新生长因子可抑制人类表皮角质细胞分化。
7.皮肤更新生长因子抑制人类黑色素细胞生长
本实施例是将制备例“冷冻干燥及研磨保存”所得的皮肤更新生长因子进行如制备例所述的“反转录酶-聚合酶连锁反应”，以评估含有皮肤更新生长因子的培养液对于人类黑色素细胞的影响。
如图12A、图12B以及图12C所示，以基础培养液为对照组，含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，随着皮肤更新生长因子的培养液浓度增加而抑制人类黑色素细胞生长。
由Dong et al.，2012(Dong L et al.，FGF2 regulates melanocytes viability through theSTAT3-transactivated PAX3 transcription，Cell death and differentiation 19(4)：616-622，2012.)及Yang et al.，2008(Yang G et al.，Inhibition of PAX3by TGF-beta modulatesmelanocyte viability，Molecular cell，32(4)：554-563，2008.)可知，PAX3是促进人类黑色素细胞增殖及刺激黑色素合成的重要转录因子，且由Sogabe et al.，2006(Sogabe Y，Basicfibroblast growth factor stimulates human keratinocyte motility by Rac activation，Woundrepair and regeneration：official publication of the Wound Healing Society[and]theEuropean Tissue Repair Society 14(4)：457-462，2006.)及Uchi et al.，2000(Uchi H et al.，Cytokines and chemokines in the epidermis，Journal of dermatological science 24 Suppl1：s29-38，2000.)可知，PAX3进一步调控MITF，再通过MITF调控酪胺酸酶(tyrosine)，进而促使黑色素合成。
如图13所示，利用如制备例所述的“反转录酶-聚合酶连锁反应”，并以基础培养液为对照组，将含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，随着皮肤更新生长因子的培养液浓度增加而抑制PAX3基因表现。
如图14所示，含有0.06wt％、0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，随着皮肤更新生长因子的培养液浓度增加而抑制MITF基因表现。
如图15所示，含有0.15wt％及0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，随着皮肤更新生长因子的培养液浓度增加而抑制酪胺酸酶表现。
如图16所示，利用如制备例所述的“黑色素合成定量分析”，并以基础培养液为对照组，将含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液培养细胞历经7天后，含有0.3wt％皮肤更新生长因子的培养液可抑制黑色素分泌。
Figure IDA00001851186200011
Figure IDA00001851186200021
Figure IDA00001851186200031
Figure IDA00001851186200041
Figure IDA00001851186200051
Figure IDA00001851186200061
Figure IDA00001851186200071

Claims (10)

1.一种皮肤更新生长因子，该皮肤更新生长因子是由猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，然后经过离心以及冷冻干燥而获得该皮肤更新生长因子，其中该皮肤更新生长因子具有促进细胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
2.如权利要求1所述的皮肤更新生长因子，其中，所述活化剂为牛凝血酶以及氯化钙。
3.如权利要求2所述的皮肤更新生长因子，其中，所述牛凝血酶的浓度为20U/mL至30U/mL；所述氯化钙的质量浓度为7.5％至15％。
4.一种用于保养皮肤的保养品，其包含如权利要求1至3任一项所述的皮肤更新生长因子。
5.一种皮肤更新生长因子促进皮肤细胞再生的用途，其包含：
齐备一如权利要求1至3任一项所述的皮肤更新生长因子，其通过促使皮肤细胞的纤维母细胞数量增多、促进胶原蛋白表现、增加蛋白多糖合成以及抑制角质细胞分化以达到促进皮肤细胞再生。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述抑制角质细胞分化是指抑制基膜素V及角蛋白10的基因表现。
7.如权利要求5或6所述的用途，其中，以总重量为基础，所述皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06％至0.3％。
8.一种皮肤更新生长因子抑制黑色素分泌的用途，其包含：
齐备一如权利要求1至3任一项所述的皮肤更新生长因子，其通过抑制皮肤的黑色素细胞增殖以及抑制黑色素生成的相关基因或蛋白酶表现以达到抑制黑色素分泌。
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述黑色素生成的相关基因或蛋白酶为PAX3基因、小眼畸形相关转录因子基因以及酪胺酸酶。
10.如权利要求8或9所述的用途，其中，以总重量为基础，所述皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06％至0.3％。
CN201210229686.2A 2012-07-04 2012-07-04 皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品 Pending CN103524613A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210229686.2A CN103524613A (zh) 2012-07-04 2012-07-04 皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210229686.2A CN103524613A (zh) 2012-07-04 2012-07-04 皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103524613A true CN103524613A (zh) 2014-01-22

Family

ID=49927006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210229686.2A Pending CN103524613A (zh) 2012-07-04 2012-07-04 皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103524613A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028571A (zh) * 2018-01-12 2019-07-19 香港科技大学 血液破壁生长因子的制备方法及其应用
EP3364954A4 (en) * 2015-08-28 2019-08-07 Cellphire Inc. PRODUCTS AND METHODS OF USING A PLATELET DERIVATIVE HEMOSTATIC AGENT FOR REGULATING BLEEDING AND ENHANCING HEALING
US11529587B2 (en) 2019-05-03 2022-12-20 Cellphire, Inc. Materials and methods for producing blood products
US11701388B2 (en) 2019-08-16 2023-07-18 Cellphire, Inc. Thrombosomes as an antiplatelet agent reversal agent
US11767511B2 (en) 2018-11-30 2023-09-26 Cellphire, Inc. Platelets as delivery agents
US11903971B2 (en) 2020-02-04 2024-02-20 Cellphire, Inc. Treatment of von Willebrand disease
US11965178B2 (en) 2018-11-30 2024-04-23 Cellphire, Inc. Platelets loaded with anti-cancer agents

