CN103341172B - 一种双孔多糖微球及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双孔多糖微球及其制备方法、用途，所述微球由多个小粒径的多糖颗粒堆积而成，微球的平均粒径为500nm-500μm，并具有包括多糖本身的凝胶孔及由多糖颗粒之间空隙所形成的大孔的双孔道结构。通过下述方法制备：将多糖颗粒分散在水相中，再分散在油相中，形成油包水乳液；将乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。上述制备方法还可与膜乳化技术相结合制备出具有均一粒径分布的双孔多糖微球，其平均粒径范围为500nm-100μm，其粒径分布系数小于20%。本发明的双孔多糖微球适合作为分离生物大分子的分离介质及生物活性物质载体等。
Description
技术领域
本发明涉及一种微球及其制备方法、用途，尤其涉及一种双孔多糖微球及其制备方法、用途。
背景技术
随着生命科学的发展，与之相关的生物大分子的分离已成为极其重要的课题。目前，大规模制备蛋白的分离纯化技术已经成为生物技术发展的一个限制因素，国内外正在进行大量的研究，这个方向也成为科技投资的重点之一。
虽然生物分离介质的研究已经有几十年的历史，介质的性能（如机械强度、适用范围和使用寿命）及其分离能力都有很大提高，但分辨率、容量和分离速度这三个因素还是难于协调。尤其对生物大分子来说，由于其体积大、结构易变，对分离条件的要求更高。然而，常规的多糖分离介质其自身孔径较小，如分离中常用的琼脂糖介质，其自身孔径在2-50nm左右。由于孔径较小，流动相在孔道内的传质过程主要依靠分子扩散完成，导致生物大分子的传质速度慢、分离时间长。
为克服上述不足，急需开发新的方法来制备具有大孔径（大于10或20倍的生物大分子的直径）的新型分离介质。例如，Afeyan等人（参见US 5019270，US 5228989，US 5833861）制备了以苯乙烯为基质的大孔聚合物微球，其具有两类孔，一类是的贯穿孔（through pores），一类是的扩散孔（diffusion pores）。贯穿孔内流体可以以对流形式流动，传质速度快；而扩散孔提供了足够高的比表面积，保证了介质的吸附容量；另外，贯穿孔与扩散孔之间的距离短，流动相很容易扩散入内。然而以苯乙烯为基质的聚合物微球其疏水性较强，用于分离生物大分子时必须经过亲水镀层修饰，其工艺繁琐且存在着镀层脱落的问题，这在一定程度上制约了它的应用。因此开发大孔多糖微球成为了研究的重点，目前文献报道有以下几种方法。
(1)复乳法
Gustavsson和Larsson等（参见P.E.Gustavsson,P.O.Larsson.Superporousagarose,a new material for chromatography.Journal of Chromatography A.1996,734:231-240；US 5723601）报道了用油相（环己烷）作为液体致孔剂，采用油包水包油复乳法制备大孔琼脂糖微球的方法。这类大孔琼脂糖微球既具有琼脂糖自身的凝胶孔（2-50nm），同时还具有较大的流通孔（50-1000μm），可以极大地提高操作流速。然而该微球中流通孔孔径难以控制，并且由于使用了有机溶剂作为液体致孔剂，微球中会残留较多的有机溶剂，难以完全清除，给后续分离带来一定的影响。
(2)无机颗粒致孔
孙彦等（参见Q.H.Shi,X.Zhou,Y.Sun.A novel superporous agarose mediumfor high-speed protein chromatography,Biotechnology and Bioengineering.2005,92(5):643-651；CN 1194811C）用碳酸钙颗粒（粒径范围0.86-4.58μm）作为固体致孔剂制备出大孔琼脂糖微球。然而，由于在制备过程中需要用到稀盐酸除去碳酸钙颗粒，在去除过程中将产生大量的气泡，凝胶介质的流通孔中由于大量气泡的快速产生形成的压强远远大于凝胶介质外界的压强，如此形成的凝胶介质的高的内外压差会对大孔琼脂糖凝胶介质的机械强度产生很大的负面影响。CN 100478066C公开了一种大孔琼脂糖凝胶介质的制备方法，将碳酸钙颗粒替换为金属氧化物颗粒作为固体致孔剂，避免了去除致孔剂时气泡的产生。然而，其制备过程同样需要用到稀酸去除固体致孔剂，造成制备过程繁琐，致孔剂难以完全清除。并且所使用的稀酸还会对环境造成一定的影响。
