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CN103443268A - 植物过氧化物酶在丝状真菌中的表达 - Google Patents

植物过氧化物酶在丝状真菌中的表达 Download PDF

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CN103443268A
CN103443268A CN2012800054744A CN201280005474A CN103443268A CN 103443268 A CN103443268 A CN 103443268A CN 2012800054744 A CN2012800054744 A CN 2012800054744A CN 201280005474 A CN201280005474 A CN 201280005474A CN 103443268 A CN103443268 A CN 103443268A
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CN
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aspergillus
peroxidase
codon
seq
identity
Prior art date
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CN2012800054744A
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L·H·厄斯特高
L·卡卢姆
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Novo Nordisk AS
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Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及植物来源的过氧化物酶在丝状真菌宿主生物体中的重组表达。

Description

植物过氧化物酶在丝状真菌中的表达
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，其并入本文以作参考。
技术领域
本发明涉及用于野生型植物过氧化物酶、或从中衍生的过氧化物酶在丝状真菌宿主生物体中的重组表达的方法和组合物。
背景技术
过氧化物酶和漆酶是已知的属于氧化还原酶的酶。过氧化物酶属于EC1.11.1.7酶类，漆酶则属于EC1.10.3.2。两种酶类均能够氧化底物，因而它们经常用于漂白应用中。商业应用包括斜纹粗棉布的漂白（牛仔裤上的磨损样式）、织物染色工序之后的漂洗水的漂白、以及洗涤工序过程中的染料转移抑制。
通常从植物中纯化植物过氧化物酶，但这是产率较低的复杂工序。或者，可以使用在细菌或酵母中的重组表达，但其收率也较低。因此，对于过氧化物酶和漆酶的高效重组生产的需求是较为明显的。
然而，科技文献中没有呈现植物来源的氧化还原酶在丝状真菌例如曲霉（Aspergillus）中表达的例子。曲霉菌和其他丝状真菌经常被用作酶的重组表达的高效表达宿主。因为研究者几乎不在文献中报道行不通的内容，由此据信，缺乏氧化还原酶表达的成功案例说明，在丝状真菌中表达植物来源氧化还原酶被认为是不可能的（技术偏见）。
植物来源的氧化还原酶不能在例如曲霉中表达的假设由本发明发明者早先未能成功地尝试出在曲霉中表达多种植物来源漆酶的事实所支持。
发明内容
本发明的发明者已经发现，实际上可以在曲霉宿主细胞中表达植物过氧化物酶。因此，本发明提供用于野生型植物过氧化物酶、或从其衍生的过氧化物酶的重组表达的方法，包括在丝状真菌宿主生物体中表达编码过氧化物酶的核酸序列，其中过氧化物酶的氨基酸序列包括选自以下的一种或更多种氨基酸基序：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I][I,L][I,L]；和
VSC[A,S]D[I,L][I,L]。
具体实施方式
定义
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包（EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite（欧洲分子生物学开放软件包）,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277）（优选3.0.0版本或更新）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needlemanand Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453），来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）替换矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出（使用-nobrief选项得到的）被用作百分比同一性并如下计算：
（相同残基×100）/（比对长度-比对中的空位总数）。
出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包（EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite（欧洲分子生物学开放软件包）,Rice等人,2000，同上）（优选3.0.0版本或更新）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman and Wunsch,1970，同上），来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EDNAFULL（NCBI NUC4.4的EMBOSS版本）替换矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出（使用-nobrief选项得到的）被用作百分比同一性并如下计算：
（相同脱氧核糖核苷酸×100）/（比对长度-比对中的空位总数）。
编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，其通常以ATG起始密码子或可替代的起始密码子如GTG和TTG开始，并以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过得自真核细胞的成熟的、剪切的mRNA分子进行反转录而制得的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录子是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪切的mRNA之前要经一系列的步骤加工，包括剪切。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
