CN103421201B - 一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法，属于纺织生物技术领域。旨在解决传统方法制备的丝素蛋白膜强力低，膜身硬而脆的缺点，同时避免了化学交联法制膜过程中污染大、丝素膜生物安全性低的缺陷。本发明利用酪氨酸酶的催化氧化作用，在实现丝素蛋白分子间交联的同时，将具有伯胺结构的多肽抗菌剂(如ε-聚赖氨酸、L-多聚精氨酸)接枝到丝素蛋白表面，改善丝素蛋白膜的应用性能，具体工艺流程包括：丝素溶液制备、酪氨酸酶催化氧化丝素、多肽抗菌剂酶促接枝、烘干与成膜。通过本发明制备的丝素蛋白膜不仅抗菌性能得到改善，丝素膜材料的强度、弹性等力学机械性能也得到提高。与基于化学交联的丝素蛋白制膜方法相比，采用酪氨酸酶法制备丝素蛋白膜具有能耗低、效率高、污染少的优点，有利于环境保护。

Description

一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法，是一种利用酪氨酸酶催化氧化作用，改善丝素蛋白膜的力学性能，同时赋予丝素蛋白膜抗菌性的方法，属于纺织生物技术领域。

背景技术

蚕丝蛋白具有良好的生物相容性和环境友好性，以丝素蛋白溶液加工的膜材料具有无毒、无刺激性与抗原性、透水透气性好的特点，是一种性能优良的天然生物制品与药物缓释载体。丝素膜的性能取决于丝素蛋白大分子的形态和结构，一般条件下干燥后制得的丝素膜聚集态结构以无定形为主，膜体硬而脆，物理机械性能较差，水中溶失率高，限制了丝素蛋白膜的应用。为改善丝素膜材料的性能，拓展其在生物医药等领域的应用，需要对丝素蛋白进行改性，对丝素膜制备方法进行优化。

丝素蛋白膜改性方法包括湿热处理、化学交联、与其他高分子共混等。其中，化学交联应用较多，基本原理是利用丝素蛋白分子中具有羟基、氨基、羧基等反应性基团的特点，借助于戊二醛、多元羧酸等交联剂使丝素大分子间共价交联，或与功能性整理剂(活泼单体)发生接枝聚合反应。这类方法在改善丝素膜性能的同时也存在一定的不足，包括交联反应条件苛刻、易产生化学有害物质残留和环境污染等问题。利用生物技术对丝素材料进行功能化改性具有高效、专一、作用条件温和及环境友好的优点，日益成为材料学科领域研究的热点。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种具有催化氧化活性的多酚氧化酶，能催化氧化包括L-酪氨酸、L-多巴在内的酚羟基结构底物形成反应性较强的活性基(多巴醌)，引发底物与伯胺化合物反应。根据这一原理，可借助于酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白中酪氨酸残基产生醌类活性基，引发丝素蛋白大分子间自交联，提升丝素蛋白的膜力学机械性能及化学稳定性；同时还可催化丝素与具有含伯胺结构的功能整理剂接枝，实现丝素蛋白膜的生物酶法功能化制备。在丝素蛋白不同功能化改性加工中，抗菌整理由于可减少微生物滋生、减轻机体细菌感染而具有积极意义。ε-多聚赖氨酸、L-多聚精氨酸等多肽抗菌剂具有与纳米无机银、季铵盐等化学抗菌剂同样的抗菌与消炎作用，可水解病菌细胞壁不溶性黏多糖，也可与带负电荷的病毒蛋白直接结合使多种病毒失活，且这类抗菌肽稳定性较好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用。丝素蛋白膜制备中，可根据抗菌肽结构中具有伯胺结构的特性，借助于酪氨酸酶催化其在丝素蛋白上接枝，制备具有抗菌功能的丝素蛋白膜。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种环境友好、生态安全、能耗低的生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法。以本方法制备的丝素蛋白膜具有较好的力学机械性能，解决了普通丝素膜强力低，膜身硬而脆的缺陷，结合接枝多肽抗菌剂拓展了丝素蛋白膜的应用范畴。

