CN103394095B - 二氯-1,2-环己二胺合铂配合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，由二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物配合作用得到。所述二氯-1,2-环己二胺合铂具有环己二胺结构，与聚合物配合后能够由于堆积和疏水作用而形成稳定的内核结构，在生理条件下稳定性好；所述配合物可以有效避免由于静脉注射进入血液循环系统后所发生的二氯-1,2-环己二胺合铂的突然释放和非特异性相互作用等问题；所述配合物能够组装形成胶束结构，可以通过增强渗透和滞留效应实现在肿瘤部位的聚积，从而实现降低毒副作用和提高治疗效果的目的。其次，所采用聚合物具有良好的生物相容性，可体内降解，因此制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物溶解性好。？
Description
技术领域
本发明涉及高分子药物领域，特别涉及二氯-1,2-环己二胺合铂配合物及其制备方法。
背景技术
奥沙利铂（草酸基-1,2-环己二胺合铂）是具有细胞毒作用的抗癌药物，由于其肿瘤治疗谱更宽、与顺铂无交叉耐药性，已经成为第三代铂类药物的代表，于2002年被美国食品药品监督管理局批准用于临床应用。
奥沙利铂进入体内后需要经过水解产生二氯-1,2-环己二胺合铂或水合1,2-环己二胺合铂，进而与DNA或RNA结合起到抗肿瘤作用（B.Desoize,etal.CriticalReviewsinOncology/Hematology,42(2002)317-325），因此二氯-1,2-环己二胺合铂（DACHPt）可以视为奥沙利铂的前药。作为奥沙利铂的同系物，二氯-1,2-环己二胺合铂相比于奥沙利铂的作用效率要高很多，但是其溶解性和稳定性差，因此未得到广泛运用。
现有技术公开了多种利用聚合物载体担载药物的方式开发二氯-1,2-环己二胺合铂制剂的方法。如I.Han报道的利用PEG化脂质体担载二氯-1,2-环己二胺合铂衍生物能够提高其治疗效果，然而，该担载方式在磷酸盐缓冲溶液中2小时后就有超过50%的药物释放，因此无法保证药物进入血液后的长循环性。Kataoka的研究组利用聚乙二醇-b-聚谷氨酸复合二氯-1,2-环己二胺合铂制备的DACHPt胶束（H.Cabral,etal.JournalofControlRelease,101(2005)223-232）能够稳定担载铂类药物，并实现比奥沙利铂高20倍的肿瘤部位聚积浓度。但其所得胶束是线性聚氨基酸侧链间经交联作用而成，此方法所得复合物经冻干后的冻干粉难以复溶，因而限制了其进一步的应用。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，具有良好的溶解性，在生理条件下稳定存在，并可以有效避免由于静脉注射进入血液循环系统后所发生的突然释放和非特异性相互作用等问题。
本发明公开了一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，由二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物配合形成，
式（I）中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基；
R2独立的选自H原子、C1～C20的烷基或取代的C1～C20的烷基;
R3独立的选自H原子或阳离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250；x，y，z为聚合度，10≤x+y+z≤5000，5%≤y/(x+y+z)≤80%。
优选的，R2独立的选自C1～C10的烷基或取代的C1～C10的烷基，所述取代的烷基的取代基选自酮缩醇、醛缩醇、羟基、醛基、氨基、巯基和糖残基中的一种或多种；
R3独立的选自H原子、金属阳离子或有机阳离子。
优选的，R3独立的选自H原子、钠离子、钾离子、镁的亚群、胺离子或氨基酸离子。
优选的，30≤x+y+z≤300，5%≤y/(x+y+z)≤50%。
优选的，R1为C6烷基、R2为甲基、R3为氢原子或钠离子、L为-CH2-CH2-。
本发明还公开了一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的制备方法，包括以下步骤：
二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物在水性介质中发生配合反应，生成二氯-1,2-环己二胺合铂配合物；
式（I）中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基；
R2独立的选自H原子、C1～C20的烷基或取代的C1～C20的烷基;
R3独立的选自H原子或阳离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250；x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，5%≤y/(x+y+z)≤80%。
优选的，所述二氯-1,2-环己二胺合铂还包括具有1,2-环己二胺配体的其他衍生物。
优选的，所述具有式（I）结构的聚合物的羧基与二氯-1,2-环己二胺合铂中Pt的摩尔比小于20。
