CN103402526A - 组蛋白抑制 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制个体中细胞外组蛋白的细胞毒性的方法，包括给予所述个体有效量的聚阴离子。具体地，本发明涉及治疗患有败血症的患者的方法，利用聚阴离子与细胞外组蛋白快速形成复合物并因此中和或抑制细胞外组蛋白的细胞毒性，所述细胞外组蛋白例如存在于败血症患者的血液循环中的那些细胞外组蛋白。

Description

组蛋白抑制

发明领域

本发明涉及使用聚阴离子来抑制组蛋白的细胞毒性。此外，本发明涉及使用纳米颗粒标记的组蛋白来筛选抑制组蛋白的细胞毒性的聚阴离子，和使用聚阴离子在败血症治疗中抑制组蛋白的细胞毒性。

背景技术

败血症是针对感染或创伤的全身性炎症反应，其与多种宿主防御机制的激活相关并由其介导，所述宿主防御机制包括细胞因子网络、白细胞、以及补体和凝血/血纤蛋白溶解系统。败血症可由细菌感染、真菌感染、病毒感染和其他感染引起，也可由非感染性刺激例如多发创伤、严重烧伤和器官移植引起。在数小时或数天内，败血症可发展为血管中的自发性凝血、严重低血压、多器官衰竭和死亡。

尽管在临床上使用了现代抗生素，但是，由于不能有效地治疗患有败血症的患者，因此依然存在显著水平的死亡率。由于例如预防移植物排斥而出现免疫受损的患者也处于增加的危险。更多的白血病患者死于败血症而非白血病。据估计，在美国每年有500,000例败血症发作，死亡率大约为35%，有200,000例败血症性休克发作，死亡率为40-70%。败血症是非冠状动脉重症监护室中的主要死亡原因。40%的创伤后医院死亡是由于由败血症引起的多器官功能障碍综合征。

近年来已经进行多次尝试以为败血症患者寻找到有效的新疗法。已经做出相当的努力以产生针对炎症的关键介质的单克隆抗体，例如抗肿瘤坏死因子单克隆抗体，但这些单克隆抗体已经被证明是临床上无效的，并且已经被发现在败血症患者中有危险的副作用。另一种方法是使用纯化的人凝血因子，例如活化的蛋白C(APC)，包括重组人APC(例如)。然而，这些基于APC的败血症疗法几乎没有临床作用。对此有多个原因，包括APC的抗凝血活性，这导致增加的出血危险，因此对于会在手术后或创伤后的患者中出现的败血症，该药物被排除在外。基于相同的理由，对于处于高出血风险的白血病患者，基于APC的败血症治疗也被排除在外。败血症可以快速发展，因此，相对于急性败血症的快速发展，基于APC的败血症治疗的相对较慢的作用方式是不利的。Xigris在2011年10月25日退市。

组蛋白是小的碱性蛋白，其在细胞核中起到调节基因表达并与DNA复合以形成装配成染色质结构的核小体的作用。Xu等(Nat Med.2009.15:1318-21)已经报道应答炎症过程而释放的组蛋白的细胞毒性，其中细胞外组蛋白作用为败血症中内皮细胞功能障碍、器官衰竭和死亡的介质。

本发明是建立在聚阴离子可以与活动物的循环中的细胞外组蛋白复合并抑制其细胞毒性的发现之上的。此外，聚阴离子可以与细胞外组蛋白复合并防止组蛋白在器官中积累。此外，这些聚阴离子可以具有不明显的抗凝血性。

发明简述

本发明人已经确定，可以通过给予寡糖聚阴离子来抑制细胞外组蛋白的细胞毒性和细胞外组蛋白在器官中积累。寡糖聚阴离子的给予提供了改善目前可用的败血症治疗的至少一些缺陷的手段。此外，纳米颗粒标记的组蛋白的使用提供了筛选能够抑制组蛋白在器官中积累的化合物的手段。

在第一方面，提供了抑制个体中细胞外组蛋白的细胞毒性的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的聚阴离子。

在第二方面，提供了抑制受试者中细胞外组蛋白积累的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的聚阴离子。

在第三方面，提供了通过抑制受试者中细胞外组蛋白的细胞毒性而治疗败血症的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的聚阴离子。

在第四方面，提供了有效量的聚阴离子在制备用于通过抑制细胞外组蛋白的细胞毒性而治疗败血症的药物中的用途。

在第五方面，提供了用于治疗败血症的有效量的聚阴离子。

在一实施方案中，所述聚阴离子基本上没有抗凝血活性。

在一实施方案中，所述聚阴离子可以是基本上没有免疫原性。

在一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(I)的聚阴离子性寡糖：

A—(B)_n—D   (I)

其中A和B各自独立地为环状单糖或环状脱氧单糖；

D是环状单糖、环状脱氧单糖、开环单糖或糖醇；

n是选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的整数；并且

其中所述环状单糖、所述环状脱氧单糖、所述开环单糖或所述糖醇中的每一个均独立地、任选地由以下基团取代：OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基或任选地取代的芳烷基；并且

其中所述聚阴离子性寡糖包含至少两个选自以下基团的阴离子性取代基：OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-。

在一实施方案中，所述环状单糖选自：葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。

在另一实施方案中，所述环状单糖选自：葡萄糖、半乳糖和果糖。

在另一实施方案中，所述环状脱氧单糖选自：岩藻糖、脱氧核糖和鼠李糖。

在另一实施方案中，所述糖醇选自：甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、甘露糖醇、卫矛醇(半乳糖醇)、艾杜糖醇和岩藻糖醇。

在另一实施方案中，所述开环单糖选自：葡萄糖、半乳糖、果糖、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(I-a)的聚阴离子性寡糖：

其中各个R¹独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；n是0、1、2、3、4、5、6、7和8中的整数；并且其中至少两个R¹选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(I-b)的聚阴离子性寡糖：

其中各个R¹独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；n是0、1、2、3、4、5、6、7和8中的整数；并且其中至少两个R¹选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是选自以下的聚阴离子性寡糖：

和

其中各个R²独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；并且其中至少两个R²选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是选自以下的聚阴离子性寡糖：硫酸麦芽糖、硫酸麦芽三糖、硫酸麦芽四糖、硫酸麦芽五糖、硫酸麦芽六糖、硫酸麦芽七糖、硫酸麦芽八糖、硫酸麦芽九糖和硫酸麦芽十糖、硫酸潘糖、硫酸异麦芽三糖、硫酸吡喃葡糖基蔗糖（erlose sulfate）、硫酸纤维二糖和硫酸棉子糖。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是聚阴离子性寡糖硫酸纤维二糖。

在一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(II)的聚阴离子性环糊精：

其中每个R³独立地选自：任选地取代的O-烷基、O-芳基、O-芳烷基、O-烯基、O-炔基，OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H，并且每个R⁴独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；x是3、4、5、6、7、8、9和10中的整数，并且其中所述聚阴离子性环糊精包含至少两个选自以下基团的阴离子性取代基：OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

所述环糊精可以是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

在另一实施方案中，提供了筛选组蛋白抑制剂的方法，所述方法包括：

(i)使组蛋白与候选化合物接触；

(ii)确定所述候选化合物与所述组蛋白的结合；

(iii)选择结合所述组蛋白的所述候选化合物。

在另一实施方案中，提供了筛选组蛋白抑制剂的方法，所述方法包括：

(i)提供纳米颗粒标记的组蛋白；

(ii)将所述标记的组蛋白给予测试受试者；

(iii)将候选化合物给予所述测试受试者；

(iv)监控相对于对照受试者组氨酸在器官中的位置；

(v)选择相对于对照受试者改变组蛋白在器官中的位置的所述候选化合物。

在一实施方案中，所述标记的组蛋白可以在所述测试化合物之前、之后或同时被给予所述测试受试者。

在另一实施方案中，提供了筛选组蛋白抑制剂的方法，所述方法包括：

(i)提供纳米颗粒标记的组蛋白；

(ii)使所述纳米颗粒标记的组蛋白与候选化合物接触；

(ii)将所述标记的组蛋白和所述测试化合物给予测试受试者；

(iv)监控相对于对照受试者组蛋白所述测试受试者的器官中的位置；

(v)选择相对于对照受试者改变组蛋白在器官中的位置的所述候选化合物。

在一实施方案中，所述候选化合物是聚阴离子。

在前述的任一方面的一实施方案中，所述聚阴离子抑制组蛋白与细胞、组织或器官的结合。

附图简要说明

通过参照附图，本发明的优选实施方案现将仅通过示例的方式描述，其中：

图1示出了使用针对组蛋白细胞毒性的流式细胞术分析产生的数据的实例，此时人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在体外单独孵育1小时(左图)或在体外与200μg/ml的小牛胸腺组蛋白孵育1小时(右图)。各个图中的数字代表各个象限中的HUVEC百分比，标出了活细胞(钙黄绿素-AM-亮,PI-暗)和死细胞(钙黄绿素-AM-暗,PI-亮)象限。

图2显示了在体外暴露1小时后，不同浓度的小牛胸腺组蛋白(100-800μg/ml)引起(A)HUVEC和(B)人微血管内皮细胞(HMEC)死亡的能力。

图3显示了不同浓度(6.25-100μg/ml)的硫酸麦芽糖、硫酸麦芽三糖、硫酸麦芽五糖、硫酸异麦芽三糖和硫酸β-环糊精抑制小牛胸腺组蛋白(200μg/ml)对HUVEC的体外细胞毒性的能力。

图4显示了更宽浓度范围(1.6-100μg/ml)的硫酸麦芽糖、硫酸麦芽三糖和硫酸麦芽五糖抑制小牛胸腺组蛋白(200μg/ml)对HUVEC的体外细胞毒性的能力。

图5显示了原始流式细胞术数据，表明25μg/ml和100μg/ml的硫酸麦芽三糖可显著抑制小牛胸腺组蛋白(200μg/ml)对HUVEC的体外细胞毒性效应。各个图中的数字代表各个象限中的HUVEC百分比，其中标出了活细胞(钙黄绿素-AM-亮,PI-暗)和死细胞(钙黄绿素-AM-暗,PI-亮)象限。

图6显示了原始流式细胞术数据，表明25μg/ml和100μg/ml的硫酸麦芽三糖可分别完全地和部分地抑制小牛胸腺组蛋白(400μg/ml)对HMEC的体外细胞毒性效应。各个图中的数字代表各个象限中的HMEC百分比，其中标出了活细胞(钙黄绿素-AM-亮,PI-暗)和死细胞(钙黄绿素-AM-暗,PI-亮)象限。

图7证明了用人血小板乙酰肝素酶或黄杆菌乙酰肝素酶从HMEC去除细胞表面硫酸乙酰肝素对小牛胸腺组蛋白(400μg/ml)对HMEC的体外细胞毒性没有影响。

图8证明了表达细胞表面硫酸乙酰肝素的野生型CHO-1细胞系和缺乏硫酸乙酰肝素的突变CHO细胞系(pgsA-745)对于小牛胸腺组蛋白的体外细胞毒性是同样易感的。

图9A是来自γ闪烁扫描法的一系列的30秒采集图，从开始向麻醉的兔的耳静脉中注射用Tc99m-纳米颗粒标记的组蛋白开始。

图9B是来自γ闪烁扫描法的一系列的30秒采集图，从开始向麻醉的兔的耳静脉中注射Tc99m-纳米颗粒开始。

图10A是来自γ闪烁扫描法的一系列的30秒采集图，从开始向麻醉的兔的耳静脉中注射用Tc99m-纳米颗粒标记的组蛋白开始。

图10B是来自γ闪烁扫描法的一系列的30秒采集图，从开始向用15mg/kg的麦芽六糖硫酸钠预处理的麻醉的兔的耳静脉中注射用Tc99m-纳米颗粒标记的组蛋白开始。

图11是来自γ闪烁扫描法的一系列的30秒采集图(第1-4帧)和60秒采集图(第5-8帧)，从开始向用15mg/kg的麦芽四糖硫酸钠预处理的麻醉的兔的耳静脉中注射用Tc99m-纳米颗粒标记的组蛋白开始。

图12是来自γ闪烁扫描法的一系列的30秒采集图，从开始向用15mg/kg的纤维二糖硫酸钠预处理的麻醉的兔的耳静脉中注射用Tc99m-纳米颗粒标记的组蛋白开始。

图13是脂多糖(LPS)诱导的小鼠败血症模型的卡普兰-迈耶存活曲线，以及对测试颗粒1(硫酸麦芽三糖；TA1)、2(硫酸纤维二糖；TA2)和3(肝素；TA3)的体内效能的评估。测试颗粒在第1天与LPS(50mg/kg)通过腹膜内注射共给予，然后通过腹膜内注射每天给药，再持续2天。测试颗粒1和2在2个剂量浓度(高剂量，100mg/kg，和低剂量，15mg/kg)被评价，测试颗粒3在1个剂量(1.1mg/kg)被评价。在图上标记的事件记录直到发现小鼠死亡或小鼠被迫安乐死的时间。

