CN103393721B - 复合特异性转移因子制备工艺及医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种复合特异性转移因子制备工艺及医药用途，采用纳米技术与化学技术方法，将致病性病毒、细菌、寄生虫、各种肿瘤，按生物制品学要求制成各种预防人、畜感染性疾病的裂解或亚单位疫苗，再用脂肪乳做佐剂配制成动物用特异性免疫抗原；用免疫抗原注射各种动物，期间测定免疫动物中相关抗原产生的抗体水平，符合要求后，免疫动物；将免疫器官组织用绞肉机绞碎，加生理盐水，抽滤泵过滤，纳米技术处理，超滤制成复特异性转移因子。具有活性稳定、产量高、规模大，而且抗感染性疾病谱很广，技术手段先进，产品质量稳定；资源利用充分，大幅度降低生产成本；可以满足不同用户需要；产品生产周期短，可大大的提高工作效率；药物组可配制多种类型制剂，使用方便。

Description

复合特异性转移因子制备工艺及医药用途

技术领域

本发明公开一种复合特异性转移因子制备工艺，同时还提供了复合特异性转移因子的医药用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

免疫系统是人与动物体内一个重要防疫系统，是指人与动物机体内参与对抗病原的免疫应答，执行免疫功能的一系列器官、细胞和分子的总称。该系统是由免疫器官、免疫细胞或免疫分子组成，是产生免疫应答的物质基础。免疫系统是由中枢免疫器官和外周免疫器官组成。中枢包括：骨髓、胸腺和法氏囊；外周包括：淋巴结、脾脏、哈德尔氏腺、粘膜免疫系统（肠粘膜、乳腺管粘膜、子宫粘膜等）。可以说脊椎动物的免疫系统是配备用来识别侵入机体的病原性生物，如细菌、病毒、真菌、寄生虫、肿瘤并保护身体免遭其侵害的。免疫系统通常包括细胞组分和非细胞组分。

免疫系统的细胞组分包括通常所说的“淋巴细胞”或白细胞，其存在几种类型。成熟免疫系统的细胞组分通常引起对入侵病原体的初次非特异性应答，惟及参与对病原体的二次特异性应答。

对病原体感染初次的初始应答中，称为吞噬细胞的白细胞定位并攻击入侵病原体。通常吞噬细胞将内在化，或“吃掉”病原体，然后消化病原体。此外，白细胞在应答致病感染中生产并分泌化学物质，预期该化学物质攻击病原体或有助于指导对病原体的攻击。

只有当入侵病原体感染持续逃避初次免疫应答时，才需要对病原体的特异性二次免疫应答。因为这种二次免疫应答通常是延迟的，因此也称为“迟发型超敏反应”。哺乳动物靠其自身，通常直至病原体感染后约14天才引发对病原体的二次免疫应答。二次免疫应答也被称为特异性病原本的获得性免疫。病原体具有一种或多种特征蛋白称为“抗原”。二次免疫应答称为B淋巴细胞或“B-细胞”和T淋巴细胞或“T-细胞”的白细胞“学习”识别病原体的一种或多种抗原。B-细胞和T-细胞一起作用产生物称为“抗体”的蛋白质。其对于病原体上的一种或多种特定抗原是特异性的。

T-细胞主要引起对病原体或抗原物质的二次免疫应答或迟发型超敏反应。存在三种类型的T-细胞：T-辅助细胞、抵制性T-细胞和抗原特异性T-细胞，后者还称为细胞毒性（意思是“细胞杀伤”）T-淋巴细胞（CTL）或T-杀伤细胞或天然杀伤（NK）细胞。T-辅助细胞和抑制性T-细胞，尽管对某些抗原不是特异性的，但是执行调节功能（例如，通常伴随感染的炎症），该调节功能帮助从感染宿主除去病原体或抗原物质。抗体只构成免疫系统非细胞组分的一部分，识别特异性抗原是“抗原特异性的”。然后产生的抗体主要帮助白细胞定位并消除身体中的病原体。通常，一旦白细胞产生是针对病原体的抗体，白细胞及其所有的远祖细胞特续产生抗体。消除感染后，少量与所识别抗原对应的T-细胞和B-细胞保持于“休眠”状态。当相应的致病物质或抗原物质再次感染宿主时，“休眠”T-细胞和B-细胞激活并在约48小时内诱导快速的免疫应答。通过如此的应答，免疫系统引发对病原体的二次免疫应答，认为免疫系统具有对该病原体的“记忆”。