控制序列：术语“控制序列”是指对于编码本发明多肽的多核苷酸的表达为必需的所有构件。各个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是原生的或外源的，或者相互为原生的或外源的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入特定限制性酶切位点的目的，控制序列可具有接头，其促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区域的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”是指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在合适位置处，从而控制序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及到多肽生产中的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且与用于其表达的其它核苷酸可操作地相连接的线性或环状DNA分子。
宿主细胞：术语“宿主细胞”或“宿主生物体”是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型，其具有包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体。术语“宿主细胞”包括因复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任意后代。
过氧化物酶
EC号可以用于酶的分类。对Recommendations of the NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and MolecularBiology,Academic Press Inc.,1992做出参考。
应该理解的是，术语酶，以及本文提及的各种酶和酶类，包括野生型的酶、以及其保留所考虑活性的任何变体。可以通过重组技术而产生这些变体。野生型酶也可以通过重组技术、或通过从天然来源分离并纯化而产生。
在特定实施方式中，所考虑的酶是明确的（well-defined），表明仅存在一种主要的酶组分。这可以例如通过在合适的尺寸排阻层析柱上分级而进行推断。这些明确的、或纯化的、或高度纯化的酶可以按领域中已知的和/或与所考虑的特定酶相关的公开物中的描述而得到。
根据本发明的过氧化物酶是包括在EC1.11.1.7酶类中的植物过氧化物酶、或从其衍生的表现出过氧化物酶活性的任何片段。植物过氧化物酶属于III类过氧化物酶。
III类过氧化物酶或分泌的植物过氧化物酶（EC1.11.1.7）仅在植物中发现，其中它们形成较大的多基因家族。尽管它们的一级序列在某些点与I类和II类不同，但它们的三维结构与II类非常相似，并且它们也具有钙离子、二硫键和N端信号以分泌。
III类过氧化物酶还能够进行第二循环反应，称为羟化，其与过氧化循环不同。在羟化循环过程中，过氧化物酶经Fe(II)状态，并主要利用超氧阴离子（O2 -）来生成羟基（OH）。已知利用这两种循环的III类过氧化物酶会参与从萌芽到衰老的很多不同的植物过程，例如，生长素代谢、细胞壁伸长和硬化、或保护免受病原体（还参见Passardi等人.“The class III peroxidase multigenic family in rice and its evolutionin land plants”,Phytochemistry,65(13),pp.1879-93(2004)）。
过氧化物酶的氨基酸序列包括植物过氧化物酶的特征基序。优选地，过氧化物酶包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV                   （SEQ ID NO:5）；
GCD[A,G]S[V,I][I,L][I,L]  （SEQ ID NO:69）；和
VSC[A,S]D[I,L][I,L]       （SEQ ID NO:70）。
更优选地，过氧化物酶包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV                （SEQ ID NO:5）；
GCD[A,G]S[V,I]LL       （SEQ ID NO:6）；和
VSC[A,S]D[I,L]L        （SEQ ID NO:7）。
更优选地，过氧化物酶包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV                  （SEQ ID NO:5）；
GCD[A,G]S[V,I]L          （SEQ ID NO:68）；和
VSC[A,S]D[I,L]L          （SEQ ID NO:7）。
本发明的过氧化物酶包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ IDNO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列具有至少60%同一性例如至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，过氧化物酶由与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列具有至少60%同一性例如至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性的氨基酸序列构成。
在另一个实施方式中，过氧化物酶可以与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列相同，或与之相比具有一个或多个氨基酸差异；例如，与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列相比，最多具有10个氨基酸差异；或最多9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异。
优选地，本发明的过氧化物酶是大豆过氧化物酶（例如，SEQ IDNO:2）或从大豆过氧化物酶衍生的；或皇家棕榈树过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:4）或从皇家棕榈树过氧化物酶衍生的；或杨树过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:45的氨基酸38～354）或从杨树过氧化物酶衍生的；或玉米过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:55的氨基酸30～362）或从玉米过氧化物酶衍生的；或烟草过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:67的氨基酸23～324）或从烟草过氧化物酶衍生的。
过氧化物酶活性（POXU）的确定
一个过氧化物酶单位（POXU）是在含有0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0）、0.88mM过氧化氢和1.67mM2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)（ABTS）的水溶液中，在30℃下每分钟催化1μmol过氧化氢转化的酶量。
反应持续60秒（混合后15秒）并测量418nm处的吸光度变化。吸光度应该在0.15～0.30的范围内。使用36mM-1cm-1氧化ABTS的吸收系数以及每氧化2μmol ABTS转化1μmol H2O2的化学计量，来计算过氧化物酶活性。
本发明的方法和用途
通常而言，从植物纯化植物过氧化物酶，但这是收率较低的复杂工序。或者，可以使用在细菌或酵母中的重组表达，但是经常造成很低的收率和/或较难的纯化。因此，对于植物来源过氧化物酶的高效重组生产的需求是明显的。
根据本发明，野生型植物过氧化物酶和从其衍生的过氧化物酶可以在丝状真菌宿主细胞中作为重组蛋白进行生产，其经常解决收率低和/或纯化困难的问题。