定义

本文所用的某些术语应具有以下含义。

如本文所用，术语“包括”意指“主要包括，但不一定是仅包括”。此外，单词“包括”的变形，例如“包含”和“含有”具有相应的改变的含义。

除非上下文要求相反或明确规定相反，否则以单数形式的整数、步骤或元件述及的本发明的整数、步骤或元件清晰地包括所述及整数、步骤或元件的单数和复数形式。

如本文所用，术语“治疗”是指以任何方式治疗病况或症状，预防病况或疾病的建立，或预防、阻止、减缓或逆转病况、疾病或其他不期望的症状的进展的任何和所有用途。

应当注意，本文在提及在治疗应用中使用时，将被理解为等同地适用于人类和非人类，如兽用。因此，应当理解，除非另外指明，否则在提及患者、个体或个体（individual）时，是指人类或非人类，例如有社会、经济或研究重要性的任何物种的个体，包括但不限于鸟、兔、羊、牛、马、猪、猫、犬、灵长和啮齿类。

在本说明书的上下文中，术语“有效量”在其含义内包括本发明的化合物或组合物提供所需效果的足够的但无毒的量。所需的确切量因个体而异，取决于诸如所需效果、被治疗的物种、个体的年龄和基本情况、被治疗病况的严重性、所给予的具体试剂和给药方式等因素。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定合适的“有效量”。

如本文所用的术语“单糖”在其含义内包括通式C_nH_2nO_n的糖或碳水化合物。例如，术语单糖包括，但不限于，葡萄糖、半乳糖、果糖、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。单糖可以是天然的或合成的。大多数单糖的存在形式为开环单糖或环状单糖。

如本文所用的术语“脱氧单糖”或“脱氧糖”在其含义内包括含有少于碳原子的氧原子的糖，这导致分子中一个或多个碳缺乏相连的羟基。例如，术语脱氧单糖包括，但不限于，岩藻糖、脱氧核糖和鼠李糖。

如本文所用的术语“糖醇”在其含义内包括氢化形式的碳水化合物或单糖，其羰基(醛或酮)已经还原成伯羟基或仲羟基(因此是醇)。糖醇具有通式H(HCHO)_n+1H。例如，术语糖醇包括，但不限于，乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、甘露糖醇、卫矛醇(半乳糖醇)、艾杜糖醇和岩藻糖醇。

如本文所用的术语“寡糖”在其含义内包括由通过糖苷键连接的2至10个单糖残基组成的碳水化合物，其可以由酸水解产生组成成分单糖单元。

如本文所用的术语“多糖”在其含义内包括含有通过糖苷键连接的10个或更多个单糖残基的单糖的聚合物，其可以由酸水解产生组成成分单糖单元。

如本文所用，术语“烷基”在其含义内包括具有1至18个碳原子（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子）的单价直链或支链饱和烃基。例如，术语烷基包括，但不限于，甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等。

如本文所用，术语“亚烷基”在其含义内包括二价的饱和直链烃基。

如本文所用，术语“芳基”在其含义内包括单价的单环或多环的共轭的和稠合的芳香族烃基，例如苯基、萘基、蒽基、芘基、苯并蒽基（phenanthracenyl）。

如本文所用，术语“亚芳基”在其含义内包括二价的单环或多环的共轭的和稠合的芳香族烃基。

如本文所用，术语“芳烷基”在其含义内包括由一个或多个芳基或取代的芳基取代的低级烷基残基，例如苄基、苯甲基、苯乙基、苯丙基、苯基异丙基、苯基叔丁基等。

术语“烯基”是指具有至少一个碳碳双键的烃基。C₂-C₆烯基是在直链或支链烯基主链中具有2-6个碳原子的烯基。示例性的烯基基团包括，但不限于，乙烯基，丙烯基，2-丁烯基等。如同针对烷基所述的，烯基可以被一个或多个部分取代。

本文所用的术语“炔基”是指具有至少一个碳碳三键的烃基。C₂-C₆炔基是在直链或支链炔基主链中具有2-6个碳原子的炔基。示例性的炔基基团包括丙炔基、3-己炔基等。如同针对烷基所述的，炔基可以被一个或多个部分取代。

如本文所用的术语“任选地取代的”意指该术语涉及的基团可以是非取代的，也可以是由独立地选自以下基团的一个或多个基团取代的：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤素、卤代烷基、卤代炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、含氮基团例如NO₂、NO₃ ^-、N(烷基)₂、NH(烷基)、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基氨基和炔基氨基，酰基、烯酰基、炔酰基、酰氨基、二酰氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷硫基、烷基羰基氧基、烷硫基、酰硫基、含磷基团例如膦酰基和氧膦基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯基、异氰酸酯基、含硫基团例如SO₃H、SO₃ ^-、OSO₃ ^-、SO₃烷基、SO₃芳基、NHSO₃H和NHSO₃ ^-，CO₂H、COO^-、CO₂烷基、C(O)NH₂、-C(O)NH(烷基)、和-C(O)N(烷基)₂。优选的取代基包括C_1-10烷基、C_1-10烷氧基、-CH₂-(C_1-10)烷氧基、C_6-10芳基例如苯基、-CH₂-苯基，卤素、羟基、羟基(C_1-10)烷基、和卤代-(C_1-10)烷基例如CF₃、CH₂CF₃。特别优选的取代基包括C_1-10烷基、C_1-10烷氧基、卤素、羟基、羟基(C_1-10)烷基例如CH₂OH、和卤代-(C_1-10)烷基例如CF₃、CH₂CF₃。

如本文所用的术语“败血症”在其含义内包括由标准医学参考文本表征和/或本领域技术人员已知的所有阶段的疾病或病况。例如败血症包括严重败血症、急性败血症、慢性败血症和败血症休克。败血症还包括与烧伤患者、用于癌症患者的治疗方案、产妇的围产期并发症、用于移植受体的免疫抑制性预防和手术后外科患者相关的败血症发作。

如本文所用，术语“纳米颗粒”是指直径小于1微米(1000nm)的任何固体颗粒。具体地，纳米颗粒可以是由多层石墨碳封装的锝-99m放射性核素的金属小片组成的FibrinLite纳米颗粒。FibrinLite纳米颗粒的直径在范围20-400nm间呈对数正态分布，中值直径为约200nm。

发明详述

本发明涉及治疗由于感染而患有败血症的患者的方法，利用聚阴离子与细胞外组蛋白快速形成复合物并因此中和或抑制细胞外组蛋白的细胞毒性，所述细胞外组蛋白例如存在于败血症患者的血液循环中的那些细胞外组蛋白。此外，聚阴离子可以与细胞外组蛋白复合并防止组蛋白在器官特别是肺中积累。在优选实施方案中，通过聚阴离子对凝血和止血的低干涉性和/或他们在循环中存留的能力来选择聚阴离子。

本发明是建立在下述发现之上的：可能具有不明显的抗凝血性质的寡糖聚阴离子能够与活动物的循环中的细胞外组蛋白复合并阻止组蛋白与器官结合。这些聚阴离子在败血症中提供了新的治疗性介入手段，并提供了更富吸引力的替代中和抗体、APC或肝素的使用的手段。

败血症

败血症是特征为动脉血压过低、代谢性酸中毒、全身性血管阻力下降、呼吸急促和器官功能障碍的全身性反应。败血症(包括败血症休克)是针对感染或创伤的全身性炎症反应，其与多种宿主防御机制的激活相关并由其介导，所述宿主防御机制包括细胞因子网络、白细胞、以及补体和凝血/血纤蛋白溶解系统。弥散性血管内凝血(DIC)与纤维蛋白在多个器官的微血管系统中广泛沉积可能是败血症的早期表现。DIC是多器官衰竭综合征的发展中的重要介质，并促成败血症休克患者的不良预后。

败血症可以由于血流中的生物体、它们的代谢产物或毒素而发展。也就是说，败血症涵盖了菌血症、真菌血症、病毒血症和寄生虫血症。因此，败血症休克(通常与多器官衰竭和高死亡率相关的由败血症导致的急性循环衰竭)可以由多种生物体或疾病过程导致。败血症还可由非感染性刺激例如创伤、严重烧伤、肠扭转、羊水栓塞和器官移植导致。

许多患有败血症的患者在24至48小时里表现出快速衰退。因此，快速治疗对于有效的败血症治疗是必要的。遗憾的是，对感染类型的诊断需要鉴定病原体的微生物分析，这需要耗费数天。因此，消除病原体的疗法(例如，抗生素疗法)必须在不知道病原体的类型和种类，并且没有办法知道感染的程度的情况下开始。

已经做出多次尝试以为败血症患者寻找到有效的新疗法，例如针对炎症的关键介质的单克隆抗体和活化蛋白C(APC)。然而这些治疗几乎没有临床作用，并且APC近期已退市。低剂量的肝素已经用于治疗败血症患者，但是其在这种环境下的使用是复杂的且有争议的，原因在于公认的增加的由于较低的血小板量和/或耗尽的凝血因子而产生的败血症患者出血的风险，特别是当败血症已经导致弥散性血管内凝血(DIC)时。通过低剂量肝素耗尽血小板和/或凝血因子随后可能导致凝血功能障碍并可能发生灾难性的大出血。肝素还可能在一些患者中导致被称为肝素诱导性血小板减少症(HIT)的病况，其中抗体介导的血小板破坏也可导致危险的大出血。

组蛋白

组蛋白是具有高含量的赖氨酸或精氨酸的功能为包装DNA的小的碱性蛋白。组蛋白是高度保守的并可分为五大类：H1/H5、H2A、H2B、H3和H4，它们被组织为两个超类：核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)和连接组蛋白(H1和H5)。

通过使DNA绕蛋白复合物缠绕，每一核心组蛋白各两个组装形成八聚体核小体核心颗粒。连接组蛋白结合核小体和进入和离开核小体处的DNA，从而将DNA锁定就位并促进更高级结构的形成。

如本文所述，组蛋白可以是全长组蛋白、其片段或变体。可以通过例如缺失、添加和/或替换氨基酸来修饰组蛋白变体。或者，可以通过赖氨酸和精氨酸的乙酰化和/或甲酰化来修饰组蛋白。通常，所述修饰基本上不会损害组蛋白的聚阳离子性质或组蛋白定位于器官的能力。

合适的氨基酸替换包括，但不一定限于，本领域内已知为“保守的”氨基酸替换。“保守的”替换是指一个氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸替换，这样肽化学领域技术人员会预测，所述多肽的生物活性、二级结构和/或亲水性（hydropathic nature）基本上没有改变。通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行氨基酸替换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸，以及带有不带电荷的极性首基、具有相似亲水性值的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守的改变的其他氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。组蛋白变体还可以含有非保守的氨基酸改变，或者组蛋白变体替代地含有非保守的氨基酸改变。

在某些实施方案中，组蛋白变体可以通过缺失、添加和/或替换氨基酸而被修饰，其与未修饰的序列的差异在于替换、缺失或者添加了5个氨基酸或更少的氨基酸，例如4个、或3个、或2个、或1个氨基酸。

如本文所用的组蛋白“变体”是指与天然存在的组蛋白序列具有基本上相似的序列的组蛋白。通常，如果两个序列具有规定百分比的相同氨基酸残基(“序列同一性”的百分比)，则这两个序列是“基本上相似的”。因此，组蛋白序列的“变体”可以与参照组蛋白序列共有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、83%、85%、88%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

通常，组蛋白序列变体具有共同的定性的生物活性。在术语“变体”的含义内还包括组蛋白的同源物。组蛋白同源物通常来自不同的物种，但与另一物种的相应的组蛋白共有基本上相同的生物学功能或活性。例如，组蛋白的同源物包括但不限于，来自哺乳动物或微生物的不同物种的组蛋白。

此外，术语“变体”还包括组蛋白序列的类似物。组蛋白“类似物”是为给定的组蛋白的衍生物的多肽，所述衍生物包含一个或多个氨基酸的添加、缺失、替换，使得该多肽保留基本上相同的功能。如上所述，术语“保守的氨基酸替换”是指组蛋白序列中一个氨基酸被具有类似性质的另一个氨基酸替换或置换。

