CN103459612A - 用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明内容涉及在丰富的序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体，例如在过量的正常核酸靶序列中检测低水平体细胞突变和少数等位基因。

Description

用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年12月3日提交的美国临时专利申请系列号61/419,639的优先权，将所述临时专利申请系列通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及在丰富的序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体，例如在过量的正常核酸靶序列中检测低水平体细胞突变和少数等位基因。

背景

有时期望在丰富的该序列变体中检测DNA序列的稀有变体或多个稀有变体。稀有变体通常是正常基因序列(其有时称为“野生型”序列)的突变。突变，尤其包括稀有突变，通常发现于癌症相关基因、低异质性频率的线粒体基因和来自小亚群的细菌或病毒的基因中。突变等位基因可在DNA序列中仅具有单个改变(例如，点突变)，并且通常它们以极低的丰度存在于含有相应非常丰富的序列的样本中。这些与疾病相关的稀有突变的检测在临床实践中对于疾病诊断和预后起着日益重要的作用。例如，结核病(tuberculosis)(TB)中的点突变可产生抗药性，这使得难以选择恰当的药物来使用以及延长治疗。体细胞突变是癌症的早期检测或对某些肿瘤药物的反应或抗性的预测的有用的生物标志物。KRAS基因的密码子12和13的突变发生在80-90%的胰腺癌和35-50%的结肠癌中。并且EGFR基因或KRAS基因中的突变与对某些肿瘤药物的反应或抗性相关。最近，美国临床肿瘤学会(ASCO)和国家综合癌症网已更新了其指导方针，建议对于患有晚期或转移性结肠癌或直肠癌的患者，将疗法(包括帕尼单抗(panitumumab)或西妥昔单抗(cetuximab))限于具有野生型KRAS的患者。此外，由于难以进入肿瘤区域，因此存在增加的从血液获得肿瘤细胞的需要。极其需要在巨大的野生型等位基因背景中检测稀有突变的灵敏测定。

已开发了许多方法来试图通过实时PCR(聚合酶链式反应)法检测体细胞DNA突变和少数等位基因。这些方法(其中有许多在Milbury,C.A.等,PCR-Based Methods for Enrichment of Minority Alleles andmutations(2009)Clin.Chem.55,第632-640页中进行了综述)包括等位基因特异性竞争阻断PCR、阻断PCR、利用锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)的实时基因分型、clamp PCR以及与实时PCR结合的限制性内切酶和与修饰聚合酶结合的等位基因特异性动态PCR。其它方法包括ARMS-PCR、TaqMAMA和FLAG-PCR。利用许多这些方法的方法需要使用修饰碱基、专门的酶或其它专利试剂(proprietary reagent)或方法。此外，大多数方法使用与某些突变序列匹配(即，完全互补)或与相应野生型序列错配的引物，意在仅扩增突变序列，以使终扩增产物都基本上仅为突变型序列。在将引物与突变点杂交的方法中，错配在扩增过程中被消除。PNA或LNA clamp PCR不依赖于突变特异性引物，但PNA或LNA寡核苷酸的生产相较于DNA寡核苷酸的生产非常昂贵。此外，为了确定阴性结果是否表示样本不包含突变体还是是否存在扩增失败，必须运行无PNA或LNA的平行样本。由于昂贵、高检测下限或两者，现有方法已被证明不太令人满意。关于现有选择性扩增测定的重大问题是因Taq DNA聚合酶所犯错误引起的假阳性的发生。减少错误率的一个方法是使用高保真聚合酶例如Pfu或高保真Taq。然而，利用此类酶的PCR扩增效率不太高，并且用于这些高保真聚合酶的PCR条件的最优化十分困难。

优先扩增突变等位基因但不需要除Taq DNA聚合酶外的酶并且提供可被测序的扩增产物的PCR扩增方法是COLD-PCR(参见Milbury等，同上)。COLD-PCR利用精确控制的PCR变性温度例如86.5℃来优先使可以是包含突变延伸产物的异源双链体(heteroduplexe)的双链体变性，并且从而优先扩增突变序列。该方法的不利方面包括对非常精确的温度控制、变性温度的实验性细调以及突变间的可变性(id)的需要。COLD-PCR也不能解决因Taq DNA聚合酶所犯错误引起的假阳性的问题。

概述

本发明的方面是用于在丰富的另一种序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体的引物依赖性扩增方法，例如利用一对扩增引物以及由常规核苷酸(DNA、RNA和DNA/RNA，仅具有常规碱基置换例如肌苷)组成的廉价的非可延伸的引物阻断发夹型寡核苷酸(阻断剂)在另外的正常序列群体中检测突变序列，特别是稀有突变体，所述一对扩增引物与稀有和丰富序列二者杂交，从而在扩增过程中不消除突变，其中阻断剂的结合位点包括所讨论的等位变异和与引物之一的结合位点重叠，所述引物称为第一引物并且在非对称方法中是限制引物(limiting primer)；其中阻断剂优选与丰富靶序列变体互补并且具有针对丰富序列变体的Tm，所述Tm比其针对稀有序列变体的Tm高至少3℃，优选至少5℃和更优选至少7℃；其中阻断剂的Tm比第一引物的Tm高至少3℃，优选至少5℃的Tm；其中阻断剂更慢地杂交，优选杂交速度为所述引物的至多1/5；并且其中扩增方法包括热循环方案，该方案包括在引物退火之前在阻断剂与丰富的变体杂交但第一引物不进行所述杂交的温度下进行的阻断剂结合步骤，和对于引物杂交足够短但对于阻断剂与稀有序列变体杂交不足够长的引物退火步骤。适当的引物依赖性指数扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)法，特别是非对称PCR法，并且更优选LATE-PCR法。

本发明的另一个方面是前述方法中的任何方法，所述方法包括检测，包括但不限于双链扩增产物、单链扩增产物或两者的均质检测。在某些实施方案中，标记引物阻断发夹型寡核苷酸以便可优选通过荧光检测检测到其与靶序列的杂交。某些优选标记的阻断剂具有3’末端淬灭剂例如Dabcyl或Black Hole淬灭剂。在此类优选的阻断剂中，一些还另外具有5’末端荧光团，即它们是分子信标探针。

本发明的另一个方面是抑制丰富野生型的扩增的引物依赖性突变体富集扩增方法，特别是非对称PCR法，该方法包括使用错配的第二引物作为另一个扩增引物(在非对称PCR法中，过剩引物)，其中首先利用第一引物进行多轮线性扩增，随后利用两种引物进行多轮指数扩增。在非对称PCR的情况下，在多轮指数扩增后进行利用第二(过量)引物进行多轮线性扩增。

本发明的另一个方面是包括使用引物阻断发夹型寡核苷酸和使用至少一种修饰引物(包括错配的第二引物和包括至少一种加尾引物(tailed primer))以减小聚合酶错误的作用的效果的方法。

本发明的其它方面包括用于进行上述方法的引物和阻断剂的寡核苷酸组以及试剂盒，所述试剂盒包括此类寡核苷酸组和扩增试剂，任选地还含有一种或多种检测试剂例如DNA结合染料和荧光标记的杂交探针。

根据本发明的方法是引物依赖性DNA扩增方法，优选为PCR法，其用于在丰富的DNA靶序列的第一变体(所述第一变体与稀有第二变体相异至少一个碱基变化)存在的情况下优先扩增该DNA靶序列的稀有第二变体，以产生富集在第二变体的扩增子中的扩增产物，所述扩增产物可被检测或测序。引物是具有或不具有5’尾的线性引物。线性引物可以是单-Tm引物，因为它们在开始时与靶互补，或它们可以是双-Tm引物，因为最初仅3’头部与靶互补。翻转尾引物(flip-tailprimer)是特殊种类的双-Tm引物，因为它们包括温度依赖性发夹结构。此类引物的设计选项是相当灵活的但包括下列以3’至5’方向所列的4个元件：1)3’线性“头部”部分，其在其中该部分结合其互补靶的初始热循环过程中用作第一引物或第二引物；2)“非互补颈”部分，其连接3’线性头部部分与引物的其余部分；3)茎-环体部分，其由自身折叠的引物的5’端组成；4)任选的5’延伸，其延伸至茎外并且可以被标记或可以不被标记。

优选的扩增方法是非对称热循环法例如非对称PCR法，所述方法利用限制引物和过剩引物，其中过剩引物与限制引物的比率为至少5:1并且其中在扩增开始时，限制引物的浓度调节的Tm(在双-Tm引物作为限制引物的情况下，3’线性部分的初始浓度调节的Tm)至少等于过剩引物的浓度调节的Tm(在双-Tm引物作为过剩引物的情况下，3’线性部分的初始浓度调节的Tm)。根据本发明的某些方法包括在扩增过程中实时地或在扩增后通过终点检测来在单个反应容器(例如，微量离心管)中进行扩增产物或第二变体扩增子的扩增和均质检测，所述方法可包括解链分析(melt analysis)或退火分析。根据本发明的方法利用将扩增靶序列的第一变体和一种或多种第二变体的一对引物，所述靶序列例如突变序列和野生型序列，如果存在于样本中的话。

在本发明的某些方法中，靶序列的第一变体的选择性排除扩增(selective discrimination against amplification)包括使用非可延伸引物阻断发夹型寡核苷酸(其在本文中有时简称为阻断剂)。引物阻断寡核苷酸具有糖-磷酸主链。其可以是DNA、RNA或DNA与RNA的组合。其可包括非天然碱基例如肌苷。通过修饰引物阻断寡核苷酸的3’末端，例如通过添加中C₃基团或通过包含荧光团或淬灭剂，使得引物阻断寡核苷酸不能被DNA聚合酶延伸。用于本发明的方法的引物阻断发夹型寡核苷酸也满足下列标准：其在靶序列上的结合位点含有经历所讨论突变的核苷酸，并且在第一靶序列变体与第二靶序列变体不同，所述第一靶序列变体与其靶结合序列完全互补，所述第二靶序列变体与其靶结合序列不完全互补；其在靶序列上的结合位点与引物之一(第一引物)的结合位点重叠至少一个核苷酸；其针对靶序列的第一变体(待被排除的变体)的Tm高至足以允许进行热循环方案中的冗长步骤(lengthy step)、阻断剂结合步骤，以便其与第一变体杂交而无引物与靶序列杂交以及无引物阻断发夹型寡核苷酸与靶序列的第二变体(待富集的变体)杂交；以及其结合靶序列的第二变体的速率显著慢于引物尤其第一引物与靶序列结合的速率，通常至多为第一引物与靶序列的结合速率的1/5。为了允许这样的阻断剂结合步骤，引物阻断发夹型寡核苷酸的Tm应当比任一引物的Tm高至少3℃，优选高至少5℃，并且引物阻断寡核苷酸针对靶序列的第一变体的Tm应当类似地比其针对第二变体的Tm高至少3℃，优选高至少5℃，并且更优选高至少7℃，以使其在冗长阻断剂结合步骤中不与第二变体杂交。在非对称方法例如LATE-PCR中，第一引物是限制引物。在线性加尾或翻转加尾引物的情况下，上述Tm/温度关系是指形成初始引物靶杂交的每一个引物的3’头部。

结果将扩增产物富集在靶序列的第二变体的扩增子中的靶序列的第一变体的选择性排除扩增还包括用于一个或多个热循环的特殊扩增方案，该方案利用引物阻断发夹型寡核苷酸的性质来选择性排除靶序列的第一变体的扩增。根据本发明的扩增方法在热循环方案中包括在解链之后和引物退火之前称为“阻断剂结合步骤”的步骤。阻断剂结合步骤处于这样的温度，该温度接近或低于引物阻断发夹型寡核苷酸针对靶序列的第一变体的Tm(该温度高于引物尤其是第一引物的Tm以及引物阻断发夹型寡核苷酸针对靶序列的第二变体的Tm)，并且具有足够的持续时间以使引物阻断发夹型寡核苷酸饱和靶序列的第一变体。(因为试剂经历热力学平衡，所以“饱和”不表示每一个第一变体链在给定的时间上与阻断剂杂交。在本说明书中，在始于10,000个拷贝的第一序列的扩增不产生SYBR信号(如图9中显示的)的实际意义上使用术语“饱和”；即，当扩增始于10,000个拷贝的在反应过程中不改变的第一变体时，未产生可检测的产物)。在阻断剂结合步骤过程中，唯一形成的杂交体是包含引物阻断发夹型寡核苷酸和靶序列的第一变体的杂交体。随后在更低的温度下进行引物退火步骤，在该温度下，引物，至少第一引物(以其整体或通过其3’线性部分，如上文中所解释的)与靶序列杂交，但该步骤的持续时间足够短以允许第一引物与靶序列杂交但防止引物阻断发夹型寡核苷酸结合靶序列的第二变体，以便使用靶序列的第二变体作为模板的第一引物的延伸不被阻断，但使用靶序列的第一变体的第一引物的延伸被阻断。取决于需要的富集程度，将阻断剂与第一序列变体杂交的额外步骤可包括在所有扩增循环中，或其可以不必包括在扩增的一个或多个热循环中。引物阻断发夹型寡核苷酸与这样的温度循环的组合使用产生相对于第一靶-序列变体的扩增子的大量富集在第二靶-序列变体的扩增子中的扩增产物。

本发明的方法可包括扩增产物的均质检测。为了该目的，将至少一种检测试剂包含在原始扩增反应混合物中。此类方法可利用DNA染料例如SYBR Green染料来检测双链扩增产物。根据本发明的方法可利用标记的探针例如荧光标记的TaqMan探针、并排FRET探针(side-by-side FRET probe)、点亮/熄灭探针(Lights-on/Lights-off probe)、分子信标探针或蝎型探针(Scorpion primer)来检测某些扩增子序列。根据本发明的方法可利用荧光标记的引物例如Amplifluor引物来检测包含整合的引物的扩增子。除了此类均质检测方法外，或作为此类方法的替代方法，根据本发明的方法还可将引物阻断发夹型寡核苷酸用作全部或部分检测工具。实施例1-3显示作为在一端上用荧光团标记并且在另一端上用Dabcyl非荧光淬灭剂标记的分子信标的引物阻断发夹型寡核苷酸的用途，其中阻断剂在与靶序列的每一个变体杂交后发出信号。或者，阻断剂可用作点亮/熄灭探针对的一个探针。实施例4-6显示了在其3’末端上利用Black Hole非荧光淬灭剂标记的发夹型寡核苷酸阻断剂(用作Off探针)与用作On探针的荧光团-淬灭剂标记的分子信标组合的用途。根据本发明的方法可使用实时检测或终点检测，包括扩增后解链(或退火)分析。

使选择性富集的变体经历在扩增过程中由DNA聚合酶产生的错误。例如，已知Taq DNA聚合酶在引物延伸过程中引入错误。报道的Taq DNA聚合酶在不同模板上的错误率从每个核苷酸2×10^-4个错误变化至1×10^-5个错误。如果，例如，在扩增开始时起始样本包含初始浓度为10,000个拷贝的靶序列的第一变体，并且如果阻断剂结合位点的长度为20个核苷酸，则Taq在第一扩增循环中将在阻断剂结合位点引入2-40个错误。此类错误通常对于测定是不利的。为了解决该问题，本发明的方法的某些实施方案利用具有低Tm的错配的第二引物和几个初始扩增循环，所述初始扩增循环利用高至足以使第二引物不杂交和延伸的引物退火温度，从而在指数扩增开始之前，靶序列的第二变体通过第一引物的延伸被线性拷贝。本发明的方法的其它实施方案利用高保真DNA聚合酶。本发明的方法的其它实施方案利用与阻断剂组合的一对具有尾的双-Tm线性引物(其可以是翻转尾引物)。对于该最后类型的实施方案，我们的策略是在PCR方案中包括一个或多个初始热循环，所述初始热循环包括阻断剂结合步骤(如下文中更全面描述的，在引物结合之前用于阻断剂结合的温度和时间)以形成包括加尾引物的产物，随后进行多个热循环，所述热循环不包括阻断剂结合步骤，但包括高至足以仅在已整合了具有5’线性或翻转尾的线性引物的所有链上进行引物退火和延伸的引物退火温度。