蛋白的重组表达不常是直截了当的，并且难以预测实际上是否能在特定的生产宿主生物体中产生所需的产物以及产物收率是否会足以建立经济的生产。
多个参数会导致丝状真菌宿主中表达的缺失。通常而言，分泌的并正确加工的过氧化物酶在丝状真菌中的表达涉及多个步骤，其中任何步骤可能是限制性的步骤。
首先，插入的过氧化物酶基因被转录成hnRNA。然后hnRNA从核被转送到胞浆，并且在此过程中成熟为mRNA。通常，mRNA池建立在胞浆中，以维持翻译。之后，mRNA被翻译成蛋白前体，接着该前体在翻译时或在翻译后分泌到内质网（ER）。在易位进入ER中时，分泌信号肽被信号肽酶切割，所得的蛋白在ER中折叠。当适当的折叠被细胞识别后，蛋白随后被分泌到高尔基体。此处，前肽将被切割，以释出成熟的过氧化物酶。因此，存在多种可能性妨碍基因序列在给定的宿主生物体中充分表达。
为了使编码所需蛋白的多核苷酸序列高效表达，翻译过程必须是高效的。因此，本发明的一个目的是使编码过氧化物酶蛋白的mRNA序列优化，以获得在丝状真菌宿主细胞中的充分表达。
在一个实施方式中，本发明涉及用于在丝状真菌宿主生物体中重组表达野生型植物过氧化物酶的方法，包括在丝状真菌宿主生物体中表达编码野生型植物过氧化物酶的修饰核酸序列，其中，修饰的核酸序列与编码野生型植物过氧化物酶的野生型核酸序列至少在一个密码子上有区别。
可以通过a）提供编码野生型植物过氧化物酶的野生型核酸序列，以及b）修饰该核酸序列的至少一个密码子来获得修饰的核酸序列，从而使修饰的核酸序列与编码野生型植物过氧化物酶的各个野生型核酸序列在至少一个密码子上有区别。修饰核酸序列的方法为本领域技术人员所熟知。在特定实施方式中，修饰不改变由该密码子编码的氨基酸的特性（identity）。
因此，在另一个方面，本发明的目的通过在丝状真菌宿主生物体中重组表达野生型植物过氧化物酶的方法而实现，其包括以下步骤：
i）提供编码野生型植物过氧化物酶的核酸序列，该核酸序列包括至少一个修饰的密码子，其中修饰不改变由该密码子编码的氨基酸，且该密码子的核酸序列与编码野生型基因的核酸序列中的对应密码子不同；
ii）在丝状真菌宿主中表达修饰的核酸序列。
根据本实施方式，待修饰的起始核酸序列是编码感兴趣的植物过氧化物酶的野生型核酸序列。
根据本发明的修饰，包括对碱基三联体的任何修饰，在特定实施方式中，它们包括不改变该密码子所编码的氨基酸的特性的任何修饰，即由原始密码子所编码的氨基酸与修饰密码子所编码的氨基酸是相同的。在大多数情况中，修饰会是在第三个位置，然而，在一些情况中，修饰也可以是在第一或第二位。如何修饰密码子同时不改变所得的氨基酸是技术人员已知的。
对于以上两个实施方式，为了获得充分表达所需的应当不同的密码子的数量或修饰的数量可以改变。因此，根据本发明的又一实施方式，修饰的核酸序列与编码野生型植物过氧化物酶的各个野生型核酸序列在至少2个密码子上不同或至少2个密码子被修饰，特别是至少3个密码子，更特别地为至少5个密码子，更特别地为至少10个密码子，更特别地为至少15个密码子，甚至更特别地为至少25个密码子。
还发现，通过将野生型核酸序列的密码子使用改变为在优选被用作宿主的丝状真菌所利用的密码子中选择，本发明的过氧化物酶表达在如今是可行的。这些密码子被称为对于表达是“优化的”。
由于遗传密码的简并性和在特定生物体/细胞中对某些优选密码子的偏好，在某些实例中可以通过优化密码子使用来改善蛋白在指定宿主细胞中的表达水平。在当前的情形中，当编码SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362和SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的野生型核酸序列通过密码子优化被优化并在曲霉中表达时，植物过氧化物酶的收率是极佳的。
在本发明中，“密码子优化”是指由于遗传密码的简并性，多于一个的三联体密码子可以用于各个氨基酸。一些密码子在特定生物体中将是优选的，并且，通过将野生型基因中的密码子使用改变成在特定表达宿主生物体中优选的密码子使用，密码子被认为是优化的。密码子优化可以例如按照在Gustafsson等人.,2004,(Trends in Biotechnologyvol.22(7);Codon bias and heterologous protein expression)和US6,818,752中所述的来进行。
密码子优化可以是基于宿主生物体的平均密码子使用，或者其可以基于已知在特定宿主细胞中大量表达的特定基因的密码子使用。
在本发明的一个实施方式中，过氧化物酶蛋白由在至少10%密码子上优化的修饰核酸序列密码子所编码，更特别地为至少20%，或至少30%，或至少40%，或特别地为至少50%，更特别地为至少60%，更特别地为至少75%。因此，修饰的核酸序列可以与编码野生型过氧化物酶的各个野生型核酸序列在至少10%密码子上有区别，更特定地为至少20%，或至少30%，或至少40%，或特别地为至少50%，更特别地为至少60%，更特别地为至少75%。具体而言，密码子可以不同，因为它们与编码野生型植物过氧化物酶的野生型核酸序列相比，已进行密码子优化。
特别地，100%的核酸序列已进行密码子优化，以与丝状真菌中使用的优选密码子相配。
在特定实施方式中，密码子优化是基于米曲霉（Aspergillus oryzae）的α-淀粉酶的密码子使用，该α-淀粉酶也称为FungamylTM（WO2005/019443；SEQ ID NO:2），其是已知在丝状真菌中高水平表达的蛋白。在当前的上下文中，对应于构成感兴趣蛋白的分泌蛋白的总量的至少20%、优选至少30%、更优选至少40%、甚至更优选至少50%的表达水平被认为是高水平的表达。
在特定实施方式中，编码成熟的植物过氧化物酶的修饰核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:44的氨基酸118～1068、SEQ ID NO:54的氨基酸94～1092、或SEQ ID NO:66的氨基酸67～972。
在实际中，根据本发明的优化包括以下步骤：
i）如以下更详细阐释的，对编码本发明过氧化物酶的核酸序列进行密码子优化；
ii）检查所得的修饰序列的平衡GC含量（约45～55%）；和
iii）如以下阐释的，检查或编辑从步骤ii）得到的修饰序列。
密码子优化的操作指南（protocol）：
单个基因、多个基因或整个基因组的密码子使用可以使用EMBOSS包的cusp程序进行计算（http://www.rfcgr.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/）。
优化的起始点是蛋白的氨基酸序列或编码蛋白的核酸序列连同密码子表。通过密码子优化的基因，以及密码子表给出的密码子统计信息，我们可知晓编码给定蛋白序列的核酸序列。
提及的密码子统计信息是cusp程序的输出中被称为“Fract”的密码子表中的列，其描述指定密码子在其他同义密码子中的分数。我们把这个称为局部得分（local score）。如果例如编码F的80%密码子是TTC而编码F的20%密码子是TTT，则密码子TTC具有0.8的局部得分，TTT具有0.2的局部得分。
密码子表中的密码子首先是按编码氨基酸进行重排序（例如，按字母顺序）然后按得分来升序排序。在以上的例子中，将F的密码子排序为TTT、TTC。之后通过顺序添加得分来生成密码子的累积得分。在以上的例子中，TTT具有0.2的累积得分，且TTC具有1的累积得分。最常用的密码子通常会具有1的累积得分。
为产生密码子优化的基因，进行如下步骤。对于氨基酸序列中的各个位置，生成0与1之间的随机数字。这是通过在程序运行的计算机系统中的随机数字生成器而完成的。第一个累积得分比所生成的随机数字更大或相等的密码子被选为密码子。在以上例子中，如果基因中的特定位置是“F”且随机数字生成器给出0.5，则TTC被选为密码子。