在某些实施方案中，组蛋白的“变体”（与相关的组蛋白）的序列差异在于替换、缺失或添加了5个氨基酸或更少的氨基酸，例如4个、或3个、或2个、或1个氨基酸。

本发明的范围还包括组蛋白的片段。组蛋白“片段”是为组蛋白或其变体的组成部分的多肽。通常，片段与该片段为其组成部分的组蛋白具有共同的定性的生物活性。通常，组蛋白片段的长度可以为大于50个氨基酸、约5至约50个氨基酸残基、约5至约45个氨基酸残基、约5至约40个氨基酸残基、约5至约35个氨基酸残基、约5至约30个氨基酸残基、约5至约25个氨基酸残基、约5至约20个氨基酸残基、约5至约15个氨基酸残基、或约5至约10个氨基酸残基。在某些实施方案中，本发明的多肽的片段的长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或大于25个氨基酸残基。

聚阴离子

本发明人认为，组蛋白是具有高等电点的聚阳离子，它们会与除了DNA之外的聚阴离子形成复合物，所述聚阴离子例如硫酸化的聚阴离子性多糖(例如肝素)、聚阴离子性寡糖和二糖、直链聚阴离子、环多醇聚阴离子、和亚芳基脲聚阴离子。

在一些实施方案中，聚阴离子可以与循环组蛋白复合从而抑制其生物学活性，同时对凝血系统没有任何影响。这将为治疗医生提供可以完全独立于败血症患者的血小板计数和凝血状态而使用的更宽剂量范围的聚阴离子的选择——即使在存在DIC时——而不会出血，也不会促进出血。这些聚阴离子还应当不会促进对血小板的破坏。

在优选实施方案中，聚阴离子是稳定的，并且在体内不会快速降解。此外，本文所述的聚阴离子可以是在室温稳定的，并因此可以长期储存而基本上不会降解。

聚阴离子性多糖

肝素是天然存在的硫酸化多糖，在临床医学中作为抗凝血剂广泛使用。在患者中，通过给予药学上可接受的聚阳离子例如鱼精蛋白，其抗凝血活性可以得到控制，甚或被中和。

人们认为，肝素——一种聚阴离子——将与循环聚阳离子性组蛋白复合，因此足以与循环组蛋白复合但不足以具有明显抗凝血效果的剂量的肝素对败血症患者是有益的。本领域技术人员已知的其他聚阴离子性多糖，例如硫酸乙酰肝素（包括蛋白聚糖基底膜蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖）、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、戊聚糖聚硫酸(Elmiron)、舒洛地希(HS/DS)、过硫酸化的透明质酸、岩藻多糖和过硫酸化的硫酸软骨素(

)，也可以足以与循环组蛋白复合但不足以具有可察觉的抗凝血效果的量使用。

在另一实施方案中，所述聚阴离子性多糖可以是已被化学修饰以移除一些硫酸基团的部分去硫酸的肝素、低分子量肝素、或缺乏显著抗凝血活性但保持与组蛋白快速有效复合的能力的化学修饰的肝素(例如，高碘酸盐处理的二醇分割肝素（glycol split heparin）)。在一些实施方案中，所述聚阴离子性多糖可以选自N-乙酰化肝素、二醇分割肝素、二醇分割N-乙酰化肝素、依诺肝素、二醇分割依诺肝素和二醇分割低分子量肝素(3KDa)。

聚阴离子性寡糖

在一实施方案中，所述聚阴离子是具有通式结构(I)的聚阴离子性寡糖：

A—(B)_n—D   (I)

其中A和B各自独立地为环状单糖或环状脱氧单糖；

D是环状单糖、环状脱氧单糖、开环单糖或糖醇；

n是选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的整数；以及

其中所述环状单糖、所述环状脱氧单糖、所述开环单糖或所述糖醇中的每一个均独立地、任选地由以下基团取代：OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基或任选地取代的芳烷基；并且

其中所述聚阴离子性寡糖包含至少两个选自以下基团的阴离子性取代基：OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-。

在一实施方案中，所述环状单糖选自：葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。在另一实施方案中，所述环状单糖选自：葡萄糖、半乳糖和果糖。

在一实施方案中，所述环状脱氧单糖选自：岩藻糖、脱氧核糖和鼠李糖。

在一实施方案中，所述糖醇选自乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、甘露糖醇、卫矛醇(半乳糖醇)、艾杜糖醇和岩藻糖醇。在另一实施方案中，所述糖醇选自山梨糖醇和卫矛醇。

在一实施方案中，所述开环单糖选自：葡萄糖、半乳糖、果糖、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。

在一实施方案中，所述开环单糖可以被芳基胺或烷基胺还原性地胺化。

在一实施方案中，所述环状单糖通过1,1、1,2、1,3、1,4、1,5或1,6键连接。在一实施方案中，所述环状单糖通过1,4或1,6键连接。在一实施方案中，所述环状单糖通过α键连接。在另一实施方案中，所述环状单糖通过β键连接。在另一实施方案中，如果存在超过2个单糖，则每个单糖通过α键连接。在另一实施方案中，如果存在超过2个单糖，则每个单糖通过β键连接。在另一实施方案中，如果存在超过2个单糖，则每个单糖通过α键和β键的组合连接。

在一实施方案中，A、B和D各自是选自以下的环状单糖：葡萄糖、半乳糖和果糖，并且葡萄糖、半乳糖和果糖的各个羟基任选地被SO₃ ^-或PO₃ ^-取代。

所述聚阴离子性寡糖可以选自：硫酸麦芽糖、硫酸麦芽三糖、硫酸麦芽四糖、硫酸麦芽五糖、硫酸麦芽六糖，硫酸麦芽七糖、硫酸麦芽八糖，硫酸麦芽九糖和硫酸麦芽十糖、硫酸潘糖、硫酸异麦芽三糖、硫酸吡喃葡糖基蔗糖、硫酸纤维二糖和硫酸棉子糖。

在另一实施方案中，所述聚阴离子性寡糖可以是硫酸纤维二糖。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(I-a)的聚阴离子性寡糖：

(I-a)

其中各个R¹独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；n是0、1、2、3、4、5、6、7和8中的整数；并且其中至少两个R¹选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。在一实施方案中，n是1、2、3或4。在另一实施方案中，n是1或2。在一实施方案中，各个R¹是OSO₃ ^-。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(I-b)的聚阴离子性寡糖：

(I-b)

其中各个R¹独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；n是0、1、2、3、4、5、6、7和8中的整数；并且其中至少两个R¹选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。在一实施方案中，n是1、2、3或4。在另一实施方案中，n是1或2。在一实施方案中，各个R¹是OSO₃ ^-。

在另一实施方案中，所述聚阴离子性寡糖可以选自以下基团：

麦芽三糖

潘糖

吡喃葡糖基蔗糖

异麦芽三糖

棉子糖

麦芽四糖

纤维二糖

其中各个R²独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；并且其中至少两个R²选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是具有通式结构(II)的聚阴离子性环糊精：

其中每个R³独立地选自：任选地取代的O-烷基、O-芳基、O-芳烷基、O-烯基、O-炔基、OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H，并且每个R⁴独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；x是3、4、5、6、7、8、9和10中的整数，并且其中所述聚阴离子环糊精包含至少两个选自以下的阴离子性取代基：OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

在一实施方案中，x是4、5或6。所述环糊精可以是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

在另一实施方案中，所述寡糖是硫酸化的寡糖或开环寡糖。

在另一实施方案中，所述聚阴离子可以是三糖或四糖的还原性糖末端的硫酸化的开环形式，分别例如麦芽三糖醇和麦芽四糖醇。这些三糖或四糖的衍生物可以是具有烷基基团和芳基基团的还原性地胺化的部分，保持或打开该还原性糖的环均可。

在另一实施方案中，所述聚阴离子是具有以下结构通式的二糖、寡糖、开环二糖或开环寡糖：

E-(G)_a

其中a是1至10的整数；E选自二糖、三糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖、辛糖和壬糖，并且每个独立的G选自：二糖、三糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖、辛糖和壬糖；

其中E和G，以及a是2或更大的整数时G和G，通过选自以下的基团连接：-O-(CH₂)_x-O-、-O-、-OCH₂-、-NH-、-S-、-NR(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xNR₁-、-NR(CH₂)_xNR₁-、-O(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xO-、-C(O)-N(R₂)-(CH₂)_x-N(R₂)-C(O)-、-N(R₂)-C(O)-Ar-(CH₂)_x-Ar-C(O)-N(R₂)-和-N(R₂)-(CH₂)_x-N(R₂)-；R、R₁、和R₂选自：氢、烷基、芳基、杂芳基和C(O)-烷基；

x是0至10的整数；

其中E和G可以被选自以下的官能团取代：烷基、烯基、芳基、卤素、杂芳基、胺衍生物例如-NHCOCH₃-、烷氧基例如-OCH₃-、-O-和-OH；

并且其中所述二糖、三糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖、辛糖和壬糖可以是硫酸化的、磷酸化的或羧酸化的。

在一实施方案中，E和各个G独立地选自戊糖、己糖和庚糖，并且通过选自以下的基团连接：-O-(CH₂)_x-O-、-O-、-OCH₂-、-NR(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xNR₁-、-O(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xO-、-C(O)-N(R₂)-(CH₂)_x-N(R₂)-C(O)-、-N(R₂)-C(O)-Ar-(CH₂)_x-Ar-C(O)-N(R₂)-，并且R、R₁、和R₂选自：氢、乙酰基和烷基，并且x是1至6的整数。

在另一实施方案中，所述己糖可以选自：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、岩藻糖和艾杜糖，并且所述戊糖可以是木糖。

直链和连接的聚阴离子

在其他实施方案中，所述聚阴离子可以是2个通过其还原末端还原性地连接的糖的硫酸化的结构，从而具有开环并呈现直链多元醇结构。例如，连接物–NH₂-CH₂-CHOH-CH₂-NH₂-可以连接2个还原性葡萄糖或葡萄糖醛酸单元。这种类型结构中每个分子的链长和可能的硫酸基团的数量还可通过适当地选择作为起始亚单元的糖的类型来扩展，例如，选择诸如景天庚酮糖的庚糖代替诸如葡萄糖的己糖。在其他实施方案中，所述聚阴离子可以是在环状单糖和开环单糖之间具有接头的硫酸化的结构。

在其他实施方案中，所述聚阴离子可以是碳原子链长为12、13、14、15、16、17或18的聚阴离子性直链多元醇。所述聚阴离子性直链多元醇可以包含不饱和键、饱和或不饱和的支链或环结构。所述聚阴离子性直链多元醇可以任选地被取代。含醇前体实例是1,2,13,14-十四烷-四醇、5-(羟甲基)十一烷-1,5,6,7,11-五醇、十八烷-1,18-二醇和水解的鲨烯衍生物。在一实施方案中，所述聚阴离子性直链多元醇是硫酸化的。在其他实施方案中，所述聚阴离子性直链多元醇包括至少2个选自以下的取代基：硫酸基团、羧酸基团和磷酸基团。

在其他实施方案中，所述聚阴离子可以是基于烷基多元醇或连接到芳香环的聚阴离子性化合物，例如，苏拉明及相关的衍生物。

环多醇聚阴离子

在另一实施方案中，所述聚阴离子是具有以下结构通式的环多醇：

其中：

H选自：N、CH、O、S、或选自-CO-NH-K-NH-CO-、-NH-CO-K-CO-NH-、-NH-K-NH-、-O-K-O-的连接物；

K选自亚烷基和亚芳基；

R₁₀是饱和或不饱和的4元、5元或6元碳环，其中所述环包含至少1个硫酸基团，至少一个羧酸基团或至少一个磷酸基团；

R₁₁选自饱和或不饱和的4元、5元或6元碳环，其中所述环包含至少1个硫酸基团、至少一个羧酸基团或至少一个磷酸基团，氢，芳基和烷基；

J选自：氢、烷基、芳基、-L-C(R₁₂)(R₁₃)和乙酸基；

L选自-(CH₂)_x-、-CH₂-Ar-CH₂-、-CH₂CH(OH)CH₂-、-(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_x，其中所述L基团可任选地包含一个或多个硫酸基团、一个或多个羧酸基团或一个或多个磷酸基团；

R₁₂和R₁₃独立地选自饱和或不饱和的4元、5元或6元碳环、氢、芳基和烷基，其中R₁₂和/或R₁₃可以包含一个或多个硫酸基团、一个或多个羧酸基团或一个或多个磷酸基团，并且x是0至10的整数。