本发明包括包含用于进行上述方法的寡核苷酸的产物。成组的寡核苷酸包括至少引物和引物阻断发夹型寡核苷酸，并且可额外地包括杂交后发荧光的探针，所述探针可以是其中引物阻断发夹型寡核苷酸为Off探针的On探针。本发明的产品还包括扩增试剂盒，所述试剂盒，除了这样一组寡核苷酸外，还包括包含至少一种缓冲剂、DNTP和热稳定性DNA聚合酶的扩增试剂，并且可额外地包括DNA染料例如SYBR Green染料。

定义

如本文中所用，“样本”可以是待测试的任何材料，例如，生物或环境样本。生物样本可从任何生物体获得。在一个实施方案中，样本可获自哺乳动物例如人、伴侣动物或家畜，并且可以是一小块组织，包括活检组织。样本还可获自其它动物例如鸟。在一个实施方案中，来自动物的样本包括鼻咽抽吸物、血液、唾液、粪便、尿液或任何其它体液。在另一个实施方案中，环境样本可获自任何环境例如土壤、水、环境和人造结构的表面。

如本文中所用，“扩增靶序列”、“靶序列”、“DNA靶序列”和“核酸靶序列”可互换地意指DNA序列，所述DNA序列提供了通过扩增反应进行拷贝的模板并且包括第一或丰富变体与至少一个第二或稀有变体之间相异的核苷酸。在双链DNA靶序列中，引物阻断发夹型寡核苷酸所结合的链称为“第一”链，并且结合该链的引物称为“第一引物。另一条链称为“互补”链或“第二”链，并且结合该链的引物称为“第二”引物。扩增靶序列在长度上通常包括在用于其扩增的一对引物之间。任一引物或两个引物的延伸产物是扩增产物或“扩增子”。双链扩增子以及在非对称扩增的情况下单链扩增子具有由引物对界定的长度。

如本文中所用，“线性引物”意指其靶结合序列是线性的而非有结构的(例如其单链环与靶互补并且参与与靶的初始结合的发夹结构，如Tyagi等的欧洲专利号1185546中公开的)的引物。线性引物在其整体性上可以简单地是无规卷曲寡核苷酸。或者，其可额外地具有有结构的5’延伸(用以发信号)，例如蝎型引物或Amplifluor引物。其还可具有5’延伸(不与靶互补并且不用于发信号，但用于增加通过该引物的延伸产生的序列的长度的尾)。当在下一轮热循环中拷贝更长的序列时，产物与整个引物互补，并且因此引物的Tm由其在第一热循环中的Tm显著增加。这样的引物的5’尾可以是线性无结构延伸，在该情况下，引物被称为“线性尾”引物。或者，延伸本身可折叠以形成茎-环结构，所述茎-环结构作为温度的函数打开和关闭，在该情况下引物在本文中称为“翻转尾”引物。

线性DNA寡核苷酸扩增引物的设计通常借助于为此目的设计的计算机程序来实现。可使用的可获得的程序有PRIDE(Haas等，Nucl.Acids Res.26:3006-30121998)；OLIGO(Rychlik等，Nucl.Acids Res17(21):8543-511989)；OSP(Hilber等，OSP：a computer program forchoosing PCR and DNA sequencing primers.PCR Methods Appl.1(2):124–1281991)；Primo(Li等，Genomics40(3):476-851997)；以及Primer Master(Proutski等，Comput Appl Biosci12(3):253-51996)和来自DNA Software(Ann Arbor,MI)的Visual OMP(6.1.9版)。

如本文中所用，“引物依赖性”扩增意指用于指数扩增DNA靶序列的方法，方式是第一DNA引物和第二DNA引物(在本领域中通常称为正向引物和反向引物)与DNA靶序列的两条链重复杂交，并且使用靶序列链作为模板通过DNA聚合酶延伸引物。用于指数扩增的熟知方法包括聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)和滚环扩增(RCA)。某些此类引物依赖性扩增方法例如PCR法包括热循环，然而其它方法例如NASBA是等温的。众多常用的DNA聚合酶有嗜热水生菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶(Taq聚合酶)和逆转录酶。

如本文中所用，“非对称”DNA扩增意指采用以有限量或浓度使用一种引物的指数扩增方法，以便引物在扩增过程中耗尽，所述扩增通过使用剩余过剩的引物在算术上继续进行。过剩引物与限制引物的比率通常为至少5:1，通常更高，例如10:1或20:1。非对称DNA扩增，首先产生双链扩增产物，并且随后，在耗尽限制引物后，产生单链扩增引物(“扩增子”)。非对称PCR和LATE-PCR是非对称PCR法。

如本文中所用，“LATE-PCR”意指采用聚合酶链式反应(PCR)法的非对称DNA扩增，所述聚合酶链式反应法使用的一种寡核苷酸引物(“过剩引物”)的量至少为另一种引物(“限制引物”)(所述引物本身以低浓度(多至200nM)使用)的5倍，其中扩增开始时限制引物的浓度调节的解链温度至少等于扩增开始时过剩引物的浓度调节的解链温度，优选高3-10℃；以及其中在限制引物耗尽后热循环继续进行多个循环，以产生单链产物，即过剩引物的延伸产物，有时称为“过剩引物链”。在某些优选的实施方案中，扩增产物的解链温度比过剩引物的浓度调节的解链温度高不超过25℃。

解链温度或“Tm”是指一半的主题核酸材料以双链形式存在并且剩余部分是单链时所处的温度。历史上，在引物浓度和盐浓度的标准条件下，使用“%GC”法(Wetmar,J.G.(1991)“DNA Probes：Applicationsof the Principles of Nucleic Acid Hybridization,”Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:227-259)或“2(A+T)+4(G+C)”法计算引物(引物-靶双链体)、探针(探针-靶双链体)或扩增子(双链扩增产物)的Tm，所述两种方法在本领域都是熟知的。然而，在本申请中，非对称扩增方法中使用的引物、引物阻断发夹型寡核苷酸或探针的Tm意指在考虑其实际浓度的情况下在扩增开始时扩增反应混合物的实际Tm，对于LATE-PCR亦如此。LATE-PCR在测定Tm时考虑了实际的引物和探针起始浓度(Sanchez等(2004)PNAS(USA)101:1933-1938和Pierce等(2005)PNAS(USA)102：8609-8614)，其中可能通过使用“最近毗邻(nearest neighbor)”法(Santa Lucia,J.(1998)PNAS(USA)95:1460-1465)，使用公式Tm=ΔH/(ΔS+R ln(C/2))+12.5log[M]-273.15(Le Novere,N.(2001),"MELTING,Computing the Melting Temperature of NucleicAcid Duplex,"Bioinformatics17：1226-7)计算Tm。ΔH是焓并且ΔS是熵(ΔH和ΔS计算基于Allawi,H.T.和Santa Lucia,J.(1997)Biochem.36:10581-10594)，C是寡核苷酸的浓度，R是谱适气体常数，并且[M]是单价阳离子的摩尔浓度(在显示的实施例中为0.07)。根据该公式，寡核苷酸的核苷酸碱基组成(包含在项ΔH和ΔS中)、单价盐浓度和寡核苷酸的浓度(包含在项C中)影响Tm。然而，PCR缓冲液中使用的双价阳离子镁的浓度不包括在该公式中。对上述公式的最近修改包括镁浓度的调整。来自DNA Software(Ann Arbor,MI)的VisualOMP(6.1.9版)软件包括至最近邻公式的调整。

关于线性引物的Tm，使用Visual OMP软件计算浓度调节的Tm。关于最初不与靶互补的具有5’线性尾或具有5’翻转尾的线性引物的Tm，可使用Visual OMP软件来计算最初与靶结合的仅引物的3’互补部分(在本文中有时称为引物的头部)的第一浓度调节的Tm和整个引物的第二浓度调节的Tm。关于引物阻断发夹型寡核苷酸或分子信标探针(其没有一个是线性的)，可使用测量的Tm。用于本发明的方法的某些引物阻断发夹型寡核苷酸和探针以影响它们Tm数℃的方式，例如通过使荧光团与淬灭剂相互作用来进行修饰。使荧光团与淬灭剂相互作用升高平端杂交体的Tm。Marras,S.A.E.,等,(2002)NucleicAcids Research30No.21e122。关于发夹阻断剂或探针，茎上的相互作用标记对将增加茎强度，并从而降低阻断剂或探针对其靶的Tm数℃(相较于无相互作用标记的相同阻断剂或探针)。有时必需考虑与具有不同序列的链杂交的引物、引物阻断发夹型寡核苷酸或探针的Tm。在本申请中，该需要通过指定Tm，即引物、阻断剂或探针“相对于”、“针对”或“对于”特定靶序列变体或扩增子的Tm施用至的链来解决。如本文中所用，“点亮/熄灭”探针意指包含至少一个在与靶杂交后产生信号的“发信号的探针”(优选荧光-淬灭剂标记的分子信标探针)与至少一个“淬灭剂探针”的荧光标记的探针组合，所述淬灭剂探针包括淬灭部分并且与靠近发信号的探针的靶杂交，以便当仅发信号的探针杂交时，其发生荧光，但当两个探针杂交时，淬灭剂探针的淬灭剂淬灭发信号的探针的荧光。如果发信号的探针是更高Tm的探针，则逐渐降低反应混合物的温度产生退火曲线：首先发信号探针杂交，导致信号产生，随后淬灭剂探针杂交，熄灭信号。如果发信号的探针具有低于淬灭剂探针的Tm的Tm，那么在发信号的探针靠近其淬灭剂探针结合后荧光不增强，但相反地在发信号探针结合后荧光减弱，因为当发信号的探针和淬灭剂探针都结合至靶时，结合至靶的相邻发信号的探针与淬灭剂探针的荧光团/淬灭剂相互作用比位于未结合的发信号探针的相对末端上的荧光团与淬灭剂的相互作用更稳定。在某些实施方案中，将Black Hole淬灭剂用于点亮/熄灭探针。点亮/熄灭探针描述于专利申请PCT/US2010/053569中，所述专利申请通过引用整体并入本文。然而，如本领域技术人员将理解的，其它淬灭剂可升高或降低最佳的探针对靶的Tm。

附图简述

图1是显示引物阻断发夹型寡核苷酸和扩增引物与靶序列的第一变体的杂交或结合的示意图。

图2是显示具有不同长度的茎的引物阻断发夹型寡核苷酸候选物的杂交速率的图。

图3A-3C是在实施例2中描述的LATE-PCR扩增过程中的实时SYBR荧光读数，所述LATE-PCR扩增包括阻断剂B62以及无阻断剂结合步骤(图3A)、1分钟的阻断剂结合步骤(图3B)或2分钟的阻断剂结合步骤(图3C)。

图4是包括在实施例2中描述的LATE-PCR扩增后包含第一靶序列变体或第二靶序列变体的样本的解链曲线(探针荧光对温度的导数)的曲线图。

图5是一系例包括在实施例2中描述的LATE-PCR扩增后包含靶序列的第一变体和第二变体的混合物的样本的解链曲线(探针荧光对温度的导数)的曲线图。

图6是平衡时持续10秒的实施例1中描述的阻断剂B62与第一靶序列变体和第二靶序列变体的杂交的荧光对温度的曲线图。

图7是在如实施例3中描述的具有第一靶序列变体或具有几种不同的第二靶序列变体的样本扩增后，在解链过程中引物阻断发夹型寡核苷酸的荧光对温度的曲线图。

图8是显示用作Off探针的引物阻断发夹型寡核苷酸、相互作用On探针、第一引物和错配的第二引物与第一靶序列变体的杂交或结合的示意图。

图9是使用优选互补第二引物和错配的第二引物的实施例4中描述的LATE-PCR扩增过程中实时SYBR荧光的读数，其中样本包含第一靶序列变体或第二靶序列变体。

图10是包括在实施例4中描述的LATE-PCR扩增后，包含第一靶序列变体或第一靶序列变体与第二靶序列变体的混合物的样本的解链曲线(On-探针荧光对温度的导数)的曲线图。

图11-16是在使用错配的第二引物候选物与第一靶变体和第二靶变体的实施例4中描述的LATE-PCR扩增过程中的实时SYBR荧光读数。

图17-20是实施例5中描述的各种细胞系的基因组DNA在LATE-PCR扩增后的解链曲线。

图21是显示用作Off探针的引物阻断发夹型寡核苷酸、On探针以及加尾扩增引物与靶序列的第一变体的杂交或结合的示意图。

图22是在实施例6描述的LATE-PCR扩增过程中的实时SYBR荧光读数。

图23是在实施例6中描述的LATE-PCR扩增后，包含第一靶序列变体、第二靶序列变体或第一靶序列变体与第二靶序列变体的混合物的样本的解链曲线(On-探针荧光对温度的导数)的曲线图。

图24是图23中的某些数据的图示，显示了在58℃下的解链曲线值对66℃下的解链曲线值的比率。

发明详述

根据本发明的方法是引物依赖性指数DNA扩增方法(该方法包括热循环)，优选PCR法。引物对与选择的扩增靶序列杂交以便扩增丰富的靶序列的第一变体以及靶序列的第二变体(突变体或稀有等位基因)。两种引物都被设计来不与靶序列杂交，以便其在靶序列中的结合位点包括在第一变体与第二变体中是不同的核苷酸，所述核苷酸存在于引物结合位点之间。相反地，称为“第一”引物的一种引物被设计来与位于差异核苷酸上游1至20个核苷酸的靶序列杂交。优选的方法是非对称PCR法，在该情况下第一引物是限制引物。LATE-PCR法是特别优选的。

采用PCR的核酸扩增是熟知的。参见美国专利4,683,202、4,683,195和4,965,188，和通常地PCR方案(PCR PROTOCOLS)，方法和应用指导，Innis等编著，Academic Press(San Diego,CA(USA)1990)。PCR扩增反应，与其它引物依赖性DNA扩增方法一样，通常被设计为对称的，即，通过利用“匹配的”正向引物和反向引物产生双链扩增产物(扩增子)；即，它们具有尽可能接近的解链温度，并且将它们以等摩尔浓度添加至反应物。已有限地用于在PCR反应中直接产生单链DNA的非对称PCR法是“非对称PCR”。Gyllensten和Erlich，“Generation of Single-Stranded DNA by thePolymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing ofthe HLA-DQA Locus,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：7652-7656(1988)；和美国专利5,066,584。非对称PCR与对称PCR的差异在于以有限的量添加引物之一，通常为另一引物的浓度的1-20%。

最近开发的非对称PCR扩增方法称为“线性-后-指数”PCR(“Linear-After-The-Exponential”PCR)或简称“LATE-PCR”。参见Sanchez等(2004)PNAS101：1933-1938,Pierce等(2005)PNAS102：8609-8614以及公布的国际专利申请WO03/054233(2003年7月3日)，将所述国际专利申请通过引用整体并入本文。LATE-PCR考虑了在扩增开始时PCR引物的实际浓度调节的解链温度，其在这些参考资料中称为Tm_[0]。可凭经验确定(当使用非天然核苷酸时这是必需的)或计算Tm_[0]。在本发明的非对称PCR法中，限制引物的Tm_[0]至少等于过剩引物的Tm_[0]，优选高3-10℃；并且限制引物是“第一”引物。LATE-PCR还考虑PCR引物的实际浓度调节的解链温度，所述PCR引物对于最初不结合靶的具有5’尾的引物的3’线性“头部”部分具有初始Tm_[0]。因为尾随后结合延伸的靶，因此此类引物可被认为具有第二浓度调节的解链温度，在下文中称为Tm_[0’]。

均质PCR测定是不需要洗涤以除去未结合的检测试剂例如探针，从而可在不打开扩增反应容器的情况下进行的PCR测定，其在本领域也是熟知的。均质PCR测定包括实时测定(其中随着反应进行在一些或全部热循环过程中检测扩增的产物)和终点检测(其中在完成扩增反应后检测扩增的产物)。终点检测可包括其中随着反应混合物的温度被加热或冷却检测信号的解链分析。参见美国专利5,994,056、5,487,972、5,925,517和6,150,097。均质检测可以通过DNA结合染料例如SYBR染料例如SYBR Green或SYBR Gold来进行，所述染料优选结合双链DNA并且当其结合时发荧光。均质检测可以是通过其与扩增的靶序列结合导致可检测的信号的标记杂交探针来进行。用于根据本发明的方法的优选探针是在杂交后产生信号的探针，例如分子信标探针。