上述的技术制备过程繁琐，需要后续工艺除去致孔剂，致孔剂难以完全清除，可控性差。此外，这些方法制备出的多糖微球的粒径分布宽，在实际应用时需要筛分，并且筛分后的微球仍具有较宽的粒径分布。而对于分离纯化应用而言，微球介质的粒径和均一度对分离结果具有重要影响。此外，其它一些用于制备大孔材料的方法，如反复熔融、冷冻-干燥等，由于反复熔融以及冷冻-干燥的过程会对微球的形态产生很大影响，使微球发生变形、聚集，甚至出现碎球等，因此一般不用于制备大孔微球介质。
发明内容
针对现有技术存在的缺点，本发明的目的之一在于提供一种双孔多糖微球，所述微球既具有多糖本身的凝胶孔，又具有堆积的多糖颗粒之间空隙所形成的大孔这样的双孔道结构，并且大孔之间相互贯通，有利于提高传质和传热效率。本发明制得的微球机械强度较高，孔径均一，并且可以可控调节，制备工艺简单，同时避免了致孔剂残留。
本发明提供的双孔多糖微球，所述微球由多个小粒径的多糖颗粒堆积而成，微球的平均粒径为500nm-500μm，例如为600nm、800nm、1μm、50μm、100μm、150μm、220μm、280μm、340μm、390μm、440μm、470μm等，并具有包括多糖本身的凝胶孔及由多糖颗粒之间空隙所形成的大孔的双孔道结构。
作为优选技术方案，本发明所提供的微球，所述凝胶孔的平均孔径为2-50nm，例如为5nm、10nm、15nm、21nm、33nm、41nm、48nm等；所述大孔的平均孔径为80nm-6μm，例如为90nm、120nm、500nm、700nm、900nm、1μm、2μm、4μm、5μm等，大孔之间相互贯通。大孔之间相互贯通，有利于提高传质和传热效率。
作为优选技术方案，本发明所提供的微球，所述微球的平均粒径为500nm-100μm，例如为600nm、800nm、1μm、10μm、20μm、35μm、41μm、52μm、63μm、74μm、80μm、91μm、95μm等，优选为5μm-100μm，其粒径分布系数≤20%；
优选地，所述多糖为琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、卡拉胶、阿拉伯胶中的一种或至少两种以上的混合物；例如为琼脂糖或葡聚糖或壳聚糖或卡拉胶，或为葡聚糖与魔芋葡甘聚糖的混合，或为海藻酸盐与明胶的混合，或为其中3种或为4种或5种等的混合。
优选地，所述微球中多糖颗粒的数量≥10个，优选为≥30个；并且为保证颗粒堆积组成的微球的稳定性，微球中的多糖颗粒数量≥10个。
优选地，所述多糖颗粒的平均粒径为微球平均粒径的0.1%-30%，例如为0.5%、1.2%、3%、4.5%、5.5%、7%、9%、11%、15%、19%、24%、26%、29%等，优选为1%-20%，进一步优选为5%-20%。
优选地，所述多糖颗粒的粒径分布系数≤20%。
所述粒径分布系数按下式计算：
C.V.=[∑(di-d)2/N]1/2/d×100%
式中：
C.V.代表粒径分布系数；
di代表各个微球的直径；
d代表微球的数均平均粒径；
d=∑di/N；
N为用于计算粒径的微球数量，且N≥200个。
本发明的目的之二在于提供一种本发明所述微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相与含有乳化剂的油相混合，形成油包水乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。
该制备方法的制备流程图见图1。
本发明提供的所述微球的第二种制备方法，包括如下步骤：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相与含有乳化剂的油相混合，形成油包水预乳液；将预乳液在压力作用下通过孔径为0.1-100μm的微孔膜得到乳液，微孔膜的孔径优选为0.8-50μm；
优选地，所述压力为0kPa-20MPa，优选为10kPa-5MPa，通过微孔膜的次数为1次以上，优选为1-5次，进一步优选为1-3次；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。
