CN103353461B - 一种基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法，属于食品安全致病菌快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品液体样本中致病菌的核磁共振检测方法，利用1抗捕获目标菌，利用1抗的抗体即2抗包被制备的顺磁纳米Ni-Co合金探针对目标菌进行富集、分离，利用纳米Ni-Co合金的顺磁特性对核磁共振衰减信号的弛豫时间的影响，检测出样本中是否含有目标菌。不同的具体的对应关系为：顺磁纳米Ni-Co合金探针，在一定条件下显示出线性关系，即纳米Ni-Co合金含量大，样品的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间值越小，在一定范围能够定量检测目标菌。该方法可以用于食品样本中有害致病菌的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种致病菌的快速检测方法，尤其涉及一种基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法。
背景技术
基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。Ni-Co合金材料具有铁磁性，当粒子直径小到一定程度会出现顺磁特性。即没有外加磁场时没有磁性，而在有外加磁场时表现出一定的磁性，可以用于磁分离。同时，顺磁性物质对核磁共振信号的影响十分显著，微量的顺磁性物质就会使核磁共振信号表现出变化。因此可以构建顺磁性的特异性Ni-Co合金纳米探针生物传感器，从磁共振的角度来做检测。
其主要的原理步骤：1. 在样品中加入检测目标菌的1抗，若样品中存在目标菌，则通过抗体抗原的结合形成1抗复合物，此时1抗起信号放大作用。2. 从市场上购买顺磁纳米Ni-Co合金材料，也可以通过其他方法制备纳米级的Ni-Co合金。使用硅烷偶联剂，其通式为:Y(CH2)nSiX3。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)3)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。通过修饰抗体可实现表面功能化，形成特异性免疫探针，再封闭多余的活性位点。由于纳米Ni-Co合金探针具有顺磁特性，因此，可以通过外加磁场分离没有联上的抗体。纳米Ni-Co合金材料修饰的是1抗的抗体，即2抗。3. 将目标菌特异性1抗采用一定的方法固定在酶标板表面，并将多余活性位点封闭备用。4. 在第1）步处理过的样品，加入第2）步制得的顺磁纳米Ni-Co合金探针，充分混合震荡反应一段时间，抓取目标菌后施加外加磁场，由于纳米Ni-Co合金具有顺磁特性，Ni-Co合金探针会聚集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出探针。若待检样品中有目标菌，则首先会在第1）步时与1抗形成1抗复合物，1抗复合物会再与探针表面的2抗复合，通过外加磁场而被富集、分离。洗涤、磁分离后加少量无菌的去离子水则形成目标菌的顺磁纳米Ni-Co合金探针悬浊液。此时，抓到目标菌和未抓到目标菌的过量探针还是混在一起。5. 将上述混在一起的探针，加到第3步的酶标板表面，则抓取了目标菌的探针将与酶标板表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未发生结合的探针洗脱。6. 再采用洗脱剂将固定载体上的结合的特异性纳米免疫探针洗下来，用磁分离的方法清洗掉离子、溶剂。此部分探针如果存在，就是抓取了目标菌的探针。由于Ni-Co合金具有顺磁特性，对于共振仪器非常敏感，相对于其他分子而言，微量的Ni-Co合金能够大幅降低无菌的去离子水的自旋-晶格驰豫时间和自旋-自旋弛豫时间，而无菌的去离子水在一定的均匀场强下，自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间是固定的。将洗脱液置于核磁共振仪中，与无菌的去离子水对照组进行对照。显著发生自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间值降低的说明有探针存在，从而间接说明食品样品中有致病菌检出。探针含量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间值降低呈正比。通过加标，可以定量检测目标菌。该方法中Ni-Co合金探针既是分离富集的手段，同时Ni-Co合金具有的顺磁特性，又可作为定量检测的探针。该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。所有的食品标准，致病菌都不得检出。因此，用该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。目前，国内外还没有文献报道这种方法。
发明内容
一种基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价。该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。