在一实施方案中，L选自-(CH₂)_x-，其中x是2至10的整数，CH₂-Ar-CH₂和CH₂CH(OSO₃H)CH₂。

在可选实施方案中，R₁₀、R₁₁、R₁₂和R₁₃可以独立地选自：

其中T独立地选自：SO₃H、SO₃ ^-、COOH、COO^-、OPO₃H和OPO₃ ^-。

亚芳基脲聚阴离子

在第一方面的另一实施方案中，所述聚阴离子是具有以下通式的亚芳基脲：

其中各个Y独立地选自SO₃H、SO₃ ^-、氢、烷基、卤素、苯基、酰胺衍生物、-NHCOCH₃、NO₃ ^--O-、-OCH₃、COOH、COO^-、OPO₃H和OPO₃ ^-；

各个V独立地选自-(NHC(O)Ph)_z-、(CH₂)_u和苯基；

W是-NH-C(O)-NH-；

u和z可互相独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的整数。

在一实施方案中，亚芳基脲可以是苏拉明或其盐。

可用于本发明的方法和组合物的聚阴离子的实例包括以下：

聚阴离子的制备

用于本发明的组合物和方法中的聚阴离子可以购买或通过本领域技术人员已知的方法制备。

用于本发明的方法和组合物中的硫酸化的寡糖化合物也可以通过本领域技术人员已知的方法对相应的寡糖进行硫酸化来制备。例如寡糖化合物可以用硫酸化试剂例如存在于合适的溶剂中的吡啶-三氧化硫复合物处理。

在本发明的一方面，所述聚阴离子可以是通过使寡糖与吡啶-三氧化硫复合物反应获得的化合物的混合物。

寡糖可以存在一个或多个硫酸基团。这些硫酸基团可以与各种碱反应形成盐。盐形式的硫酸化的化合物是稳定的。游离形式的硫酸化的化合物可以通过使用阳离子交换树脂例如Dowex50W-X8从其盐衍生得到。任选地，可以对盐进行常规的离子交换处理，以将其转化成多种其他所需盐中的任意一种。

硫酸化的寡糖可以是天然产物，例如棉子糖、水苏糖或环糊精。或者，可以通过化学合成制备聚阴离子，或通过酶促或化学降解天然存在的多糖，然后进行化学修饰来制备寡糖。

聚阴离子的抗凝血活性

一些聚阴离子可能具有抗凝血活性。术语“抗凝血活性”是指物质在体外或体内凝血测定中阻止、抑制或延长凝血的活性。

凝血测定是本领域内已知的，并包括测量纤维蛋白凝块形成所需时间的测定。例如，所述测定可以包括凝血酶原时间(PT)、部分促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、纤维蛋白原测定、凝血酶凝血时间(TCT)和活化凝血时间(ACT)。

在一些实施方案中，聚阴离子的抗凝血活性可以影响用于本文所述方法的聚阴离子的临床应用或有效剂量。然而，具有抗凝血活性的聚阴离子仍然可用于本文所述的方法中。在优选实施方案中，聚阴离子基本上没有抗凝血活性。

与正常范围相比，基本上没有抗凝血活性的聚阴离子基本上不会增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。例如，基本上没有抗凝血性质的聚阴离子将不会增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT，或所述聚阴离子将以正常范围的0至约10%增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。在其他实施方案中，所述聚阴离子将以正常范围的约1至约5%增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。在另一实施方案中，所述聚阴离子将以正常范围的约2.5至约7.5%增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。在又一实施方案中，所述聚阴离子将以正常范围的约5至约10%增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。在又一实施方案中，所述聚阴离子将以正常范围的约12.5至约15%增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。在其他实施方案中，所述聚阴离子将以正常范围的约15至约20%增加PT、PTT、APTT、TCT或ACT。

纳米颗粒

标题为“用于检测纤维蛋白凝块的方法”的第6,977,068号美国专利中描述了在纤维蛋白凝块的检测中使用碳封装的放射性核素纳米颗粒的方法。在2006年4月28日提交的公开号为WO2006/116798Al的标题为“形成碳封装的放射性颗粒的可注射放射性组合物的方法”的第PCT/AU2006/000554号国际专利申请描述了用于生产碳封装的纳米颗粒的可注射制剂的方法。该文描述的方法可以被称为“FibrinLite工艺”，并且由此生产的纳米颗粒可以被称为“FibrinLite”。

在允许的范围内，通过引用将US6,977,068和PCT/AU2006/000554(WO2006/116798)的全部内容并入本文中。

应当理解，本领域技术人员会意识到，制备碳封装纳米颗粒复合材料的水性分散液的方法可以包括放射性气溶胶的水捕获步骤，并且该步骤可以通过多种方式完成。例如，用于制备碳封装纳米颗粒复合材料的放射性气溶胶的水捕获步骤可以包括但不限于：在文丘里洗涤器中收集气溶胶，在液体电极上浓缩气溶胶，或使用旋风设备。

在一个实施方案中，可以使用PCT/AU2006/00054中所述的方法来制备碳封装纳米颗粒复合材料，其中所述方法包括利用第5,792,241号美国专利中描述的Browitt沉淀器在水中捕获放射性气溶胶，这份专利的全部内容通过引用纳入。

如之前所述，碳封装纳米颗粒可以提供高比放射活性和高亲合力标记的大分子，例如组蛋白。

如PCT/AU2006/000554所述，碳封装放射性颗粒(纳米颗粒)可以通过以下方式制备：将锝或其他同位素装载在碳坩埚中，预热装载的坩埚，快速排放出颗粒，在水或其他水性溶液中捕获颗粒。

如PCT/AU2006/000554所述，如果同位素的比活性足够高，例如为100mCi/mL，则同位素可以用于通过蒸发法装载合适的石墨坩埚，该方法仅需将一等份的同位素溶液放置在坩埚中，并通过仔细地调节坩埚的电阻加热来蒸干液体。或者，可以通过将坩埚用作阴极，将流体递送管中的细铂丝作为阳极，通过电解方式装载坩埚。该管将同位素溶液递送至坩埚中(并促进其再循环经过坩埚)，并通过电解和持续泵注的联合作用，可以将同位素浓缩在坩埚的内表面上。

装载后，对坩埚进行预热步骤处理，以除去同位素溶液中的任何载体，例如除去氯化钠，优选地通过蒸发到惰性气流例如氩气流中。预热步骤减少了之后脱离（ablate）坩埚的游离碳的量，降低了污染纳米颗粒的游离同位素的水平，并增加了存在于小颗粒部分中的同位素比例。

通过电子伺服装置将预热的坩埚快速加热至例如2740至2790°C，持续3秒，以产生受到严格调控的坩埚加热曲线，其特征为先有一段快速升温时间(例如0.3至0.7秒)，然后是在预定的加热期(例如0.5至15秒)维持在例如2765°C±15°C的一个平台。在该步骤中，纳米颗粒脱离坩埚的表面。

将脱离坩埚的颗粒沉淀在含有低浓度的表面活性剂（例如10微摩尔脱氧胆酸）和非常低的离子强度条件(例如，小于100微摩尔)的水中。在优选实施方案中，纳米颗粒可以沉淀在非常低浓度的弱酸性缓冲液中，或者可以将这种弱酸性缓冲液加入从沉淀器中收集之后的纳米颗粒分散液中，所述弱酸性缓冲液例如终浓度为300微摩尔、pH4.1的柠檬酸二氢钠。

因此，可以将纳米颗粒生产为具有极低电解质浓度（少于1.0mMNaCl的当量）的稳定水性分散液。可以在制备用于本发明的纳米颗粒中，利用在PCT/AU2006/000554中描述的任何颗粒制备方法或由其衍生出的颗粒制备方法。在一实施方案中，这可以通过例如以下方式实现：将装载同位素的石墨坩埚在约1600°C至1650°C加热15秒，以除去载体氯化钠，然后在2700°C以上使放射性同位素脱离。氯化钠的沸点仅为1413°C，并且Tc-99m放射性同位素在该温度下不挥发。当在本发明的方法中利用其他放射性同位素时，本领域技术人员将能够确定脱离的合适温度，例如参考PCT/AU2006/000554。

根据PCT/AU2006/000554制备的纳米颗粒水性分散液静置例如48小时不会絮凝、沉淀或沉积。纳米颗粒的分散液可以包含非常低(例如，约1微摩尔至约20微摩尔，通常为约10微摩尔)浓度的阴离子表面活性剂，通常为脱氧胆酸钠，其与活体的血液循环相容，并且可以注入其中(参见，本文的图5和图6)。可以以任何合适的方式储存纳米颗粒，优选地以保持分散液的稳定性的方式，例如储存在低浓度的弱酸性缓冲液中，例如终浓度为300微摩尔、pH4.1的柠檬酸二氢钠中。纳米颗粒的分散液是稳定的，并且可以通过使用容易获得的亲水性膜滤器来进行大小分级，所述膜滤器例如具有800nm、450nm和220nm孔隙率的市售的Millipore混合纤维素酯(MCE)注射滤器。在常规的纳米颗粒制剂中大于90%的放射性将通过800nm的MCE滤器，并且通过薄层色谱法可以证明该制剂通常包含低于5%的可溶性同位素。

放射性同位素

本领域技术人员会理解，金属元素的任何放射性同位素均可以并入纳米颗粒中。如在PCT/AU2006/000554和PCT/AU2009/000508中所述，可以将不同范围的放射性同位素并入纳米颗粒中，所述放射性同位素包括发出γ射线的那些同位素，例如Tc-99m、Ga-67；发出β射线的那些同位素，例如Y-90；发出α射线的那些同位素，例如Bi-213；和发出正电子射线的那些同位素，例如Cu-64。可以利用任何合适的金属放射性同位素，包括：¹⁹⁸Au、⁶⁴Cu、²¹³Bi、⁵⁷Co、⁵¹Cr、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁹Er、⁵⁹Fe、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹⁵³Gd、¹⁶⁶Ho、¹¹¹In、^113mIn、¹⁷⁷Lu、²³Na、²⁴Na、¹⁰³Pd、⁸¹Rb、⁸²Rb、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁷⁵Se、¹⁵³Sm、^117mSn、⁸⁹Sr、²⁰¹Th、⁹⁰Y、¹⁶⁹Yb、¹⁹²Ir。

可以在纳米颗粒中使用并因此可以在本发明方法中使用的同位素的范围包括理想地适用于诊断成像应用的那些，所述诊断成像应用为例如，使用Tc-99m或Ga-67的单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和使用Cu-64或Zr-89或γ闪烁扫描法的正电子发射断层成像术(PET)。

如在PCT/AU2006/000554和PCT/AU2009/000508中所述，示例性的放射性核素为Tc-99m。每个纳米颗粒能够在其核心中携带成千上万或更多的同位素原子，从而能够容易地获得远远高于用传统标记方法可获得的极高水平的比活性。对于以及使用Tc-99m作为模型封装的放射性同位素，可以制备的Tc-99m的负载为约1mCi至约100mCi、约5mCi至约100mCi、约7.5mCi至约95mCi、约10mCi至约90mCi、约15mCi至约85mCi、约20mCi至约80mCi、约25mCi至约75mCi、约30mCi至约70mCi、约35mCi至约65mCi、约40mCi至约60mCi、约45mCi至约55mCi或约50mCi至约55mCi。能够容易地制备典型的颗粒制剂，从而如所期望地，在2mL的水悬浮系中包含约1mCi至约30mCi。从使用扫描电迁移颗粒粒度仪(SMPS)对颗粒的气相表征可以表明，该悬浮液能够包含大约50μg的纳米颗粒材料，从而使产生的比活性可以高达600mCi/mg或超过22GBq/mg。可以根据需要，通过改变用于在气溶胶发生器中装载坩埚的同位素活性来调节制剂的比活性。

用纳米颗粒标记组蛋白

在优选实施方案中，在标记的组蛋白在体内通常遇见的条件下，对组蛋白的标记基本上是不可逆的。通常，对组蛋白的高亲合力标记使得在在体条件下解离不到约10%。2009年4月23日提交的公开号为WO2009/129577A1的标题为“放射性标记大分子的方法”的第PCT/AU2009/000508号国际专利申请描述了标记生物大分子例如多肽的方法。在允许的范围内，通过引用将PCT/AU2006/000554(WO2009/129577)的全部内容并入本文中。

PCT/AU2009/000508描述了使用纳米颗粒可制备放射性标记的大分子的方法，本发明人利用将金属同位素包裹在碳笼中的碳封装方法(参见PCT/AU2006/000554)，这样同位素与其外部环境的接触被物理地隔离，这对于颗粒并因此对于大分子是一个特别有价值的性质，特别是当它们在体内使用时。由于只有纳米颗粒复合材料的碳外部暴露于体内生物环境中，因此放射性标记的大分子的放射性金属离子在体内的渗出和生物摄入的可能性事实上是不存在的。