为解决上述技术问题，本发明利用酪氨酸酶的催化氧化作用，将具有氨基的多肽抗菌整理剂与丝素蛋白中酪氨酸残基接枝，提高丝素膜应用性能。

具体工艺如下：

(1)丝素溶液的制备：以溴化锂或氯化钙溶解丝素纤维，制备丝素溶液。

处理工艺处方及条件：将脱胶后家蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液(乙醇溶液)体系中，在70-80℃左右不断搅拌至溶解(浴比1∶10-50)，得到混合丝素溶液。将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析24-48小时，期间每小时换一次水，透析后过滤，制得丝素水溶液。

(2)酪氨酸酶处理：在丝素溶液中添加酪氨酸酶进行催化氧化处理。

处理工艺处方及条件：酪氨酸酶用量为1-200U/g丝素蛋白，温度20-40℃，pH范围6.0-8.0，处理1-24小时。

(3)多肽抗菌剂接枝：酪氨酸酶处理一段时间后，在丝素浴中添加多肽抗菌剂，进行丝素蛋白抗菌改性。

处理工艺处方及条件：多肽抗菌剂用量0.05-5.0g/L，温度20-40℃，pH范围6.0-8.0，处理2-24小时。

(4)烘干：酶促接枝反应结束后，取定量的丝素溶液倒入聚苯乙烯表面皿中，通过延流使其平整铺展，在25-85℃条件下烘干1-12小时，得到抗菌丝素蛋白膜。

基于酪氨酸酶催化天然抗菌整理剂接枝的丝素蛋白膜制备方法，特点是丝素溶液制备可选用不同浓度的溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液；应用的酪氨酸酶包括了动物、植物和微生物等不同来源的酶品种；应用的多肽抗菌整理剂品种包括了不同分子量的ε-聚赖氨酸、L-多聚精氨酸等多肽抗菌剂；丝素蛋白抗菌改性中酪氨酸酶和多肽抗菌剂既可以分步添加至丝素溶液中，也可采用同时添加的方法进行。

本发明的有益后果

本发明利用酪氨酸酶催化氧化丝素，不但改善了丝素膜的力学机械性能，而且提高了膜材料的抗菌性，与传统丝素蛋白膜制备方法相比，本发明具有以下优点：

(1)酶催化效率高，利用酪氨酸酶作丝素蛋白改性的催化剂，在催化丝素蛋白分子间交联和酶促多肽抗菌剂接枝反应中催化效率高，酶制剂用量少。

(2)反应条件缓和，在低温近中性条件下进行完成丝素蛋白交联和抗菌丝素膜的制备，具有能耗低、处理工艺安全环保的优点，避免了化学交联法反应条件苛刻、易造成环境污染和丝素膜生物安全性低等方面的缺陷。

(3)丝素膜性能改善明显，利用酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白分子，不但可促进丝素上酪氨酸残基与丝素肽间共价键合，改善丝素蛋白膜的力学机械性能，通过催化与含氨基的外源多肽抗菌剂接枝，还增强了丝素膜的抗菌性。经湿处理后，丝素膜材料的抗菌效果仍较好。

具体实施方式

采用酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白，实现丝素蛋白自交联和接枝多肽抗菌剂，制备具有较好力学与抗菌性能的丝素蛋白膜，具体实施例如下：

实施例1

(1)丝素溶液的制备：将脱胶后的家蚕丝加入到溴化锂-乙醇-水(质量比45∶44∶11)溶液中，在70℃不断搅拌至溶解(浴比1∶50)，得到混合溶液。将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析24小时，期间每小时换一次水，透析后过滤得到丝素水溶液。

