CN103374537B - 一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株。本发明菌株为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)BJX002，保藏号为CGMCC No.6026。该方法包括如下步骤：1)将所述菌株的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；2)从发酵液中提取恩拉霉素。本发明所述菌株生产恩拉霉素有效组分A与B的能力强，可达10000μg/ml发酵液，而且本发明菌株连续传5代后其生产恩拉霉素有效组分A与B的能力还保持原来水平，遗传稳定性好。用本发明菌株来制备恩拉霉素的方法，能够提高生产恩拉霉素的效率，而且方法简单、成本低廉，适合于在恩拉霉素的生产中推广应用。

Description

一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株

技术领域

本发明涉及一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)，又名恩来霉素、安来霉素、恩霉素、持久霉素。是由土壤中分离出来的放线菌(Streptomyces fungicidicusNo.B5477)发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十七种氨基酸结合成的多肽类抗生素，根据末端脂肪酸分子的不同将其分为恩拉霉素A和恩拉霉素B，恩拉霉素是这两种组分的混合物。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。2005年，国内生产企业与美国先灵葆雅动物保健有限公司(Schering Plough Anima Health Corp.)开始合作生产恩拉霉素预混剂。

恩拉霉素为多肽类抗生素，其抗菌作用机理是抑制细菌细胞壁的合成。恩拉霉素对革兰氏阳性细菌有很强的活性，特别是对肠道内的有害梭菌有很强的抑杀作用，对革兰氏阳性细菌的最小抑制浓度(MIC)为0.39～3.12g/ml。恩拉霉素还可以通过抑制肠道中有害细菌的生长和繁殖来改变肠道内的菌群平衡，饲料中营养物质的吸收和利用增加。长期使用恩拉霉素，细菌对其也不易产生耐药性，恩拉霉素与其他抗生素之间也不产生明显的交叉耐药。由于恩拉霉素具备以上诸多优点，使其具有良好的社会效益和环境效益，是一种新型的绿色抗生素，具有广阔的市场前景。

而在发酵行业中，提高单位菌种的生产效率，可以在现有设备条件下，在不增加原料成本、动力成本、人力成本的基础上提高产量。

发明内容

本发明的目的是提供一株杀真菌素链霉菌以提高生产恩拉霉素的效率。

本发明另一目的是提供应用本发明菌株生产恩拉霉素的方法。

本发明所提供的杀真菌素链霉菌为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)BJX002，已于2012年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)，保藏号为：CGMCC No.6026。

杀真菌素链霉菌BJX002的孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。在甘油硝酸盐琼脂培养基上气丝为白色至灰色，基丝为无色。在葡糖天冬素琼脂培养基上气丝为白色至微灰色，基丝为无色，可溶色素有时为微黄色。在淀粉琼脂培养基上气丝为白色至微灰色，基丝为无色至微黄色。在苹果酸钙琼脂培养基上气丝为白色至微灰色，基丝为无色至微黄色。可溶色素无，某些株为粉色，后消失。在甘油天冬素琼脂(ISP)、无机盐淀粉琼脂(ISP)、酵母精麦芽精琼脂(ISP)、燕麦粉琼脂(ISP)培养基上气丝无或少，为白色。基丝反面无鉴别色素：浅黄色或淡灰黄色。无可溶色素。在营养琼脂培养基上可溶色素无或略黄褐色。马铃薯块培养基上气丝无或白色至微灰色，基丝微黄色至微灰色，基丝周围可能有深褐色素。该菌株能使明胶液化，牛奶凝固且胨化弱，水解淀粉强。硝酸盐不还原或可疑。不产生类黑色素、酪氨酸酶和H₂S。利用D—葡萄糖、D—木糖、D—果糖、肌醇、D—甘露醇；对L—阿拉伯糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖利用可疑。

本发明提供一种制备恩拉霉素的方法，包括如下步骤:

1)发酵培养：将所述菌株的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；

2)从发酵液中提取恩拉霉素。

其中，所述菌株培养为在温度25-30℃的条件下培养192-240小时。

所述发酵培养基成分为：玉米淀粉7.0-13.0g/L，葡萄糖9.1-16.9g/L，磷酸氢二钾0.14-0.26g/L，七水硫酸镁0.7-1.3g/L，氯化钠10.5-19.5g/L，碳酸钙1.54-2.86g/L。所述发酵培养基灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

所述发酵培养基优选如下培养基：玉米淀粉10g/L，葡萄糖13g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钠15.2g/L，碳酸钙2.2g/L。所述发酵培养基灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

接种量优选为5～15％(V/V)，所述种子液为培养至对数生长期的种子液。

所述发酵可以在振荡的条件下进行，所述振荡的转速可以为170-210rpm，旋转半径为50mm。所述振荡的转速优选为190rpm。

为了防止发酵液因过多蒸发而浓缩，造成虚假的发酵单位，保持发酵过程中所述环境相对湿度为50-60％。

所述发酵的温度优选为28℃。

所述发酵的时间优选为240小时。

本发明的菌株生产恩拉霉素的能力强，可达10000μg/ml发酵液，有效组份A与B比值达到3.0以上。而且本发明菌株连续传5代后其生产恩拉霉素的能力及A/B比值均还保持在原有水平，表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备恩拉霉素的方法，能够提高生产恩拉霉素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此，本发明菌株及制备恩拉霉素的方法适合于在恩拉霉素的生产中推广应用。

附图说明

图1为恩拉霉素标准品的高效液相色谱图。

图2为发酵滤液中恩拉霉素的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

玉米淀粉购自黑龙江龙凤玉米开发有限公司；葡萄糖购自黑龙江省镜泊湖农业开发有限公司，玉米浆粉购自山东邹平鹤伴生物科技有限公司，蛋白胨购自偃师市百家工贸有限公司，氯化钠购自龙盐(牡丹江)盐业有限公司，碳酸钙购自河北省井径呈龙钙业有限公司，磷酸氢二钾及七水硫酸镁购自天津市东丽区天大化学制剂厂，琼脂购自青岛鲸海生物有限公司，酵母膏购自武穴市国邦生物工程有限公司，天门冬素购自国药集团化学试剂北京有限公司。

实施例1 菌株的制备

一、菌株的制备

本实验中用到的高通量初筛方法如下：

发酵阶段：采用96孔深孔板，每孔中装培养基0.3ml。每孔接入菌种，28℃静置培养10天。所用培养基由玉米淀粉10g/L，葡萄糖13g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钠15.2g/L，碳酸钙2.2g/L和琼脂2.5g/L组成，溶剂为水。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

提取阶段：将每孔用1ml甲醇浸泡，捣碎，取上清。

测定阶段：用酶标仪测定上清在267nm下的UV吸收值。

1、从土壤中分离菌株

取黑龙江省宁安市镜泊湖边的土壤，将土壤制成悬浮液，将土壤悬浮液接种于分离培养基中进行培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株；分离培养基由葡萄糖20g/L(单独灭菌后加入)，琼脂20g/L，酵母膏2g/L，天门冬素0.5g/L及K₂HPO₄0.5g/L组成，溶剂为水；pH为7.2；115℃，灭菌20分钟；

初筛：获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经8000rpm离心5分钟，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤获得发酵滤液；HPLC分析法检测发酵液中是否含有恩拉霉素；将能产生恩拉霉素的菌株分别进行如下系列诱变。

2、诱变

(1)紫外线复合链霉素诱变

取菌悬液7ml，加入无菌培养皿中，以30W的紫外照射仪于30cm处照射。设定照射时间分别为60s、90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿，28℃培养10d。挑取单菌落按照上述方法进行高通量筛选、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(2)紫外线复合链霉素诱变(第2轮)

对第一轮紫外线复合链霉素诱变获得的高产菌株用同样的方法再次进行紫外线复合链霉素诱变。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(3)5-氟尿嘧啶

将菌株斜面接种于无有机氮源的饥饿培养基中，培养过夜，将菌株接种于含有不同浓度的5-氟尿嘧啶平皿中，5-氟尿嘧啶的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml的5-氟尿嘧啶平皿中。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(4)微波复合链霉素诱变