一种基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法，利用核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与Ni-Co合金纳米粒子顺磁免疫探针含量的相关性指标。不同的致病菌检出下限不同。
该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特异性顺磁纳米 Ni-Co合金探针富集、分离，从核磁共振弛豫信号参数变化的角度，检测出样品中的有害致病菌。采用偶联了特异性单克隆抗体的顺磁纳米Ni-Co合金探针，可以将样品中的特异性致病菌进行富集。由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对Ni-Co合金纳米粒子非常敏感，即在去离子水中，存在微量的顺磁Ni-Co合金纳米粒子，则水的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫就会显著下降。在一定条件下，顺磁免疫探针的顺磁特性使核磁共振的弛豫衰减信号自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间产生线性减小。通过定量检测出样品中的免疫探针含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与探针含量线性相关，拟合度较好。最终以顺磁免疫探针与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。而所有的食品标准，致病菌均不得检出。因此，该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。
本发明是这样实现的，步骤如下：
1）在样品中加入检测目标菌的1抗，若样品中存在目标菌，则通过抗体抗原的结合形成1抗复合物。
2）检测目标菌的1抗的抗体，即2抗包被顺磁纳米Ni-Co合金探针的制备；。
3）将目标菌特异性1抗在酶标板上的固定备用。
4）富集目标菌株，并分离：在第1）步处理过的样品，加入第2步制得的顺磁纳米Ni-Co合金探针，充分混合震荡反应一段时间，抓取目标菌后施加外加磁场，由于纳米Ni-Co合金的顺磁特性，则Ni-Co合金探针就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出探针。若待检样品中有目标菌，则首先会在第1）步时与1抗形成1抗复合物，1抗复合物会再与探针表面的2抗复合，通过外加磁场而被富集、分离。洗涤、磁分离后加少量无菌的去离子水则形成目标菌的顺磁纳米Ni-Co合金探针悬浊液。此时，抓到目标菌和未抓到目标菌的过量探针还是混在一起。
5）将富集的探针悬浊液加到第3）步制作的固定了单克隆抗体的酶标板上，若存在目标菌则形成双抗夹心；用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的探针就被洗掉，若不存在目标菌，则所有探针都被洗掉。
6）之后，用洗脱剂将酶标板上的双抗夹心的探针洗下来，用外加磁场分离探针的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在探针就是抓到目标菌的探针。这部分探针，加入无菌的去离子水形成探针的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定，以无菌的去离子水为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样本中有目标菌，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，可以通过定量探针在一定程度上间接定量出目标菌的量。
所述NMR探针为具有顺磁特性的纳米级Ni-Co合金材料，纳米粒径小于1000纳米。
所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化。
所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间(T1)和自旋-自旋弛豫时间(T2)。
所述的1抗为检测目标菌的特异性抗体，最好是单抗。2抗为1抗的抗体。
本发明的有益效果：本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依赖于建立的可用于检测顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的核磁共振检测方法。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。
具体实施方式
实例1
检验食品样本中测定其是否含有有害致病菌——单增李斯特菌。
1.纳米Ni-Co合金免疫探针制备：1抗采用单增李斯特菌的兔抗IgG单克隆抗体，2抗为单增李斯特菌的羊抗兔IgG。Ni-Co合金纳米粒子可以从市场上购买。比如北京德科岛金科技股份有限公司或上海超威纳米材料公司，20nm，比例1:1，各自纯度99.5%。
二氧化硅包被纳米Ni-Co合金：取47.5g硅酸钠，用去离子水溶解于烧杯中，用盐酸调节pH值为12-13。取5.0g纳米Ni-Co合金加入到此烧杯中，机械搅拌(用玻璃棒)5min。将混合液超声30min，适时搅拌。升温到85˚C，逐滴加入盐酸调节pH值6-7，生成沉淀。边磁分离边用去离子水洗涤沉淀，洗涤3-4次。然后，将沉淀分散于250mL甲醇中。以上过程重复三次，保证硅依附在Ni-Co合金上。