避免内含子的对策是确保没有分支点。这是通过确保序列中不存在米曲霉中分支点的共有序列CT[AG]A[CT]来完成的。序列[AG]CT[AG]A[AG]可被识别为内含子中的分支点。因此，在本发明的特定实施方式中，根据本发明的方法，这样的序列也可以被修饰或除去。这在后加工步骤中完成，其中对序列扫描该基序的存在，通过将基序中的密码子改变成同义密码子来剔除各个事件，先选择最佳局部得分的密码子。
示出米曲霉α-淀粉酶的密码子使用的密码子表在以下给出。
表1.米曲霉α-淀粉酶的密码子使用
（CUSP密码子使用文档）
Figure BDA00003517197300101
Figure BDA00003517197300111
Figure BDA00003517197300121
内含子
真核基因可能被间插序列（内含子）打断，该间插序列必须在前体转录本中被修饰以产生功能性mRNA。除去内含子的过程被称为前体mRNA剪切。通常，内含子的分支点序列对于经由形成套索的内含子剪切是必须的。剪切信号直接位于内含子剪切位点的边界处。内含子剪切位点的边界通常在其5’和3’端部分别具有共有内含子序列GT和AG。尽管没有报道过AG以外的3’剪切位点，但存在对于5’GT剪切位点有一些例外情形的报道。例如，有一些先例，其中在5’边界处CT或GC代替GT。还有在GT后接核苷酸碱基ANGT的强烈偏好，其中N是A、C、G或T（在酵母（Saccharomyces）种中主要是A或T），但在GT剪切位点之前没有对任何特定核苷酸的明显偏好。3’剪切位点AG之前主要是嘧啶核苷酸碱基（Py），即C或T。
可以打断真菌基因的内含子数量在一个到十二个以上内含子的范围内（Rymond and Rosbash,1992,In,E.W.Jones,J.R.Pringle,and J.R.Broach,editors,The Molecular and Cellular Biology of the YeastSaccharomyces,pages143-192,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York；Gurr等人.,1987,In Kinghorn,J.R.(ed.),GeneStructure in Eukaryotic Microbes,pages93-139,IRL Press,Oxford）。它们可以分布在整个基因上，或朝向基因的5’或3’端分布。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，内含子主要位于基因的5’端。内含子的大小通常可以小于1kb，在酵母中其大小通常小于400bp，并且在丝状真菌中小于100bp。
酿酒酵母内含子分支点序列5’-TACTAAC-3’很少在丝状真菌内含子中出现（Gurr等人.,1987，同上）。在丝状真菌内含子的等同位置观察到与TACTAAC极为相似或略有相似的序列延伸段，其具有一般共有的NRCTRAC，其中N是A、C、G或T，且R是A或G。例如，第四位的T在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和构巢曲霉（Aspergillusnidulans）的推定共有序列中是不变的。此外，核苷酸G、A和C分别在80%多的3、6和7位占优势，尽管构巢曲霉中的7位更灵活，仅有65%的C。然而，在粗糙脉孢菌和构巢曲霉中，1、2、5和8位要不严格得多。其它丝状真菌在其内含子的等同位置具有相似的分支点延伸段，但是样本太小，无法辨明任何确切的趋势。
编码多肽的基因在真菌宿主株中的异源表达可能得到将基因的编码序列内的区域错误识别成间插序列或内含子的宿主株。例如，已经发现，丝状真菌的含内含子基因在酿酒酵母中被错误剪切（Gurr等人.,1987,In Kinghorn,J.R.(ed.),Gene Structure in Eukaryotic Microbes,pages93-139,IRL Press,Oxford）。因为区域未被基因获得来源的亲本株识别成内含子，该内含子被称为隐蔽内含子。内含子（此处指代隐蔽内含子）的不恰当识别可能引起前体mRNA分子的异常剪切，导致不能产生有生物活性的多肽或产生多种具有不同生物活性的多肽产物。
“隐蔽内含子”在本文中被定义为：未被正确识别成从初级mRNA转录本中切除的内含子的编码序列区域。隐蔽内含子优选具有10～1500个核苷酸，更优选为20～1000个核苷酸，甚至更优选30～300个核苷酸，最优选为30～100个核苷酸。
当尝试在对于确定内含子所必需的序列具有不太严格的要求的生物体中表达蛋白时，隐蔽内含子的存在特别成为问题。例如，当试图在真菌表达系统中表达重组蛋白时，可能产生这些“草率”识别。
隐蔽内含子可以通过使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）来鉴定。在RT_PCR中，mRNA逆转录成单链cDNA，其可以经PCR扩增成双链cDNA。之后可以将PCR引物设计成扩增单链或双链cDNA的一部分，将所得PCR产物的序列分析与基因组DNA序列相比，反映出隐蔽内含子的存在和准确位置（T.Kumazaki等人.(1999)J.Cell.Sci.112,1449-1453）。
根据本发明的一个实施方式，引入到野生型基因序列中的修饰将会优化特定宿主生物体中的mRNA表达。在本发明中，宿主生物体或宿主细胞包括被称为丝状真菌的真菌，其在以下将做更详细的解释。
丝状真菌宿主生物体
本发明的宿主生物体（宿主细胞）是以下面的子囊菌门（Ascomycota）为代表的丝状真菌，包括，例如脉孢菌属（Neurospora）、正青霉属（Eupenicillium）（=青霉菌（Penicillium））、翘孢霉属（Emericella）（=曲霉属）、散囊菌属（Eurotium）（=曲霉属）。
在优选实施方式中，丝状真菌包括分支真菌门（Eumycota）和卵菌门（Oomycota）的所有丝状形式（如Hawksworth等人.,In,Ainsworthand Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义的）。丝状真菌的特征是，由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖构成的营养菌丝体。营养生长是通过菌丝延伸进行的，且碳的分解代谢一般是专性需氧的。
在更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是支顶孢属（Acremonium）、曲霉属（Aspergillus）、镰孢霉属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、毛霉属（Mucor）、毁丝霉属（Myceliophthora）、脉孢菌属（Neurospora）、青霉属、梭孢壳属（Thielavia）、弯颈霉属（Tolypocladium）和木霉属（Trichoderma）或其有性型或同物异名型的细胞，但不限制于此。在甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是支顶孢属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是镰孢霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是腐质霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是毛霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是脉孢菌属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是青霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是梭孢壳属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是弯颈霉属细胞。