以脉冲频率为2450MHz的650W家用微波炉，分别对平皿中菌悬液进行辐射处理。每次照射5s后使平皿冷却，再进行照射，并将照射时间累计，累计照射时间分别为60s、90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(5)NTG(亚硝基胍)复合链霉素诱变

亚硝基胍(NTG)诱变用0.1mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，分别用终浓度为1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml浓度的NTG处理单孢子悬液，于28℃震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，经稀释后涂布于含终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素的平皿。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。从筛选中获得恩拉霉素的高产菌株。

经过上述系列方法，最终获得了恩拉霉素高产菌株BJX002。

二、菌株的鉴定

杀真菌素链霉菌菌株BJX002是好氧放线菌，孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。

通过PCR扩增该菌的16SrDNA，PCR所用的引物序列为：

正向引物：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′

反向引物：5′AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA3′

将PCR产物进行凝胶电泳，发现与目的条带大小相同，为1481bp。序列如序列表1所示。

以上生理生化特征表明本发明得到的突变菌株属于杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)，将其命名为BJX002，该菌株已于2012年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.6026。

实施例2 发酵杀真菌素链霉素BJX002生产恩拉霉素

应用响应曲面法优化高产菌株BJX002发酵培养条件。

斜面培养基组成：由玉米淀粉10g/L，葡萄糖13g/L，玉米浆粉10g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钠15g/L，碳酸钙2.2g/L组成，溶剂为水。斜面培养基的pH值为7.2，121℃，灭菌30min。

种子培养基组成：由玉米淀粉20g/L，葡萄糖25g/L，玉米浆粉10g/L，蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙5g/L组成，溶剂为水。种子培养基的pH值为7.2，121℃，灭菌30min。

发酵培养基I组成：由玉米淀粉7.0g/L，葡萄糖9.1g/L，磷酸氢二钾0.14g/L，七水硫酸镁0.7g/L，氯化钠10.5g/L，碳酸钙1.54g/L组成，溶剂为水。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

发酵培养基Ⅱ组成：由玉米淀粉13.0g/L，葡萄糖16.9g/L，磷酸氢二钾0.26g/L，七水硫酸镁1.3g/L，氯化钠19.5g/L，碳酸钙2.86g/L组成，溶剂为水。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

发酵培养基Ⅲ组成：由玉米淀粉10g/L，葡萄糖13g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钠15.2g/L，碳酸钙2.2g/L组成，溶剂为水。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

一、利用发酵培养基Ⅰ发酵杀真菌素链霉菌BJX002制备恩拉霉素

(一)发酵杀真菌素链霉菌BJX002

1、斜面培养：

将杀真菌素链霉菌BJX002接种到斜面培养基上，在28℃、环境相对湿度为50-60％条件下培养10-12天。

2、种子培养

挖取步骤一中得到的斜面菌苔1cm²，将其接入装有30ml灭过菌的种子培养基的种子瓶，在如下条件下培养44-48小时(到对数生长期)：温度为28℃、环境相对湿度为50-60％、转速为180-200rpm、旋转半径为50mm，得到种子培养液。

3、发酵培养

发酵培养方法：取上述种子培养液按10％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基Ⅰ的三角瓶中，在如下条件下发酵培养240小时：温度为28℃、湿度为55％、转速为200rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

(二)提取恩拉霉素及产量检测

1、提取方法如下：

(1)取2ml发酵液，加入盛有8ml甲醇的10ml磨口比色管中，超声波超声20min，以4000rpm的速度离心10min，取上清溶液，共得到9.2-9.4ml上清。

(2)取1ml上清，以0.45μm的有机相微孔滤膜过滤，获得发酵浸提液，待测。

2、HPLC分析：

采用岛津LC-10A型高效液相色谱仪，250mm×4.6mm(i·d)不锈钢柱，内填Reliasil Cl8型号为Wondasil的C18反相柱，柱温35℃，取步骤(2)的发酵浸提液，进样量20μl；以磷酸缓冲盐(pH8.2)：乙腈(体积比为7:3)为流动相进行分离，流速为1ml/min，利用UV检测器在波长267nm处检测并自动形成分离图谱；在此色谱条件下，恩拉霉素标准品的色谱图如图1所示，恩拉霉素有效组份A与B的保留时间分别为16.5min与28.5min左右。