胺基硅烷化Ni-Co合金纳米材料：将制得的二氧化硅包被的纳米Ni-Co合金加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀释到150mL。然后加入150mL甘油混合。超声30min，转移到有搅拌装置的500mL三口烧瓶中。加入10mL氨基硅烷偶联剂（AEAPS），在80-90 ˚C下快速搅拌3h后，转移出产物。产物用去离子水洗涤3次，甲醇洗涤2次(用布氏漏斗抽滤)。真空干燥。需要注意的是，抽滤由于有甘油，所以比较慢，抽一段时间后可适时用吸管吸去上层液体，抽滤过程约需6-8h。最后将得到的胺基硅烷化Ni-Co合金纳米材料真空干燥12h。
抗体修饰：取一定量氨基化Ni-Co合金纳米粒子，加入过量的单增李斯特菌的羊抗兔IgG抗体, 26 ˚C孵育、洗涤后, 加过量1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，封闭表面活性空位,洗涤、重悬浮。因纳米Ni-Co合金具有顺磁特性，外加磁场分离，纳米Ni-Co合金就会汇集到磁场一边，吸走上清液，洗涤，则将多余的抗体、BSA洗去。制备的顺磁纳米免疫探针保存在4℃待用。
2.单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入单增李斯特菌第一抗体，兔抗IgG单克隆抗体，即将100 µL 100 µg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3.将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样品。将待检样品中加入1抗，单增李斯特菌的兔抗IgG。若待检样品中存在单增李斯特菌，将与1抗形成1抗复合物。将第1步制得的第2抗体单增李斯特菌的羊抗兔IgG探针加入后进行充分震荡。上磁力架分离探针，加少量无菌的去离子水得到探针的悬浊液。此时，如果待检样品中有目标单增李斯特菌，则通过第2抗体与1抗的相互作用，从而捕获该复合物，达到了目标菌富集的目的。此时，结合了目标菌的1抗复合物和没有结合目标菌的过量1抗都会与探针表面的2抗结合，还是混在一起。将此富集的探针悬浊液加到第2步所制备的1抗酶标板上，则探针悬浊液中结合了单增李斯特菌的探针会进一步与酶标板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合单增李斯特菌的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了单增李斯特菌的探针。
4.用洗脱液（甲醇等）将酶标板上的结合了单增李斯特菌的探针洗脱下来。上磁力架，分离探针并清洗1-2次，将离子洗去。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的T1和T2。以无菌的去离子水为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样本中有单增李斯特菌。探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明单增李斯特菌越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。所有食品标准均不得检出单增李斯特菌，此方法可以快速检测出样品中是否含有单增李斯特菌。
具体实施方式
实例2
测定食品样品是否含有有害致病菌——大肠杆菌O157：H7。
1.纳米Ni-Co合金免疫探针制备：1抗采用O157：H7的兔抗IgG单克隆抗体，2抗为O157：H7的羊抗兔IgG，可以是单抗也可以是多抗。Ni-Co合金纳米粒子可以从市场上购买。比如北京德科岛金科技股份有限公司或上海超威纳米材料公司，20nm，比例1:1，各自纯度99.5%。
二氧化硅包被纳米Ni-Co合金：取47.5g硅酸钠，用去离子水溶解于烧杯中，用盐酸调节pH值为12-13。取5.0g纳米Ni-Co合金加入到此烧杯中，机械搅拌(用玻璃棒)5min。将混合液超声30min，适时搅拌。升温到85˚C，逐滴加入盐酸调节pH值6-7，生成沉淀。边磁分离边用去离子水洗涤沉淀，洗涤3-4次。然后，将沉淀分散于250mL甲醇中。以上过程重复三次，保证硅依附在Ni-Co合金上。
胺基硅烷化Ni-Co合金纳米材料：将制得的二氧化硅包被的纳米Ni-Co合金加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀释到150mL。然后加入150mL甘油混合。超声30min，转移到有搅拌装置的500mL三口烧瓶中。加入10mL氨基硅烷偶联剂（AEAPS），在80-90 ˚C下快速搅拌3h后，转移出产物。产物用去离子水洗涤3次，甲醇洗涤2次(用布氏漏斗抽滤)。真空干燥。需要注意的是，抽滤由于有甘油，所以比较慢，抽一段时间后可适时用吸管吸去上层液体，抽滤过程约需6-8h。最后将得到的胺基硅烷化Ni-Co合金纳米材料真空干燥12h。
抗体修饰：取一定量氨基化Ni-Co合金纳米粒子，加入过量的2抗，即大肠杆菌O157:H7的羊抗兔IgG抗体, 26 ˚C孵育、洗涤后, 加过量1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，封闭表面活性空位, 洗涤、重悬浮。因纳米Ni-Co合金具有顺磁特性，外加磁场分离，纳米Ni-Co合金就会汇集到磁场一边，吸走上清液，洗涤，则将多余的抗体、BSA洗去。制备的顺磁纳米免疫探针保存在4 ℃待用。