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101969985A (zh) * 2008-01-07 2011-02-09 国瑞生医科技股份有限公司 可凝结的血小板生长因子浓厚液及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101969985A (zh) * 2008-01-07 2011-02-09 国瑞生医科技股份有限公司 可凝结的血小板生长因子浓厚液及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NA, JUNG-IM等: "Rapid Healing and Reduced Erythema after Ablative Fractional Carbon Dioxide Laser Resurfacing Combined with the Application of Autologous Platelet-Rich Plasma", 《DERMATOLOGIC SURGERY》 *
樊明山: "富血小板血浆（PRP）与皮肤抗衰老", 《2012全国中西医结合医学美容学术交流大会论文汇编》 *
高峰: "冰冻干燥血小板创伤修复作用的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3364954A4 (en) * 2015-08-28 2019-08-07 Cellphire Inc. PRODUCTS AND METHODS OF USING A PLATELET DERIVATIVE HEMOSTATIC AGENT FOR REGULATING BLEEDING AND ENHANCING HEALING
CN110028571A (zh) * 2018-01-12 2019-07-19 香港科技大学 血液破壁生长因子的制备方法及其应用
US11767511B2 (en) 2018-11-30 2023-09-26 Cellphire, Inc. Platelets as delivery agents
US11965178B2 (en) 2018-11-30 2024-04-23 Cellphire, Inc. Platelets loaded with anti-cancer agents
US11529587B2 (en) 2019-05-03 2022-12-20 Cellphire, Inc. Materials and methods for producing blood products
US11752468B2 (en) 2019-05-03 2023-09-12 Cellphire, Inc. Materials and methods for producing blood products
US11813572B2 (en) 2019-05-03 2023-11-14 Cellphire, Inc. Materials and methods for producing blood products
US11701388B2 (en) 2019-08-16 2023-07-18 Cellphire, Inc. Thrombosomes as an antiplatelet agent reversal agent
US11903971B2 (en) 2020-02-04 2024-02-20 Cellphire, Inc. Treatment of von Willebrand disease

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103524613A (zh) 皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品
Rennert et al. Diabetes impairs the angiogenic potential of adipose-derived stem cells by selectively depleting cellular subpopulations
Wu et al. Regenerative potentials of platelet-rich plasma enhanced by collagen in retrieving pro-inflammatory cytokine-inhibited chondrogenesis
Yan-nan et al. MicroRNA-21 accelerates hepatocyte proliferation in vitro via PI3K/Akt signaling by targeting PTEN
Xian et al. Concentration-dependent effect of platelet-rich plasma on keratinocyte and fibroblast wound healing
Mazza et al. Engineering in vitro models of hepatofibrogenesis
Han et al. Exosomes derived from autologous dermal fibroblasts promote diabetic cutaneous wound healing through the Akt/β-catenin pathway
WILMINK et al. Differences in polymorphonucleocyte function and local inflammatory response between horses and ponies
Guerra et al. Progranulin is a stress-response factor in fibroblasts subjected to hypoxia and acidosis
KR102282437B1 (ko) 인간 지방 유래 줄기세포로부터 섬유아유사세포로의 분화방법
Khan et al. Interleukin-1β enhances cartilage-to-cartilage integration
US20170157296A1 (en) Macrophage or monocyte enhanced wound healing
Zocchi et al. New perspectives in regenerative medicine and surgery: the bioactive composite therapies (BACTs)
Krezdorn et al. Reduced hypoxia-related genes in porcine limbs in ex vivo hypothermic perfusion versus cold storage
FATHI et al. Expired platelet concentrate as a source of human platelet lysate for Xenogeneic-free culture of human dermal fibroblasts
KR102257386B1 (ko) 줄기세포 재료 및 그 제조방법
Mansbridge Tissue-engineered skin products
Gauthier et al. Expression of membrane type-4 matrix metalloproteinase (metalloproteinase-17) by human eosinophils
EP3192368B1 (en) Composition for preserving cells, containing, as active ingredients, plant-derived recombinant human serum albumin and plant peptides
Cristino et al. Expression of CXC chemokines and their receptors is modulated during chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells grown in three-dimensional scaffold: evidence in native cartilage
Somoza et al. TGFβ3 secretion by three‐dimensional cultures of human dental apical papilla mesenchymal stem cells
CN116492291A (zh) 一种促间充质干细胞生长水凝胶及其应用
Wu et al. The interaction between co-cultured human nucleus pulposus cells and mesenchymal stem cells in a bioactive scaffold
Gulevsky et al. The influence of low-molecular fraction from cord blood (below 5 kDa) on functional and biochemical parameters of cells in vitro
TW201400139A (zh) 皮膚更新生長因子、使用該皮膚更新生長因子進行皮膚保養之方法及包括有該皮膚更新生長因子之保養品

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140122