优选的，所述具有式（I）结构的聚合物的羧基与二氯-1,2-环己二胺合铂中Pt的摩尔比小于10。
优选的，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。
与现有技术相比，本发明利用二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物制备得到的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物。所述二氯-1,2-环己二胺合铂具有环己二胺结构，其与聚合物配合后能够由于堆积和疏水作用而形成稳定的内核结构，在生理条件下稳定性好；所述配合物可以有效避免由于静脉注射进入血液循环系统后所发生的二氯-1,2-环己二胺合铂的突然释放和非特异性相互作用等问题；所述配合物能够组装形成胶束结构，可以通过增强渗透和滞留效应（EPR效应）实现在肿瘤部位的聚积，从而实现降低毒副作用和提高治疗效果的目的。其次，所采用聚合物具有良好的生物相容性，可体内降解；所述聚合物采用接枝方法侧链键接聚乙二醇，因此制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物具有良好的溶解性。
附图说明
图1本发明实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的流体力学半径分布图；
图2为本发明实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物在pH=7.4和pH=5.5时的释放曲线图；
图3为本发明实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物胶束的光散射图；
图4本发明实施例2中制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物和奥沙利铂裸药对A549细胞的药效考察结果图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，由二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物配合形成，
式（I）中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基，R1优选为C3～C8的直链烷基、C4～C8的支链烷基、苯基，更优选为C6烷基；
R2独立的选自H原子、C1～C20的烷基或取代的C1～C20的烷基，优选为H原子、C1～C10的烷基或取代的C1～C10的烷基，所述取代的烷基的取代基选自酮缩醇、醛缩醇、羟基、醛基、氨基、巯基和糖残基中的一种或多种；
R3独立的选自H原子或阳离子，优选为H原子、金属阳离子或有机阳离子，更优选为H原子、钠离子、钾离子、镁的亚群、胺离子或氨基酸离子，最优选为H原子或钠离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250，优选为45≤m≤200；x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，优选为30≤x+y+z≤300，更优选为50≤x+y+z≤250；5%≤y/(x+y+z)≤80%，优选为5%≤y/(x+y+z)≤50%。
在本发明中，具有式（I）结构的聚合物优选为R1为正己基，R2为甲基，R3为H原子，L为-CH2-。此时，聚合物具有式（I-a）的结构。
m为聚合度，40≤m≤250，优选为45≤m≤200;x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，优选为30≤x+y+z≤300，更优选为50≤x+y+z≤250；5%≤y/(x+y+z)≤80%，优选为5%≤y/(x+y+z)≤50%。
在本发明中，具有式（I）结构的聚合物优选为R1为正己基，R2为甲基，R3为H原子，L为-CH2-CH2-。此时，聚合物具有式（I-b）的结构。
m为聚合度，40≤m≤250，优选为45≤m≤200;x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，优选为30≤x+y+z≤300，更优选为50≤x+y+z≤250；5%≤y/(x+y+z)≤80%，优选为5%≤y/(x+y+z)≤50%。
在本发明中，具有式（I）结构的聚合物优选为R1为正己基，R2为H原子，R3为H原子，L为-CH2-。此时，聚合物具有式（I-c）的结构。
m为聚合度，40≤m≤250，优选为45≤m≤200；x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，优选为30≤x+y+z≤300，更优选为50≤x+y+z≤250；5%≤y/(x+y+z)≤80%，优选为5%≤y/(x+y+z)≤50%。
在本发明中，具有式（I）结构的聚合物优选为R1为正己基，R2为H原子，R3为H原子，L为-CH2-CH2-。此时，聚合物具有式（I-d）的结构。
m为聚合度，40≤m≤250，优选为45≤m≤200；x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，优选为30≤x+y+z≤300，更优选为50≤x+y+z≤250；5%≤y/(x+y+z)≤80%，优选为5%≤y/(x+y+z)≤50%。
