CN103357390A - 多层结构键合硅胶液相色谱填料及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类新型多层结构键合硅胶高效液相色谱填充材料及其合成方法。本发明首先利用烷基硅烷试剂对硅胶基质颗粒进行表面烷基化处理，然后硅胶基质烷基化填料与极性氟代苯基硅烷反应，最后将制备好的干燥硅胶填料进一步与硅烷封端试剂反应制得一类具有高惰性和优良色谱分离性能的新型高效液相色谱固定相。由于本发明采用了新型的极性氟代苯基和烷基官能团的组合作为硅胶表面键合相，从而得到比传统C₁₈色谱柱更优良的选择性，分离度和重现性。键合相具有疏水性作用，偶极-偶极作用，π-π作用以及形成氢键等多重作用机理，在合适的色谱条件下，本发明制得的色谱填料可有效地用于酸性，中性和碱性化合物的分离分析。

Description

多层结构键合硅胶液相色谱填料及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱填料及其制备方法，特别涉及采用多层键合技术制备的烷基和极性氟代苯基组合键合硅胶作为高效液相色谱填料及其制备方法，属于高效液相色谱填充材料制备技术领域。该色谱填料可用于正相、反相和亲水作用色谱三种分离模式，主要用于有机合成、食品、环境和制药行业中多组分有机化合物的分离分析。

背景技术

液相色谱是一种广泛使用的分析色谱技术，其基本原理在于通过流动相和固定相的分离效果来分离混合物中的组分，更具体地说是分离溶解在溶剂中的离子或分子。色谱柱用来填充固定相，流动相携带混合物流经固定相。样品中与固定相有着较强亲合力的组分在固定相中停留时间较长，而与固定相亲合力较弱的组分则较快地流出色谱柱，这样就达到了分离的效果。

高效液相色谱同时分离检测不同性质的化合物是色谱工作者始终关注的研究内容，制备具有多种作用机理的色谱固定相材料是实现这种分离的关键。人们曾尝试过用各种方法来实现具有疏水作用，离子交换，p-p作用和氢键作用等多重作用机理的酸性、中性、碱性和离子化合物的同时分析。如将不同性质的色谱柱进行并联，串联或预停留等的柱切换法来实现不同性质化合物的分离；将不同性能的两种填料混合均匀后充填在同一根色谱柱里制成混合床固定相进行酸性、中性和碱性化合物的同时分离；另一种方法是在固定相表面包覆具有合适多功能基的物质，实现不同性质化合物的同时分离。所有这些方法都不能从根本上解决不同性质化合物同时分离的问题。

在药物分析与纯化，代谢物分析，食品、环境分析和农药残留物的分析中，极性化合物的色谱分析一直是分析测试领域中的一个难题。对于较易离子化的有机酸或有机碱，一般是在流动相中加入离子对试剂，以达到分离的目的。但是这种方法存在许多自身无法克服的缺点，例如体系复杂，方法重现性差，平衡时间长等。随着当今LC-MS的发展趋势，离子对方法很难在LC-MS联机上使用。因而人们开始研发可与100%水溶液相匹配的反相色谱柱和与高水流动相相匹配的正相色谱柱，以使正相和反相色谱柱的适用范围得到扩展，从而在不使用离子对试剂的条件下可以对亲水性，强极性化合物进行液相色谱分析。然而目前使用的这两类色谱柱都具有稳定性和重现性差，分离机理复杂等缺点。