动物的免疫系统产生较小的蛋白称为“转移因子”，作为对感染病原体的二次免疫应答的一部分。转移因子是动物免疫系统的另一种非细胞组分。一般认为抗原特异性转移因子结构上与抗体类似，但是分子小得多。抗原特异性转移因子和抗体都包括原特异性位点。此外，转移因子和抗体都包括与其各自效应细胞上受体位点的相互作用的高度保守区域。转移因子和抗体分子是第三个区域“衔接物”，连接抗原特异性位点和高度保守区域。

转移因子是从具有免疫活性的淋巴细胞中释放出来的一种物质。免疫活性淋巴细胞在抗原刺激下释放的转移因子又能使未致敏的淋巴细胞转化为具有免疫活性的淋巴细胞。因此，转移因子可将供体淋巴细胞的一些特定或非特定的细胞免疫功能转移给非免疫的受体，使受体具有供体的细胞免疫能力，以提高和诱发受体的免疫防御能力，改善受体免疫状态。

从正常健康动物免疫器官提取的转移因子称普通转移因子（也叫非特异性转移因子）；用特定病原生物体制成的疫苗称特异性疫苗（抗原），免疫各种动物，取动物免疫器官的提取物称特异性转移因子。

针对目前国内外制备转移因子，抗原制作不标准，不少不符合生物制品学规范要求，而且多是一种抗原免疫一种动物，采集一种或两种免疫器官组织，提取方法是用反复冻融破碎细胞，通过离心、透析，这样制出的产品，活性多不稳定，产量低、规模小而且抗感染性疾病谱很窄，手段相对落后。

发明内容

本发明公开了一种复合特异性转移因子制备工艺，解决了传统制备转移因子存在活性不稳定、产量低、规模小而且抗感染性疾病谱很窄的缺欠。

本发明进一步提供了复合特异性转移因子制备工艺的医药用途。

本发明提供的一种复合特异性转移因子的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

1）将人畜多种病原生物体的疫苗或病原体原液以静水压200-300Mpa、20-30分钟灭活；

2）按病原体原液总量加0.5%-0.7%去酮氮101，摇床混合1-2小时，用纳米对撞机200-300压力、10-40纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加20%-30%脂肪乳作为免疫佐剂，得裂解苗抗原或亚单位苗抗原；

3）将步骤2）的抗原免疫注射2—3种不同类型动物，采集动物免疫系统器官组织，通过铰肉机破碎组织，加2—3倍生理盐水，用均质机制成匀浆，过滤泵过滤，滤液用纳米对撞机处理，调通道定40-60纳米孔，最后用5000—10000膜超滤，即得复合特异性转移因子；

所述的病原生物体包括病毒、细菌、寄生虫；

所述的动物免疫系统器官组织包括扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏。

所述制备工艺制备的复合特异性转移因子在制备免疫促进剂和非特异性免疫药物中的用途。

把现代生物技术和生化技术结合起来，采用纳米技术与化学技术方法，将致病性病毒、细菌、寄生虫、各种肿瘤，按生物制品学要求制成各种预防人、畜感染性疾病的的裂解或亚单位疫苗（抗原），再用脂肪乳做佐剂配制成动物用特异性免疫抗原；用免疫抗原注射各种动物，期间测定免疫动物中相关抗原产生的抗体水平，符合要求后，采取动物扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏、血液白细胞，免疫牛奶、羊奶的脱脂奶，免疫蛋鸡去蛋清卵黄液等免疫组织器官；其提取工艺是将免疫器官组织用绞肉机绞碎，加生理盐水，抽滤泵过滤，纳米技术处理，超滤制成复特异性转移因子。这种转移因子是一种多肽、多核苷酸以及其他成分组成的复合物质，相对分子量大约为2000—5000。转移因子本身没有抗原性，依赖抗原激活，可激发非致敏淋巴细胞成为致敏淋巴细胞，发挥细胞免疫效应。转移因子无种属特异性，可在不同种属之间相互传递，因此，可以用各种动物，如马、牛、羊、猪、鸡等免疫器官（扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏、血液白细胞及胎盘等），制备出满足人、畜感染性疾病治疗用特异性转移因子。