在另一个甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。在最优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、臭曲霉（Aspergillus foetidus）、日本曲霉（Aspergillus japonicus）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、构巢曲霉或米曲霉的细胞。在另一个优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是色变组（section Discolor，也称为镰孢霉组）的镰孢霉细胞。例如，丝状真菌亲本细胞可以是Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、禾谷镰孢菌（Fusariumgraminearum）、禾赤镰孢（Fusarium graminum）、异孢镰孢（Fusariumheterosporum）、Fusarium negundi、Fusarium reticulatum、粉红色镰刀菌（Fusarium roseum）、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、肤色镰孢（Fusarium sarcochroum）、硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）或拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）的细胞。在另一个优选实施方式中，丝状真菌亲本细胞是美丽组（section Elegans）的镰孢霉菌株，例如尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。在另一个最优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉（Humicola insolens）或柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）的细胞。在另一个最优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是Mucor miehei细胞。在另一个最优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophilum）细胞。在另一个最优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是粗糙脉孢菌细胞。在另一个最优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是产紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）或绳状青霉（Penicillium funiculosum）（WO00/68401）细胞。在另一个最优选实施方式中，丝状真菌宿主细胞是太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）细胞。在另一个最优选实施方式中，木霉属细胞是哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、康宁木霉（Trichodermakoningii）、长梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）、里氏木霉（Trichoderma reesei）或绿色木霉（Trichoderma viride）的细胞。
在特定实施方式中，丝状宿主细胞是米曲霉或黑曲霉细胞。
在本发明的优选实施方式中，宿主细胞是蛋白酶缺陷菌株或蛋白酶缺失菌株（minus strain）。
这可以例如是名为“alp”的碱性蛋白酶基因缺失的蛋白酶缺陷菌株米曲霉JaL125。该菌株在WO97/35956（Novozymes）、或EP专利第429,490号中记载，或是在WO96/14404号中公开的无TPAP宿主细胞特别是黑曲霉菌株。此外，根据本发明，在WO01/68864中记载的转录活化物（prtT）产出减少的宿主细胞，特别是黑曲霉或米曲霉，也具体包括在内。
真菌的转化
可以以本身已知的方式通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的工序来转化真菌细胞。转化曲霉宿主细胞的合适步骤在EP238023以及Yelton等人.,1984,Proceedings of the National Academyof Sciences USA81:1470-1474中记载。转化镰孢霉种的适当方法被Malardier等人.,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述过。可以使用Becker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York;Ito等人.,1983,Journal of Bacteriology153:163;以及Hinnen等人.,1978,Proceedingsof the National Academy of Sciences USA75:1920所描述的步骤转化酵母。
生产的方法
本发明还涉及修饰的核酸序列的表达，以生产本发明的过氧化物酶。表达包括，（a）培养从修饰的核酸序列表达过氧化酶的丝状真菌；以及（b）回收过氧化物酶。优选地，丝状真菌是曲霉属，更优选为米曲霉或黑曲霉。
在本发明的生产方法中，使用领域内已知的方法在适合生产多肽的营养介质中培养细胞。例如，可以通过在合适的介质中并在允许多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、在实验发酵罐或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵）来培养细胞。使用领域内已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养介质中进行培养。合适的培养基可以从商业供应方处得到或可以根据已公开的组成（例如，在美国模式培养物集存库的目录中）进行制备。如果多肽被分泌到营养介质中，可以直接从介质中回收多肽。如果多肽未被分泌出去，可以从细胞裂解物中进行回收。
可以使用领域内已知的特定用于多肽的方法来检测多肽，例如对多肽的N端测序。这些检测方法可以包括特定抗体的使用。所得的多肽可以通过领域内已知的方法进行回收。例如，可以通过常规程序从营养介质中回收多肽，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过本领域已知的多种程序进行纯化，包括但不限于色谱（例如，离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻）、电泳法（例如制备式等电聚焦）、差别溶解（例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或提取（参见，例如Protein Purification,J.-C.Janson and LarsRyden,editors,VCH Publishers,New York,1989）。