随着蛋白质组学、代谢组学、中药现代化、环境保护等研究领域的迅速发展，强极性和亲水性的小分子物质迅速成为分析化学和生物化学领域的重要研究对象，但这类物质往往较难在液相色谱上得到有效分离。传统的反相色谱对这些物质的保留和分离能力较弱，因为这类样品分子中极性的功能基团易于和流动相形成偶极矩作用，即被“溶剂化”，而与非极性的固定相缺乏这种作用，导致样品停留在流动相中而无法与固定相作用，因此通常在死时间流出而无法得到分离。对于带有一个或更多可电离的功能基团的极性分子，固然可以采用离子交换色谱或离子对色谱代替反相色谱进行分离分析，但这两种分离模式因与质谱检测器的兼容性较差而导致其在复杂样品分析中应用的局限性。正相色谱技术可以通过样品在强极性的固定相和极性更强的洗脱剂间的分配达到分离目的，但在应用过程中，正相色谱有一些难以避免的缺点，如样品峰形易前伸或拖尾，保留时间随进样量漂移，流动相中微量水的存在显著影响保留等。更重要的是，对于大多数亲水性强的样品，正相色谱的流动相无法提供足够的溶解度，这些问题都造成其在实际应用中的局限性。亲水作用色谱（HILIC）作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，可以作为正相、反相液相色谱的重要补充，解决极性化合物的分离问题，因而成为近年来色谱领域研究的热点之一。亲水作用色谱具有和正相色谱类似的保留行为，能为强极性的待测样品提供合适的保留；它采用水-水溶性有机相作为流动相，又能显著改善样品在流动相中的溶解度。此外，它在体现和反相色谱正交选择性的同时，具有与反相色谱相媲美的柱效和对称的峰形，又和多种检测器尤其是质谱检测器具有良好的兼容性，因此是一种非常适合于强极性和亲水性样品定性定量分析的液相色谱替代技术，并得到越来越广泛的重视和应用。在HILIC分离体系中，一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5-40%以保证其显著的亲水作用。这样的流动相组成使得HILIC可以和多种检测器兼容，尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。在HILIC分离体系中，目前普遍使用硅胶、氨基、二醇基、氰基等正相色谱填料，适合于HILIC分离的专用色谱填料很少，因而开发新型官能团表面修饰的、具有良好重现性和稳定性的色谱填料具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一类应用范围宽，柱效高，柱容量大，分离效率高，分离度好，可用于正相、反相和亲水作用色谱三种分离模式适用于等度或梯度分析的新型多层结构键合硅胶高效液相色谱柱填料。

本发明的另一目的是提供上述多层结构键合硅胶高效液相色谱柱填料的制备方法，以克服现有技术的不足。

本发明目的是这样实现的：

本发明是在硅胶基质上，采用多步键合的方法得到一类多层结构的硅胶基质键合相，该类材料是性能良好的高效液相色谱填料。

多层结构键合硅胶高效液相色谱柱填料的制备方法包括以下步骤：

（1）利用烷基硅烷试剂对硅胶基质颗粒进行表面烷基化处理得到硅胶基质烷基化填料；

（2）硅胶基质烷基化填料与极性氟代苯基硅烷反应得到硅胶填料；

（3）将干燥的硅胶填料进一步与硅烷封端试剂反应，得到硅胶液相色谱填料。

所述硅胶基质颗粒为球形多孔硅胶，金属杂质含量小于30 ppm，硅胶基质颗粒的粒径范围为1-60 mm；孔径范围为50-1000 Å，比表面积范围为50-500 m²/g。

所述的烷基硅烷试剂是单或双或三官能团的C₁-C₃₀有机硅烷，其化学结构通式为

其中R¹ = C₁-C₃₀取代或未取代烷基;

R² = C₁–C₂₀取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，苯基，取代苯基;

α= 0, 1, 2;

X = 卤素，烷氧基，酰氧基或胺基。

所述极性氟代苯基硅烷由2,3,4,5,6-五氟代苯甲酰氯与氨基硅烷反应得到，极性氟代苯基硅烷化学结构通式为：

其中R¹ = C₆F₅-，C₆F₅CONH-, C₆F₅CONHC₆H₄-或C₆F₅CONHC₆H₄O-；

α= 0~30；β= 0, 1, 2;