2.单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入1抗，即兔抗IgG单克隆抗体，即将100 µL 100 µg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入牛血清蛋白将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3.将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样品。将待检样品中加入1抗，O157:H7的兔抗IgG。若待检样品中存在O157:H7，将与1抗形成1抗复合物。将第1步制得的第2抗体，O157:H7的羊抗兔IgG探针加入后进行充分震荡。上磁力架分离探针，加少量无菌的去离子水得到探针的悬浊液。此时，如果待检样品中有目标单增李斯特菌，则通过第2抗体与1抗的相互作用，从而捕获该复合物，达到了目标菌富集的目的。此时，结合了目标菌的1抗复合物和没有结合目标菌的过量1抗都会与探针表面的2抗结合，还是混在一起。将此富集的探针悬浊液加到第2步所制备的1抗酶标板上，则探针悬浊液中结合了O157:H7的探针会进一步与酶标板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合O157:H7的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了O157:H7的探针。
4.用洗脱液（甲醇等）将酶标板上的结合了大肠杆菌O157：H7的探针洗脱下来。上磁力架，分离探针并用无菌的去离子水清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20,纽迈公司或miNi-Co合金NMR华东师范大学)测定溶液的T1和T2，以去离子水为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间与空白比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样本中有大肠杆菌O157：H7，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明大肠杆菌O157：H7越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。
Claims (3)
1.一种基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征步骤如下：
1）在样品中加入检测目标菌的特异性1抗，若样品中存在目标菌，则通过抗体抗原的结合形成1抗复合物；
2）检测目标菌的1抗的抗体，即2抗包被顺磁纳米Ni-Co合金探针的制备；
3）将目标菌特异性1抗在酶标板上的固定备用；
4）富集目标菌株，并分离：在第1）步处理过的样品，加入第2）步制得的顺磁纳米Ni-Co合金探针，充分混合震荡反应一段时间，抓取目标菌后施加外加磁场，由于纳米Ni-Co合金具有顺磁特性，Ni-Co合金探针会聚集到磁场一边，吸走上清液则分离出探针；若待检样品中有目标菌，则首先会在第1步时与1抗形成1抗复合物，1抗复合物会再与探针表面的2抗复合，通过外加磁场而被富集、分离；洗涤、磁分离后加少量无菌的去离子水则形成目标菌的顺磁纳米Ni-Co合金探针悬浊液；此时，捕到和未捕到1抗复合物的Ni-Co合金探针还是混在一起；
5）将富集的Ni-Co合金探针悬浊液加到第3）步固定了单克隆抗体的酶标板上，若存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的探针就被洗掉，若不存在目标菌，则所有探针都被洗掉；
6）之后，用洗脱剂将酶标板上的双抗夹心的探针洗下来，用外加磁场分离探针的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在探针就是抓到目标菌的探针；
7）第6）步所得的探针，加入无菌的去离子水形成探针的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定；在固定场强下，无菌的去离子水的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间是一个恒定值，以无菌的去离子水为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样本中有目标菌，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标菌的量。
2.根据权利要求1所述的基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间的变化。
3.根据权利要求1所述的基于顺磁纳米Ni-Co合金探针间接富集的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述的1抗为检测目标菌的特异性单抗；2抗为1抗的抗体。
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