本发明的积极效果在于：抗原制作标准化，同时免疫两种以上动物，并采集动物的多个免疫器官组织，采用均质机制成匀浆、过滤泵过滤、纳米对撞机处理，超滤得复合特异性转移因子；具有活性稳定、产量高、规模大，而且抗感染性疾病谱很广，技术手段先进，产品质量稳定；资源利用充分，大幅度降低生产成本；可以满足不同用户需要；产品生产周期短，可大大的提高工作效率；药物组可配制多种类型制剂，使用方便。

具体实施方式：

通过以下实施例进一步描述本发明，不以任何方式限制本发明，在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域专业技术人员容易实现任何改动或改变都将落入本发明权利要求范围之内。

实施例1

复合艾兹病特异性转移因子的制备：

1）将马传贫病毒驴白细胞毒株吸取营养液后换以含1—2%种子液的新鲜培养液，37度继续培养，接毒后每天观察5—7天后约80%的细胞出现病变，与对照细胞差异显著时即收毒每毫升病毒含量≥105TCD50，等量分别引入艾兹病毒培养原液和卡介苗，静水压灭活（300Mpa、30min）；

2）按病毒体原液总量加0.6%去酮氮101，摇床混合1.5小时，用纳米对撞机200-300压力、20纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加30%脂肪乳作为免疫佐剂，得裂解苗抗原；

3）将步骤2）的抗原免疫健康马、驴各3匹和产蛋鸡100只、奶牛5头（奶山羊）通过基础免疫和强化免疫，符合要求时，屠宰后采取马、驴免疫系统组织器官（包括扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏、血液白细胞），除肌膜及脂肪用绞肉机绞碎，加二倍生理盐水，用均质机制成匀浆，抽滤泵过滤，用滤液和收集免疫鸡蛋，去蛋清，取卵黄液与免疫牛奶，去脂肪、取蛋白，将三种溶液充分混合，用纳米对撞机，调40纳米孔处理两次，用1万超滤膜超滤，滤液浓缩制成复合艾兹病特异性转移因子。

将制备的复合艾兹病特异性转移因子通过补体结合试验和琼脂扩散试验结果，效价≥3。

艾滋病病毒与马传贫病毒它们“生物亲缘关系接近，其体内所含化学成分亦接近”，用“以毒攻毒的办法产生抗毒素免疫”从而达到“异病同治”的目的。

马传贫（ELAV）与艾滋病（HIV）同属逆转录病毒科、慢病毒属成员。两者在形态结构、抗原特性、基因结构成以及病毒与宿主的持续作用等方面极为相似，且ELAV病毒具有独特的快速发病进程和明显的病程分界，使其成为研究HIV的基因变异与临床症状之间的相互关系的理想动物模型。ELAV疫苗接种马体后，不引起动物发病，且能获得持久的免疫保护，可能是存在低水平的病毒核酸复制，这对HIV疫苗的可行性至关重要，近期对ELAV疫苗在动物体内的核酸水平定量跟踪监测，从一个侧面反映用以代替HIV疫苗是具有实用性。

实施例2

犬用五联疫苗制作犬联用复合特异性转移因子

犬用五联疫苗包括狂犬病、犬温热、犬副流感、犬腺病毒和犬细小病毒五种弱毒，由中国兽药监察所保管、鉴定和供应。所用五种毒种均包括原始毒种、基础毒种和生产用毒种三级，三级毒种均为毒种所适应的细胞培养物，其中1-5代为原始毒种；6-10代为基础毒种；11-15代为生产用毒种。三类毒种都可以，以原始毒种细胞培养原液最好。