R² = C₁ – C₂₀取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，苯基，取代苯基；

X = 卤素，烷氧基，酰氧基或胺基。

所述的硅烷封端试剂是单，二，三，四或五硅烷中的一种或几种，所述的单硅烷为三甲基氯硅烷，N,N-二甲基三甲基硅胺，三甲基硅基咪唑，甲基三氯硅烷，二甲基二氯硅烷，二甲氧基二甲基硅烷，三甲基硅醇或N-三甲基硅基乙酰胺；所述的二硅烷为六甲基二硅氮烷或1,3-二甲氧基四甲基二硅氧烷；所述的三硅烷是六甲基环三硅氧烷；所述的四硅烷是八甲基环四硅氧烷；所述的五硅烷是十甲基环五硅氧烷。

按照上述硅胶液相色谱填料制备方法制备得到的硅胶液相色谱填料可用于正相、反相和亲水作用色谱分离。

本发明以硅胶颗粒为基质，利用相应烷基硅烷试剂，采用液相反应法对硅胶颗粒进行表面烷基化处理，得到烷基硅胶填料，进一步与极性氟代苯基硅烷反应得到多层结构键合硅胶填料，再经水解、进一步与硅烷封端试剂反应制得一类新型的高效液相色谱填料。本发明的关键是联合了新型的极性氟代苯基和烷基官能团作为硅胶表面键合相，从而得到比传统C₁₈色谱柱更优良的选择性和分离度。其特点是烷基官能团具有疏水作用，极性氟代苯基官能团具有偶极-偶极作用，π-π作用和氢键作用等多种作用机理，能够有效地同时分离检测酸性，中性和碱性化合物，特别是对极性化合物有很强的分离能力，可与含氧，氮，磷，硫的有机化合物形成氢键，因而具有很好的应用潜力。

本发明的色谱柱可用于正相、反相和亲水作用色谱分离，并适用于等度或梯度分析，即流动相的组分比例在整个分离过程中可以保持恒定或按一定规律改变。流动相中可含有0-100%水或0-100%有机溶剂。当含水时，其它成份应与水互溶。常用的有机溶剂有（但不限于）甲醇，乙腈，异丙醇，乙醇，四氢呋喃等。流动相中可加入0-100 mmol/L可溶性酸，碱或其它缓冲盐。流动相pH范围在pH 2-8之间以保证一定的色谱柱稳定性。使用的温度范围可以在5-60 ⁰C，最好在20-40 ⁰C。在LC-MS联机时，使用高有机流动相能够加大离子化过程，从而提高检测灵敏度。

惰性化处理（封端）过的键合相具有较高的惰性，其对混合物尿嘧啶-吡啶-苯酚色谱分离分析较之未惰性化处理的键合相硅胶填料相比，吡啶的峰形和保留时间得到明显改善，说明其有效地弱化了碱性物质与色谱固定相残留硅羟基间的相互作用。在合适的色谱条件下，惰性化处理过的固定相可有效地用于酸性、中性和碱性化合物的分离分析。

本发明色谱填料与传统的C₁₈色谱填料相比具有以下优点：

（1）烷基和极性氟代苯基组合键合硅胶是一类新型的液相色谱填料，具有很好的开发潜力。新型材料具有U型色谱分离特性，有望为目前难以解决的复杂极性和亲水性样品的分离分析提供强有力的工具；由于烷基和极性氟代苯基组合键合硅胶是一类具有多种作用机理的填料，因而可以对不同极性化合物的混合物进行同时分离检测；

（2）固定相同时具有正相、反相和亲水作用色谱分离的功能。既可以使用纯水流动相分离极性、碱性和亲水性有机化合物，减少有机溶剂的污染；又可以使用纯有机流动相，加大LC-MS的检测灵敏度；

（3）填料合成步骤简单，容易操作，重复性好；

（4）填料的色谱性能优越，柱效高，柱容量大，选择性好，分离度高。在体现和反相色谱正交选择性的同时，具有与反相色谱相媲美的柱效和对称的峰形，可以作为正相和反相色谱的重要补充。