本发明实施例还公开了一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的制备方法，包括以下步骤：二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物在水性介质中发生配合反应，生成二氯-1,2-环己二胺合铂配合物；
式（I）中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基，R1优选为C3～C8的直链烷基、C4～C8的支链烷基、苯基，更优选为C6烷基；
R2独立的选自H原子、C1～C20的烷基或取代的C1～C20的烷基，优选为H原子、C1～C10的烷基或取代的C1～C10的烷基，所述取代的烷基的取代基选自酮缩醇、醛缩醇、羟基、醛基、氨基、巯基和糖残基中的一种或多种;
R3独立的选自H原子或阳离子，优选为H原子、金属阳离子或有机阳离子，更优选为H原子、钠离子、钾离子、镁的亚群、胺离子或氨基酸离子，最优选为H原子或钠离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250，优选为45≤m≤200；x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，优选为30≤x+y+z≤300，更优选为50≤x+y+z≤250；5%≤y/(x+y+z)≤80%，优选为5%≤y/(x+y+z)≤50%。
在本发明中，所述具有式（I）结构的聚合物为担载二氯-1,2-环己二胺合铂的载体，二氯-1,2-环己二胺合铂的至少一个氯离子作为离去基团被式（I）所示聚合物中的羧基所替代，其余的氯离子有可能被水分子替代或保持不变，而另一配体1,2-环己二胺保持不变。如果为二氯-1,2-环己二胺合铂与所述聚合物的两个羧基发生配合作用，其可以为分子内配合，也可以为分子间配合，对此，本发明并无特殊限制。
所述二氯-1,2-环己二胺合铂具有环己二胺结构，其与聚合物配合后能够由于堆积和疏水作用而形成稳定的内核结构，在生理条件下稳定性好；并可以有效避免由于静脉注射进入血液循环系统后所发生的突然释放和非特异性相互作用等问题。
在本发明中，所述二氯-1,2-环己二胺合铂优选包括各种立体异构的同系物（如JournalofMedicinalChemistry,21(1978)1315-1318中的报道），以及任何具有1,2-环己二胺配体的铂类药物。
在本发明中，所述具有式（I）结构聚合物的羧基与二氯-1,2-环己二胺合铂的摩尔比（COO-/Pt）优选小于20，更优选为小于10。
在本发明二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的制备方法中，二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式（I）结构的聚合物在水性介质中的配合可以通过直接混合反应的方法，也可以通过首先用硝酸银预处理二氯-1,2-环己二胺合铂得到二水合-1,2-环己二胺合铂再进一步与具有式（I）结构的聚合物反应的方法得到。优选为在避光条下将具有式（I）结构的聚合物溶于水性介质中，调节pH值，加入1,2-环己二胺合铂，进行配合作用，透析或超滤后得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物胶束。所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，以及混合添加的在不影响成胶束能力范围内的有机溶剂如乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺等，优选为去离子水。所述去离子水的pH值优选为6.5～8.5，更优选为7.0～8.0。所述聚合物的羧基在水性介质中的浓度优选为0.1mM～100mM，更优选为1mM～60mM，最优选为2mM～20mM。聚合物溶于水性介质后，优选将其pH值调节至6.0～10.0，更优选调节至7.0～9.0；然后加入二氯-1,2-环己二胺合铂发生配合作用，所述配合作用的时间优选为24～72小时，更优选为48～72小时；所述配合作用的温度优选为20℃～40℃。
按照本发明二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的制备方法，得到的所述二氯-1,2-环己二胺合铂配合物以胶束的形式存在于水性介质中，所述胶束的流体力学半径优选为10nm～2000nm，更优选为10nm～300nm。
利用该方法得到的配合物可以在经灭菌、浓缩、添加辅料等处理后直接以液体形式保存或用于静脉注射，也可以将其进行后处理后制成冻干粉保存或使用。所述冻干过程中可加入少量冻干保护剂，如小分子氨基酸、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇中的一种或几种。
本发明对所述具有式（I）结构的聚合物的来源也没有特殊限制，优选按照以下方法制备：
具有式（II）结构的聚合物，在脱水剂与催化剂共同作用下，与具有式（III）结构的聚合物发生接枝反应，得到具有式（I）结构的聚合物；