PCT/AU2009/000508描述了使用诸如组蛋白的聚阳离子可以包被纳米颗粒的方法，从而所得的颗粒具有高比活性的可检测放射标记的核心以及紧密结合的组蛋白。

根据组蛋白所具有的与器官例如肺的特异性生物相互作用，放射性标记的组蛋白可以用于将可容易地检测的同位素定位到体内的预定位点。例如，如本文例示的，与小牛胸腺组蛋白复合的Tc99m纳米颗粒对肺组织有选择性，并且当给予个体时，其优先靶向肺，如通过γ闪烁扫描法可视化的。以这种方式，组蛋白包被的纳米颗粒可以用作测试候选化合物抑制组蛋白在肺中积累的能力的筛选剂。

使用纳米颗粒放射性标记组蛋白的条件

如此制备或获得的纳米颗粒可以用于PCT/AU2009/000508中所述的放射性标记组蛋白的方法。

如在水性纳米颗粒悬浮液中的疏水性界面，例如空气-水界面、烃-水界面以及推定的石墨-水界面，通常会吸引稍多一些的纯水中的氢氧根离子。结果是这些界面表现为略带负电荷，尽管表面电位通常极低(几十毫伏)。由于吸附了在这些制剂中使用的通常为脱氧胆酸盐的阴离子性表面活性剂，纳米颗粒还可以在其表面携带更多的负电荷。如果该颗粒和某种大分子在同一水性介质中同样地均带负电荷，则在其散开的双层电荷重叠时，它们可以在几十纳米范围内互相轻微地排斥。然而，对该水性介质的pH进行选择，使其中的组蛋白上的净电荷基本为零，例如使其pH为组蛋白的pI，能够非常迅速地屏蔽掉该电位，从而在这样的系统中，对颗粒吸附和内聚至大分子几乎没有能垒。在德拜长度<10nm下，这样的屏蔽将产生这样的状况，即其中吸引性分散、离子相互作用或疏水力通常将控制这些表面的总相互作用能。结果是一旦颗粒与组蛋白结合，该颗粒就将以基本上不可逆的方式牢固地粘附于该大分子。由此该条件会促进组蛋白和纳米颗粒复合材料的亲合结合。在优选实施方案中，其中出现接触的介质所具有的pH或电解质浓度，可以通过逐渐缩小远程静电排斥力的程度和幅度来促进纳米颗粒和组蛋白之间的短程吸引力相对于远程静电排斥力的影响。由于成功地接触，大分子可以被描述为与纳米颗粒复合材料联合或复合。所得的实体还可以被称为复合物。应当注意在本文语境中，术语“复合”和“与……复合”并非旨在暗示组蛋白和纳米颗粒复合材料的任何特别的结构排列，而是指由于成功地接触出现的结构排列，其中它们紧密结合。

可以在合适的pH值和优选地也合适的电解质浓度的条件下，通过使纳米颗粒与大分子接触，将纳米颗粒用于标记组蛋白。可以选择促进上述屏蔽过程并因此使短程吸引力强于排斥静电力的合适溶液条件，这使得纳米颗粒与大分子几乎不可逆地结合。考虑到本文的公开内容，应当理解，对于纳米颗粒和组蛋白之间的所需接触，合适的和最佳的（如果需要）结合条件，例如pH和电解质浓度，能够根据经验确定。

接触可以出现在任何合适的介质中，但通常优选水性介质。在接触之前，可以在合适的储存介质中制备或储存纳米颗粒，通常选择所述合适的储存介质以保持分散液的稳定性。因此纳米颗粒的分散液可以包含非常低(例如，约10微摩尔)浓度的诸如脱氧胆酸钠的阴离子表面活性剂。在本发明方法的接触步骤之前，可以将纳米颗粒预处理以调节分散液的条件来促进纳米颗粒与组蛋白的结合。例如，可以调节诸如缓冲液类型、pH、电解质浓度和类型、表面活性剂的存在或不存在以及包括纳米颗粒在内的任何组分的浓度等的条件。可以在组蛋白存在或不存在的情况下，进行对介质的pH和离子强度的调节。通常，在纳米颗粒存在时，对介质的pH和离子强度的调节出现在还存在大分子的情况下，从而促进纳米颗粒和大分子之间的结合，而不是将导致聚集和凝结的仅纳米颗粒之间的结合。

可以通过使用与组蛋白的pI接近的pH和合适浓度的简单电解质NaCl实现纳米颗粒与该大分子的结合，在大于约1mM NaCl的浓度下，氯化钠会有效地引起纳米颗粒与该大分子的亲合结合。应当理解，可以使用种类繁多的电解质中的任意一种或者多种来实现用于引起纳米颗粒与组蛋白的亲合结合的合适条件。可以使用大于约1毫摩尔的简单电解质浓度来引起纳米颗粒与组蛋白的亲合结合，并因此当纳米颗粒具有放射性颗粒核心时，提供放射性标记的组蛋白制剂。通常，期望用于接触的溶液或介质的简单电解质浓度为约1毫摩尔至约200毫摩尔；通常为约10毫摩尔至约175毫摩尔；约20毫摩尔至约150毫摩尔；约50毫摩尔至约150毫摩尔。更典型地，期望溶液中的电解质浓度为约1毫摩尔至约200毫摩尔；通常为约10毫摩尔至约175毫摩尔；约20毫摩尔至约150毫摩尔；约40毫摩尔至约150毫摩尔；约50毫摩尔至约150毫摩尔；约75毫摩尔至约150毫摩尔；约90毫摩尔至约150毫摩尔；约100毫摩尔至约150毫摩尔；约150毫摩尔。本领域技术人员应当理解，通过例如使用NaCl（其中用约150mM浓度的NaCl可以实现合适的离子强度），或例如低于约75mM浓度的MgSO₄，可以实现用于本发明接触步骤的电解质溶液或介质的离子强度。本领域技术人员还应当理解，通过使用诸如NaCl和MgSO₄混合物的许多不同的离子种类，可以实现电解质溶液的合适离子强度。此外，本领域技术人员应当理解，通过使用至少一种离子种类和至少一种诸如渗透物或高分子量聚合物（如聚乙二醇）的非离子种类可以实现所述离子强度。例如，当水的有效浓度降低时，可能需要增加电解质的浓度，例如以约250mM。

可以使用任何合适的离子种类。例如，所述离子种类可以选自Na、Ni、Al、Ru、Pt、Os、Ir、Fe、Se、Sn、K、Te、Mn、Mo、V、Mg、Zn、Ca、Cu、Co的盐。在优选实施方案中，所述离子种类通常限于在有效浓度下无毒的那些离子，例如Na、K、Ca。

接触步骤中使用的缓冲液可以是任何合适的所选pH，其适合于通过抑制静电排斥力促进纳米颗粒和组蛋白之间的短程吸引力。优选地，缓冲液在约pH3至约pH10的范围内或更高，约pH3至约pH8、约pH3.5至约pH8.5、约pH4至约pH8、约pH4.5至约pH7.5、约pH5至约pH7。更优选地，接触步骤的pH，例如水性介质的pH，接近诸如多肽的待用于接触的大分子的pI。仍然更优选地，接触步骤的pH基本上处于待用于接触的大分子的pI。如本文所述，在考虑到诸如电解质类型、浓度和大分子等的其他反应条件下，本领域技术人员可以确定所需pH和最佳pH。

接触可以包括在接触过程期间改变条件，例如在接触期间升高或降低孵育温度，或在接触期间增加或减少对介质的搅拌或混合。

可以在接触后，对放射性标记的组蛋白进行一个或多个纯化步骤处理。这可以包括将放射性标记的大分子与未标记的大分子和/或游离纳米颗粒复合材料分离。在典型的反应中，接触可以导致纳米颗粒与组蛋白理想的结合以提供放射性标记的组蛋白，同时未反应的组分会保留在接触步骤的水性介质中，通常为未与组蛋白连接的一部分纳米颗粒复合材料。可能需要去除未反应组分，例如在游离纳米颗粒复合材料是有害的情况下，例如血液运输至非靶器官。在以下情况下需要去除未结合的大分子：如果不去除，其将与标记的大分子竞争诸如细胞受体或抗原位点的特异性结合位点，并由此削弱成像能力或筛选敏感性。未反应组分的去除可以是部分的，基本上完全的或者完全的。在本文中，“部分的”去除应理解为包括去除任何量的一种或多种未反应的或不期望的组分，更通常地，去除最高达约80%、90%或95%的一种或多种未反应的或不期望的组分，并且“完全的”去除应理解为去除大于约95%的一种或多种未反应的或不期望的组分。通常优选去除至少95%的未反应的或不期望的组分，更优选去除大于约96%、97%、98%或99%的未反应的或不期望的组分。

因此，应当理解，在本文中，在述及“纯化”时，意图表示任何程度的纯化，由此，与纯化步骤前相比，“纯化”步骤后的放射性标记的大分子(或用放射性同位素的无活性的原始颗粒“标记的”大分子)包含较少杂质，例如所述接触中的未反应的或不期望的组分。

在纯化步骤中可以使用能够将放射性标记的组蛋白与诸如未结合的放射性纳米颗粒或组蛋白的未反应的或不期望的组分分离的任何方法。例如，所述方法可以包括从放射性标记的组蛋白中洗去一种或多种不期望的组分，或者可以包括从一种或多种不期望的组分中提取出放射性标记的组蛋白，或可以包括高速离心，或者可以包括这些步骤的组合。

用组蛋白包被纳米颗粒复合材料的方法

可以根据PCT/AU2006/000554制备碳封装的放射性核素的纳米颗粒复合材料。可以制备包含碳封装的放射性核素(例如，Tc-99m)的纳米颗粒的中性或弱酸性pH的稳定水性分散液。纳米颗粒的分散液还可以包含非常低(例如，10微摩尔)浓度的阴离子表面活性剂脱氧胆酸钠，其与活体的血液循环相容，并且可以注入其中(参见，本文的图5和图6)。这些颗粒中的每一个均能够携带成千上万或更多的同位素原子作为标记源，从而能够容易地获得远远高于用传统标记方法可获得的极高水平的比活性。对于以Tc-99m作为模型封装的放射性同位素的纳米颗粒复合材料，能够容易地制备典型的纳米颗粒制剂，从而如所期望地，在2mL的水性悬浮系中包含约1mCi-约30mCi。从使用扫描电迁移颗粒粒度仪(SMPS)技术对颗粒的气相表征可以表明，该悬浮系包含约50μg的纳米颗粒材料，从而使产生的比活性可以高达600mCi/mg或超过22GBq/mg。

碳封装方法将金属同位素包裹在碳笼中，这样同位素与其外部环境的接触被物理地隔离，这对于颗粒在体内使用时是一个特别有价值的性质。放射性金属离子在体内的渗出和生物摄取的可能性事实上是不存在的。只有纳米颗粒复合材料的碳外部暴露于体内生物环境中。由于所述碳是石墨形式，所以其具有天然吸附性质，并且这可以用作对所选择的多肽的物理吸附的基础。但是，需要首先确定有利于多肽附着的合适的条件，并且以下研究和实例说明了如何确定这些条件。

纳米颗粒复合材料能够通过涉及其石墨表面的疏水或分散相互作用而进行高亲合力的结合。为了使石墨表面与诸如多肽的大分子形成疏水相互作用，该多肽必需能够以非常近的距离接近石墨表面，因此需要静电排斥力被抑制。本发明人证实，在通过将pH调整至接近多肽的等电点，或通过用合适浓度的电解质抗衡离子屏蔽多肽的电荷，从而将该多肽以最小的表面净电荷呈递给纳米颗粒制剂时，可以满足该条件。经验性结合实验可被用于确定合适的结合条件。

筛选方法

本发明提供了筛选调节一种或多种组蛋白的活性的化合物的方法。通常，这些方法包括在适于使候选化合物与组蛋白相互作用的条件下使组蛋白和候选化合物接触，并测定组蛋白的活性或活性丧失。

组蛋白可选自H1、H2A、H2B、H3、H4或H5。组蛋白还可包括不同组蛋白的混合物，例如小牛胸腺组蛋白。在一些实施方案中，可以使用组蛋白的变体、片段和类似物。

在一实施方案中，提供了筛选结合组蛋白的化合物的方法。所述方法利用向测试个体给予一种或多种放射性标记的组蛋白，然后向该测试个体给予一种或多种候选化合物。然后对放射性标记的组蛋白成像，放射性标记的组蛋白的位置使得能够评估候选化合物抑制组蛋白在诸如肺的器官中积累的能力。