附图说明

图1是实施例6中乙腈浓度对吲哚洛尔保留因子的影响；

图2是实施例7中传统C18柱与本发明色谱柱对吡啶-苯酚分离的色谱图；1代表吡啶，2代表苯酚；

图3是实施例8中本发明色谱柱对尿嘧啶-对羟基苯甲酸丁酯-普萘洛尔-邻苯二甲酸二丙酯-萘-苊-阿米替林混合物分离的色谱图；1代表尿嘧啶，2代表对羟基苯甲酸丁酯，3代表普萘洛尔，4代表邻苯二甲酸二丙酯，5代表萘，6代表苊，7代表阿米替林；

图4是实施例9中本发明色谱柱对胞嘧啶-硫脲-腺嘌呤-尿苷混合物分离的色谱图；1代表胞嘧啶，2代表硫脲，3代表腺嘌呤，4代表尿苷。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的技术，通过实例给予进一步的说明。

具体地说，本发明多层结构键合硅胶填料合成的具体步骤如下：

将活化的硅胶加入反应器中，通入干燥惰性气体，加入二甲苯和吡啶，机械搅拌均匀，然后加入烷基硅烷试剂，加热回流，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1:1，v/v），甲醇洗涤，干燥。将烷基键合硅胶放入反应器中，通入干燥惰性气体，加入二甲苯和吡啶，机械搅拌均匀，然后加入极性氟代苯基硅烷试剂，加热回流，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1:1，v/v），甲醇洗涤。材料然后用0.1%三氟醋酸甲醇水溶液（5：1）在室温下水解，真空抽滤，依次用丙酮，甲醇-水 （1:1，v/v），甲醇洗涤，干燥。键合硅胶被放入反应器中，通入干燥惰性气体，加入二甲苯，机械搅拌均匀，然后加入一定量的封端硅烷试剂，加热回流，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1:1，v/v），甲醇洗涤，干燥。在本发明硅胶填料的合成中，所涉及的反应物质最佳比例为，硅胶，硅烷，吡啶和溶剂之间的摩尔比为1:1.5:1.5:5，回流搅拌反应时间为24-48小时。

实施例 1

（1）称取氨丙基三甲氧基硅烷18克，放入三口瓶中，安装冷凝管和滴液漏斗，通入干燥氩气，加入干燥甲苯100毫升，三乙胺13克，滴加2,3,4,5,6-五氟代苯甲酰氯23克，机械搅拌16小时。粗材料用蒸馏方法纯化。

（2）称取10克球形硅胶（5 μm, 100 Å, 450 m²/g, 金属杂质含量小于30 ppm），120 ⁰C真空干燥24小时，冷却后置入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入正十八烷基二甲基氯硅烷18克，加热至回流并恒温反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（3）称取10克干燥的正十八烷基键合硅胶，放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入步骤(1)合成的硅烷20克，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤。

（4）将步骤（3）键合硅胶（10克）放入反应器中，加入50毫升0.1%三氟醋酸甲醇水溶液（5：1， v/v），在室温下反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（5）取步骤（4）键合硅胶（10克）放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，六甲基二硅氮烷10毫升，（N,N-二甲胺基）三甲基硅烷8毫升，机械搅拌均匀，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

实施例 2

（1）称取10克球形硅胶（5μm, 100 Å, 450 m²/g, 金属杂质含量小于30 ppm），120 ⁰C真空干燥24小时，冷却后置入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入正十八烷基二甲基氯硅烷18克，加热至回流并恒温反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（2）称取10克干燥的正十八烷基键合硅胶，放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入氨丙基三甲氧基硅烷3克，加热至回流并恒温反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（3）取步骤（2）键合硅胶（10克）放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入甲苯50毫升，三乙胺4克，滴加2,3,4,5,6-五氟代苯甲酰氯8克，机械搅拌16小时。停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤。

（4）将步骤（3）键合硅胶放入反应器中，加入50毫升0.1%三氟醋酸甲醇水溶液（5：1， v/v），在室温下反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（5）取步骤（4）键合硅胶（10克）放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，1,2-双（氯代二甲基硅基）乙烷5克，N-三甲基硅基咪唑7克，机械搅拌均匀，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