式（II）中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-,R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基，R1优选为C3～C8的直链烷基、C4～C8的支链烷基、苯基，更优选为C6烷基；
R3独立的选自H或阳离子，优选为H原子、金属阳离子或有机阳离子，更优选为H原子、钠离子、钾离子、镁的亚群、胺离子或氨基酸离子，最优选为H原子或钠离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
n，z为聚合度，10≤n+z≤5000，优选为30≤n+z≤300，更优选为50≤n+z≤250；5%≤z/(n+z)≤80%，优选为5%≤z/(n+z)≤50%；
式（III）中，R2独立的选自烷基或取代烷基,优选为H原子、C1～C10的烷基或取代的C1～C10的烷基，所述取代的烷基的取代基选自酮缩醇、醛缩醇、羟基、醛基、氨基、巯基和糖残基中的一种或多种;
m为聚合度，40≤m≤250,优选为45≤m≤200。
本发明制备具有式（I）结构的聚合物的反应优选在惰性气体保护的条件下，具有式（II）结构的聚合物和具有式（III）结构的聚合物用溶剂溶解后在脱水剂和催化剂的作用下，发生接枝反应得到具有式（I）结构的聚合物。所述反应温度优选为室温；所述反应时间优选为1～5天；所述惰性气体优选为氮气，通氮气时间优选为0.5～1小时；所述溶剂优选为二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺或二氧六环，更优选为二甲基亚砜；所述脱水剂优选为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐或N,N-二异丙基碳二亚胺或N,N'-二环己基碳二亚胺的一种或几种，更优选为N,N-二异丙基碳二亚胺；所述催化剂优选为4-二甲基吡啶。得到所述具有式（I）结构的聚合物后优选透析72小时、换水12次，冷冻干燥得到具有式（I）结构的聚合物的冻干粉。
本发明在制备具有式（I）结构的聚合物时，以具有式（II）结构的聚合物和具有式（III）结构的聚合物为原料；本发明对具有式（II）或式（III）结构的嵌段共聚物的来源没有特殊限制。其中，式（II）优选按照以下方法制备：
将γ-苄基-L-谷氨酸或γ-苄基-L-天冬氨酸在三光气的作用下反应，生成γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体或γ-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐单体；本发明优选在惰性气体条件下，将γ-苄基-L-谷氨酸或γ-苄基-L-天冬氨酸加入四氢呋喃中，加入三光气反应，反应后再溶剂中沉降，得到固体后重结晶、干燥得到γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体或γ-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐单体，所述溶剂优选为石油醚或正己烷；所述惰性气体优选为氮气；本发明对所述沉降、重结晶和干燥方式并无限制，本领域技术人员熟知的沉降、重结晶或干燥方式即可。
得到γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体或γ-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐单体后，在具有式（IV）结构的引发剂的作用下，将其进行开环聚合反应，脱除苄基后得到式（II）氨基酸共聚物；或者在具有式（IV）结构的引发剂的作用下，将γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体或γ-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐单体进行开环聚合反应，脱除苄基后，与钠离子、钾离子或镁离子混合得到式（II）氨基酸共聚物；
R1-NH2(IV)；
式(IV)中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基，R1优选为C3～C8的直链烷基、C4～C8的支链烷基、苯基，更优选为C6烷基。本发明优选在惰性气体条件下，将具有式（IV）结构的引发剂的二甲基甲酰胺溶液加入到γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体或γ-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐单体的二甲基甲酰胺溶液中，反应后在溶剂中沉降，过滤得到固体，干燥后脱苄基保护基后得到式（II）氨基酸共聚物。所述溶剂优选为乙醚；所述惰性气体优选为氮气；本发明对于所述沉降、过滤和干燥方式并无限制，本领域技术人员熟知的沉降、过滤和干燥方式即可。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