用于根据本发明的方法的阻断寡核苷酸是由糖主链组成的发夹型寡核苷酸，例如DAN或RNA或DNA与RNA的组合。其可包括非天然碱基例如肌苷。该类型的阻断寡核苷酸可通过常规方法廉价地合成。阻断寡核苷酸的3’端被阻断例如被加帽，以防止被DNA聚合酶延伸。其可以未被标记，或其可以被标记，优选被标记，如上文中所论述的。用于本发明的方法的阻断寡核苷酸是引物阻断性的。其在靶序列中的结合位点与第一引物的结合位点重叠至少一个核苷酸。(在下文中所示的几个实例中，阻断剂的结合位点与第一引物的结合位点重叠8个核苷酸)。因此，如果阻断剂首先与靶序列的变体杂交，那么第一引物被阻止结合和延伸。因此，用于本发明的方法的阻断剂称为“引物阻断发夹型寡核苷酸”。

为了用于本发明的方法，扩增引物是被设计来包括靶序列以便靶序列的所有变体被扩增的线性引物。不必标记引物。或者，引物之一可以通过将荧光团连接至5’端而被荧光标记，以产生扩增子链产生的信号，所述引物不与靶序列互补(蝎型引物或Amplifluor引物)。在某些实施方案中，采用未标记引物。两种引物都不具有包含在靶变体之间相异的核苷酸的结合位点。然而，一种引物(在本文中称为第一引物)被设计来具有仅在相异的核苷酸上游少数(少于20)核苷酸的靶结合位点。这样设计引物阻断发夹型寡核苷酸，以便其结合位点满足两个标准：第一，其包括靶变体之间相异的核苷酸；和第二，其在靶序列中的结合位点的3’端与第一引物的结合位点的5’端重叠至少一个核苷酸。在包括非对称PCR扩增(包括LATE-PCR扩增)的方法中，第一引物是限制引物。此外，优选产生与其扩增将被阻断的第一(丰富)靶变体互补的引物阻断发夹型寡核苷酸的靶结合序列。引物与引物阻断发夹型寡核苷酸与靶序列的关系以及引物彼此之间的关系描述于图1中。该图描述了由链2、3组成的双链靶1。待扩增的靶序列由引物4、5决定，所述引物包括该序列。待扩增的靶序列包含在靶变体之间相异的核苷酸6。第一引物4被设计来在核苷酸6稍许上游结合链2。引物阻断发夹型寡核苷酸7包括靶结合序列8和3’阻断部分9，这使得其不能被DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶延伸。在图1中描述的实施方案中，阻断剂7包括5’和3’末端区域10、11，所述区域不与靶互补，但其允许阻断剂的至少一个端是互补的。如图1中所示，阻断剂7的靶结合序列8在区域阻断剂结合位点12(其包括寡核苷酸6)中与链2互补，即其结合位点包括核苷酸6。此外，靶结合序列8的至少一个5’核苷酸和引物4的一个3’核苷酸竞争与链2的杂交；换句话说，阻断剂7的结合位点与引物4的结合位点重叠至少一个核苷酸。如图1中所示，阻断剂7与链2杂交，从而阻止第一引物4的3’末端杂交和阻止DNA聚合酶对该引物的延伸。

根据本发明的方法利用引物阻断发夹型寡核苷酸相对于靶序列的完全互补的变体(其被称为“第一”变体)的Tm与相对于其序列与阻断剂的结合位点中的至少一个核苷酸相异的任何变体(其被称为“第二”变体)的Tm之差。更重要地，根据本发明的方法利用缓慢的引物阻断发夹型寡核苷酸的杂交速率(相对于第一引物的杂交速率)，所述第一引物的杂交速率通常少于10秒。这些性质在下文中的实施例1中进行了举例说明。通过调整其环和茎的长度和GC含量设计引物阻断发夹型寡核苷酸，以具有针对第一靶序列变体的Tm，所述Tm高于其针对第二靶序列变体的Tm达到一定量足以在热循环方案中具有引物阻断发夹型寡核苷酸在其中结合第一变体但不结合第二变体的步骤。为此目的，针对第一变体的Tm超过针对第二变体的Tm至少3℃，优选至少5℃，并且更优选7℃或更高，例如8℃、9℃或10℃。此外，其针对靶序列的第一变体的Tm比任一引物的Tm高至少3℃，优选至少5℃。引物阻断发夹型寡核苷酸经设计具有比在本方法中使用的杂交温度下引物的杂交速率慢得多的与靶变体的杂交速率，优选花费为使第一引物退火所需的时间至少5倍的时间来饱和靶。例如，对于10秒的第一引物的退火步骤，阻断剂杂交速率应当足够慢，以需要1分钟来饱和靶以及任选地更长时间例如2-3分钟。甚至更长的饱和时间是不太想要的，因为它们不必要地延长扩增反应的总时间。实施例1描述了包含长度为18个核苷酸但在茎长度上相异1个核苷酸(NT)至9个NT的相同靶结合序列的引物阻断发夹型寡核苷酸候选物的分析。如表1中所示，增加茎长度降低了针对所有变体的Tm，但针对靶序列的第一变体的Tm保持比针对在阻断剂的结合位点中相异1个NT的第二变体的Tm高约10℃。然而，图2显示结合变化的速率随着茎长度的变化而显著变化。具有1个NT的茎长度的引物阻断发夹型寡核苷酸BL在60℃下在约30秒内饱和靶序列的第一变体(曲线21)。具有5个NT的茎长度的引物阻断发夹型寡核苷酸B62花费2分钟来在相同温度下饱和该变体(曲线22)。并且具有6个NT的茎长度的引物阻断发夹型寡核苷酸B71花费3分钟(曲线23)。由于阻断剂具有该特定靶结合序列，阻断剂B62和B71的茎因而被判断具有足够的长度来赋予通常用于根据本发明的方法的期望的缓慢的杂交速率。在另一方面，只有当使用极短的引物退火步骤时，短茎阻断剂BL才被判断为是可接受的。

如上所述，本发明的方法利用引物阻断发夹型寡核苷酸，所述寡核苷酸与靶缓慢杂交，但在比任一引物结合时所处的温度更高的温度下与靶序列的第一变体杂交。本发明的方法在热循环方案中包括解链后步骤，所述步骤处于阻断剂杂交与靶的第一变体杂交所处的温度下，但在该温度下引物不与靶序列杂交并且阻断剂不与靶序列的第二变体杂交，该步骤足够长以允许阻断剂饱和靶序列的第一变体。称为阻断剂结合步骤的该步骤优选包括在所有扩增循环中，但其可在一个或多个热循环中省略(在由这样的省略引起的靶序列的第一变体的扩增可被耐受的情况下)，这可通过经验来确定。本发明的方法包括阻断剂结合步骤后的短的引物退火步骤。为了允许引物退火，引物退火步骤处于比阻断剂结合步骤低的温度下。在引物退火温度下，在平衡时，较高Tm的引物阻断发夹型寡核苷酸可竞争过较低Tm的第一引物与靶序列的第二变体的结合。然而，引物是线性寡核苷酸，并且因此它们与靶序列的杂交速率比阻断剂的快得多。引物退火步骤被限定于对于引物结合靶序列是充足的但对于阻断剂明显地结合靶序列的第二变体是不充足的时间。本发明的方法将扩增产物极大地富集在第二变体的扩增子中。通过使引物阻断发夹型寡核苷酸对靶序列的变体的Tm，阻断剂对靶的结合动力学、引物的Tm以及PCR方案协同作用，可在丰富的靶序列的第一变体的背景中选择性扩增靶的序列的稀有第二变体。

在下文中的实施例2中显示了扩增方案中的阻断剂结合步骤的作用。在LATE-PCR反应中分别扩增靶序列的第一变体(与引物阻断发夹型寡核苷酸(阻断剂)B62的结合序列完全互补)和靶序列的第二变体(与阻断剂B62的结合序列的一个NT错配)，所述LATE-PCR反应包括引物阻断发夹型寡核苷酸B62(5个NT的茎)和在50℃下进行10秒的引物退火步骤。以10⁶个拷贝的靶序列开始扩增第一变体。以10³、10²、10¹和10⁰个拷贝的靶序列开始扩增第二变体。使用SYBRGreen染料实时检测双链扩增产物的产生。不利用(0分钟)60℃阻断剂结合步骤(图3A)、利用60℃/1分钟的阻断剂结合步骤(图3B)和利用60℃/2分钟的阻断剂结合步骤(图3C)进行扩增。转至图3A，甚至在无60℃阻断剂结合步骤的情况下，阻断剂抑制靶序列的所述第一变体的扩增。100万拷贝的第一变体(曲线301)导致循环阈值(C_T)为26，其比1,000个拷贝的所述第二变体(曲线302)早2C_T。100个拷贝的第二变体(曲线303)、10个拷贝(曲线304)和单个拷贝的第二变体(曲线305)分别产生C_T值为32、37和42。第二靶序列变体的扩增曲线彼此平行，并且单个拷贝可靠地上升，这表明阻断剂B62的存在不抑制第二变体的扩增。具有相同C_T的扩增可产生相同量的终扩增产物，所述扩增产物可通过探针或通过测序容易地检测。对于不具有阻断剂结合步骤的热循环方案，100万个拷贝的靶序列的第一变体可具有与4,000个拷贝的靶序列的第二变体相同的C_T。因此，测定的灵敏度可以为约4,000个拷贝的第二靶序列变体至100万个拷贝的第一靶序列变体。测定对于每250个拷贝的第一变体约1个拷贝的第二变体比率敏感，这是1:250的灵敏度。通过对图3B(1分钟的阻断剂结合步骤)应用相同的分析，灵敏度提高至1:10,000。通过对图3C(2分钟的阻断剂结合步骤)应用相同分析，灵敏度进一步提高至介于1：10,000与1:100,000之间。应指出，前述分析不能解释可被Taq DNA聚合酶引入的错误。如果当Taq DNA聚合酶拷贝靶序列的第一变体时其将错误引入引物阻断发夹型寡核苷酸的结合位点，则所得的第一靶序列的拷贝可以是靶序列的第二变体。这样的错误可产生第二变体存在的假阳性信号并且显著降低测定的灵敏度。

通过进行LATE-PCR测定来确认实施例2的测定中发夹阻断寡核苷酸的功效，所述LATE-PCR测定包括对5种不同反应混合物的2分钟的阻断剂结合步骤，所述反应混合物包含与不同量(10至100,000个拷贝)的靶序列的第一变体组合的10个拷贝的靶序列的第二变体。产生扩增后解链曲线。图5表示解链曲线。图5显示测定确实对至少1:10,000的比率敏感，因为当起始扩增反应混合物包含10个拷贝的第二靶序列变体和100,000个拷贝的第一靶序列变体时，第二变体的扩增子的43℃融熔峰是可检测的(曲线55)。再次地，Taq DNA聚合酶的错误在该分析中不能得到解释，并且这样的错误可显著不利地影响测定的灵敏度。

可结合图6考虑实施例2的实验中的引物阻断发夹型寡核苷酸的操作，该图将作为来自实施例1中描述的阻断剂杂交实验的温度的函数的选择的来自阻断剂B62的荧光团的荧光读数绘制成曲线。在图6中，曲线61是阻断剂B62结合靶序列的第一变体的平衡曲线，并且曲线62是阻断剂B62结合靶序列的第二变体的平衡曲线。如可看到的，在60℃下，存在来自第一变体(点A)的高信号但基本上没有来自第二变体(点B)的信号(等于无模板对照，曲线63)。然而，在50℃下，存在来自第一变体(点C)的高信号，但也存在来自第二变体(点D)的高信号。图6中还有其中退火仅被允许进行10秒的曲线。曲线64是10秒曲线(对于阻断剂B62与第一靶序列变体结合)，并且曲线65是10秒曲线(对于阻断剂B62与第二靶序列变体结合)。如果温度从60℃下降至50℃但在该温度下仅维持10秒，则存在来自第一变体(点D)的高信号，但也存在来自第二靶序列变体(点E，其仅比无模板对照略高一点，曲线66)的极少的信号。根据本发明的测定利用图6中的信息。如图6中所示，阻断剂B62在比其与靶序列的第二变体结合更高的温度下结合靶序列的第一变体。图6还显示在给定的温度下，仅进行短时间的(10秒)的退火导致比在平衡时(2分钟)达到的少得多的与第二靶序列变体的结合。考虑图6，如果将阻断剂结合步骤插入PCR循环，即如果解链后温度的降低不直接进行至50℃以进行引物退火，而是在60℃下停止2分钟，则靶序列的第一变体将被阻断剂B62阻断剂(点A)结合，同时第二变体都将不被结合(点B)。该结果，因为阻断剂B62针对第一变体的Tm(67℃)足够高以在60℃下结合第一变体，但阻断剂B62针对第二变体的Tm(57℃)不足够高以结合第二变体。如果，对于所结合的第一靶序列变体，将温度下降至50℃以进行引物退火，则第一靶序列将保持被阻断剂B62结合。结果是阻断剂B62将阻止第一引物结合/延伸第一变体的拷贝。如果阻断剂B62的杂交速率很快，则其可能能够在50℃/10s引物退火步骤(点D)过程中结合绝大部分拷贝的靶序列的第二变体。这不仅可抑制第一变体的扩增而且还可抑制第二变体的扩增。然而，情况并非如此。阻断剂B62具有缓慢的结合动力学，即，因其茎导致的缓慢的杂交速率。将引物退火步骤设置在10秒阻止了阻断剂B62结合靶序列的第二变体(点E)。因为引物在50℃下在10秒内退火，所以靶序列的第二变体的扩增继续进行，然而第一变体的扩增被阻断剂B62极大地抑制。

图6举例说明了利用引物阻断发夹型寡核苷酸的方法的另一个特征。如果没有信号由包括均质检测的扩增产生，那么结果可以是阴性的，即，样本仅包含第一靶序列变体，或结果因扩增反应的失败(因为一些原因例如从反应混合物中省略聚合酶)而可以是假阳性的。确定哪种可能性是事实可通过简单地重新运行无阻断-结合步骤的热循环方案在相同反应容器中使用相同测试样本来确定。在该情况下，一些第一引物将竞争过阻断剂与第一靶序列变体结合，并且真正的阴性样本将从第一靶序列变体的扩增产生荧光信号，从而显示扩增反应工作。图6显示阻断剂B62在50℃下在10秒内，甚至在竞争性第一引物不存在的情况下不饱和第一靶-序列变体，因此阻断剂在无阻断剂结合步骤的重新运行中将不阻止第一靶序列的扩增。无需运行其中省略了阻断剂的单独的对照样本。

靶序列的第一变体与靶序列的第二变体的序列之间的差异的性质对扩增产物的解链曲线具有影响。在下文中的实施例3中，测试多种不同的单NT改变。如图7中所示，对于不同的改变解链曲线是不同的。这提供了关于哪种改变存在于样本中的信息。

利用荧光团和淬灭剂标记实施例1-3中使用的引物阻断发夹型寡核苷酸，特别地阻断剂B62。它们与靶序列的杂交导致来自荧光团的荧光，如上文中所论述的和实施例1-3中所描述的。本发明的某些优选实施方案利用引物阻断发夹型寡核苷酸，所述引物阻断发夹型寡核苷酸不具有荧光团，但具有至少一种淬灭剂并且为点亮/熄灭探针对的部分，即Off探针。这样的对示意性地显示于图8中，其中803是与靶序列809的链810杂交的阻断剂的结合区，并且805是阻断剂的3’端上的非荧光淬灭剂部分。紧靠阻断剂下游与链810杂交的是On探针，其中804是探针的结合区，806是在On探针的5’端上的荧光团，并且807是在On探针的3’端上的淬灭剂。应理解阻断剂-Off探针可额外地在其5’端上具有淬灭剂，或甚至在其5’端上具有荧光团，只要能够区别所述荧光团与荧光团806。