在其他实施方案中，候选化合物可以先于放射性标记的组蛋白或与之同时被给予测试个体。或者，候选化合物可以与放射性标记的组蛋白混合，然后将混合物给予测试个体。

可以使用通过本领域内已知的方法的外部成像，例如单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、正电子发射断层成像术(PET)或γ闪烁扫描法。在其他实施方案中，可以使用诸如FITC(异硫氰酸荧光素)的荧光染料或量子点标记组蛋白。在另一实施方案中，可以使用生物发光部分标记组蛋白。从而可以体内确定标记的组蛋白的位置和浓度。

然后，通过本领域内已知的任何模式的成像可以揭示可能是由于候选化合物不能抑制组蛋白积累而致的标记组蛋白在某组织或器官位点的存在或者过多。类似地，与不存在测试化合物的对照标记的组蛋白相比，标记的组蛋白在组织或器官的丰度的降低指示候选化合物抑制组蛋白并阻止在组织或器官的积累。

应当注意，当静脉内注射时，在20分钟内，未标记的纳米颗粒复合材料被网状内皮系统(即吞噬细胞，如肝的库普弗细胞)从循环中几乎完全去除。因此，肝、脾和骨髓中标记的组蛋白的存在或过多可以指示循环的纳米颗粒被网状内皮系统快速清除，这可能是由于候选化合物抑制组蛋白与例如肺结合所致。

组蛋白及其变体、片段和类似物可用于筛选和鉴定与这些分子相互作用的化合物和试剂。具体地，所需化合物是调节这些分子的活性的那些化合物。这类化合物可以通过抑制组蛋白及其变体、片段和类似物的功能而发挥调节作用。此外，组蛋白及其变体、片段和类似物可用于筛选和鉴定促进组蛋白的降解的化合物和试剂。合适的化合物通过直接(例如结合)或间接相互作用发挥他们的作用。或者或另外地，合适的化合物可以通过调节组蛋白及其变体、片段和类似物与其他蛋白或肽的相互作用而发挥他们的作用。

可以通过多种合适的方法鉴定结合组蛋白或者以其他方式与组蛋白相互作用的化合物，特别是调节组蛋白的活性或促进组蛋白的降解的化合物。非限制性方法包括，共免疫沉淀反应、基于免疫学的检测方法例如蛋白质印迹、亲和层析、凝胶过滤、凝胶迁移分析、质谱、串联亲和纯化、噬菌体展示、标记转移、蛋白微阵列。

此外，可以通过候选化合物对组蛋白功能的影响评估这些候选化合物结合组蛋白或以其他方式与组蛋白相互作用的能力，以及调节组蛋白的活性或促进组蛋白降解的能力。可以根据本领域内已知的任何方法测量功能。

亲和层析

亲和层析可以用于确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与组蛋白或其变体或片段相互作用或结合。例如，可以将组蛋白、其变体、片段或类似物固定在支持物(例如琼脂糖)上，并使候选化合物单独地或混合地过柱。然后可以将结合到固定的组蛋白多肽或其变体或片段的化合物从该柱上洗脱下来，并通过例如质谱对其进行鉴定。

以这种方式，可以鉴定不与组蛋白、其变体、片段或类似物直接相互作用的蛋白或其他化合物。例如，相应地，与组蛋白直接相互作用的化合物可与可以调节组蛋白活性但不与组蛋白直接相互作用的试剂联合。化合物和联合试剂与固定的组蛋白多肽或其变体或片段的复合物将促进对可以调节组蛋白活性但不与组蛋白直接相互作用的化合物的鉴定。

通过本领域技术人员已知的多种技术通过上述方法可以产生供筛选的潜在的组蛋白活性调节物。例如，诸如X射线晶体学和核磁共振光谱学的方法可以用于对组蛋白、其变体、片段或类似物建模，从而促进通过使用计算机建模设计潜在的调节试剂。多种形式的组合化学也可用于产生推定的调节物。

组蛋白、其变体、片段或类似物可以用于高通量筛选中，以测定候选化合物与其结合或者以其他方式相互作用的能力。可以进一步针对功能性组蛋白、其变体、片段或类似物筛选这些候选化合物，以确定所述化合物对酶活性的影响。

免疫学方法

免疫学方法可以用于确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与组蛋白或其变体或片段相互反应或结合。在一实施方案中，组蛋白或其变体或片段可以与至少一种候选化合物接触，然后使用免疫沉淀确定一种候选试剂或多种候选试剂是否与组蛋白或其变体或片段相互作用或结合。使用这种技术，至少一种候选化合物可以与组蛋白或其变体或片段接触，通常通过将各自的溶液混合。然后，可以将该混合物(样品)与对候选化合物或组蛋白特异的抗体孵育，其可从溶液中免疫沉淀出来，例如通过用连接到固体支持物的抗体结合蛋白捕获。通过这种方法，蛋白的免疫沉淀促进了与该蛋白联合的试剂的共免疫沉淀。使用多种本领域内已知的方法可以建立对联合的试剂的鉴定，所述方法包括但不限于，SDS-PAGE、蛋白印迹和质谱。

可以将对候选化合物或组蛋白特异的抗体固定在支持物上。为检测与组蛋白联合的候选化合物，通常涉及在适合固定的抗体与组蛋白或候选化合物之间的结合的条件下，使固定的抗体与推定包含与组蛋白联合的候选化合物的样品接触，并用合适的试剂冲洗支持物以去除未结合的样品。然后，例如通过用变性剂洗涤来洗脱推定包含与组蛋白联合的候选化合物的结合的样品，并可以利用本领域内已知的多种方法确定结合的样品的组分的特性，所述方法包括但不限于SDS-PAGE、免疫印迹和质谱。

可以通过直接的结合将抗体固定在支持物上，或经由一种或多种其他化合物将抗体间接地结合在支持物上。合适的支持物的非限制性实例包括由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯制造的试验板(例如微量滴定板)或试管，膜(例如，硝酸纤维素膜)，珠/盘(包括磁珠和磁盘)，和颗粒材料如滤纸，硝酸纤维素膜，Sepharose，琼脂糖、交联葡聚糖、和其它多糖。

在某些实施方案中，以酶联免疫吸附试验(ELISA)的形式进行对与组蛋白或其变体或片段相互作用或结合的一种候选试剂或多种候选试剂的检测。通常，该试验涉及将合适的捕获试剂包被在由诸如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料制造的固体支持物例如微量滴定板的孔或柱上。在一实施方案中，使用抗组蛋白抗体作为捕获试剂。在另一实施方案中，通过将至少一种候选化合物包被在固体支持物上制备捕获试剂。在另一实施方案中，捕获试剂可以是肝素、硫酸乙酰肝素、与牛血清白蛋白缀合的硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如，基底膜蛋白聚糖)、哺乳动物细胞等。在另一实施方案中，组蛋白可以用作捕获试剂。

捕获试剂可以连接到支持物的表面，例如通过非共价或共价相互作用或物理连接。如果使用共价键，可以利用交联剂将捕获试剂连接到支持物(例如，戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双官能马来酰亚胺)。

可以用封闭剂(例如，脱脂乳、牛血清白蛋白、酪蛋白、卵白蛋白)处理支持物，以阻止材料与支持物的表面上的过量位点的不期望的结合。

可以在包被和封闭之后将样品给予到支持物的表面。通常，使用合适的缓冲液将样品稀释到合适的水平。样品稀释的程度和对合适的缓冲液的选择将取决于多种因素，例如待分析的样品、以及试验中使用的支持物和捕获试剂的类型。本领域技术人员可以确定这些因素而无需创造性劳动。

一旦将样品施加到包被有捕获试剂的支持物上，通常就在适于最大化试验的灵敏度和最小化解离的条件下孵育样品。可以在大致恒定的温度下进行孵育，所述温度为约0°C至约40°C，优选地约20°C至约30°C。孵育混合物的pH值可以为约4至约10，优选地约6至约9，更优选地约7至约8。在一实施方案中，孵育混合液处于pH7.4。可以利用多种缓冲液以在孵育期间实现和维持目标pH，缓冲液的非限制性实例包括Tris^-磷酸盐、Tris-HCl、硼酸盐、磷酸盐、醋酸盐和碳酸盐。孵育时间通常与温度有关，并可以少于约12小时以避免非特异性结合。优选地，在室温下，孵育时间为约0.5小时至约3小时，更优选地为约0.5小时至约1.5小时。

孵育后，可以从固定的捕获试剂去除生物样品，以去除未结合的样品，例如通过洗涤/冲洗支持物。合适的洗涤缓冲液的pH可以为约6至约9，优选地约7至约8。洗涤/冲洗可以进行三次或更多次。可以使用通常温度为约0°C至约40°C、优选地约4°C至约30°C的洗涤缓冲液进行洗涤/冲洗。

在下一步中，可以使结合到捕获试剂的样品的被固定组分与检测试剂接触。对检测试剂的选择可以取决于多种因素，包括利用的捕获试剂和待分析的样品的类型。优选地，使结合到捕获试剂的样品的被固定的分子与检测试剂在约20°C至约40°C的温度、优选地在约20°C至约25°C的温度接触。在一实施方案中，使结合到捕获试剂的样品的被固定的分子与检测试剂在室温(RT)下接触约1小时。检测试剂可以是抗体。在检测试剂是抗体的应用中，优选抗体相对于最大浓度的固定在支持物上的样品的分子是摩尔过量的。可以直接或间接地检测抗体。抗体可以具有比色标记或荧光标记。可以使用结合检测试剂的其他抗体。所述其他抗体可以具有比色标记或荧光标记。

可以使用本领域内已知的方法实现对结合到捕获试剂的样品的存在和水平的确定，并该确定将取决于使用的检测试剂。例如，检测可以包括比色法、化学发光法或荧光测定法。可以根据来自检测试剂的信号相比于来自对照样品的背景信号来进行检测和定量测量。

对败血症的治疗

对败血症的治疗通常涉及治疗病况的根本病因，例如通过抗生素疗法。尽管已经开发出了替代治疗，例如活化蛋白C(APC)，但是由于所述治疗剂的抗凝血性质或相对于败血症的快速进展的缓慢作用模式，这些替代治疗几乎没有临床作用。

近来，已经将组蛋白毒性鉴定为败血症中内皮细胞功能障碍、器官衰竭和死亡的介质。本发明人发现，寡糖聚阴离子可能具有不显著的抗凝血性质，可以与活动物的循环中的组蛋白复合并阻止组蛋白在器官中积累。这提供了治疗败血症的基础，其通常涉及向需要这类治疗的患者给予至少一种聚阴离子。

组合物、剂量和给药途径

用于本发明的聚阴离子可以以组合物形式治疗性地或预防性地给予。在治疗应用中，以足以消退或部分地阻止疾病和/或其并发症或足以改善患者的存活的量，将组合物给予已患疾病(例如败血症)的个体。

通常，合适的组合物可以根据本领域技术人员已知的方法制备，因此可包含可药用载体、稀释剂和/或佐剂。

制备可给予的组合物的方法对本领域技术人员是显而易见的，并更详细地描述于，例如Remington's Pharmaceutical Science(雷明顿制药科学),15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.，这份参考文献通过引用将其整体并入本文。

聚阴离子的存在形式可以为可药用盐。“可药用盐”是指这样的盐：在合理的医学判断范围内，其适于用于与人或低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变态反应等，并且与合理的收益/风险比相匹配。可药用盐在本领域是公知的。

对于任何具体的个体，本文公开的聚阴离子的治疗有效量将取决于多种因素，包括：败血症的严重程度；所利用的组合物的活性；患者的年龄、体重、一般情况、性别和饮食；给药的时间；给药途径；组合物的利用率（rate of sequestration）；治疗的持续时间；与治疗组合或同时使用的药物，以及医学内公知的其他相关因素。

本领域技术人员将能够通过常规试验确定实现本发明的方法的所需结果所需要的制剂的组分的有效的无毒量。

通常，预期聚阴离子的有效剂量为每kg体重每24小时约0.0001mg至约1000mg；通常，每kg体重每24小时约0.001mg至约750mg；每kg体重每24小时约0.01mg至约500mg；每kg体重每24小时约0.1mg至约500mg；每kg体重每24小时约0.1mg至约250mg；每kg体重每24小时约1.0mg至约250mg。更典型地，预期有效剂量为每kg体重每24小时约1.0mg至约200mg；每kg体重每24小时约1.0mg至约100mg；每kg体重每24小时约1.0mg至约50mg；每kg体重每24小时约1.0mg至约25mg；每kg体重每24小时约5.0mg至约50mg；每kg体重每24小时约5.0mg至约20mg；每kg体重每24小时约5.0mg至约15mg。