实施例 3

（1）称取[3-(p-苯胺基)丙基]三甲氧基硅烷26克，放入三口瓶中，安装冷凝管和滴液漏斗，通入干燥氩气，加入干燥甲苯100毫升，三乙胺13克，滴加2,3,4,5,6-五氟代苯甲酰氯23克，机械搅拌16小时。粗材料用蒸馏方法纯化。

（2）称取10克球形硅胶（5μm, 100 Å, 450 m²/g, 金属杂质含量小于30 ppm），120 ⁰C真空干燥24小时，冷却后置入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入正十八烷基甲基二氯硅烷20克，加热至回流并恒温反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（3）称取10克干燥的正十八烷基键合硅胶，放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入步骤(1)合成的硅烷7克，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水 （1：1，v/v），甲醇洗涤。

（4）将步骤（3）键合硅胶（10克）放入反应器中，加入50毫升0.1%三氟醋酸甲醇水溶液（5：1， v/v），在室温下反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（5）取步骤（4）键合硅胶（10克）放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，1,2-双（氯代二甲基硅基）乙烷5克，六甲基二硅氮烷10毫升，机械搅拌均匀，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

实施例 4

（1）称取[8-(p-苯胺基)辛基]二甲基氯硅烷30克，放入三口瓶中，安装冷凝管和滴液漏斗，通入干燥氩气，加入干燥甲苯100毫升，三乙胺13克，滴加2,3,4,5,6-五氟代苯甲酰氯23克，机械搅拌16小时。粗材料用蒸馏方法纯化。

（2）称取10克球形硅胶（5μm, 100 Å, 450 m²/g, 金属杂质含量小于30 ppm），120 ⁰C真空干燥24小时，冷却后置入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入正八烷基二甲基氯硅烷11克，加热至回流并恒温反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（3）称取10克干燥的正八烷基键合硅胶，放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入步骤(1)合成的硅烷27克，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（4）取步骤（3）键合硅胶（10克）放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，1,2-双（氯代二甲基硅基）乙烷5克，N,O-双（三甲基硅基）乙酰胺12毫升，机械搅拌均匀，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

实施例 5

（1）称取10克球形硅胶（5μm, 100 Å, 450 m²/g, 金属杂质含量小于30 ppm），120 ⁰C真空干燥24小时，冷却后置入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入正十二烷基二甲基氯硅烷14克，加热至回流并恒温反应24小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（2）称取10克干燥的正十二烷基键合硅胶，放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，吡啶4毫升，机械搅拌均匀，然后加入（2,3,4,5,6-五氟代丙基）二甲基氯硅烷11克，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

（3）取步骤（2）键合硅胶（10克）放入反应器中，通入干燥氩气，安装冷凝管和干燥管，加入二甲苯50毫升，六甲基环三硅氧烷10毫升，六甲基二硅氮烷10毫升，机械搅拌均匀，加热至回流并恒温反应48小时，停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时。

实施例 6

取实施例1所得的键合硅胶填料0.5克，匀浆法填充于50 x 2.0 mm ID 不锈钢柱中。应用吲哚洛尔作为测试样品，以乙腈:20 mM醋酸铵（pH 5.6）为流动相，在30 ⁰C，每分钟0.2毫升流速下对色谱柱在Agilent 1200液相色谱仪上进行检测，检测波长为220 nm。图1表明了乙腈浓度对吲哚洛尔保留因子的影响。从图1中可以看出，当流动相中的有机相浓度增加时（0-30%），溶质的保留因子下降，表现出反相色谱的性质；而随着流动相中有机相的浓度继续增加（30-80%），溶质的保留因子基本保持恒定；当流动相中有机相的浓度继续增加时（80-100%），溶质的保留因子快速增加，表现出正相色谱的性质。本发明制备的高效液相色谱填料同时具有反相和正相色谱分离的功能，因而能够同时分离检测不同极性化合物的混合物。对于传统的反相C₁₈色谱柱，溶质的保留时间总是随流动相中有机相浓度的增加而减少。