计算发酵滤液中保留时间为16.5min与28.5min左右处的洗脱峰面积，计算恩拉霉素A与B的含量。发酵滤液中恩拉霉素的色谱图如图2所示。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，20μl发酵滤液中获得162.6μg/ml的A组份和34.6μg/ml的B组份，A:B＝4.7。核算得恩拉霉素产量为9858μg/ml。

二、利用发酵培养基Ⅱ发酵杀真菌素链霉菌BJX002制备恩拉霉素

(一)发酵杀真菌素链霉菌BJX002

1、斜面培养：

同步骤一中所述一致。

2、种子培养:

同步骤一中所述一致。

3、发酵培养:

发酵培养方法：取上述种子培养液按7％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基Ⅱ的瓶中，在如下条件下发酵培养192小时：温度为26℃、环境相对湿度为50％、转速为200rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

(二)提取恩拉霉素及产量检测

1、提取方法如下：

同步骤一中所述一致。用2ml发酵液提取得到9.4-9.5ml上清。取2ml上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，获得发酵浸提液，待测。

2、HPLC分析

方法同步骤一中所述一致。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，20μl发酵滤液中获得156.7μg/ml的A组份和34.8μg/ml的B组份，A:B＝4.5。核算得恩拉霉素产量为9576μg/ml。

三、利用发酵培养基Ⅲ发酵杀真菌素链霉菌BJX002制备恩拉霉素

(一)发酵杀真菌素链霉菌BJX002

1、斜面培养：

同步骤一中所述一致。

2、种子培养：

同步骤一中所述一致。

3、发酵培养:

发酵培养方法：取上述种子培养液按10％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基Ⅲ的瓶中，在如下条件下发酵培养216小时：温度为30℃、环境相对湿度为60％、转速为190rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

(二)提取恩拉霉素及产量检测

1、提取方法如下：

同步骤一中所述一致。用2ml发酵液提取得到9.2-9.4ml上清。取1ml上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，获得发酵浸提液。

2、HPLC分析

方法同步骤一中所述一致。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，20μl发酵滤液中获得166.8μg/ml的A组份和36.3μg/ml的B组份，A:B＝4.6。核算得恩拉霉素产量为10156μg/ml。

实施例3 本发明菌株遗传稳定性检测

将突变菌株BJX002进行斜面传代，共传5代，每代菌的培养方法均如实施例2中所述一致，每代培养得到的菌均按照实施例2中步骤一中所述方法进行发酵和提取，并计算菌株产生的恩拉霉素的能力。

实验设3次重复，结果取平均数。结果本发明菌株BJX002在5次传代后，生产能力还能保持原来水平，表明本发明菌株BJX002的遗传稳定性好。

Claims (6)

1.杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)BJX002，其保藏号为CGMCC No.6026。

2.一种采用权利要求1所述杀真菌素链霉菌制备恩拉霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)发酵培养：将所述菌株的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；

2)从发酵液中提取恩拉霉素；

所述步骤1)的发酵培养为在温度25-30℃的条件下培养192-240小时；

所述发酵培养基成分为：玉米淀粉7.0-13.0g/L，葡萄糖9.1-16.9g/L，磷酸氢二钾0.14-0.26g/L，七水硫酸镁0.7-1.3g/L，氯化钠10.5-19.5g/L，碳酸钙1.54-2.86g/L，所述发酵培养基灭菌前调节pH至7.2；

所述发酵在振荡的条件下进行，所述振荡的转速为170-210rpm，旋转半径为50mm；发酵环境相对湿度为50-60％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：玉米淀粉10g/L，葡萄糖13g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钠15.2g/L，碳酸钙2.2g/L，所述发酵培养基灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述振荡的转速为190rpm。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述温度为28℃，培养时间为240小时。

6.权利要求1所述杀真菌素链霉菌在生产恩拉霉素中的应用。