所有选择性测定都面临来自样本的假阳性信号的问题，所述样本仅包含因聚合酶特别是Taq DNA聚合酶引入的错误而产生的靶序列的第一变体。这由当使用与其互补的靶链(两条靶序列变体的第二链)作为模板延伸第二引物时由例如Taq DNA聚合酶产生的错误引起。当然，绝大部分的此类模板链由靶序列的第一变体贡献。如果错误在拷贝这样的第一变体链的拷贝时在阻断剂结合区(即在阻断剂结合位点)中发生，这可产生等同于靶序列的第二变体的原始拷贝的突变体，所述突变体在随后的扩增循环中可不被阻断。如果这早在扩增反应中发生，那么将产生假阳性。本发明的某些实施方案利用低温、错配的第二引物(在非对称PCR中，过剩引物)与改进的扩增方案组合以消除或减少假阳性的发生。

本发明的某些测定包括使用错配的第二引物与改进的热循环方案组合以解决假阳性的问题。错配的第二引物示于图8中，其中第二引物802具有针对第二靶链811的3’末端C-C错配。改进其中排除第一靶序列变体的扩增的热循环扩增方案例如PCR方案以使用错配的第二引物。方案包括数个具有高退火温度的初始循环。在这些循环中，第一引物结合靶序列并且被延伸，但错配的第二引物不结合和延伸。因为扩增方法排除靶序列的第一变体，所以这些线性扩增循环将反应混合物富集在通过拷贝第一变体产生的链中。在线性扩增的循环后进行一个或多个具有更低退火温度的循环，优选一个循环。在该循环或这些循环过程中，两种引物结合并且被延伸。这产生了包含第二引物的链。包含第二引物的链可使用更高的退火温度来指数扩增。随后在低温循环之后进行其中退火温度回复至更高温度的循环。利用错配的第二引物和改进的热循环方案的扩增方法通常包括排除第一靶序列变体的扩增的热循环法。在某些实施方案中，采用包括如本申请中描述的引物阻断发夹型寡核苷酸的用途的测定。

使用错配的第二引物的扩增测定的实施方案描述于实施例4中。该实施方案是使用引物阻断发夹型寡核苷酸的LATE-PCR测定，所述寡核苷酸用作点亮/熄灭探针对的Off探针和短茎分子信标On探针，这已进行了论述。错配的第二引物(其在非对称PCR法中为过剩引物)具有相对于靶序列的3’末端C-C错配，如图8中描述的。热循环方案在除一个循环外的所有循环中包括60℃/2分钟的阻断剂结合步骤和50℃/10秒的引物退火步骤。为了讨论的目的，这类循环称为“常规”循环。方案始于多个常规循环，优选至少5个。实施例4的方案始于10个下常规循环，其中错配的引物不参与，靶序列的第二变体被线性拷贝，从而将反应混合物富集在第二序列变体中。随后在方案中进行1个包括在40℃下退火的循环，其中错配的过剩引物不参与。这产生了其互补拷贝优选与错配的过剩引物完全互补的扩增子。随后利用足够高的引物退火温度50℃(以使过剩引物只结合完全互补的链)进行50个循环的LATE-PCR扩增。为了进行比较，还使用完全互补的过剩引物进行扩增。

图9显示了利用改进的热循环方案的扩增的实时SYBR荧光曲线。曲线901是包含10,000个拷贝的靶序列的第一变体和完全互补的过剩引物的反应混合物。曲线902是包含10个拷贝的靶序列的第二变体和完全互补的过剩引物的反应混合物。曲线903是包含10,000个拷贝的靶序列的第一变体和错配的过剩引物的反应混合物。曲线904是包含10个拷贝的靶序列的第二变体和错配的过剩引物的反应混合物。比较曲线901与902，可看到通过使用完全互补的过剩引物，10,000个拷贝的第一靶序列变体产生与10个拷贝的第二靶序列变体产生的一样多的扩增产物–它们的C_T大致相同。然而，通过比较曲线903与904，可看到通过使用错配的过剩引物，10,000个拷贝的第一变体未产生与10个拷贝的第二变体产生的一样多的扩增产物–它们的C_T不相同。事实上，10,000个拷贝的靶序列的第一变体和错配的过剩引物(曲线903)未产生出可检测的信号。

实施例4还包括使用错配的过剩引物和改进的热循环方案的扩增，所述热循环方案利用包含第一靶序列变体与第二靶序列变体的混合物：10,000个拷贝的第一变体加1、10、100或1000个拷贝的第二变体的样本(另外的样本是无模板对照和仅10,000个拷贝的第一变体)。扩增后，从来自On探针的荧光信号获得解链曲线。如图10中所示，来自所有包含第二靶序列的样本(包括在混合物中仅包含一个拷贝的第二变体和10,000个拷贝的第一变体的样本)的曲线在约67℃下具有峰值(归因于更高温度的On探针杂交体的解链)和在约59℃下具有谷值(归因于Off探针杂交体的解链)。Sanger测序确认所有这些样本产生在引物阻断发夹型寡核苷酸结合位点的区域中具有第二靶序列变体的序列的扩增产物。仅包含10,000个拷贝的第一变体的样本既未显示峰值也未显示谷值并且落在无模板对照的曲线的顶部。图9和10显示测定可检测1个拷贝的第二变体并且测定具有1:10,000的灵敏度(10,000个拷贝的第一变体中存在1个拷贝的第二变体)而无假阳性。

决定使用具有3’C-C错配的错配的引物部分基于在本发明的实施方案的开发过程中进行的实证工作(empirical word)。已发现不同的单核苷酸改变影响结果。图11-16显示了利用包含6个不同改变的错配的过剩引物候选物的试验的结果。样本包含10,000个拷贝的第一靶序列变体或10个拷贝的第二靶序列变体。扩增利用上文中描述的改进的LATE-PCR方案。图11-16的每一个中示意性显示的是过剩引物的3’端和在靶序列的第二链中终止的相对的3个核苷酸(CTA)，突出显示了每一个错配的碱基和位置。图中显示的曲线是实时SYBR信号，其对应于图9中的曲线903和904。在某些实施方案中，优选使用错配的引物候选物，对于所述候选物，具有10个拷贝的第二靶序列变体的样本的实时曲线比具有10,000个拷贝的第一变体的样本的曲线更早上升。按照该标准，具有末端C-C错配的引物(图9)是用于该测定的最好候选物，因为具有10,000个拷贝的靶序列的第一变体的样本的曲线从未上升。同样地按照该标准，在来自引物的3’端的第三个核苷酸中具有G-A错配的引物(图16)经判断非常好。相反地，在来自引物的3’端的第三个核苷酸中具有A-A错配的引物(图15)经判断对于该特定测定是不可接受的。

在于反应混合物中不包含引导错误-预防试剂(mispriming-prevention reagent)的情况下，进行实施例中描述的测定，已显示所述试剂对于使用的靶材料即质粒DNA不是必需的。对于基因组DNA的使用，可考虑使用引导错误-预防试剂，特别是对于利用错配的过剩引物和低温退火步骤以使用其进行拷贝的测定，因为引导错误在更低的温度下倾向于具有更多的问题。引导错误预防试剂公开于美国专利号7,517,977和美国临时专利申请号61/202,565中，将所述专利和临时专利申请通过引用并入本文。引导错误预防试剂的包含当然需要其它试剂或测定中使用的热循环方案的一些调整。

实施例5描述了利用来自4个从ATCC获得的细胞系的基因组DNA进行的实验。细胞系具有Kras基因的不同等位基因。根据文献，一个细胞系–K562–具有野生型Kras基因。在目标区域中，其具有序列GGTGGC。另外3个细胞系包括一些在该区域中具有不同单碱基对改变GATGGC(细胞系PL45)、GTTGGC(细胞系CAPAN2)或GCTGGC(细胞系SW1116)的细胞。

通过经由LATE-PCR(不包含阻断剂)扩增每一个细胞系，随后利用Rice等(2007)Nature Protocols2(10)：2429-2438；和Jia等(2010)Nucl.Acids Res.38(11)：e119中描述的“Dilute-N-Go”测序法进行测序来确认序列。测序揭示细胞系K562确实是具有GGT等位基因的纯合野生型；并且另外3个细胞系PL45、CAPAN2和SW1116分别包含GGT等位基因与突变等位基因GAT、GTT和GCT的混合物。

当使用阻断剂时，研究由Taq DNA聚合酶引入的错误。为此目的，使用阻断剂、2分钟的阻断剂结合步骤扩增包含野生型序列(SEQID NO：12)的质粒DNA和使用SYBR Green检测双链扩增产物。平行地进行一系列扩增。样本中SYBR Green信号的出现表示该质粒DNA包含痕量水平的在阻断剂结合序列中具有突变的DNA或存在Taq错误–在(未阻断的)过剩引物的延伸过程中野生型序列的自发突变。对产生阳性SYBR信号的15个样本进行测序。注意两件事。第一，一些突变发生在其中已发现天然存在的突变的GGTGGC区域外部。第二，绝大部分(超过80%)突变是A核苷酸的不正确插入，并且已知Taq DNA聚合酶在延伸结束时插入A。基于所述证据，得出错误应当被认为是Taq错误，当始于基因组DNA时这也是可预期的并且需要加以考虑。在本实施例中在混合物的测定中，阻断剂具有与待阻断的野生型序列互补的18个核苷酸。在那些核苷酸中，8个与限制引物重叠。如果Taq依赖性错误发生在限制引物所结合的序列内，则限制引物将不能结合，并且扩增将停止。然而，如果错误落在存在于阻断剂结合序列之内但在限制引物-结合序列之外的10个核苷酸内，则阻断剂将不结合但限制引物将结合，因此扩增将继续进行。如先前所指出的，已报道Taq DNA聚合酶的错误率高达每个碱基约1x10^-4个错误(参见，例如，Eckert,K.A.和Kunkel,T.A.(1991)PCRMethods增刊1；Tindall,K.R和Kunkel,T.A.(1988)Biochemistry27：6008-6013)。因此，对于10,000个拷贝的野生型DNA，在长度为10个碱基的序列中可存在多达10个错误。由于不存在减少聚合酶错误率的步骤，谨慎地预期0.1%的突变归因于Taq-引起的错误。因此，指示每10,000个拷贝的野生型基因组10个或更少个拷贝的突变的测定结果不能保守地被评定为真实突变，因为突变可以是真实的(即，存在于起始扩增反应混合物中)或通过聚合酶错误引入的。

为了提高测定的灵敏度，可采用一个或多个减少Taq DNA聚合酶错误的影响的步骤。一个这样的步骤是对于如实施例4中描述的改进的热循环方案使用错配的过剩引物。如所描述的，该额外的步骤使测定的灵敏度增强至10倍。这可通过以10个热循环开始扩增过程来实现，在所述热循环中使阻断剂结合所有野生型模板链并且使限制引物结合所有可获得的突变模板链并且在其上进行延伸，而不将温度降低至足以结合错配的过剩引物。在该测定中，所有10倍扩增的限制引物链在可能通过Taq错误在过剩引物链中引入人工突变之前可具有真实突变(bono fide mutation)。灵敏度的该10倍增加表示当每10,000(0.01%)个模板链存在1个或少于1个突变链时才需要“非决定性的”评分。

此外，由于本领域技术人员将理解可被采用来增加特异性的另一个步骤，并且因此，测定的灵敏度将利用具有比常规Taq聚合酶更高的固有保真度的热稳定DNA聚合酶。几种这样的高保真度酶是商购可得的，包括高保真度Platinium Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Phusion高保真度DNA聚合酶等。在实施例5的对于混合物的测定中，使用Platinum Taq DNA聚合酶。由于每一种这样的酶具有其自己的最佳缓冲液，因此可能必需调整阻断剂和/或引物的设计以便每一种保持其最佳解链温度。

如实施例5中所报道的，使用两者都与所有等位基因完全互补的限制引物和过剩引物通过LATE-PCR扩增来自4个细胞系的基因组DNA。为了产生信号，使用点亮探针分子信标发夹探针，所述探针具有2个核苷酸长的茎，在一端上用荧光团Quasar670(Quas670)标记并且在另一端用Black Hole淬灭剂2(BHQ2)标记；以及使用组合发夹阻断剂和熄灭探针(发夹型寡核苷酸)，所述探针具有5个核苷酸长的茎，在一端用Black Hole淬灭剂2(BHQ2)标记。阻断剂/Off探针描述于实施例4中，阻断剂/Off探针与具有野生型GGT等位基因的DNA序列完全互补，并且其用于阻断包含该等位基因的基因组DNA的扩增。通过使用包含10,000个拷贝的来自细胞系K562的野生型DNA(作为丰富的靶序列的第一变体)和不同量(10至1000个拷贝)的含突变体细胞系PL45、CAPAN2和SW1116的每一种(以有助于稀有第二变体)的起始混合物，确定根据本发明的测定在纯化的基因组DNA中具有0.5%或更好的检测灵敏度。此外，鉴于图18-20中利用不同(GAT、GTT、GCT)突变体获得的解链曲线的完整性，据信存在的突变体的身份可由样本的荧光特征来确定。

具有5’线性尾的引物或具有5’翻转尾的引物的利用使得能够产生另一个策略，所述策略用于减少扩增包含因DNA聚合酶错误而产生的变体序列而非存在于原始样本中的变体的产物的机会。具有5’线性尾或5’翻转尾的引物具有3’线性头部分，所述3’线性头部分最初如针对第一引物和第二引物所描述的起作用。第二引物(在LATE-PCR中为过剩引物)的3’线性头部可与靶序列完全互补，或其可以如实施例4中所述被错配。一旦一对具有5’线性尾或5’翻转尾或一个5’线性尾与一个5’翻转尾的引物已被整合进入双链靶，所述双链靶的长度就增加，并且每一条链包含与引物的尾互补的序列。因此，一旦这些引物被整合，每一种引物的Tm_[0]变成Tm_[0’]。每一种引物的Tm_[0’]必定高于相应的Tm_[0]并且可实际上高于阻断剂针对其靶链的Tm。因此，一旦加尾引物已被整合进入双链模板，扩增可在不包括阻断剂的情况下继续进行，在该情况下阻断剂不再用于选择靶变体的扩增，无论它们一开始就存在还是可通过聚合酶错误的整合产生。

具有5’线性尾的引物的设计选项非常灵活，但必须满足下列标准：1)具有5’线性尾的引物的3’线性头部分必须与靶链互补并且必须满足上文中针对第一引物(包括第一限制引物)或第二引物(包括过剩引物)所描述的标准；2)具有5’线性尾的引物的5’线性部分必须包括不超过2个，优选不超过1个互补核苷酸对(彼此互补、与其3’线性部分互补或与存在于3’线性部分的靶-结合序列的3’的序列互补)。此外，用作第一引物的具有5’线性尾的引物(其可以是限制引物(L))的浓度依赖性Tm_[0’]必须等于或高于用作第二引物的具有5’线性尾的引物(其可以是过剩引物(X))的浓度依赖性Tm_[0’]。换句话说，(Tm^L _[0’]-Tm^X _[0’])≥0。在一些情况下，可优选地利用其中第一引物的Tm^L _[0’]比阻断剂与野生型靶序列杂交时的解链温度高的5’加尾引物。一对具有满足上述标准的5’线性尾的引物的实例示于实施例6中。然而，实施例6中显示的引物对不一定是实施例6中利用的靶的最佳可能的引物对。