将10g的γ-苄基-L-谷氨酸，在干燥惰性气体的条件下，加入100ml无水四氢呋喃中，在6.5g三光气的作用下充分反应，然后加入石油醚沉降，得到固体，重结晶、干燥后最终得到7.85gγ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐（BLG-NCA）单体；在惰性气体的条件下，将正己胺的二甲基甲酰胺（DMF）溶液加入到BLG-NCA的DMF溶液中，正己胺与γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐（BLG-NCA）的物质的量比1：140，反应后加入乙醚沉降，过滤得到固体，干燥后得到聚合度为140的带苄基保护基的谷氨酸共聚物；脱保护基后得到式（II）结构聚合度为140的谷氨酸共聚物，记为PLG140。
向干燥的反应瓶内加入上述制备的1.010gPLG140、2.020g数均分子量为5000的聚乙二醇单甲醚，记为mPEG5k，用20mL干燥的二甲基亚砜溶解并搅拌，通氮气0.5小时，在室温、氮气保护条件下加入24.7mg4-二甲基吡啶和0.31mlN,N-二异丙基碳二亚胺，室温、搅拌反应3天，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥后得具有式（I-b）结构的聚合物冻干粉。
对所述聚合物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为5.00%，反应转化率为93%。所述具有式（I-b）结构的聚合物y=7，记为P(Glu)140-g-(mPEG5k)7。
实施例2
将54.0mg实施例1制备的P(Glu)140-g-(mPEG5k)7溶于25mL双蒸水中，调节pH值为8.0左右，加入24.6mg二氯-1,2-环己二胺合铂，37℃避光反应72h，纯水透析24h，换水6次以除去游离二氯-1,2-环己二胺合铂，得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束；将所述二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物冻干粉，其转化率为85%。
测定胶束的流体力学半径，结果见图1，图1为本发明实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的流体力学半径分布图，结果表明，二氯-1,2-环己二胺合铂配合物胶束的流体力学半径为41nm。
将得到的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物冻干粉复溶，其Pt含量利用电感耦合等离子体质谱测定，按照以下公式计算包封效率（DLE）和包封量（DLC）；
制备得到的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的包封效率为87.2%，包封量为0.91mmolPt/g。
实施例3添加的这几个实施例是不同载药量的
将54.0mg实施例1制备的P(Glu)140-g-(mPEG5k)7溶于25mL双蒸水中，调节pH值为8.0左右，加入12.3mg二氯-1,2-环己二胺合铂，37℃避光反应72h，纯水透析24h，换水6次以除去游离二氯-1,2-环己二胺合铂，得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束；将所述二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物冻干粉，其转化率为93%。
实施例4
将54.0mg实施例1制备的P(Glu)140-g-(mPEG5k)7溶于25mL双蒸水中，调节pH值为8.0左右，加入6.2mg二氯-1,2-环己二胺合铂，37℃避光反应72h，纯水透析24h，换水6次以除去游离二氯-1,2-环己二胺合铂，得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束；将所述二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物冻干粉，其转化率为98%。
实施例5
将54.0mg实施例1制备的P(Glu)140-g-(mPEG5k)7溶于25mL双蒸水中，调节pH值为8.0左右，加入3.1mg二氯-1,2-环己二胺合铂，37℃避光反应72h，纯水透析24h，换水6次以除去游离二氯-1,2-环己二胺合铂，得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束；将所述二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到二氯-1,2-环己二胺合铂配合物冻干粉，其转化率为98%。
实施例6
在37℃的条件下，分别称取5mg实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，溶解在5mL0.01MpH值为7.4的磷酸盐和pH值为5.5的醋酸盐缓冲溶液中，然后转移至透析袋，透析袋的截留分子量为3500，用40mL相应pH值的缓冲液进行透析，在12h、24h、48h、72h和120h分别取样3mL，并加入相应量的缓冲液；利用电感耦合等离子体质谱进行定量分析，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图2所示。图2为本发明实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物在pH=7.4和pH=5.5时的释放曲线图，由图2可知，二氯-1,2-环己二胺合铂配合物具有缓释能力和酸性pH下加快释放的特征。