或者，聚阴离子的有效剂量可以最高达约500mg/m²。通常，预期有效剂量为约25至约500mg/m²，优选地约25至约350mg/m²，更优选地约25至约300mg/m²，更优选地约25至约250mg/m²，更优选地约50至约250mg/m²，更优选地约75至约150mg/m²。

此外，对本领域技术人员显而易见的是，每次给药最佳的剂量和间隔由被治疗的败血症的性质和程度、给药的形式、途径和位点、以及被治疗的具体个体的性质确定。此外，可以通过常规技术确定所述最佳条件。在一些治疗应用中，治疗在败血症期间持续。

对本领域技术人员还将是显而易见的是，可以由本领域技术人员使用常规的疗程确定测试确定最佳疗程，例如持续给定小时数或天数的每小时或每天给予的聚阴离子的剂数。

通常，合适的组合物可以根据本领域技术人员已知的方法制备，因此可包含可药用载体、稀释剂和/或佐剂。

常规的给药模式包括注射(皮下、静脉内、动脉内等)、口服给药、鼻内给药或吸入。根据给药途径，可以用某种材料包被制剂和/或聚阴离子，以使聚阴离子免于可能使化合物的治疗活性失活的酶、酸和其它自然条件的作用。聚阴离子还可以肠胃外或腹膜内给药。

聚阴离子的分散液还可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中和在油中制备。在正常的保存和使用条件下，药物制剂可以包含防腐剂，以防止微生物生长。

适合于注射的药物组合物包括无菌水性溶液(可溶于水的情况下)或分散液，以及用于随时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。理想地，组合物在制备和保存条件下是稳定的，并且可以包含防腐剂，以稳定组合物来对抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。

在本发明的一实施方案中，本发明的聚阴离子可以口服给药，例如与惰性稀释剂或可吸收的可食用载体口服给药。聚阴离子和其它成分还可以装入硬壳或软壳明胶胶囊中，被压制为片剂或直接合并入个体的饮食中。对于口服治疗给药，聚阴离子可以与赋形剂合并，并且可以以可摄取片剂、含服片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片等形式使用。适宜地，这样的组合物和制剂可以包含以重量计至少1%的活性聚阴离子。当然，聚阴离子在药物组合物和制剂中的百分比可以变化，例如可以方便地为剂量单位重量的约2%至约90%、约5%至约80%、约10%至约75%、约15%至约65%、、约20%至约60%、约25%至约50%、约30%至约45%、或约35%至约45%。治疗上有用的组合物中的聚阴离子的量使得可获得合适的剂量。

在本发明的另一实施方案中，聚阴离子可以以脂质体的形式给予。脂质体通常源自磷脂或其他脂质材料，并由散布于水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理上可接受的且可新陈代谢的脂质。脂质体形式的组合物可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然的以及合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域内已知的，并具体参照以下文献：Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,NewYork,N.Y.(1976),p.33et seq.，该文献通过引用将其内容并入本文。

术语“可药用载体”旨在包括溶剂、分散介质、包被剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。可药用载体或稀释剂的实例是：去离子水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生(peanut)油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油例如花生(peanut)油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生(arachis)油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如聚甲基硅氧烷、聚苯基硅氧烷和聚甲苯基硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；西黄蓍胶或阿拉伯树胶，和凡士林。通常，所述一种或多种载体将占所述组合物重量的10%至99.9%。

将这些介质和试剂用于药物活性物质在本领域是公知的。除非任何常规介质或试剂与聚阴离子是不相容的，否则考虑其在治疗组合物和治疗及预防方法中的使用。补充的活性化合物也可以被合并入本发明的组合物中。为方便给药和使剂量均一，将胃肠外组合物配制成单位剂型是特别有利的。本文使用的“单位剂型”是指适合作为用于待治疗个体的单位剂量的物理分离单位；包含预定量聚阴离子的每一单位经计算会与需要的药物载体联合产生所需的治疗效果。为了方便有效地给药，可以将有效量的聚阴离子与适当的可药用载体配制为可接受的剂量单位。在组合物包含补充的活性成分的情况下，参考所述成分的通常剂量和给药方式来确定剂量。

在一实施方案中，载体可以为可口服给药的载体。

药物组合物的另一形式是配制为适合于口服给药的肠包衣颗粒、片剂或胶囊剂的剂型。

本发明的范围内还包括延迟释放制剂。

聚阴离子还可以以“前药”的形式进行给药。前药是在体内转化为活性形式的化合物的无活性形式。合适的前药包括活性形式的聚阴离子的酯、磷酸酯等。

用于口服使用的合适的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯树胶、西黄蓍胶、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂还可包含合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，可以用延迟崩解的化合物例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包被胶囊。

在一个实施方案中，化合物可通过注射进行给药。对于可注射溶液，载体可以为包含诸如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物的溶剂或分散介质、和植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。通过包含各种抗细菌剂和/或抗真菌剂能够实现对微生物作用的预防。合适的试剂为本领域技术人员所公知，并且包括例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、苄醇、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情况下，可以优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，诸如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇，氯化钠。通过在组合物中包含诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的试剂可以实现可注射组合物的延长吸收。

可以通过以下方式制备无菌可注射溶液：将所需量的聚阴离子与上文列举的所需的一种或多种成分并入合适的溶剂中，随后过滤灭菌。通常地，通过将类似物并入无菌媒介中来制备分散液，所述媒介包含基础分散介质和上文列举的所需的其它成分。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可以包含以下物质：结合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸氢钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除了以上类型的材料外，其还可以包含液体载体。各种其它材料可以以包衣的形式存在，或者可以存在来以其他方式修饰剂量单位的外形。例如，可以用虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂或胶囊剂。糖浆剂或酏剂可以包含所述类似物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料和诸如樱桃味或桔子味的调味剂。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料应当是药学纯的并且在使用的量下是基本上无毒的。此外，所述类似物可以被合并入缓释制剂和药剂中。

药物组合物还可以包含合适的缓冲液以最小化酸水解。合适的缓冲剂为本领域技术人员所公知，并且包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐及其混合物。

本发明的药物组合物可以进行单次或多次给药。本领域技术人员通过常规实验能够确定聚阴离子的有效的、无毒的剂量水平和/或适于治疗败血症的给药方式。

组合方案

通过组合方案可以实现治疗益处。本领域技术人员将意识到，本文所述的聚阴离子可以作为败血症的治疗的组合疗法途径的一部分给予。在组合疗法中，各种试剂可以同时或以任何顺序依次给予。当依次给予时，可以优选将各组分通过相同的途径给予。

或者，可以将各组分以单一剂量单位、作为组合产品形式配制在一起。可与本发明的组合物组合使用的合适的试剂将为本领域技术人员所知。

本发明的治疗方法可以与常规疗法联合施用。常规疗法还可包括给予抗炎药、抗生素试剂、抗病毒剂、抗真菌剂或其他形式的医学介入，例如使用APC。

示例性的抗炎药包括类固醇、皮质类固醇、COX-2抑制剂、非类固醇类抗炎药(NSAID)、阿司匹林或它们的任意组合。

抗生素试剂的实例包括氨基糖苷类、安沙霉素类、碳头孢烯类，碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、单环β-内酰胺类、青霉素类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。

抗病毒剂的实例包括非核苷类逆转录酶抑制剂、核苷类逆转录酶抑制剂(如核苷类似物)、蛋白酶抑制剂和核苷类似物逆转录酶抑制剂。

抗真菌剂的实例包括咪唑类、三唑类、噻唑类、烯丙基胺类和棘白菌素类。

本文公开的聚阴离子可以治疗性地或预防性地给予。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分地阻止败血症及其症状和/或并发症的量，向已患败血症的患者给予化合物和组合物。所述化合物或组合物应当提供足以有效地治疗患者的量的活性化合物。

可以向败血症临床表现明显之前的患者（例如具有发展为败血症风险的患者）给予本文公开的聚阴离子。

载体、稀释剂、赋形剂和佐剂

载体、稀释剂、赋形剂和佐剂必须在与组合物的其他成分的相容性方面是“可接受的”，并且对其接受者无害。这类载体、稀释剂、赋形剂和佐剂可以用于增强本发明的组合物的完整性和半衰期。这些还可用于增强或保护本发明的组合物的生物活性。

可药用载体或稀释剂的实例是：去离子水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生(peanut)油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生(arachis)油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如聚甲基硅氧烷、聚苯基硅氧烷和聚甲苯基硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；西黄蓍胶或阿拉伯树胶，和凡士林。通常，所述一种或多种载体将占所述组合物重量的10%至99.9%。

载体还可包括与本发明的化合物共价键合的融合蛋白或化合物。这类生物和化学载体可以用于增强化合物向靶标的递送或增强化合物的治疗活性。用于产生融合蛋白的方法是本领域内已知的，并描述于例如Ausubel et al(In:Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术).Wiley Interscience,ISBN047150338,1987)和Sambrook et al(In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册),ColdSpring Harbor Laboratories,New York,Third Edition2001)。

本发明的组合物可以为适于通过注射进行给药的形式、适于口服摄取的制剂的形式(例如，胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适于外部给药的软膏、霜剂或洗剂的形式、适于作为滴眼剂递送的形式、适于通过吸入进行给药（例如通过鼻内吸入或口内吸入）的气溶胶形式、适于肠胃外给药（即皮下注射、肌内注射或静脉内注射）的形式。

对于以可注射溶液或悬浮液形式给药，无毒肠胃外可接受稀释剂或载体可包括：林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2-丙二醇。

用于口服使用的合适的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂的一些实例包括：花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯树胶、西黄蓍胶、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂还可包含合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，可以用延迟崩解的化合物例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包被胶囊。

用于口服给予的固体形式可包含人和兽药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包被剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜（aspartame）或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔豆胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢钙。合适的调味剂包括：薄荷油、冬青油、樱桃、橙或木莓调味剂。合适的包被剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物，蜡，脂肪醇、玉米醇溶蛋白，虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

除了上述试剂外，用于口服给药的液体形式还可以含有液体载体。合适的液体载体包括水，油，如橄榄油、花生(peanut)油、芝麻油、葵花油、红花油、花生(arachis)油、椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丙三醇，脂肪醇，甘油三酸酯或它们的混合物。

用于口服给药的悬浮液可进一步包括分散剂和/或助悬剂。合适的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、藻酸钠或乙酰基醇。合适的分散剂包括卵磷脂，诸如硬脂酸的脂肪酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇的单或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇的单或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸等。

用于口服给药的乳剂还可以包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上文列举的分散剂或天然树胶，例如瓜尔豆胶、阿拉伯树胶或西黄蓍胶。

治疗的时间安排

本领域技术人员将会理解，在诊断或随后，可以将聚阴离子作为单一药物或作为败血症治疗的组合疗法途径的一部分给予，例如，作为后续治疗或巩固治疗，以作为目前可用的败血症治疗的补充。还可用作为阻止败血症发展的预防的一部分的合适的无毒聚阴离子，例如与抗生素一起，治疗已知处于败血症的高风险的患者。

现在，将参考以下实施例，仅通过举例说明的方式，更详细地描述本发明。实施例旨在用于说明本发明，不应当解释为限制贯穿本说明书的描述的公开内容的通用性。

实施例

实施例1：通过不同的聚阴离子抑制组蛋白对人内皮细胞的细胞毒性作用。

首先评估不同浓度的小牛胸腺组蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人微血管内皮细胞(HMEC)的毒性。将199培养基/20%胎牛血清(FCS)中的HUVEC/HMEC悬浮液分配至96孔板的每个孔中(50μl培养基中1×10⁵个细胞/孔)。然后加入小牛胸腺组蛋白(M199/20%FCS中50μl/孔)，终浓度为100-800μg/ml，然后加入25μl/孔的PBS中的钙黄绿素-AM(终浓度0.04μM)和25μl/孔的PBS中的碘化丙啶(PI，终浓度2.5μg/ml)。每个96孔板在5%CO₂培养箱中在37°C下孵育60分钟，置于冰上，并通过流式细胞术分析每个孔的内容物中的活细胞和死细胞。活细胞被检测为钙黄绿素-AM-亮和PI-暗，死细胞被检测为钙黄绿素-AM-暗和PI-亮。图1示出了比较单独培养的HUVEC(9.15%死细胞，78.6%活细胞)和与200μg/ml小牛胸腺组蛋白一起培养60分钟的HUVEC(50.4%死细胞，35.6%活细胞)的典型活力测定。小牛胸腺组蛋白对HUVEC和HMEC的毒性在图2中详细示出，组蛋白对HUVEC(图2A)和HMEC(图2B)的毒性是高度浓度依赖的，但是HMEC比HUVEC更耐受组蛋白毒性。例如，在100μg/ml，组蛋白杀死15-20%的HUVEC，但对HMEC活力没有影响，而在800μg/ml，组蛋白杀死＞85%的HUVEC和约55%的HMEC(图1)。在随后的抑制试验中，对于HUVEC使用200μg/ml的小牛胸腺组蛋白，对于HMEC使用400μg/ml的小牛胸腺组蛋白，这些浓度导致对两个内皮细胞群体约50%的杀死。