如先前提出的，5’翻转尾引物是一个特殊种类的5’加尾引物，因为它们包括温度依赖性发夹结构。此类引物的设计选项相当灵活，但包括下列以3’至5’方向所列的4个元件：1)在其中其结合其互补靶的初始热循环过程中用作第一引物或第二引物的3’线性“头”部分；2)连接3’线性部分与引物的其余部分的“非互补颈”；3)由茎-环部分(由自身折叠的序列组成)组成的“体”部分；4)可以延伸或可以不延伸超过茎和可以被标记或可以不被标记的引物的5’端。具有5’翻转尾的引物的3’线性头部分必须与靶链互补并且必须满足上文中针对第一引物或第二引物(包括第一限制引物或第二过剩引物)所描述的标准。5’翻转尾引物的“颈”必须由不与靶互补并且用作引物的3’线性头部与存在于颈的5’的体部分之间的“颈”的0-10个额外的核苷酸组成。组成体部分的核苷酸必须形成在Tm_[0]闭合但在Tm_[0’]下打开的温度依赖性茎-环结构。茎-环结构通常包含为4-6个碱基对长的茎和超过3个核苷酸长的环。此外，用作第一引物的具有5’翻转尾的引物的终浓度依赖性解链温度(Tm_[0’]或，当其是第一限制引物时，Tm^L _[0’])必须等于或高于用作第二引物的具有5’翻转尾的引物的终浓度依赖性解链温度(Tm_[0’]或，当其是第二过剩引物时，Tm^X _[0’])。换句话说，(Tm^L _[0’]-Tm^X _[0’])≥0。在一些情况下，可以优选利用其中第一引物的Tm^L _[0’]高于阻断剂与野生型靶序列杂交时的解链温度的5’加尾引物。

实施例6中给出了利用一对满足上述标准的具有5’尾的引物的LATE-PCR扩增方案的实例。在实施例6的方案中，仅在第一少数循环(在该情况下2个扩增循环)中包括阻断剂结合步骤，其中产生与整个引物互补的扩增子。此后，在高温下进行循环(不使用阻断剂结合步骤)以便仅与整个引物互补的靶参与。通过使用这样的利用加尾限制引物和加尾过剩引物的扩增方案，Taq聚合酶错误不影响选择性扩增，并且未获得假阳性结果。稀有突变检测灵敏度达到0.1%。如可被理解的，过剩引物在合成限制引物链上的延伸产生Taq错误在阻断剂结合序列中上升的可能性。因此，在实施例6中，测试始于一个热循环的方案，在所述热循环中，在结合第一(限制)引物之前基于其Tm^L _[0]利用阻断剂结合步骤，并且从不将温度降低至足以使第二(过剩)引物结合其模板链，随后仅进行一个其中利用阻断剂结合步骤的热循环，并且随后基于Tm^X _[0]将温度降低至足以使第二引物结合其模板链，随后进行多个热循环，在所述热循环过程中基于Tm^L _[0’]和Tm^X _[0’]，仅将温度降低至刚好足以使第一引物和第二引物结合它们各自的模板并且在其上延伸，同时阻断剂保持不结合，因为所述温度高于阻断剂与第一变体的靶链的Tm。

实施例6中或前述实施例中的引物不一定是用于相对于各个实施例中使用的第一变体偏向选择第二变体的最佳的可能的引物对。因为本领域技术人员将理解，引物设计通常必须通过实验进行最优化。用于最优化的基础也示于实施例6中。其包括单独或混合地使用几个稀释度的野生型靶序列(丰富的靶序列的第一变体)和一种或多种变体序列(稀有的靶序列第二变体)，以及阻断剂、待测试的引物序列加上使从靶产生的双链和单链产物的动力学和量可视的染料例如SYBR Green或荧光杂交探针。具体地，对于每一对引物(5’线性引物，5’翻转尾引物，或由一个5’线性和一个5’翻转尾引物组成的对)，有用地测量当在阻断剂存在的情况下扩增每一个靶时相较于在阻断剂不存在的情况下扩增产生的扩增抑制的程度，如通过循环阈值的增加(△C_T)所指示的。在不结合阻断剂的靶变体的情况下，△C_T应当非常小，优选不超过3个循环，更优选不超过1个循环。在确实结合阻断剂的野生型靶的情况下，△C_T应当尽可能大，优选至少5个循环，更优选至少10个循环。此外，野生型与变体靶序列的混合物可用于最优化成对的具有5’尾的引物。通过最优化加尾引物对，可在具有1/100，优选1/1000，更优选1/10,000和最优选1/100,000或甚至1/1,000,000的第二靶变体与第一靶比率的混合物中检测出变体靶。

此外，此处描述的一般方法是非常灵活的。不仅引物而且实施例6和其它实施例中所利用的热廊线(thermal profile)对于相对于第一变体偏向于第二变体的选择性扩增必须是最佳的。例如，此处描述的系统允许利用不具有尾的线性引物和其Tm高于第一引物的Tm的发夹阻断剂的方法(如实施例1-5中描述的)与方案组合，在所述方案中将阻断剂结合步骤用于前几个，优选不超过10个，并且最优选仅2个热循环，如实施例6中所描述的，随后进行一个至10个热循环，其中通过快速降低温度以使两种引物与它们各自的靶链杂交而不留时间给阻断剂杂交来避开(不使用)发夹阻断剂，随后进行少数，优选一个或两个循环，其中再次采用阻断剂结合步骤使发夹阻断剂与其积累的第一变体的靶链杂交，随后进行多个循环，其中通过快速降低温度以结合两种引物来再次避开阻断剂。

上述设计的方案将在反应中两次相较于第一变体有利于第二变体的选择性扩增。第一次，相对于第一变体偏向选择第二变体而无产生由Taq错误引起的新型变体的可能性。相对于第一变体偏向选择第二变体的第二次，阻断剂还将选择因阻断剂的结合其第一变体模板的区域中的Taq错误而已积累的的任何新型变体。然而，此类反应产生的新型变体的绝对数目相对于存在于原始样本中的任何原始第二变体的已积累的拷贝是非常低的。在循环中，那些新型变体的之后进一步积累将远远滞后于第二变体的扩增。事实上，当第一(限制)引物被第一变体、第二变体或两者的指数扩增用完时，新型变体的另外的指数扩增将停止，并且通过仅第二(过剩)引物的延伸进行的线性扩增将开始。在反应结束时通过荧光探针的结合产生的信号将只反映第二变体在原始样本中的存在，因为它们积累的数目将为积累的新型链的数目许多倍。

实施例

实施例1.具有不同茎长度的发夹阻断剂的结合动力学

分子信标探针具有茎-环结构，提供了发夹茎杂交体与探针-靶杂交体的形成之间的竞争。该竞争用于增加探针特异性，包括排除单碱基差异(单核苷酸改变)。然而常规线性(或无规卷曲)探针具有针对完全互补的靶序列的变体的Tm，其比针对具有单碱基改变的变体的Tm高几度，分子信标发夹探针具有更大的差异，通常7-10℃。参见，例如，Marras,S.A.E.等(1999),Genetic Analysis:Biomolecular Engineering14：151-156。在本实施例中，证明了对于给定的环序列，此类靶变体之间的Tm的差异在1-9个核苷酸的茎长度上保持相对恒定，在更长的长度上适当增加，但杂交的动力学随着茎长度的改变而改变，更长的茎具有显著减小的杂交速率。

通过使用具有18个核苷酸长的相同靶结合序列的引物阻断发夹型寡核苷酸候选物，针对与靶结合序列完全互补的靶变体和相异单个核苷酸的靶变体测试1-9个核苷酸的几个不同茎长度。用荧光团、CalOrange560在其5’末端以及用非荧光淬灭剂，Dabcyl在其3’末端标记每一个发夹阻断剂候选物。阻断剂候选物和靶变体的序列示于下文中。对于阻断剂，与靶序列的完全互补变体互补的18个核苷酸以下划线标示，并且茎形成末端核苷酸以粗体标示。应指出，两个核苷酸对于茎和靶结合序列是共同的。对于靶变体，变体中相异的核苷酸以下划线和粗体标示。

引物阻断发夹型寡核苷酸(阻断剂)

阻断剂BL:5'CalOrg560-GCCTACGCCACCAGCTCC-Dabcyl3’(SEQ ID NO.1)

阻断剂B62:5'CalOrg560-CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-Dabcyl3’

           (SEQ ID NO.2)

阻断剂B71:5'CalOrg560-GCGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCGC-

           Dabcyl3’(SEQ ID NO.3)

阻断剂B77:5’CalOrg560-CGCGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCGCG-

           Dabcyl3’(SEQ ID NO.4)

阻断剂BH2:5’CalOrg560-CCGCGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCGCGG-

            Dalcyl3'(SEQ ID NO.5)

阻断剂BB6:5’CalOrg560-GCCGCGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCGC

            GGC-DabCyl3’(SEQ ID NO.6)

DNA靶序列变体

第一变体(优选与阻断剂候选物互补)：

5'GTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGT3'(SEQ TD NO.7)

第二变体(单核苷酸匹配对阻断剂候选物)：

5'GTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGT3'(SEQ ID NO.8)

通过探针-靶解链和退火分析阻断剂的结合动力学和热力学。25微升(μl)反应混合物包含具有3毫摩尔(mM)Mg⁺⁺的1×PCR缓冲液+100纳摩尔(nM)的阻断剂候选物之一和250nM的靶序列变体之一。也运行无靶反应混合物。将反应混合物置于热循环仪中，并经历下列热循环规范：首先，95℃下进行10秒，60℃下进行30分钟，每5秒进行一次荧光检测；随后在30℃下进行20分钟，随后进行解链(以每30秒1℃的阶梯(step)进行至95℃)，在每一步骤结束时进行荧光检测。

阻断剂针对每一种变体的Tm从解链曲线(荧光对温度的一阶导)获得。结果示于表1中。

表1

虽然平衡的等位基因特异性窗口(allele-specific window)(△Tm)随茎的长度改变相对小，但结合动力学显著改变。结合动力学通过在从95℃退火后在60℃下每5秒进行荧光读数来监测。图2显示了阻断剂BL、B62和B71(其全都在60℃下与完全互补的靶变体结合)的随时间的Cal Orange荧光团的荧光强度。如从图2可见，结合动力学取决于茎的长度。阻断剂BL(长度为1个核苷酸(NT)的茎)花费约30秒来完全结合靶变体(曲线21)。然而，对于5个碱基对(bp)的茎，即长度为5个核苷酸(NT)的茎，阻断剂B62花费约2分钟来完全结合相同的靶变体(曲线22)，并且具有6-bp茎的阻断剂B71花费约3分钟来完全结合相同的靶变体(曲线23)。在60℃下，阻断剂BL结合错配靶变体，但其它阻断剂都不结合(数据未显示)。

监测B62对靶序列的第一变体(完全互补的)和靶序列的第二变体的结合动力学。在第一方案中，将阻断剂和靶在30℃保持10分钟来确保达到平衡状态，随后通过每30秒1℃的增加使样本解链，直至95℃。在每一个温度下获得来自Cal Orange荧光团的荧光。以一式二份运行样本，包括无模板对照(NTC)。图6显示作为解链过程中温度的函数的荧光读数。曲线61是第一靶序列变体，其中点A是60℃下的荧光，并且点C是50℃下的荧光。曲线62是第二靶序列变体，其中点B是60℃下的荧光，并且点D是50℃下的荧光。曲线63是NTC。在第二方案中，将样本在95℃下保持3分钟以使靶与阻断剂完全解链，随后以10℃的阶梯(每一阶梯持续仅10秒)将样本退火，降至30℃。曲线64是第一靶序列变体。曲线65是第二靶序列变体，其中点E是从60℃下降后在50℃进行10秒的荧光。曲线66是NTC。

实施例2.引物阻断发夹型寡核苷酸在选择性扩增稀有突变等位基因DNA靶序列变体中的功效

测试引物阻断发夹型寡核苷酸B62(参见实施例1)的阻断第一(完全互补的)靶序列变体的扩增，但允许使用改进的PCR热循环规范扩增在阻断剂结合位点中包含单个核苷酸错配的第二靶序列变体的能力。靶序列变体包括与实施例1中使用的靶序列变体相同的阻断剂结合位点。为了探测和分析，使第二靶序列变体具有在引物与阻断剂的结合区域外的第二核苷酸差异，以便与第一靶序列变体互补的等位基因-识别分子信标探针可质询和区分扩增产物。在该情况下，探针是在其5’端用Black Hole淬灭剂2(BHQ2)标记并且在其3’端用荧光团(Quasar670)标记的短茎耐受错配分子信标探针。该探针以55℃的Tm与完全互补的第一靶序列变体杂交以及以43℃的Tm与不完全互补的第二靶序列变体杂交。

使用与两种靶序列变体都完全互补的限制引物和过剩引物进行LATE-PCR扩增。在扩增开始时限制引物的浓度调节的Tm是54℃，并且过剩引物的浓度调节的Tm是52℃。如实施例1的表1中所示，阻断剂B62针对第一靶序列变体的Tm是67℃，并且阻断剂B62针对第二靶序列变体的Tm是57℃。阻断剂B62的杂交速率示于图2中。阻断剂B62的结合位点与限制引物的结合位点重叠8个NT。在阻断剂结合位点上相异的核苷酸是限制引物的3’末端下游的3个NT。靶是质粒DNA(Epoch Biolabs,Inc,Sugar Land,TX)。寡核苷酸的序列示于下文中。对于阻断剂，与完全互补的靶序列的第一变体互补的18个核苷酸以下划线标示，并且茎形成末端核苷酸以粗体标示。对于靶序列变体，给出一条链的序列，即，限制引物和引物阻断发夹型寡核苷酸与之互补的链。在靶序列中，在阻断剂结合位点中相异的核苷酸以下划线标示，并且在分子信标探针结合位点中相异的核苷酸以粗体标示。

`断剂B62:5'Cal Org560-CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-Dabcyl3'

            (SEQ ID NO.2)

限制引物:5'ACTCTTGCCTACGC3'(SEQ ID NO).9)

过剩引物:5'GTGGAGTATTTGATAG3'(SEQ ID NO.10)

分子信标探针:5'BHQ2-CAAGAACATGTCACACATAATG-Quas6703'

            (SEQ lD NO.11)

靶序列的第一变体：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3'(SEQ ID NO.12)

靶序列的第二变体：

5'CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTCACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC1T

GTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGC3'(SEQ ID NO.1.3)

使用25 μl反应混合物进行LATE-PCR扩增，所述混合物包含1XPCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3 mM MgCl₂、200 nM dNTP、0.24X SYBR Green(Invitrogen, Carlsbad, CA)、50 nM限制引物、1000nM过剩引物、500 nM阻断剂B62、200 nM分子信标探针、1个单位的Platinium Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)和不同浓度的质粒DNA靶变体之一(提供在10⁰至10⁶的范围内的起始拷贝数，通过系列稀释获得的)。以一式二份进行扩增反应。

测试这些反应的3个热循环规模条件。规范是：在95℃下进行3分钟，随后进行55个循环：95℃下进行10秒，60℃下进行0分钟、1分钟或2分钟，50℃下进行10秒，72℃下进行30秒。扩增后，将反应混合物加热至30℃持续10分钟，随后以1℃的增量的阶梯以30秒的间隔进行解链，直至90℃。在所有PCR循环的引物延伸部分过程中实时检测SYBR Green信号。在解链过程中检测来自分子信标探针的Quasar 670信号。

SYBR Green的实时荧光读数示于图3A-3C中。图3A显示包含10⁶个拷贝的靶序列的第一变体：(曲线301)、10³个拷贝的第二变体(曲线302)、10²个拷贝的第二变体(曲线303)、10¹个拷贝的第二变体(曲线304)和10⁰个拷贝的第二变体(曲线305)的反应混合物的荧光对不具有(0分钟)60℃的步骤的扩增的循环数的曲线。图3B显示包含10⁶个拷贝的靶序列的第一变体：(曲线306)、10³个拷贝的第二变体(曲线307)、10²个拷贝的第二变体(曲线308)、10¹个拷贝的第二变体(曲线309)和10⁰个拷贝的第二变体(曲线310)的反应混合物的荧光对具有1分钟60℃的步骤的扩增的循环数的曲线。图3C显示包含10⁶个拷贝的靶序列的第一变体：(曲线311)、10³个拷贝的第二变体(曲线312)、10²个拷贝的第二变体(曲线313)、10¹个拷贝的第二变体(曲线314)和10⁰个拷贝的第二变体(曲线315)的反应混合物的荧光对具有2分钟60℃的步骤的扩增的循环数的曲线。