在另一个方面，本发明涉及编码野生型植物过氧化物酶并能在丝状真菌宿主生物体中表达的修饰核酸序列，例如编码大豆过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:2）、皇家棕榈树过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:4）、杨树过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:45的氨基酸38～354）、玉米过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:55的氨基酸30～362）、或烟草过氧化物酶（例如，SEQ ID NO:67的氨基酸23～324），其中修饰的核酸序列通过以下步骤得到：
i）提供编码过氧化物酶的野生型核酸序列；
ii）修饰至少一个密码子，其中修饰不改变由该密码子编码的氨基酸，且该密码子的核酸序列不同于野生型基因中的对应密码子。
在当前的上下文中，术语“能在丝状宿主中表达”是指，过氧化物酶蛋白的收率应该是至少1.5mg/l，更特别地为至少2.5mg/l，更特别地为至少5mg/l，更特别地为至少10mg/l，甚至更特别地为至少20mg/l，或更特别地为0.5g/L，或更特别地为1g/L，或更特别地为5g/L，或更特别地为10g/L，或更特别地为20g/L。
编码本发明的过氧化物酶并根据本发明被修饰以提供过氧化物酶蛋白在丝状真菌宿主（例如曲霉）中的表达的修饰核酸序列的具体例子在SEQ ID NO:1（大豆过氧化物酶）、SEQ ID NO:3（皇家棕榈树过氧化物酶）、SEQ ID NO:44的氨基酸118～1068（杨树过氧化物酶）、SEQID NO:54的氨基酸94～1092（玉米过氧化物酶）、和SEQ ID NO:66的氨基酸67～972（烟草过氧化物酶）中示出。在本文中公开的信息将使技术人员可以按照以上的指示来分离其他的也可以在丝状真菌中表达的修饰核酸序列，这些序列也包括在本发明的范围内。
方法和组合物
在第一个方面，本发明提供用于重组表达植物过氧化物酶的方法，包括在丝状真菌宿主生物体中表达编码过氧化物酶的核酸序列，其中过氧化物酶的氨基酸序列包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I][I,L][I,L]；和
VSC[A,S]D[I,L][I,L]。
优选地，基序选自：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I]LL；和
VSC[A,S]D[I,L]L。
在一个实施方式中，过氧化物酶是EC1.11.1.7的III类过氧化物酶。
在另一个实施方式中，过氧化物酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列具有至少65%的同一性，优选至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、或至少95%的同一性。
在另一个实施方式中，过氧化物酶由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列构成。
核酸序列可以与用于表达过氧化物酶的合适的控制序列相连。
在另一个实施方式中，为在丝状真菌宿主生物体中翻译，核酸序列的至少一个密码子被优化。优选地，核酸序列的至少一半密码子被优化，以在丝状真菌宿主生物体中翻译。更优选地，核酸序列在至少10%密码子，优选至少20%密码子，更优选至少30%密码子，更优选至少50%密码子，最优选至少75%密码子被密码子优化。最优选地，优化的密码子与米曲霉α-淀粉酶的密码子使用相对应。
在另一个实施方式中，丝状真菌宿主生物体选自支顶孢属、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯颈霉属、或木霉属。优选地，丝状真菌宿主生物体是曲霉菌，更优选为泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。更优选地，丝状真菌宿主生物体是米曲霉或黑曲霉。
在第二个方面，本发明提供编码野生型过氧化物酶并能够在丝状真菌宿主生物体中表达的修饰的核酸序列，其中该修饰的核酸序列与编码野生型过氧化物酶的野生型核酸序列在至少一个密码子上不同，且其中过氧化物酶与大豆过氧化物酶或皇家棕榈树过氧化物酶具有至少60%的同一性，并包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I]LL；和
VSC[A,S]D[I,L]L。
在一个实施方式中，至少一个密码子的修饰被优化，以在曲霉宿主生物体中翻译。优选地，曲霉宿主生物体是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。更优选地，曲霉宿主生物体是米曲霉或黑曲霉。
在另一个实施方式中，密码子使用与米曲霉α-淀粉酶的密码子使用相对应。
在另一个实施方式中，修饰的核酸序列如SEQ ID NO:1、3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66所示。
在第三个方面，本发明提供编码过氧化物酶并能够在丝状真菌宿主生物体中表达的修饰核酸序列，其与选自SEQ ID NO:1、3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66的核酸序列具有至少50%的同一性，优选至少60%的同一性、至少70%的同一性、至少80%的同一性、或至少90%的同一性。
在另一个方面，本发明还提供重组的丝状真菌宿主生物体，包括方面2或方面3的修饰核酸序列。
在一个实施方式中，重组的丝状真菌宿主生物体是曲霉菌；优选地为泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉；更优选为米曲霉或黑曲霉。
在本文中记载且主张权利的本发明的范围不局限于本文公开的具体方面，因为这些方面意在示例说明本发明的一些方面。任何等同的方面都意在包括在本发明范围内。实际上，根据以上描述，除了本文中示出并描述的那些外，本发明的多种改变对于本领域技术人员也是显而易见的。这些改变也意在落入所附权利要求的范围之内。在冲突的情况下，包括定义的本公开将优先。
通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应被认为是限制本发明的范围。
实施例
质粒pENI2516，如WO2004/069872的实施例2所述。
米曲霉菌株ToC1512，如WO2005/070962的实施例11所述。
引物1：
5’-TCCTGACCTAGGACAGCTCACACCCACTTTC-3’
（SEQ ID NO:36）
引物2：
5’-ACAGGTCTTAAGTCATTTGGACTGGGCGACG-3’
（SEQ ID NO:37）
引物3：
5’-TGCCCGCCTAGGAGACCTCCAGATTGGATTCTATAAC-3’
（SEQ ID NO:38）
引物4：
5’-ATCATA CTTAAG TTATCAGGAGTTGACCACGGAACAG-3’
（SEQ ID NO:39）
引物5：
5’-TAATCCTAGGTCAGCTCACACCTACCTTCTAC-3’
（SEQ ID NO:40）
引物6：
5’-GGTACCCTTAAGTCAAATCGAC-3’