在抑制试验中，将抑制剂(终浓度为1.6-100μg/ml)与小牛胸腺组蛋白(终浓度为200或400μg/ml)混合，然后向每个孔中加入HUVEC/HMEC、钙黄绿素-AM和PI。发现硫酸麦芽三糖和硫酸麦芽五糖是组蛋白对HUVEC的细胞毒性的强效抑制剂，在100μg/ml时完全抑制组蛋白的毒性，并在25μg/ml时仍是高效的(图3和图4)。针对硫酸麦芽三糖的一些原始流式细胞术数据在图5中示出，进一步凸显了这种硫酸化的三糖的强效抑制活性。相比之下，二糖硫酸麦芽糖是组蛋白毒性的弱抑制剂(图3和图4)，表明聚阴离子寡糖的串联麦芽糖的链长在抑制活性中起重要作用。然而，硫酸异麦芽三糖(α1-6连接的葡萄糖)是比硫酸麦芽三糖(α1-4连接的葡萄糖)活性较差的抑制剂，表明糖键也可以影响抑制活性(图3)。然而，环状β-环糊精(环状α1-4连接的葡聚七糖（heptaglucose）)与直链硫酸麦芽三糖和硫酸麦芽五糖分子活性基本一致(图3)。

使用HMEC作为内皮细胞靶标，观察到硫酸麦芽三糖(图6)和其他硫酸化的寡糖(表1)对组蛋白毒性有类似的抑制效果。事实上，在表1中示出了使用HMEC作为靶内皮细胞对多种聚阴离子对组蛋白毒性的抑制活性的更详细的分析。

表1不同聚阴离子抑制组蛋白杀死HMEC的能力

化合物	组蛋白杀死%±SEM*
		纤维二糖SO4	6.9±3.3**
八硫酸蔗糖	43.5±4.0
		麦芽糖SO4	77.1±4.7

麦芽糖醇SO4	19.6±3.9
		麦芽三糖SO4	17.4±2.8
异麦芽三糖SO4	49.5±5.4
		棉子糖SO4	18.0±3.0
潘糖SO4	9.3±0.5
		丙基双葡糖酰胺SO4	27.8±1.5
羧化的β-环糊精	105.8±19.9
		β-环糊精SO4	11.7±2.9
肝素	2.4±2.1
		N-乙酰化肝素	24.8±2.7
二醇分割肝素	0±1.9
		二醇分割N-乙酰化肝素	0±3.1
依诺肝素	9.1±5.6
		二醇分割依诺肝素	0.7±3.3
二醇分割LMWH(3kDa)	7.2±1.3

*在50μg/ml测试的化合物抑制小牛胸腺组蛋白(400μg/ml)对HMEC的细胞毒性的能力。

**黑体和斜体的值表示对组蛋白毒性的抑制＞80%的化合物。

HMEC=人微血管内皮细胞。

LMWH=低分子量肝素。

不同的硫酸化的二糖的抑制活性不同，硫酸纤维二糖(β1-4连接的葡萄糖)是组蛋白毒性的强效抑制剂，而硫酸麦芽糖(α1-4连接的葡萄糖)和八硫酸蔗糖(β1-4连接的葡萄糖与果糖)是较弱的抑制剂(表1)。然而，麦芽糖醇——麦芽糖的开环形式——的抑制活性大于麦芽糖。硫酸化的三糖的抑制活性也不同，硫酸化的麦芽三糖、棉子糖和潘糖比硫酸化的异麦芽三糖更具活性。该分析还揭示了硫酸化的连接的葡萄糖分子显示出一定的抑制活性(例如，丙基双葡糖酰胺SO₄)，硫酸化的β-环糊精有活性，但羧化的β-环糊精没有活性，肝素、低分子量肝素和一些化学变体(例如，N-去乙酰化的、二醇分割的)有活性(表1)。

其他研究揭示组蛋白的细胞毒性不依赖于细胞表面的硫酸乙酰肝素。例如，用人血小板乙酰肝素酶(4μg/ml,37°C,1hr)或来自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的乙酰肝素酶I、II和III(0.25单位/ml,37°C,1hr)处理HMEC——移除细胞表面的硫酸乙酰肝素的酶促过程，对HMEC对组蛋白细胞毒性的易感性没有影响(图7)。类似地，野生型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和该细胞系的硫酸乙酰肝素缺陷变体(pgsA-745)的比较揭示，两种细胞系对组蛋白细胞毒性是同样易感的(图8)。

实施例2：静脉内注射的组蛋白在兔肺中积累。

通过吸附到Tc99m-纳米颗粒的表面上来放射性标记小牛胸腺组蛋白。在室温下，用组蛋白(10μg/ml)处理Tc99m-纳米颗粒(约50μg；4mCi)的水性胶体悬浮液(3mL)1小时。将放射性标记的组蛋白注射进放置在γ照相机之下的麻醉的兔的耳静脉，从开始注射开始，以一系列30秒的采集图形式获得动态图像。图9A中的图像显示组蛋白在肺中快速和选择性积累，与组蛋白诱导的组织损伤的肺定位一致。没有结合组蛋白的放射性标记的纳米颗粒定位于肝、脾和骨髓(参见图9B)，如同预期，循环外来颗粒被网状内皮系统快速清除。

实施例3：对组蛋白在肺中积累的竞争性抑制。

通过吸附到Tc99m-纳米颗粒的表面上来放射性标记小牛胸腺组蛋白。然后将该放射性标记的制剂分成两半。将第一半注射进放置在γ照相机之下的麻醉的对照兔的耳静脉，从开始注射开始，以一系列30秒的采集图形式获得动态图像。如上文实施例2，图10A中的图像显示放射性标记的组蛋白在对照兔肺中的快速和选择性积累。将第二半放射性标记的组蛋白制剂注射进麻醉的兔的耳静脉，该麻醉的兔在15分钟之前已经接受15mg/kg的麦芽六糖硫酸钠的静脉内注射。从放射性标记的注射开始的对该预处理的兔的γ成像显示，放射性标记的组蛋白在肺中的积累被阻碍(图10B)。放射性标记的组蛋白穿过肺，定位于肝和脾。

实施例4：通过硫酸麦芽四糖阻碍组蛋白在兔肺中积累。

将放射性标记的组蛋白制剂注射进麻醉的兔的耳静脉，该麻醉的兔在15分钟之前已经接受15mg/kg的麦芽四糖钠硫酸的静脉内注射。从放射性标记的注射开始对该预处理的兔的γ成像(图11)显示放射性标记的组蛋白在肺中的积累被阻碍；放射性标记的组蛋白穿过肺而不结合，并定位于肝和脾。图11的第1-4帧是30秒采集图，而第5-8帧是60秒采集图。

实施例5：通过硫酸纤维二糖阻碍组蛋白在兔肺中积累。

将放射性标记的组蛋白制剂注射进麻醉的兔的耳静脉，该麻醉的兔在15分钟之前已经接受15mg/kg的纤维二糖硫酸钠的静脉内注射。从放射性标记的注射开始对该预处理的兔的γ成像(图12)显示放射性标记的组蛋白在肺中的积累被阻碍；放射性标记的组蛋白穿过肺而不结合，并定位于肝和脾。图12的第1-4帧是30秒γ照相机采集图。

实施例6：小鼠中LPC诱导的败血症研究

进行研究以评估试验物品1(硫酸麦芽三糖；TA1)、2(硫酸纤维二糖；TA2)和3(肝素；TA3)在脂多糖诱导的小鼠败血症模型中的体内效能。在第1天，通过腹膜内(i.p.)注射LPC诱导内毒素血症。在第1天腹膜内共给予试验物品，然后每天腹膜内给药，再持续2天。如下文表2所示，在2个剂量浓度评价试样样品1和2，并在1个浓度评价试验样品3。

表2：

结果：在图13的卡普兰-迈耶曲线中示出了直到发现动物死亡或被迫安乐死的时间。在该研究中使用的高剂量(100mg/kg)的硫酸麦芽三糖(TA1)似乎在第三次给药之后会产生一定的毒性(成群死亡)，但低剂量(15mg/kg)被更好地耐受。硫酸纤维二糖(TA2)在两个剂量下均被良好地耐受，对肝素选择的低剂量(TA3；1.1mg/kg)也如此。图13中的卡普兰-迈耶曲线表明，低剂量的硫酸麦芽三糖(TA1)和两个剂量的硫酸纤维二糖(TA2)获得了更长的存活时间。对于肝素(TA3)，与对照相比存活曲线没有明显改变(参见图13)。

Claims (19)

1.抑制个体中细胞外组蛋白的细胞毒性的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的聚阴离子。

2.抑制个体中细胞外组蛋白积累的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的聚阴离子。

3.通过抑制个体中细胞外组蛋白的细胞毒性而治疗败血症的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的聚阴离子。

4.有效量的聚阴离子在制备用于通过抑制细胞外组蛋白的细胞毒性而治疗败血症的药物中的用途。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法或权利要求4所述的用途，其中所述聚阴离子基本上没有抗凝血活性。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法或权利要求4所述的用途，其中所述聚阴离子基本上没有免疫原性。

7.如权利要求1-3中任一项所述的方法或权利要求4所述的用途，其中所述聚阴离子是具有通式结构(I)的聚阴离子性寡糖：

A—(B)_n—D   (I)

其中A和B各自独立地为环状单糖或环状脱氧单糖；

D是环状单糖、环状脱氧单糖、开环单糖或糖醇；

n是选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的整数；并且

其中所述环状单糖、所述环状脱氧单糖、所述开环单糖或所述糖醇中的每一个均独立地、任选地由以下基团取代：OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基或任选地取代的芳烷基；并且

其中所述聚阴离子性寡糖包含至少两个选自以下基团的阴离子性取代基：OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-。

8.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述环状单糖选自：葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。

9.如权利要求8所述的方法或用途，其中所述环状单糖选自：葡萄糖、半乳糖和果糖。

10.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述环状脱氧单糖选自：岩藻糖、脱氧核糖和鼠李糖。

11.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述糖醇选自：乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、甘露糖醇、卫矛醇(半乳糖醇)、艾杜糖醇和岩藻糖醇。

12.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述开环单糖选自：葡萄糖、半乳糖、果糖、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖。

13.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述聚阴离子性寡糖具有通式结构(I-a)：

(I-a)

其中各个R¹独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；n是0、1、2、3、4、5、6、7和8中的整数；并且其中至少两个R¹选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

14.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述聚阴离子性寡糖具有通式结构(I-b)：

(I-b)

其中各个R¹独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；n是0、1、2、3、4、5、6、7和8中的整数；并且其中至少两个R¹选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

15.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述聚阴离子性寡糖选自：

和

其中各个R²独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；并且其中至少两个R²选自OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

16.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述聚阴离子性寡糖选自：硫酸麦芽糖、硫酸麦芽三糖、硫酸麦芽四糖、硫酸麦芽五糖、硫酸麦芽六糖，硫酸麦芽七糖，硫酸麦芽八糖，硫酸麦芽九糖和硫酸麦芽十糖、硫酸潘糖、硫酸异麦芽三糖、硫酸吡喃葡糖基蔗糖、硫酸纤维二糖和硫酸棉子糖。

17.如权利要求7所述的方法或用途，其中所述聚阴离子性寡糖是硫酸纤维二糖。

18.如权利要求1-3中任一项所述的方法或权利要求4所述的用途，其中所述聚阴离子是具有通式结构(II)的环糊精：

其中每个R³独立地选自：任选地取代的O-烷基、O-芳基、O-芳烷基、O-烯基、O-炔基，OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H，并且每个R⁴独立地选自OSO₃ ^-、COO^-、OPO₃ ^-、OH或H；x是3、4、5、6、7、8、9和10中的整数，并且其中所述聚阴离子性环糊精包含至少两个选自以下基团的阴离子性取代基：OSO₃ ^-、COO^-和OPO₃ ^-。

19.如权利要求18所述的方法或用途，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

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