通过分子信标来监测扩增的特异性，所述探针具有55℃的针对靶序列的第一变体的Tm和43℃的针对第二变体的Tm。来自100万个拷贝的第一靶序列变体的所有产物在55℃提供了解链峰值并且来自第二靶序列变体的所有产物在43℃提供了解链峰值，从而确认了扩增反应的特异性。图4显示在包括2分钟的60℃步骤的热循环规范后产物的解链曲线(荧光对温度的导数曲线)。曲线41是包含100万个初始拷贝的第一靶序列变体的样本。曲线42是包含1000个初始拷贝的第二靶序列变体的样本。曲线43是包含100个初始拷贝的第二变体的样本。曲线44是包含10个拷贝的第二变体的样本。曲线45是包含1个拷贝的第二变体的样本。要指出的是，一式两份具有初始单拷贝的第二靶序列变体的反应混合物之一不产生任何解链峰值。该事实归因于这样的事实：对于至单拷贝水平的稀释，不能期望所有样本具有DNA，并且可预期一些样本具有超过一个拷贝。

用包含靶序列的第一变体和靶序列的第二变体的反应混合物测试使用引物阻断发夹型寡核苷酸B62和在60℃下进行2分钟的循环步骤的LATE-PCR扩增的针对靶序列的所述第一变体的选择性。除反应混合物包含与不同量(10个拷贝至100,000个拷贝)的第一变体组合的10个拷贝的所述第二变体外，反应混合物是如上文中所描述的。热循环如上所述，具有60℃/2分钟的步骤。图5显示10个拷贝的第一变体(曲线51)、100个拷贝的第一变体(曲线52)、1,000个拷贝的第一变体(曲线53)、10,000个拷贝的第一变体(曲线54)和100,000个拷贝的第一变体(曲线55)的解链曲线(分子信标Quasar670荧光团的荧光对温度的导数)。那些混合物提供1:1至1:10,000的第二靶变体对第一靶变体的比率。对于1:1的比率和1:10的比率，只观察到所述第二变体的解链峰值。对于1:100的比率，所述第一靶的峰值正好开始显示上升。在1:1,000的比率上其开始变得更强，并且第二变体的峰值减小。在1:10,000的比率上，第一变体的峰值仍然很强，并且第二变体的峰值较低，尽管仍然可识别。利用这样的长循环规范进一步增加所述第一变体的浓度导致产物演变并且未观察到解链峰值(数据未显示)。

虽然上述数据似乎显示引物阻断发夹型寡核苷酸的使用能够在10,000个拷贝的第一序列变体存在的情况下检测1个拷贝的第二序列变体，但这样的结论是不确定的，因为其未考虑第二引物在其模板链上延伸的过程中可能的Taq聚合酶错误。这样改变的链不能在随后的热循环中结合引物阻断发夹型寡核苷酸。

实施例3.阻断剂结合位点中不同NT改变的作用

本实施例使用引物阻断发夹型寡核苷酸B62、与实施例2中使用的相同的限制和过剩引物以及相同的第一靶序列变体。其还将除对于分子信标探针其不具有额外的核苷酸改变外，与实施例2中使用的第二变体相同的序列用作第二靶序列变体。本实施例还使用几个额外的与第一变体相异阻断剂结合位点中的单个NT的第二靶序列。为了清楚起见，几个第二靶序列(其扩增期望得到增强)在此处称为靶序列变体2-7。本实施例使用来自阻断剂B62的荧光信号用于检测。本实施例中使用的寡核苷酸的序列示于下文中。对于阻断剂，与靶序列的完全互补的第一变体互补的18个核苷酸以下划线标示，并且茎形成末端核苷酸以粗体标示。对于靶序列变体，给出一个链序列，即，限制引物和引物阻断发夹型寡核苷酸与之互补的链。在靶序列中，在阻断剂结合位点中与第一变体相异的核苷酸以下划线标示。

阻断剂B62:5'Cal Org560-CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-Dabcyl3'

            (SEQ ID NO.2)

限制引物：5'ACTCTTGCCTACGC3'（SEQ ID NO.9)

过剩引物：5'GTGGGAGTATTTGATAG3'(SEQ ID NO.10）

第一靶序列变体：

5'CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3'(SEQ ID NO.12)

靶序列变体2：

5'CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGC3'(SEQ ID NO.14)

靶序列变体3：

5'CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

CTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGC3'(SEQ ID NO.15)

靶序列变体4：

5'CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGATGC3(SEQ ID NO.16)

靶序列变体5：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTAGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.17)

靶序列变体6：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTAtAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTTGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.18)

靶序列变体7：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTCGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3'(SEQ ID NO.19)

在25μl体积(由1X PCR缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3mMMgCl₂、200nM dNTP、50nM限制引物、1000nM过剩引物、0.24XSYBR Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)、500nM阻断剂B62、1个单位的Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)+10个拷贝的第一靶序列变体或10个拷贝的靶序列的第二变体之一(靶序列变体2至靶序列变体7)组成)中进行LATE-PCR扩增。这些反应的热规范条件如下：在95℃下进行3分钟，随后进行55个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟、50℃/10秒、72℃/20秒，随后在30℃进行10分钟浸泡，随后在30℃下以30秒的间隔使用1℃的增量开始解链，直至90℃。通过来自阻断剂的Cal Orange560信号监测解链曲线，所述阻断剂在杂交后发出信号。以一式二份运行样本。

将原始解链数据(荧光对温度)自我标准化至70℃(此时预期阻断剂不结合在任何靶上)和45℃(此时阻断剂应当结合在每一个靶序列变体上)。将遍及每一个样本的解链曲线的数据减去70℃下的数据以将70℃下的数据标准化至0。随后将每一个样本的在所有温度下的经减去的数据除以45℃下的经减去的数据以将45℃下的数据标准化至1。

图7显示每一个样本的标准化数据。线71是第一靶序列变体的标准化数据。线72是靶序列变体2的标准化数据，其在阻断剂结合位点下具有GGT至GAT的单NT改变。线73是靶序列变体3的标准化数据，其具有GGT至GTT的单NT改变。线74是靶序列变体4的标准化数据，其具有GGT至GCT的单NT改变。线75是靶序列变体5的标准化数据，其具有GGT至AGT的单NT改变。线76是靶序列变体6的标准化数据，其具有GGT至TGT的单NT改变。线77是靶序列变体7的标准化数据，其具有GGT至CGT的单NT改变。

如图7中所示，靶序列的第一变体的扩增(线71)完全被阻断剂抑制。其解链曲线与无模板对照的样本(未显示)遵照相同的规范。每一个靶序列的第二变体的一式二份彼此完全吻合。不同的NT改变产生不同的解链曲线。

实施例4.具有作为点亮/熄灭探针对的部分的发夹阻断剂的错配的第二引物

在本实施例中，将错配的第二引物(对于非对称PCR，过剩引物)的用途与完全匹配的第二引物的用途相比较。改进扩增方案以利用低至足以使该引物只有在前10轮扩增后才结合的引物退火温度。因此，在前10轮扩增中，只有第一引物(与引物-结合发夹型寡核苷酸重叠的引物)被延伸，并且靶序列的第二变体被线性拷贝。

第一靶序列变体是如实施例2和3中使用的。靶序列的第二变体与实施例3中使用的相同(其不包含被用于通过分子信标探针来检测的核苷酸改变)。限制引物和完全互补的过剩引物也与实施例3中使用的相同。引物阻断发夹型寡核苷酸具有与用于这些实施例中的阻断剂B62相同的核苷酸(NT)序列，但其标记被改变：然而阻断剂B62具有5’Cal Orange和3’Dabcyl，此处使用的阻断剂不具有5’标记和3’Black Hole淬灭剂2。

为了产生信号，使用点亮/熄灭探针组合，其中引物阻断发夹型寡核苷酸(用3’末端Black Hole淬灭剂2非荧光淬灭部分标记)作为“Off”探针。对于“On”探针，使用具有5’荧光团(Quasar670)和3’淬灭剂(Black Hole淬灭剂2)的短茎分子信标探针，其与紧接引物阻断发夹型寡核苷酸下游的靶序列杂交，以便当两者都与靶序列杂交时，引物阻断发夹型寡核苷酸的淬灭剂与来自“On”探针的5’末端荧光团的荧光相互作用(淬灭)。“On”探针具有比靶序列更高的Tm。下文中给出寡核苷酸的序列。对于阻断剂，与靶序列变体的完全互补的第一变体互补的18个核苷酸以下划线标示，并且茎形成末端核苷酸以粗体标示。对于靶序列变体，提供一条链序列，限制引物和引物阻断发夹型寡核苷酸与之互补的链。在靶序列中，在阻断剂结合位点中相异的核苷酸以下划线标示。对于错配的过剩引物，错配的核苷酸以下划线标示。对于“On”探针，茎形成末端核苷酸以粗体标示。

阻断剂，修饰的B62:5'CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-BHQ23'

                (SEQ ID NO.2)

限制引物：5’ACTCTTGCCTACGC3’(SEQ ID NO.9)

匹配的过剩引物：5’GTGGAGTATTTGATAG3(SEQ ID NO.10)

错配的C-C过剩引物:5'GTGGAGTATTTGATAC3'(SEQ ID NO.20)

On-探针:5'Quas670-AAAACTACCACAAGTTTATATTCACTCATTTTCAGTT-

      BHQ23'(SEQ ID NO.21)

靶序列的第一变体：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGGTGGTGGGgTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.12)

靶序列的第二变体：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.14)

在25μl体积(由1X PCR缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3mMMgCl₂、200nM dNTP、50nM限制引物、1000nM过剩引物(完全互补或错配的)、0.24X SYBR Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)、500nM阻断剂、100nM“On”探针、1个单位的Platinium Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和10,000个拷贝的第一靶序列变体，和10个拷贝的靶序列的第二变体，或和包含10,000个拷贝的第一靶序列变体和无、1、10、100或1000个拷贝的第二靶序列变体的混合物组成)中进行LATE-PCR扩增。此外，在无任何靶存在(无模板对照)的情况下进行测定。平行地运行使用完全匹配的过剩引物和错配的过剩引物的测定。

这些反应的热规范条件如下：在95℃下进行3分钟；10个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟、50℃/10秒、72℃/20秒；1个循环：95℃/10秒；5个循环：60℃/2分钟和40℃/30秒；1个循环：72℃/2分钟；50个循环：95℃/10秒、50℃/10秒、72℃/30秒(进行SYBR信号读数)；随后在30℃下进行10分钟浸泡，随后在30℃下以30秒的间隔利用1℃的增量开始解链，直至90℃。以一式二份运行样本。规范的第一节段(95℃下进行3分钟)是使Planimium Taq上的抗体变性，并且而激活聚合酶。随后的节段(于95℃/60℃/50℃/72℃下进行的10个循环)是线性扩增第二变体，同时利用阻断剂B62(修饰的)抑制第一变体的扩增。将随后的3个节段(95℃，5个循环：60℃/40℃，随后72℃)与单个扩增循环组合以结合并且延伸错配的过剩引物，扩增循环内的60℃/40℃循环用于改善该过程(在循环内的该循环过程中，阻断剂继续留在第一靶序列变体上)。随后的50个循环(在95℃/50℃/72℃下进行的终扩增循环)是常规LATE-PCR循环，其使用两种引物产生双链扩增子，并随后从靶序列的第二变体产生单链扩增子。扩增后但在解链前在30℃下的浸泡是为了在解链过程中进行检测而将阻断剂B62(修饰的)和On探针都与第一靶序列变体和第二靶序列变体的单链扩增子杂交。

图9显示了在最终50个扩增循环过程中作为循环数的函数的实时SYBR信号。曲线901是完全匹配过剩引物，始于10,000个拷贝的靶序列的第一变体。曲线902是完全匹配过剩引物，始于10个拷贝的靶序列的第二变体。曲线903是错配的过剩引物，始于10,000个拷贝的靶序列的第一变体。曲线904是错配的过剩引物，始于10个拷贝的靶序列的第二变体。如从图9可见，第一靶序列变体的扩增完全被抑制。未检测到SYBR信号。

图10显示具有10,000第一靶序列变体并且具有或不具有1至1000拷贝的第二靶序列变体的样本加上无模板对照(NTC)的Quasar670解链曲线(荧光强度的导数)。曲线1001是NTC；曲线1002是10,000个拷贝的第一靶序列变体；曲线1003是10,000个拷贝的第一靶序列变体和1000个拷贝的第二靶序列变体；曲线1004是10,000个拷贝的第一靶序列变体和100个拷贝的第二靶序列变体；曲线1005是10,000个拷贝的第一靶序列变体和10个拷贝的第二靶序列变体；以及曲线1006是10,000个拷贝的第一靶序列变体和1个拷贝的第二靶序列变体。

约67℃下的峰值归因于“On”探针的结合，并且约59℃下的谷值归因于off探针(此处引物阻断发夹型寡核苷酸)的结合。如可见，峰值和谷值的位置对于所有样本都是相同的，然而高度不同，这表明扩增子具有相同序列但量不同。

对来自混合物的扩增的扩增产物进行测序。来自包含10,000个拷贝的靶序列的第一变体和不同数目的拷贝(1、10、100、1000)的靶序列的第二变体的样本的Sanger测序结果都具有第二靶序列变体的序列，包括在阻断剂结合位点中和特别包括在“On”探针的结合位点中(数据未显示)。

已在本实施例的测定中测试了不同的错配的过剩引物。上文中使用的完全互补过剩引物、错配的过剩引物以及几种其它错配的过剩引物的序列示于下文中。在每一种情况下错配核酸以下划线标示。

错配的过剩引物：5’GTGGAGTATTTGATAG3’（SEQ ID NO.10)

错配的C-C过剩引物:5'GTGGAGTATTTGATAC3'(SEQ ID NO.20)

错配的过剩引物XplA:5'GTGGAGTATTTGATAA3'(SEQ ID NO.22)

错配的过剩引物XP1T:5'GTGGAGTATTTGATAT3’(SEQ ID NO.23)

错配的过剩引物,XP2T:S'GTGGAGTATTTGATTGi'(SFQ ID INO.24)

错配的过剩引物XP2C:5'GTGGAGTATTTGATCG3’(SEQ ID NO.25)

错配的过剩引物XP3A:5'GTGGAGTATTTGAAAG3’(SEQ ID N0.26)

错配的过剩引物XP3G:5'GTGGAGTATTTGAGAG3'(SEQ ID NO.27)

如上所论述的，图9包括圆圈903，使用错配的C-C过剩引物的10,000个拷贝的第一靶序列变体的实时扩增曲线(SYBR荧光对循环数)，并且圆圈904，利用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。图11-16显示了其它错配的过剩引物的相同信息。在图11中，圆圈1101是使用错配的过剩引物XP1A的10,000个拷贝的第一靶序列变体的实时扩增曲线，并且圆圈1102是利用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。在图12中，圆圈1201是使用错配的过剩引物XP1T的10,000个拷贝的靶序列的第一变体的实时扩增曲线，并且圆圈1202是利用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。在图13中，圆圈1301是使用错配的过剩引物XP2T的10,000个拷贝的靶序列的第一变体的实时扩增曲线，并且圆圈1302是利用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。在图14中，圆圈1401是使用错配的过剩引物XP2C的10,000个拷贝的靶序列的第一变体的实时扩增曲线，并且圆圈1402是使用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。在图15中，圆圈1501是使用错配的过剩引物XP3A的10,000个拷贝的靶序列的第一变体的实时扩增曲线，并且圆圈1502是使用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。在图16中，圆圈1601是使用错配的过剩引物XP3G的10,000个拷贝的靶序列的第一变体的实时扩增曲线，并且圆圈1602是使用该引物的10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线。对于该靶扩增，因为其而使10个拷贝的靶序列的第二变体的曲线先于10,000个拷贝的靶序列的第一变体的曲线上升(C_T)的任何错配的过剩引物被认为是可接受的，即错配的C-C过剩引物(图9)和错配的过剩引物XP3G(图16)。