实施例 7

取实施例1所得的键合硅胶填料2克，匀浆法填充于150 x 4.6 mm ID不锈钢柱中。所得色谱柱用于分离混合物样品。应用1吡啶，2苯酚作为测试样品，以50%乙腈和50%水为流动相，在30 ⁰C，每分钟一毫升流速下对色谱柱在Agilent 1200液相色谱仪上进行检测，检测波长为254 nm。所得谱图见附图2。其中上部为传统C₁₈色谱柱测试结果，下部为本发明色谱柱测试结果。本发明色谱柱所得到的峰形明显优于传统C₁₈色谱柱所得的相应结果。

实施例 8

用实施例7制备的150 x 4.6 mm ID色谱柱，分离了1尿嘧啶，2对羟基苯甲酸丁酯，3普萘洛尔，4邻苯二甲酸二丙酯，5萘，6苊，7阿米替林混合物，图3为其色谱图。色谱条件如下：流动相，甲醇:20 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）= 80:20 (v/v); 流速，1 mL/min; 柱温，30 ⁰C；检测波长， UV254 nm。

实施例 9

用实施例7制备的150 x 4.6 mm ID色谱柱，分离了1胞嘧啶，2硫脲，3腺嘌呤，4尿苷混合物，图4为其色谱图。色谱条件如下：流动相，10 mmol/L甲酸胺水溶液（pH 3.0）; 流速，1 mL/min; 柱温，30 ⁰C；检测波长， UV254 nm。

Claims (7)

1.一种硅胶液相色谱填料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）利用烷基硅烷试剂对硅胶基质颗粒进行表面烷基化处理得到硅胶基质烷基化填料；

（2）硅胶基质烷基化填料与极性氟代苯基硅烷反应得到硅胶填料；

（3）将干燥的硅胶填料进一步与硅烷封端试剂反应得到硅胶液相色谱填料。

2.根据权利要求1所述的硅胶液相色谱填料的制备方法，其特征在于：所述硅胶基质颗粒为球形多孔硅胶，金属杂质含量小于30 ppm，硅胶基质颗粒的粒径范围为1-60 mm，孔径范围为50-1000 Å，比表面积范围为50-500 m²/g。

3.根据权利要求1所述的硅胶液相色谱填料的制备方法，其特征在于：所述烷基硅烷试剂的化学结构通式为

其中R¹ = C₁-C₃₀取代或未取代烷基;

R² = C₁–C₂₀取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，苯基，取代苯基;

α= 0, 1, 2;

X = 卤素，烷氧基，酰氧基或胺基。

4.根据权利要求1所述的硅胶液相色谱填料的制备方法，其特征在于：极性氟代苯基硅烷的化学结构通式为：

其中R¹ = C₆F₅-，C₆F₅CONH-, C₆F₅CONHC₆H₄-或C₆F₅CONHC₆H₄O-；

α= 0~30；β= 0, 1, 2;

R² = C₁–C₂₀取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，苯基，取代苯基；

X = 卤素，烷氧基，酰氧基或胺基。

5.根据权利要求1所述的硅胶液相色谱填料的制备方法，其特征在于：所述的硅烷封端试剂是单，二，三，四或五硅烷中的一种或几种，所述的单硅烷为三甲基氯硅烷，N,N-二甲基三甲基硅胺，三甲基硅基咪唑，甲基三氯硅烷，二甲基二氯硅烷，二甲氧基二甲基硅烷，三甲基硅醇或N-三甲基硅基乙酰胺；所述的二硅烷为六甲基二硅氮烷或1,3-二甲氧基四甲基二硅氧烷；所述的三硅烷是六甲基环三硅氧烷；所述的四硅烷是八甲基环四硅氧烷；所述的五硅烷是十甲基环五硅氧烷。

6.根据权利要求1至5任意之一所述硅胶液相色谱填料制备方法制备得到的硅胶液相色谱填料。

7.权利要求6所述硅胶液相色谱填料在正相、反相和亲水作用色谱分离中的应用。

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