（SEQ ID NO:41）
引物7：
5’-TAATCCTAGGTGCCGGTCTCAAAGTGGGATTCTAC-3’
（SEQ ID NO:42）
引物8：
5’-ATTACTTAAGTCAGTTGGTTGCCACGTG-3’
（SEQ ID NO:43）
实施例1
大豆过氧化物酶的克隆和表达
使用如上所述的密码子优化，将DNA序列设计成编码大豆过氧化物酶的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）。基因被特定设计成在米曲霉中表达，并且在任一端加入限制性酶切位点，以方便克隆。之后，经商业供应商合成DNA。
使用分子生物学的标准技术，将编码过氧化物酶的合成基因作为BamHI-AflII片段连接到质粒pENI2516的多克隆位点中，以生成构建体SEQ ID NO:8。该构建体被用作PCR反应的模板，使用引物1和引物2，得到大约大小为1095bp的片段。PCR产物在任一端包含限制性酶切位点，以使AvrII-AflII片段可以连接到现有质粒中，以生成构建体SEQ ID NO:10、12、14、16、18和20。这些构建体包含已知在米曲霉中良好作用的不同分泌信号和prepro序列。所有构建出的质粒都首先转化到大肠杆菌（E.coli）菌株Top10中，对该插入片段测序，以验证核苷酸序列。之后，将质粒转化到米曲霉菌株ToC1512中以用于表达试验。
培养米曲霉的转化菌株，以表达过氧化物酶。通常，将培养在添加有10mM NaNO3的蔗糖琼脂上的菌株的孢子接种在200μL的YP生长介质中。将培养物在96孔无菌微孔板中于34℃培养3～4天，不摇动。通过在SDS-PAGE上存在有正确分子量的条带，以及通过在10-吩噻嗪丙酸（10-phenothiazinepropionic acid（PPT））的存在下能使靛胭脂变白来证实过氧化物酶的表达：
100μL的100mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液，pH6
2μL的10mM靛胭脂
4μL的10mM PPT（于96%乙醇中）
2μL的0.3%过氧化物酶
10μL的发酵液上清液。
通过610nm的吸光度变化来监测酶活性，持续10分钟。通过对从胰蛋白酶的凝胶内消化得到的片段进行质谱分析来证实所表达的过氧化物酶的特性。
所有构建体都表达至少约0.5g/l的活性大豆过氧化物酶。
实施例2
皇家棕榈树过氧化物酶的克隆和表达
皇家棕榈树过氧化物酶的氨基酸序列（SEQ ID NO:4）公开可得（Uniprot D1MPT2），但是没有关于原生分泌信号的信息。因此，将在大豆过氧化物酶的分泌信号中编码的氨基酸融合到皇家棕榈树过氧化物酶的成熟氨基酸序列的N端。如上所述，使用密码子优化，将DNA序列设计成编码该氨基酸序列，以在米曲霉中表达。在任一端加入合适的限制性酶切位点以方便克隆，并经商业供应商合成DNA。
使用分子生物学的标准技术，将编码过氧化物酶的合成基因作为BamHI-AflII片段连接到质粒pENI2516的多克隆位点中，以生成构建体SEQ ID NO:34。该构建体被用作PCR反应的模板，使用引物3和引物4，得到大约大小为1029bp的片段。PCR产物在任一端包含限制性酶切位点，以使AvrII-AflII片段可以连接到现有质粒中，以生成构建体SEQ ID NO:22、24、26、28、30和32。这些构建体包含已知在米曲霉中良好作用的不同分泌信号和prepro序列。所有构建出的质粒都首先转化到大肠杆菌菌株TOP10中，对该插入片段测序，以验证核苷酸序列。之后，将质粒转化到米曲霉菌株ToC1512中以用于表达试验。
培养米曲霉的转化菌株，以表达过氧化物酶。通常，将培养在添加有10mM NaNO3的蔗糖琼脂上的菌株的孢子接种在200μL的YP生长介质中。将培养物在96孔无菌微孔板中于34℃培养3～4天，不摇动。通过在SDS-PAGE上存在有正确分子量的条带，以及通过对ABTS的活性，来证实过氧化物酶的表达：
20μL的10mM ABTS
20μL的0.3%过氧化物酶
140μL的100mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液，pH3
10μL的发酵液上清液。
通过在405nm的吸光度变化来监测酶活性，持续5分钟。通过对从胰蛋白酶的凝胶内消化得到的片段进行质谱分析来证实所表达的过氧化物酶的特性。
所有构建体都表达至少约0.5g/l的活性皇家棕榈树过氧化物酶。
实施例3
杨树过氧化物酶的克隆和表达
如上所述，使用密码子优化，将DNA序列设计成编码杨树过氧化物酶的氨基酸序列（成熟的过氧化物酶是SEQ ID NO:45的氨基酸38～354）。基因具体设计成在米曲霉中表达，在任一端加入限制性酶切位点，以方便克隆。之后，经商业供应商合成DNA。
使用分子生物学的标准技术，将编码过氧化物酶的合成基因作为BamHI-AflII片段连接到质粒pENI2516的多克隆位点中，以生成构建体SEQ ID NO:44。该构建体被用作PCR反应的模板，使用引物5和引物6，得到大约尺寸为977bp的片段。PCR产物在任一端包含限制性酶切位点，以使AvrII-AflII片段可以连接到现有质粒中，以生成构建体SEQ ID NO:46、48、50和52。这些构建体包含已知在米曲霉中良好作用的不同分泌信号和prepro序列。所有构建出的质粒都首先转化到大肠杆菌菌株TOP10中，对该插入片段测序，以验证核苷酸序列。之后，将质粒转化到米曲霉菌株ToC1512中以用于表达试验。
培养米曲霉的转化菌株，以表达过氧化物酶。通常，将培养在添加有10mM NaNO3的蔗糖琼脂上的菌株的孢子接种在200μL的YP生长介质中。将培养物在96孔无菌微孔板中于34℃培养3～4天，不摇动。通过在SDS-PAGE上存在有正确分子量的条带，以及通过对ABTS的活性，来证实过氧化物酶的表达：
20μL的10mM ABTS
20μL的0.3%过氧化氢
140μL的100mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液，pH3
10μL的发酵液上清液。
通过在405nm的吸光度变化来监测酶活性，持续5分钟。所有构建体都表达至少约0.5g/l的活性杨树过氧化物酶。
实施例4
玉米过氧化物酶的克隆和表达
如上所述，使用密码子优化，将DNA序列设计成编码玉米过氧化物酶的氨基酸序列（成熟的过氧化物酶是SEQ ID NO:55的氨基酸30～362）。基因具体设计成在米曲霉中表达，在任一端加入限制性酶切位点，以方便克隆。之后，经商业供应商合成DNA。
使用分子生物学的标准技术，将编码过氧化物酶的合成基因作为BamHI-AflII片段连接到质粒pENI2516的多克隆位点中，以生成构建体SEQ ID NO:54。该构建体被用作PCR反应的模板，使用引物7和引物8，得到大约尺寸为1023bp的片段。PCR产物在任一端包含限制性酶切位点，以使AvrII-AflII片段可以连接到现有质粒中，以生成构建体SEQ ID NO:56、58、60、62和64。这些构建体包含已知在米曲霉中良好作用的不同分泌信号和prepro序列。所有构建出的质粒都首先转化到大肠杆菌菌株Top10中，对该插入片段测序，以验证核苷酸序列。之后，将质粒转化到米曲霉菌株ToC1512中以用于表达试验。
培养米曲霉的转化菌株，以表达过氧化物酶。通常，将培养在添加有10mM NaNO3的蔗糖琼脂上的菌株的孢子接种在200μL的YP生长介质中。将培养物在96孔无菌微孔板中于34℃培养3～4天，不摇动。通过在SDS-PAGE上存在有正确分子量的条带，以及通过对ABTS的活性，来证实过氧化物酶的表达：
20μL的10mM ABTS
20μL的0.3%过氧化物酶