实施例5.使用作为点亮/熄灭探针对的部分的发夹型阻断剂检测基因组DNA中的稀有点突变

本实施例显示了根据本发明的测定以检测可能发生人工交叉杂交的基因组DNA(丰富的第一变体)的背景中的稀有突变(稀有第二变体)。在本实施例中，使用从几个细胞系制备的基因组DNA和发夹型阻断剂(其也用作点亮/熄灭探针对中的熄灭探针)来示范稀有点突变的检测。

a.DNA聚合酶错误的研究

如实施例2中所示，当将1,000,000个拷贝的第一序列(此处“纯”野生型靶)用作模板时，观察到微弱的信号。仅仅是SYBR信号的出现不能确定该信号是否因如下原因产生：a)阻断剂的结合错误；b)非野生型序列对纯野生型的痕量污染；c)Taq错误。为了检查这些可能性，在一系列平行反应中进一步扩增野生型序列的质粒DNA，并随后对产生SYBR信号的每一种扩增产物的过剩引物链进行测序。使用的寡核苷酸如下：

限制引物:5'ACTCTTGCCTACGC3’(SEQ ID NO.9)

过剩引物:5'GTGGAGTATTTGATAG3’(SEQ ID NO.10)

阻断剂,Off-探针:5'CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-BHQ23'

              (SEQ lD NO.2)

过剩引物链的野生型序列

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.12)

在阻断剂/Off-探针中，与靶序列互补的核苷酸以下划线标示，并且发夹形成互补末端核苷酸以粗体标示。在靶序列中，关于突变细胞系的6个目标核苷酸以下划线标示。

在25μl体积(由1X PCR缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3mMMgCl₂、200nM dNTP、50nM限制引物、1000nM过剩引物、0.24XSYBR Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)、500nM阻断剂(Off-探针)和1个单位的Platinium Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)以及1000或10,000个拷贝的包含靶序列的质粒DNA组成)中进行LATE-PCR扩增。

这些反应的热规范条件包括实施例2中描述的和实施例3中使用的2分钟的阻断剂结合步骤。条件如下：在95℃下进行3分钟；60个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟、50℃/10秒、72℃/30秒；随后在30℃下浸泡10分钟，随后以30秒的间隔以1℃的增量从30℃开始解链，直至90℃。

15个将产生SYBR Green信号的样本在H₂O中稀释12次，并随后送至商业公司进行双脱氧测序。将测序结果与作为野生型DNA的靶序列相比较，然后进行PCR。所有测序的产物具有至少一个突变(一个样本具有2个突变)，并且所有突变存在于阻断剂结合区域中(数据未显示)。1/3的测序的产物具有存在于区域(GGTGGC)(突变在突变细胞系中所发生的区域)外部的突变。同样地，被发现的16个突变中有13个是A核苷酸的不正确插入，根据已知Taq聚合酶在延伸的末端插入A的事实这是很明显的。综上所述这些观察强烈地建议未预料到的序列改变归因于Taq聚合酶错误。

b.从细胞系制备基因组DNA

细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA)。在本实验中使用4个细胞系(K562、SW1116、CAPAN2和PL45)来提供野生型等位基因(K562)和不同的突变等位基因。在无选择性扩增的PCR后，通过Dilute-‘N’-Go测序(Rice等(2007)Nature Protocols2(10)：2429-2438；和Jia等(2010)Nucl.Acids Res.38(11)：e119)来确认每一个细胞系的实际突变和基因型。

通过在不含Mg²⁺的PBS中离心，随后悬浮于100μl体积来洗涤细胞(约7.5x10⁵个)2次。将5μl的细胞悬浮物添加至32.5μl的Quantilyse(参见，“QuantiLyse(TM)：Reliable DNA amplification frontsingle cells,Pierce KE；Rice JE；Sanchez JA;等,BIOTECHNIQUES,32(5),1106-1111,2002.)，其包含10mM Tris-CL(pH8.3)缓冲液、5μMSDS和0.1mg/ml蛋白酶K，随后在50℃下孵育120分钟，然后在95℃下孵育15分钟。当将来自细胞系的细胞在超过一个管中裂解时，在裂解后将所有管汇集在一起。随后将20μl的等分于-20℃下贮存直至需要。因此每一个等分的基因组数目都是相同的。

上述处理消化所有结合至DNA的蛋白质但不将基因组DNA从消化产物中纯化出来。使用下列引物通过系列稀释PCR测定来自每一个细胞系的每一个冷冻等分的基因组DNA的浓度：

限制引物：5’CACTCTTGCCTACG3’(SEQ ID NO.28)

过剩引物：5’GTGGAGTATTTGATAG3’(SEQ ID NO.10)

过剩引物是实施例4中使用的完全匹配的过剩引物。此处使用的限制引物是通过在5’端上添加一个核苷酸C和通过在3’端缺失核苷酸C而从实施例3和4中使用的限制引物修饰而来的。该修饰的限制引物不检测在密码子12和密码13上存在于KRas基因中的可能突变，所述突变与癌症相关。

在25μl的体积(由1X PCR缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3mM MgCl₂、200nM dNTP、50nM限制引物、1000nM过剩引物、0.24XSYBR Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1个单位的Platinium Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)加上具体稀释度的从每一个细胞系制备的基因组DNA组成)中进行PCR扩增。不向该PCR扩增中添加阻断剂。因此以相同的效率扩增所有DNA变体。

用于这些反应的热规范条件，除循环数外，与实施例3中的相同。条件如下：95℃下进行3分钟；50个循环：95℃/10秒、50℃/10秒、72℃/20秒；随后在30℃下暂停10分钟，然后以30秒的间隔以1℃的增量从30℃开始解链直至90℃。以一式二份运行所有样本。产生可识别的SYBR Green信号的最高稀释度被认为包含单个基因组，并且基于达到该单基因组浓度所需的稀释程度测定每一个原始原液的浓度。

c.每个细胞系中的突变的测定

通过取1μl的来自每一个扩增的PCR产物并且用11μl H₂O稀释其，通过Dilute-‘N’-Go测序(参见，“Monoplex/multiplexlinear-after-the-exponential-PCR assays combined with PrimeSafe andDilute-'N'-Go sequencing,”Rice,John E.；Sanchez,J.Aquiles；Pierce,Kenneth E.;等,NATURE PROTOCOLS,2(10),2429-2438,2007：和Dilute-'N'-Go dideoxy sequencing of all DNA strands generated inmultiplex LATE-PCR assays,”Jia Yanwei；Osborne Adam；Rice John E.;等,NUCLEIC ACIDS RESEARCH,38(11),e119,2010)测定存在于每一个细胞系中的突变。将样本送至商业测序公司进行双脱氧测序。基于该序列信息，发现1个细胞系对于GGT等位基因是纯合的(细胞系K562，被认为是“野生型”)，发现2个细胞系对于GGT等位基因和GAT等位基因或GCT等位基因是50:50杂合的，并且发现1个细胞系是两个序列GGT等位基因和GTT等位基因的不等混合物，如下文中通过粗体下划线显示：

K562靶序列–纯合的：100%GGT等位基因

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.12)

PL45靶序列–50:50杂合的：50%SEQ ID NO.12和50%GAT等位基因：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.14)

CAPAN2靶序列–10:90的混合物：90%SEQ ID NO.12和10%GTT等位基因:

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCTTTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.15)

SW1116靶序列–50:50杂合的：50%SEQ ID NO.12和50%GCT等位基因：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.16)

细胞系K562对于GGT等位基因是纯合的并且为了检测稀少量的其它等位基因(突变体)的目的被认为是野生型。其它细胞系包含超过一个等位基因。在PL45中，存在约50%的GAT等位基因和50%的GGT等位基因。在CAPAN2中，存在少于10%的GTT等位基因和超过90%的GGT等位基因。在SW1116中，存在约50%的GCT等位基因和50%的GGT等位基因。

d.不同细胞系的混合物中的选择性扩增

用点亮/熄灭探针对运行LATE-PCR扩增。点亮/熄灭探针对是与实施例4中使用的相同的探针对。熄灭探针也用作引物阻断发夹型寡核苷酸(“发夹型阻断剂”)，其具有5个核苷酸(粗体标示的)的茎和与细胞系K562的序列完全互补的18个核苷酸的内部序列。点亮探针具有2个核苷酸(粗体标示的)的茎。

限制引物:5'CACTCTTGCCTACG3'(SEQ ID NO.28)

过剩引物:5'GTGGAGTATTTGATAG3'(SEQ ID NO.10)

阻断剂,Off-探针:5’CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-BHQ23’

             (SEQ ID NO.2)

On-探针:5'Quas670-AAAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGTT-

       BHQ23'(SEQ ID NO.21)

在25μl的体积中进行PCR扩增。反应混合物包含1X PCR缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3mM MgCl₂、200nM dNTP、50nM限制引物、1000nM过剩引物、0.24X SYBR Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)、500nM阻断剂(Off-探针)、100nM On-探针和1个单位的Platinium Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。反应混合物还包含不同浓度的从每个细胞系纯化的基因组DNA或10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与拷贝数为1000个拷贝至1个拷贝的量的来自其它细胞系之一的DNA的混合物。

用于这些反应的热规范条件与实施例3的热规范条件相似。(它们不包括实施例4中与错配的过剩引物一起使用的规范修改)。条件如下：在95℃下进行3分钟；60个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟、50℃/10秒、72℃/30秒(进行SYBR信号读取)；随后在30℃下浸泡10分钟，然后以30秒的间隔以1℃的增量从30℃开始解链直至90℃。以一式二份运行样本。在解链过程中监测和分析来自点亮/熄灭探针组合的荧光特征。解链曲线(探针荧光强度对温度的一阶导数)示于图17-20。

限制引物和过剩引物都与所有等位基因完全匹配。因为得出Taq错误将会发生(参见上文)，并且已知Platinum Taq聚合酶以每次核苷酸添加约10^-4个错误的速率产生错误，所以在第一轮扩增中在阻断剂结合区域可存在，或至少可存在约10个错误。这些错误可被扩增，因为阻断剂不能在随后循环中阻断它们。由于这些错误，包含10,000个拷贝的纯野生型基因组(来自细胞系K562)的起始样本预期产生相当于10,000个基因组中10个真实突变的阳性荧光特征。为此原因，来自500K562二倍体细胞的DNA的特征被当作用于区分预先存在的突变与Taq错误的界线，并且在10,000个基因组处具有低于纯K562的高峰(On-peak)信号的高峰的来自混合物样本的信号被弃去。

图17显示包含来自不同细胞系的基因组DNA(如上所述获得的)的样本加上无模板对照(NTC)的Quasar670解链曲线。曲线1701是NTC；曲线1702是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的基因组DNA(10,000个基因组)的扩增；曲线1703是始于1000个细胞系PL45的基因组的扩增；曲线1704是始于1000个细胞系SW1116的基因组的扩增；以及曲线1705是始于1000个细胞系CAPAN2的基因组的扩增。如从图17可见，不同等位基因产生可相互区别的不同解链曲线(不同的“荧光特征”)。在使用的点亮/熄灭探针设计中，如果靶是野生型，则与On-探针相比较，Off-探针(阻断剂)以更高的温度结合靶，以便在解链过程中，On-探针首先解链。在约67℃下的峰值归因于On-探针的结合，并且在约59℃下的谷值归因于Off-探针的结合。如果存在完全选择性并且无聚合酶错误，则来自细胞系K562的扩增产物相较于NTC可具有阴性荧光特征，因为当淬灭剂彼此靠近时，与它们在溶液中随机接触相比较，它们淬灭更多的荧光。如图17中所示，对于10,000个拷贝的来自K562的DNA，在约67℃检测到小的高峰，这表明On-探针的结合。这经判断归因于在扩增过程中由Taq聚合酶错误产生的人工突变。

图18显示10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与不同浓度的来自细胞系PL45的DNA的混合物的点亮/熄灭荧光导数。曲线1801是NTC；曲线1802是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA的扩增；曲线1803是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与10个拷贝的来自细胞系PL45的DNA的混合物的扩增；曲线1804是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与100个拷贝的来自细胞系PL45的DNA的混合物的扩增；和曲线1805是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与1000个拷贝的来自细胞系PL45的DNA的混合物的扩增。

通过使用纯K562荧光信号作为阈值，当其在约67℃的高峰信号更高时，决定判断始于另一种细胞系或混合物的结果为阳性而非不确定的。参考图18，判断10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与10个拷贝的来自细胞系PL45的DNA的混合物不能与10,000个拷贝的来自单独的K562的DNA相区别。然而，判断包含100或1000个拷贝的来自细胞系PL45的DNA的混合物是明确可区别的。因此，测定能够用10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA的背景检测少至100个拷贝的来自细胞系PL45的DNA。鉴于PL45的杂合性，50%的DNA具有GAT等位基因，而50%具有与细胞系K562所具有的相同的GGT等位基因，GAT突变的稀有突变检测灵敏度实际为50/10,000，其可转化成0.5%的检测灵敏度。

图19显示10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与不同浓度的来自细胞系CAPAN2的DNA的混合物的点亮/熄灭荧光导数。曲线1801是NTC；曲线1802是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA的扩增；曲线1803是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与10个拷贝的来自细胞系CAPAN2的DNA的混合物的扩增；曲线1804是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与100个拷贝的来自细胞系CAPAN2的DNA的混合物的扩增；以及曲线1805是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与1000个拷贝的来自细胞系CAPAN2的DNA的混合物的扩增。通过应用用于图18的标准，检测到100个拷贝的稀有等位基因高于使用10,000个拷贝的野生型细胞系建立的背景信号。鉴于具有10%的GTT突变的细胞系CAPAN2中的杂合性，通过该测量产生的检测灵敏度达到0.1%(对于GTT突变)，其好于由考虑Taq错误率预测的灵敏度。

图20显示10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与不同浓度的来自细胞系SW1116的DNA的混合物的点亮/熄灭荧光导数。曲线1801是NTC；曲线1802是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA的扩增；曲线1803是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与10个拷贝的来自细胞系SW1116的DNA的混合物的扩增；曲线1804是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与100个拷贝的来自细胞系SW1116的DNA的混合物的扩增；以及曲线1805是始于10,000个拷贝的来自细胞系K562的DNA与1000个拷贝的来自细胞系SW1116的DNA的混合物的扩增。通过应用用于图18的标准，检测到100个拷贝的稀有GCT等位基因高于使用10,000个拷贝的野生型细胞系建立的背景信号。鉴于具有50%GCT突变的细胞系SW1116中的杂合性，对于GCT突变的检测灵敏度达到0.5%。

实施例6.用于使用作为点亮/熄灭探针对的部分的发夹型阻断剂检测稀有点突变的加尾引物

本实施例描述了由其序列与靶匹配的3’线性区段或“头部”和其序列不与靶匹配的5’线性尾或5’翻转尾组成的一组引物以及点亮/熄灭探针对(其中Off-探针是序列排除引物阻断发夹型寡核苷酸(阻断剂))，用于检测含点突变的靶序列的稀有第二变体的用处。在本实施例中，过剩引物的3’头部与靶序列完全互补。

图21显示该系统中的分子组分的示意性设计。限制引物2104具有与链2102上的靶2101匹配的3’头部2105和不与靶2102匹配的5’尾2106。限制引物的3’头部与发夹型阻断剂2110竞争，所述阻断剂结合靶2101中的其中发生点突变2115的序列。此处发夹型阻断剂还用作在3’端具有淬灭剂2111的Off-探针，其与和On-探针2112(在5’端具有荧光团2113和在3’端上具有淬灭剂2114)相邻的靶杂交。过剩引物2107还包含与链2103上的靶2101完全匹配的3’头部2108，和不与靶链2103匹配的5’尾2109。

如实施例5中所论述的，Taq聚合酶在PCR扩增过程中产生错误，并且一旦在阻断剂结合区域中产生错误突变后，其在随后其中阻断剂起作用的循环中被选择并扩增，从而当野生型浓度为1000个分子或更高时产生假阳性信号。在本实施例中描述的设计中，仅突变型加尾链在随后的循环中获得扩增，因为当阻断剂阻断野生型时，仅突变型原始序列在第一循环中被利用。在这些情况下，即使Taq聚合酶在过剩引物在野生型靶上延伸时产生错误，该错误也不被选择并扩增。因此，使由Taq错误产生的假阳性突变体减少至最少。