疫苗以1万头剂为1批次进行混合，即按每头剂含狂犬、犬瘟热和犬副流感苗各15个最小免疫量，含犬细小病毒与犬腺病毒各10个最小免疫量的用量以从检验合格的各苗半成品混合液瓶中取出，无菌混合，即为本疫苗湿苗，放-30℃备用。每头剂1.4ml。即Rb/E3苗0.1ml；CDV/R-20/8苗0.5ml；CPIV/A-20/8苗0.5ml；YCA18苗0.1ml；CR86106苗0.2ml。保护剂为30%脂肪乳，与湿苗之比为1：3，充分混合，分装、冻干。

1）将犬用五联疫苗以静水压200Mpa、30分钟灭活；

2）按病毒体原液总量加0.5%%去酮氮101，摇床混合2小时，用纳米对撞机200压力、10纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加20%脂肪乳作为免疫佐剂，得亚单位苗抗原；

3）选马5匹、猪10头、狗50头注射亚单位苗抗原，基础免疫用量为本体动物预防量的5倍，每7天一次，持续一个月；第二个月为强化免疫，用量为本体动物预防量的15倍，也持续一个月，每15天免疫一次，期间检测免疫动物相关抗体，达到高峰时屠宰。取上述动物免疫系统器官组织（包括扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏、血液白细胞）除去肌肉、脂肪用绞肉机绞碎，加2倍生理盐水，用均质机制成匀浆，抽滤泵过滤，用纳米对撞机调40纳米孔处理两次，最后用1万超滤膜超滤，滤液即为复合犬联用特异性转移因子。

将制备的复合犬联用特异性转移因子通过抗体检测结果，最低抗体效价分别为：

狂犬病≥1.10；犬温热≥1.50；犬副流感≥1.40；犬腺病毒≥1.10；犬细小病毒≥1.16。

实施例3

复合联用菌特异性转移因子的制备

1）将兰菌净、b型流感“嗜血杆菌偶联疫苗”采用等份比例配合，再按上述总量1：1的比例加入30%脂肪乳混合，以静水压200Mpa、20分钟灭活；

2）按病毒体原液总量加0.5%去酮氮101，摇床混合1小时，用纳米对撞机250压力、30纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加20%脂肪乳作为免疫佐剂，得裂解复合联用菌特异性转移因子抗原；

3）选4匹马，10头猪进行上述抗原免疫注射，采集动物免疫系统器官组织，通过铰肉机破碎组织，加2倍生理盐水，用均质机制成匀浆，过滤泵过滤，滤液用纳米对撞机处理，调通道定40纳米孔，最后用10000膜超滤，即得复合联用菌特异性转移因子。

复合联用菌特异性转移因子通过循环抗体检测，最低抗体效价分别为：

兰菌净≥1.10；b型流感“嗜血杆菌偶联疫苗”≥1.50；为复合联用菌特异性转移因子，这种转移因子。制作方法简便、安全无副反应，治疗范围广，不仅对上述病原菌有治疗作用，还能够提高非特异性免疫功能，抗过敏反应疾病效果也好。

实施例4：

复合联用寄生虫特异性转移因子的制备：

寄生虫抗原的制作：可从目前国家批准上市的寄生虫疫苗引入或从寄生虫科研单位引入浓缩的寄生虫原液。血吸虫1000毫升，弓形虫1000毫升，球虫1000毫升，囊虫1000毫升，疟疾虫1000毫升，加卡介苗1000毫升，充分混合，用均质机制成匀浆，用纳米对撞机，选40纳米孔，反复两次，再加入1：130%脂肪乳，即为寄生虫免疫抗原。

1）将寄生虫免疫抗原以静水压200Mpa、20分钟灭活；

2）按病毒体原液总量加0.6%去酮氮101，摇床混合1.5小时，用纳米对撞机200压力、30纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加25%脂肪乳作为免疫佐剂，得裂解寄生虫免疫抗原；