140μL的100mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液，pH3
10μL的发酵液上清液。
通过在405nm的吸光度变化来监测酶活性，持续5分钟。所有构建体都表达至少约0.5g/l的活性玉米过氧化物酶。
实施例5
烟草过氧化物酶的克隆和表达
如上所述，使用密码子优化，将DNA序列设计成编码烟草过氧化物酶的氨基酸序列（成熟的过氧化物酶是SEQ ID NO:67的氨基酸23～324）。基因具体设计成在米曲霉中表达，在任一端加入限制性酶切位点，以方便克隆。之后，经商业供应商合成DNA。
使用分子生物学的标准技术，将编码过氧化物酶的合成基因作为BamHI-AflII片段连接到质粒pENI2516的多克隆位点中，以生成构建体SEQ ID NO:66。构建出的质粒都首先转化到大肠杆菌菌株Top10中，对插入片段测序，以验证核苷酸序列。之后，将质粒转化到米曲霉菌株ToC1512中以用于表达试验。
培养米曲霉的转化菌株，以表达过氧化物酶。通常，将培养在添加有10mM NaNO3的蔗糖琼脂上的菌株的孢子接种在200μL的YP生长介质中。将培养物在96孔无菌微孔板中于34℃培养3～4天，不摇动。通过在SDS-PAGE上存在有正确分子量的条带，以及通过对ABTS的活性，来证实过氧化物酶的表达：
20μL的10mM ABTS
20μL的0.3%过氧化氢
140μL的100mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液，pH3
10μL的发酵液上清液。
通过在405nm的吸光度变化来监测酶活性，持续5分钟。构建体表达至少约0.5g/l的活性烟草过氧化物酶。
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Claims (24)

1.一种用于植物过氧化物酶的重组表达的方法，包括在丝状真菌宿主生物体中表达编码过氧化物酶的核酸序列，其中所述过氧化物酶的氨基酸序列包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I][I,L][I,L]；和
VSC[A,S]D[I,L][I,L]。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基序选自：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I]LL；和
VSC[A,S]D[I,L]L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述过氧化物酶是EC1.11.1.7的III类过氧化物酶。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述过氧化物酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQ ID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列具有至少65%同一性，优选至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述过氧化物酶由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38～354、SEQID NO:55的氨基酸30～362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23～324的氨基酸序列构成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述核酸序列与用于表达所述过氧化物酶的合适的控制序列相连。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述核酸序列的至少一个密码子被优化，以在丝状真菌宿主生物体中翻译。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述核酸序列的至少一半密码子被优化，以在丝状真菌宿主生物体中翻译。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述核酸序列有至少10%的密码子，优选至少20%的密码子，更优选至少30%的密码子，更优选至少50%的密码子，最优选至少75%的密码子被密码子优化。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中所述优化的密码子与米曲霉α淀粉酶的密码子使用相对应。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主生物体选自支顶孢属、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属。
12.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主生物体是曲霉菌，优选为泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。
13.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主生物体是米曲霉或黑曲霉。
14.一种编码野生型过氧化物酶并能在丝状真菌宿主生物体中表达的修饰的核酸序列，其中所述修饰的核酸序列与编码所述野生型过氧化物酶的野生型核酸序列在至少一个密码子上不同，且其中所述过氧化物酶与大豆过氧化物酶或皇家棕榈树过氧化物酶具有至少60%同一性并且包括选自以下的一种、两种或三种氨基酸基序：
HFHDCFV；
GCD[A,G]S[V,I]LL；和
VSC[A,S]D[I,L]L。
15.根据权利要求14所述的修饰的核酸序列，其中至少一个密码子的修饰被优化，以在曲霉宿主生物体中翻译。
16.根据权利要求15所述的修饰的核酸序列，其中所述曲霉宿主生物体是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。
17.根据权利要求16所述的修饰的核酸序列，其中所述曲霉宿主生物体是米曲霉或黑曲霉。
18.根据权利要求14～17中任一项所述的修饰的核酸序列，其中所述密码子使用与米曲霉α淀粉酶的密码子使用相对应。
19.根据权利要求14～18中任一项所述的修饰的核酸序列，其见SEQ ID NO:1、3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66。
20.一种编码过氧化物酶并能在丝状真菌宿主生物体中表达的修饰的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:1、3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66的核酸序列具有至少50%同一性，优选至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性或至少90%同一性。
21.一种重组的丝状真菌宿主生物体，包括权利要求14～20中任一项所述的修饰的核酸序列。
22.根据权利要求21所述的重组的丝状真菌宿主生物体，其为曲霉菌。
23.根据权利要求21所述的重组的丝状真菌宿主生物体，其为泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。
24.根据权利要求21所述的重组的丝状真菌宿主生物体，其为米曲霉或黑曲霉。
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