实施例7
在37℃的条件下，称取5mg实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，溶解在5mL0.01MpH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，利用动态光散射技术测试不同时间点的散射强度和粒径。结果见图3所示。图3为实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物胶束的光散射图；（a）为在测试时间内的散射强度变化，（b）为测试时间内的粒径结果。结果表明，在240h的时间内，散射强度下降有限，而粒径基本没有明显变化。由此说明二氯-1,2-环己二胺合铂配合物胶束具有超长的稳定性。
比较例1
根据文献N.Nishiyama,etal.CancerResearch,63(2003)9877-8983的记载，其中的顺铂配合物的稳定性只能维持30小时。
比较例2
将54.0mg实施例1制备的P(Glu)140-g-(mPEG5k)7溶于25mL双蒸水中，调节pH值为8.0左右，加入19.5mg顺铂，37℃避光反应72h，纯水透析24h，换水6次以除去顺铂，得到顺铂配合物的胶束；将所述顺铂配合物的胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到顺铂配合物冻干粉，其转化率为85%。
在37℃的条件下，称取5mg上述制备的顺铂配合物，溶解在5mL0.01MpH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，利用动态光散射技术测试不同时间点的散射强度和粒径。实验结果表明，在60h的时间内，散射强度由1.0下降至0.2，胶束粒径明显变小，胶束逐渐分解。由此说明顺铂配合物胶束稳定性不及二氯-1,2-环己二胺合铂配合物胶束。
实施例8
收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（约104个）细胞，37℃培养24h后弃培养液；
用培养基将实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物分别按照二氯-1,2-环己二胺合铂中Pt浓度稀释为40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL6个浓度的样品；同样的用培养基将奥沙利铂裸药分别稀释为Pt浓度分别为40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL6个浓度的样品；
将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔，在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48h和72h，之后每孔加入20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到使用各个浓度的奥沙利铂裸药铂及二氯-1,2-环己二胺合铂配合物后细胞的存活率，结果见图4。图4为本发明实施例2制备的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物和奥沙利铂裸药对A549细胞的药效考察结果图。图4中，为使用不同浓度的奥沙利铂裸药48小时内细胞的存活率；为使用不同浓度的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物48小时内细胞的存活率；为使用不同浓度的奥沙利铂裸药72小时内细胞的存活率；为使用不同浓度的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物48小时内细胞的存活率。由图4可知，二氯-1,2-环己二胺合铂配合物具有与奥沙利铂裸药相当的药效和剂量-时间依赖关系。
实施例9
将6只Wistar大鼠随机分为2组（n=3，平均体重为240g），分别尾静脉注射奥沙利铂（Oxaliplatin）和二氯-1,2-环己二胺合铂配合物(以Pt计算剂量为3mg/kg)。在预定的时间点（5min，0.5、1、4、10、24h），通过眼眶收集血样至含有肝素钠的离心管中，离心分离得到血清。取200μL血清样品，硝酸消化后定容到4mL由电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测试铂含量，考察两种药物的血液药物代谢动力学。结果显示，二氯-1,2-环己二胺合铂配合物在Wistar大鼠血液中的代谢时间明显延长，血浆药物浓度半衰期（t1/2）达到2h。
实施例10