在扩增反应开始时，过剩引物针对靶的浓度依赖性Tm(Tm^X _[0])比反应开始时限制引物的浓度依赖性Tm(Tm^L _[0])低10℃。运行PCR方案，其中第一循环包括阻断剂结合步骤，并且阻断剂选择性结合野生型靶。在该循环中，在阻断剂结合步骤后，在对于过剩引物的3’头部的结合来说太高的温度下使限制引物的3’头部退火。因为阻断剂阻断限制引物在野生型靶上的结合，因此限制引物在该循环中仅结合突变靶并且在其上延伸。通过限制引物的延伸合成的新链(限制引物链)必定包括限制引物的5’尾。在第二循环中，加热反应物以将限制引物链与其模板分离；随后进行阻断剂结合步骤；随后将温度降低至允许不仅限制引物在突变体上结合和延伸而且过剩引物在突变型限制引物链上结合和延伸的退火温度。所得的链(过剩引物链)必定具有过剩引物的5’尾并且在完全延伸后，具有与限制引物的5’尾互补的3’端。虽然在第二循环中过剩引物也在丰富的野生型靶上结合和延伸(阻断剂结合区域中的Taq错误可从该过程产生)，但其完全延伸不具有与限制引物的5’尾互补的3’端。随后仅在2个温度(解链温度和引物退火/延伸温度)下将反应混合物循环许多次。然而，在这些循环中，将引物退火/延伸温度设置在显著高于仅限制引物的3’头部的结合所需的温度的温度上。该温度允许全长限制引物和全长过剩引物结合它们在过剩引物链和限制引物链上的互补序列。退火温度比全长过剩引物的Tm(Tm^X _[0’])低数度。因此，仅突变型稀有第二变体在这些循环中被扩增。

使用具有下文中所示的序列的寡核苷酸进行实验。在翻转尾第一限制引物的序列中，形成茎-环结构的互补核苷酸以下划线标示，“颈”核苷酸以粗体表示。在线性尾第二过剩引物的序列中，5’尾的核苷酸以粗体表示。在On探针中，茎形成末端核苷酸以粗体表示。在阻断剂中，与靶序列的第一野生型变体互补的18个核苷酸以下划线标示，并且茎形成末端核苷酸以粗体标示。

翻转加尾限制引物"5’AGCGGCACCACGCTCCACTCTTGCCTACG-3(SEQ ID

NO.29)

线性加尾过剩引物:5'CTCACCTTCCATCACCACGAGTATTTGATAG-3'

(SEQ ID NO.30)

On-探针:5’Quas670-AAAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGTT-

    BHQ23'(SEQ ID NO.21)

阻断剂/Off-探针:5'CGCCGCCTACGCCACCAGCTCCGGCG-BHQ23'

      (SEQ ID NO.2)

靶序列的第一变体：

5’CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQIDNO.12)

靶序列的第二变体：

5'CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTCACATGTTCTAATATAG

TCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT

GTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGC3’(SEQ ID NO.13)

在25μl的体积(由1X PCR缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、3mM MgCl2、200nM dNTP、50nM加尾限制引物、1000nM加尾过剩引物、0.24X SYBR Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)、500nM阻断剂、100nM On-探针、1个单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和10,000个拷贝的第一变体(野生型)或第二变体(突变体)或和包含10,000个拷贝的第一变体与1、10、100或1000个拷贝的第二变体序列的混合物组成)中进行LATE-PCR扩增。此外，在无任何靶的情况下运行测定；即，无模板对照(NTC)。

这些反应的热规范条件如下：在95℃下进行3分钟；1个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟、50℃/10秒、72℃/30秒；1个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟和40℃/30秒、72℃/30秒；60个循环95℃/10秒、70℃/30秒(进行SYBR和Quasar670信号读取)；随后在30℃下浸泡10分钟，随后以30秒的间隔以1℃的增量从30℃开始解链，直至95℃。以一式二份运行样本。

规范的第一节段(在95℃下进行3分钟)是使Platinum Taq上的抗体变性，并激活聚合酶。随后的节段(在95℃/60℃/50℃/72℃下进行的一个循环)是将阻断剂结合在第一变体上，将限制引物结合在第二变体上，延伸第二变体上的限制引物以产生限制引物链，同时利用阻断剂/Off-探针抑制第一变体模板上的引物延伸。随后的节段(1个循环：95℃/10秒、60℃/2分钟和40℃/30秒、72℃/30)是使加尾过剩引物啮合以产生包含加尾限制引物和加尾过剩引物的完整序列(不仅仅是与靶序列互补的3’线性部分)的过剩引物链。随后的节段(95℃/72℃下进行的60个循环)是利用两个全长引物产生双链扩增产物或扩增子以及随后产生包含第二变体+整合的尾的单链扩增子的两步骤LATE-PCR循环。扩增后但在解链前在30℃下进行的浸泡是使阻断剂/Off-探针和On探针都与第一变体(如果存在的话)和第二变体的单链扩增子杂交以定量检测和鉴定产物链。

图22显示在阻断剂存在或不存在的情况下纯的第一变体或纯的第二变体的样本的实时SYBR信号。曲线2201是在阻断剂不存在的情况下的无模板对照；曲线2202是在阻断剂不存在的情况下10,000个拷贝的第二变体；曲线2203是在阻断剂不存在的情况下10,000个拷贝的第一变体；曲线2204在阻断剂存在的情况下无模板对照；曲线2205是在阻断剂存在的情况下10,000个拷贝的第二变体；曲线2206是在阻断剂存在的情况下10,000个拷贝的第一变体。

如图22中可看到的，在阻断剂不存在的情况下，第一和第二变体的扩增是同样高效的，具有相同的Ct值。在阻断剂存在的情况下，第二变体的扩增被略微抑制，如通过两个循环的Ct的延迟(ΔCt为2)所反映的，而第一变体被更显著地抑制，如通过ΔCt为8反映的。这产生ΔΔCt为6，这表示低于2%的第一变体分子与第二变体分子(10,000的2%=200)一样高效地被扩增。

图23显示不同样本的Quasar670解链曲线(作为温度的函数的荧光强度的导数)，其有时称为荧光特征。曲线2301是NTC；曲线2302是10,000个拷贝的第二变体；曲线2307是10,000个拷贝的第一变体；曲线2303是10,000个拷贝的第一变体和1000个拷贝的第二变体；曲线2304是10,000个拷贝的第一变体和100个拷贝的第二变体；曲线2305是10,000个拷贝的第一变体和10个拷贝的第二变体；曲线2306是10,000个拷贝的第一变体和1个拷贝的第二变体。

如图23中所示，纯的第二变体样本在68℃(在该温度下On-探针结合)显示峰值，以及在58℃(在该温度下Off-探针/阻断剂结合)显示负峰值。纯的第一变体样本在66℃显示负峰值。这是因为On-探针和Off-探针(阻断剂)在相同温度下结合第一变体。当On-探针的荧光团与Off-探针上的淬灭剂相邻时，系统中的总荧光低于当On-探针存在于溶液即不结合靶时的总荧光。应指出，虽然相同的点亮/熄灭探针对用于本实施例(如实施例4中使用的)，但荧光特征不同。在实施例4中，纯的第一变体样本不产生任何信号，然而在实施例6中，纯的第一变体产生负峰值。这是因为在实施例4中未发生可测量的第一变体的扩增，因为阻断剂在所有热循环中起作用。相反地，在实施例6中，阻断剂仅在前两个热循环中起作用并且很明显在第一热循环过程中未被充分最优化以完全阻断限制引物在第一变体模板链上的延伸。在随后循环中，“逃脱”的第一变体的那些链正好与第二变体链一样高效地被扩增，因为阻断剂不再被利用。然而本实施例显示加尾引物的原理的检验。

上述测定可通过扩大阻断剂与限制引物之间的Tm差异来进一步最优化。这可通过重新设计限制引物的3’头部，重新设计限制引物的5’尾，调整限制引物的颈，调整限制引物的浓度，调整Off-探针/阻断剂的浓度，调整用于阻断剂结合的温度和/或时间，调整用于限制引物结合的退火温度和/或时间来进行。然而另一个最优化策略可以是利用其5’端与靶互补的阻断剂。这可保证引物的3’端存在于阻断剂的5’端顶部。另一个改进可以是使用缺乏5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。这可使得酶不可能通过引物依赖性或不依赖于引物的切割来切割阻断剂的5’端。如本领域技术人员将理解的，可组合上文所列的许多改进以实现第一变体模板上的引物的最佳抑制。在第一热循环过程中第一变体模板上限制引物的延伸的抑制越大，来自第一变体的扩增子的积累越少。

图23还显示了10,000个拷贝的第一变体与1000、100和10个拷贝的第二变体的混合物具有与纯的第一变体和纯的第二变体的荧光特征不同的荧光特征。将混合物的曲线当作纯靶的两个特征的叠加，每一个靶具有不同的贡献。因此认为，混合物中1000个拷贝的第二变体为大致10%的样本，在68℃存在正峰值并且在58℃存在负峰值，这与纯的第二变体的峰值相似。这表明大部分终产物是第二变体序列。并且对于混合物中100或10个拷贝的第二变体(其为1%或0.1%的样本)，可看到58℃下的负峰值和66℃下的另一个负峰值，这表明终产物主要是第二变体。对于混合物中1个拷贝的第二变体(其为0.01%的样本)，可看到曲线与纯的第一变体的特征不能相区别。

图24将图23中显示的信息显示为比率，即，58℃下的荧光特征的值(在减去NTC的值后)与66℃下的荧光特征的值(在减去NTC的值后)的比率。根据混合物中第二变体或突变体的百分比(从100%(“MT”)至0%(“WT”))图解显示比率。点2401是100%的第二变体的比率；点2402是10%的第二变体的比率；点2403是1%的第二变体的比率；点2404是0.1%的第二变体的比率；点2405是0.01%的第二变体的比率；以及点2406是0%的第二变体，100%的第一变体。线2407是为0的比值，线2408是100%的第一变体的比值。

如上所论述的，本实施例中使用的条件使10,000个拷贝的第一变体的有效浓度降至<200个拷贝。如图24中所示，纯的第二变体(100%)和10%的第二变体的比值都具有负值。这是因为66℃处的峰值是正数，并且58℃处的峰值是负数。因此，为负数的任何比值主要具有第二变体靶。对于更低的第二变体百分比，比值为正数。这是因为两个峰值都为负数。起始混合物中第二变体的不同百分比在扩增后产生不同的百分比，因此比率将反映初始百分比。将100%第一变体的比值(点2406)当作基线，产生可区别的值的任何样本是混合物。根据图24，可告知在99.9%的第一变体的存在中存在0.1%的第二变体。系统沿着上述线的进一步最优化将导致第二变体的更大的选择性扩增，这使得可能区分包含少于0.1%的第二变体的混合物与纯的第一变体。

上述实施例仅是举例说明性的。可在不背离本发明的情况下对上述实施例中描述的方法进行的许多改变和修改对于本领域普通技术人员来说将是显然的。实施例不限制更确切地说由下文中所提出的权利要求确定的本发明的范围。

Claims (21)

1.一种引物依赖性DNA扩增方法，其用于选择性扩增包含丰富的靶序列的第一变体的样本中的DNA靶序列的稀有第二变体，其中所述第二变体与所述第一变体相异至少一个核苷酸，所述方法包括

a)制备包含所述样本和扩增试剂的反应混合物，所述扩增试剂包括将所述靶序列包括在其间的第一线性引物和第二线性引物，和其在所述靶序列上的结合位点在所述第一引物的所述靶结合位点下游并且包括所述至少一个核苷酸差异的额外的引物阻断发夹型寡核苷酸，

其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸的所述靶结合序列优选地与所述靶序列的所述第一变体完全互补，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸的所述靶序列上的所述结合位点与所述第一引物的所述靶序列上的所述结合位点重叠至少一个核苷酸，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在扩增开始时具有比其针对所述靶序列的所述第二变体的对应解链温度高至少5℃的针对所述靶序列的所述第一变体的浓度调节的解链温度，并且其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在所述引物不与所述靶序列杂交的温度下但以为所述第一引物结合所述靶序列的速率的至多1/5的速率与所述靶序列的所述第一变体杂交；和

b)使所述反应混合物经历热循环方案，所述热循环方案包括解链、引物退火和引物延伸的步骤的重复循环，

其中至少所述初始循环在所述引物退火步骤之前另外包括阻断剂结合步骤，所述阻断剂结合步骤具有这样的温度，在该温度下所述引物阻断发夹型寡核苷酸仅结合所述靶序列的所述第一变体并且所述引物不结合所述靶序列，以及该温度具有足以使所述引物阻断发夹型寡核苷酸饱和所述靶序列的所述第一变体的持续时间，并且其中所述引物退火步骤具有不足以使所述引物阻断发夹型寡核苷酸结合所述靶序列的所述第二变体的持续时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增开始时，所述引物阻断发夹型寡核苷酸具有比其对应的针对所述靶序列的所述第二变体的解链温度高至少7℃的针对所述靶序列的所述第一变体的浓度调节的解链温度。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法是非对称扩增方法，其中所述第一引物是限制引物并且所述第二引物是过剩引物，其中过剩引物与限制引物的比率为至少5:1，并且其中扩增开始时所述限制引物的所述浓度调节的解链温度至少等于扩增开始时所述过剩引物的所述浓度调节的解链温度。

4.根据权利要求3所述的方法，其中扩增开始时所述限制引物的所述浓度调节的解链温度比扩增开始时所述过剩引物的所述浓度调节的解链温度高3-10℃。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包括至少一种均质检测试剂，并且所述方法包括至少一种扩增产物的均质检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸被标记以便参与所述均质检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在其3’端包括淬灭剂，并且所述反应混合物包括短茎分子信标探针，所述探针在其5’端包括荧光团，在其3’端包括淬灭剂，并且在紧接所述引物阻断发夹型寡核苷酸的下游杂交。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述热循环方案包括多个不包括所述阻断剂结合步骤的热循环。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中包括所述阻断剂结合步骤的初始循环被1至10个不包括所述阻断剂结合步骤的循环中断。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述中断后所述阻断剂结合步骤包括在不超过2个循环中。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述热循环方案包括至少10个初始循环，所述循环包括所述阻断剂结合步骤和低至足以使所述第一引物结合但低至不足以使所述第二引物结合的引物退火温度，由此所述第二变体在利用两种引物的指数扩增开始之前通过所述第一引物的结合和延伸被线性扩增。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述引物的至少一个被修饰以在扩增过程中具有两个浓度调节的解链温度，针对所述初始靶序列的低解链温度和针对所述反应中产生的产物链的高解链温度，并且其中所述热循环方案包括至少一个具有低至足以使所述至少一种引物在其低解链温度下结合的引物退火温度的循环和多个具有高至足以使所述至少一种引物仅在其高解链温度下结合的引物退火温度的循环。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种修饰引物是第二引物，并且所述第二引物与所述靶序列错配。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种引物是加尾引物。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一引物和第二引物是加尾引物，其具有线性3’区段和不与所述靶序列互补的5’尾，并且其中所述热循环方案包括不超过10个包括阻断剂结合步骤的循环和多个随后的循环，所述随后的循环具有高至足以使包含所述引物尾的互补序列的扩增子链被指数扩增但其它链不被指数扩增的引物退火温度。

16.根据权利要求15所述的方法，其中至少一种引物是翻转尾引物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中不超过两个初始循环包括所述阻断剂结合步骤。

18.一种用于扩增选择的靶序列的试剂盒，所述试剂盒包括引物阻断发夹型寡核苷酸、第一扩增引物和第二扩增引物以及用于进行根据权利要求1所述的方法的测定的扩增试剂。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第二扩增引物与所述靶序列错配。

20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一引物和第二引物是加尾引物。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中至少一种引物是翻转尾引物。

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