(2)酪氨酸酶处理：在丝素溶液中添加酪氨酸酶(200U/g丝素)，在温度30℃，pH＝7.0条件下处理6小时。

(3)多肽抗菌剂接枝：经酪氨酸酶处理后，在酶浴中添加ε-聚赖氨酸(2g/L)进行酶促接枝，在温度30℃，pH＝7.0条件下处理12小时。

(4)烘干：反应结束后，取40毫升丝素溶液倒入聚苯乙烯的表面皿，在50℃条件下烘干6小时，形成平整透明的抗菌丝素蛋白膜。

试样1：未经酪氨酸酶处理，仅添加ε-聚赖氨酸处理样；

试样2：分别经酪氨酸酶、ε-聚赖氨酸组合处理样；

经上述工艺处理后，试样1断裂强度为25.5MPa，断裂伸长率为1.2％，初始模量为5.6N/mm，37℃热水中的溶失率为8.8％，室温下3次水洗后丝素膜对金黄色葡萄球菌的抑制率为47％；试样2断裂强度为32.3MPa，断裂伸长率为1.8％，初始模量为3.2N/mm，37℃热水中的溶失率为5.9％，室温下3次水洗后丝素膜对金黄色葡萄球菌的抑制率为85％。

实施例2

(1)丝素溶液的制备：将脱胶后的家蚕丝加入到氯化钙-乙醇-水(摩尔比1∶2∶8)溶液中，在70℃不断搅拌至溶解(浴比1∶50)，得到混合溶液。将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析24h，期间每小时换一次水，透析后过滤，得到丝素水溶液。

(2)酪氨酸酶和多肽抗菌剂处理：在丝素溶液中同时添加酪氨酸酶(100U/g丝素)、L-多聚精氨酸(1g/L)，在温度30℃，pH＝7.0条件下同浴处理12小时。

(3)烘干：反应结束后，取40毫升丝素溶液倒入聚丙烯的容器内，在50℃条件下烘干6小时，形成抗菌丝素蛋白膜。

试样3：仅添加L-多聚精氨酸处理样；

试样4：经酪氨酸酶、L-多聚精氨酸处理样；

经上述工艺处理后，试样3断裂强度为20.7MPa，断裂伸长率为1.3％，初始模量为6.2N/mm，37℃热水溶失率为10.2％，室温下3次水洗后丝素膜对金黄色葡萄球菌的抑制率为45％；试样4断裂强度为28.1MPa，断裂伸长率为1.9％，初始模量为3.5N/mm，37℃热水溶失率为6.1％，室温下3次水洗后丝素膜对金黄色葡萄球菌的抑制率为74％。

Claims (5)

1.一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜的制备方法，其特征是利用酪氨酸酶催化氧化丝素进行丝素分子自交联，同时将多肽抗菌剂接枝到丝素表面上，改善丝素膜的力学机械性能与抗菌性，具体步骤如下：

(1)将脱胶后家蚕丝加入到溴化锂或氯化钙乙醇溶液体系，在70-80℃不断搅拌至溶解，得到混合丝素溶液；将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析24-48小时，期间每小时换一次水，透析后过滤，制得丝素水溶液；

(2)在步骤(1)处理后的丝素水溶液中添加酪氨酸酶进行催化氧化处理，处理工艺处方及条件：酪氨酸酶用量为1-200U/g丝素蛋白，温度20-40℃，pH范围6.0-8.0，处理1-24小时；

(3)在步骤(2)的混合液中加入多肽抗菌剂，处理工艺处方及条件：多肽抗菌剂用量为0.05-5.0g/L，温度20-40℃，pH范围6.0-8.0，处理2-24小时；

(4)步骤(3)反应结束后，取定量丝素溶液倒入聚苯乙烯表面皿中，通过延流使其平整铺展，在25-85℃条件下烘干1-12小时，得到抗菌丝素蛋白膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述丝素溶液制备时选用溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液、或氯化钙-乙醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酪氨酸酶来源于动物、植物和微生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述多肽抗菌剂品种包括了不同分子量大小的ε-聚赖氨酸、L-多聚精氨酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)、(3)同时或分步进行。