于C57BL/6小鼠（6周，15g，购自吉林大学实验动物中心）右前腋下注射100μL悬浮1.0×106个B16F1细胞（鼠源黑色素瘤细胞系）的PBS溶液。5天后，肿瘤体积增长至30-70mm3时开始第一次治疗，标记为第0天。将小鼠称重和测量瘤体积，并随机分为3组，每组6只：Saline组（即对照组）、奥沙利铂组（Oxaliplatin，Pt剂量：3.0mg/kg）、二氯-1,2-环己二胺合铂配合物组（DACHPtMicelles，Pt剂量3.0mg/kg），分别在第0、2、4、6、8天实施尾静脉注射。测量肿瘤的长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积（V=a×b×b/2）。于第14天处死全部小鼠，解剖出肿瘤组织称重，计算抑瘤率（TI）。TI（%）=（Saline组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量）/Saline组平均肿瘤质量×100%。奥沙利铂组对鼠源黑色素瘤的抑瘤率为30.2%，而二氯-1,2-环己二胺合铂配合物组的抑瘤率为40.1%，显示出良好的肿瘤抑制效果。
实施例11
于Balb/C裸鼠（6周，15g）右前腋下注射100μL悬浮1.0×106个A549肺腺癌细胞的PBS溶液。20天后，肿瘤体积增长至200mm3时开始第一次治疗，标记为第0天。将小鼠称重和测量瘤体积，并随机分为3组，每组6只：Saline组（即对照组）、奥沙利铂组（Oxaliplatin，Pt剂量：3.0mg/kg）、二氯-1,2-环己二胺合铂配合物组（DACHPtMicelles，Pt剂量3.0mg/kg），分别在第0、4、8天实施尾静脉注射。测量肿瘤的长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积（V=a×b×b/2）。于第14天处死全部小鼠，解剖出肿瘤组织称重，计算抑瘤率（TI）。TI（%）=（Saline组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量）/Saline组平均肿瘤质量×100%。奥沙利铂组对鼠源黑色素瘤的抑瘤率为40.2%，而二氯-1,2-环己二胺合铂配合物组的抑瘤率为49.7%，显示出良好的肿瘤抑制效果。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，由二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式(I)结构的聚合物配合形成，
式(I)中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基；
R2独立的选自H原子、C1～C20的烷基或取代的C1～C20的烷基；所述取代的C1～C20的烷基的取代基选自酮缩醇、醛缩醇、羟基、醛基、氨基、巯基和糖残基中的一种或多种；
R3独立的选自H原子或阳离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250；x，y，z为聚合度，10≤x+y+z≤5000，5％≤y/(x+y+z)≤80％。
2.根据权利要求1所述的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，其特征在于，R2独立的选自C1～C10的烷基或取代的C1～C10的烷基；
R3独立的选自H原子、金属阳离子或有机阳离子。
3.根据权利要求2所述的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，其特征在于，R3独立的选自H原子、钠离子、钾离子、镁的亚群、胺离子或氨基酸离子。
4.根据权利要求1所述的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，其特征在于，30≤x+y+z≤300，5％≤y/(x+y+z)≤50％。
5.根据权利要求1所述的二氯-1,2-环己二胺合铂配合物，其特征在于，R1为C6烷基、R2为甲基、R3为氢原子或钠离子、L为-CH2-CH2-。
6.一种二氯-1,2-环己二胺合铂配合物的制备方法，包括以下步骤：
二氯-1,2-环己二胺合铂与具有式(I)结构的聚合物在水性介质中发生配合反应，生成二氯-1,2-环己二胺合铂配合物；
式(I)中，R1独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基、苯基或R′-CO-，R′独立的选自C2～C10的直链烷基、C3～C10的支链烷基或苯基；
R2独立的选自H原子、C1～C20的烷基或取代的C1～C20的烷基；
R3独立的选自H原子或阳离子；
L独立的选自-CH2-或-CH2-CH2-；
m为聚合度，40≤m≤250；x，y，z为聚合度,10≤x+y+z≤5000，5％≤y/(x+y+z)≤80％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述具有式(I)结构的聚合物的羧基与二氯-1,2-环己二胺合铂中Pt的摩尔比小于20。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述具有式(I)结构的聚合物的羧基与二氯-1,2-环己二胺合铂中Pt的摩尔比小于10。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。
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