3）选马10匹，猪50头，按本体动物预防用量10倍注射寄生虫免疫抗原进行基础免疫，每10天一次，连用3次，一个月后再做强化免疫，按本体动物预防用量20倍，每半月1次，连用3次，在此期间检测免疫循环相关抗体，复合要求后，屠宰马、猪，收集免疫系统器官组织，通过铰肉机破碎组织，加3倍生理盐水，用均质机制成匀浆，过滤泵过滤，滤液用纳米对撞机处理，调通道定30纳米孔，最后用10000膜超滤，即得复合寄生虫特异性转移因子。

复合寄生虫特异性转移因子通过免疫学检测，循环保护性抗体均为阳性。

实施例5

复合联用肿瘤特异免疫因子的制备：

肺癌疫苗（抗原）制备

选取自体肺鳞状细胞癌与肺腺细胞癌或此类癌细胞组织培养物1000毫升作为特异性免疫抗原，在配合几种细菌苗作为非特异性免疫疫苗（抗原），卡介苗1000毫升，小棒杆菌疫苗1000毫升，在配合细胞因子作为免疫佐剂，加白细胞介素—2，白细胞介素—10各500毫升，充分混合，用纳米对撞机，40纳米孔处理3次，即为复合肿瘤特异性转移因子抗原。

1）将肺癌疫苗以静水压200Mpa、25分钟灭活；

2）按病毒体原液总量加0.5%去酮氮101，摇床混合1小时，用纳米对撞机200压力、30纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加20%脂肪乳作为免疫佐剂，得裂解肺癌疫苗抗原；

3）选马3匹、猪10头、鸡50只用裂解肺癌疫苗抗原免疫，采集动物免疫系统器官组织，通过铰肉机破碎组织，加3倍生理盐水，用均质机制成匀浆，过滤泵过滤，滤液用纳米对撞机处理，调通道定50纳米孔，最后用510000膜超滤，即得复合肺癌特异性转移因子。

复合肺癌特异性转移因子经免疫学技术检测，CD8⁺和CD4⁺T细胞均为阳性。

实施例6

可以用实施例1~5制备的异性转移因子制成各种不同的药物制剂：

1、直接灌封制成静脉或肌肉注射剂；

2、加入2.5%甘露醇制成冻干制剂；

3、原液浓缩喷雾干燥制成粉剂；

4、将粉剂加入常规辅料制成片剂、胶囊、软膏透皮剂和干粉喷雾剂；

5、原液加注射用脂肪乳可制成液体喷雾剂。特异性免疫好的奶牛，奶羊或蛋鸡，收集牛奶，羊奶脱脂，鸡蛋去蛋清取卵黄液，用纳米技术处理，也可制成出各种药物剂型；

6、复合特异性转移性因子可按1:1比例与相关免疫促进剂，一种或多种成分，实施组合药物制剂（如蘑菇多糖、B葡聚糖、虫草素、黄芪多糖、人参皂甙、复合维生素、矿物质及微量元素、复合氨基酸、纳米初乳，免疫脱脂乳和蛋清衍生物及相关干扰素，白介素肿瘤坏死子等细胞因子）以更进一步提高免疫效果，满足更多抗感染性疾病的需要。

Claims (2)

1.一种复合特异性转移因子的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

1）将人畜多种病原生物体的疫苗或病原体原液以静水压200-300Mpa、20-30分钟灭活；

2）按病原体原液总量加0.5%-0.7%去酮氮101，摇床混合1-2小时，用纳米对撞机200-300压力、10-40纳米条件下处理，用凝胶过滤清出去酮氮101，加20%-30%脂肪乳作为免疫佐剂，得裂解苗抗原或亚单位苗抗原；

3）将步骤2）的抗原或亚单位苗抗原免疫注射2—3种不同类型动物，采集动物免疫系统器官组织，通过铰肉机破碎组织，加2—3倍生理盐水，用均质机制成匀浆，过滤泵过滤，滤液用纳米对撞机处理，调通道定40-60纳米孔，最后用5000—10000膜超滤，即得复合特异性转移因子；

所述的病原生物体包括病毒、细菌、寄生虫；

所述的动物免疫系统器官组织包括扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏。

2.根据权利要求1所述制备工艺制备的复合特异性转移因子在制备免疫促进剂和非特异性免疫药物中的用途。