该制备方法的制备流程图见图2。本方法采用了快速膜乳化法。
在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中的预乳液通过至少一个，优选至少两个孔径均一的微孔膜以得到所述乳液。在另一些实施方案中，步骤2）中的预乳液通过同一孔径均一的微孔膜至少一次，优选至少两次以上以得到所述乳液。例如，所述预乳液可以连续或间歇地通过两个或更多个孔径均一的微孔膜，先使用的微孔膜的孔径大于或等于后使用的微孔膜的孔径。或者，所述预乳液可以通过同一孔径均一的微孔膜两次或更多次，每次通过在相同或不同的压力条件下进行。通过选择具有合适孔径的微孔膜，将预乳液通过所述孔径均一的微孔膜一次或多次或者通过一个或多个微孔膜后，所得乳液中的乳液滴的粒径分布系数CV值会逐渐变小，直至小于20%，因此即可得到本发明的平均粒径为500nm-100μm和粒径分布系数小于20%的双孔多糖微球产品。
本发明提供的所述微球的第三种制备方法，包括如下步骤：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相在压力作用下通过孔径为0.1-100μm的微孔膜进入含有乳化剂的油相，搅拌油相，形成油包水乳液，微孔膜的孔径优选为0.8-50μm；
优选地，所述压力为0kPa-2MPa；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。
该制备方法的制备流程图见图3。本方法采用了常规膜乳化法。
在本发明方法的一些实施方案中，使用的微孔膜优选疏水性的膜，如聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或经过疏水处理的SPG膜。在制备过程中，可通过选择不同膜孔径的膜来控制产品的粒径大小，常用的微孔膜的孔径为0.1-100μm，优选膜孔径为0.8-50μm。由于不同膜孔径所制备的微球粒径不同，所制备的微球的平均粒径与膜孔径存在某种线性关系。因此，对于某一特定体系，可以选择不同孔径大小的膜来制备所需粒径的微球。
反应完成后，通过离心或抽滤的方式将微球分离，并分别用乙醇、丙酮、水洗涤数次，得到双孔多糖微球。
作为优选技术方案，本发明所提供的制备方法，所述多糖为琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、卡拉胶、阿拉伯胶中的一种或至少两种以上的混合物；
优选地，所述水相为有机溶剂与水的混合溶液；所述有机溶剂的沸点≤85℃，并可溶于水；所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯或四氢呋喃中的一种或至少两种以上的混合物；进一步优选为乙醇或丙酮，或其混合物。水相中可含有一定浓度的水溶性乳化剂，乳化剂优选自聚乙烯醇、聚吡咯烷酮、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯（Tween80）、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯（Tween 20）、十二烷基磺酸钠（SLS）、亲油性－亲水性嵌段共聚物中的一种或者几种，乳化剂浓度优选为0.1wt%-10wt%。
优选地，所述多糖颗粒在水相中的质量浓度为5wt%-95wt%，例如为25wt%、27wt%、30wt%、32wt%、36wt%、38wt%、40wt%、50wt%、54wt%、57wt%、61wt%、64wt%、68wt%、71wt%、78wt%、82wt%、86wt%、89wt%、91wt%等，优选为20wt%-95wt%，进一步优选为50wt%-95wt%。多糖颗粒在水相中的分散方式可为机械搅拌、磁力搅拌、均质、超声、振荡中的一种方式或几种方式的组合使用，优选为机械搅拌或磁力搅拌；搅拌转速可以是50-1000rpm，优选为100-500rpm。
优选地，所述多糖颗粒的平均粒径为微球平均粒径的0.1%-30%，优选为1%-20%，进一步优选为5%-20%；
优选地，所述多糖颗粒的粒径分布系数≤20%。
作为优选技术方案，本发明所提供的制备方法，所述油相为液体石蜡、环己烷、甲苯、四氯化碳、石油醚中的一种或至少两种以上的混合物；优选为液体石蜡与石油醚的混合物或环己烷与四氯化碳的混合物；
优选地，所述油相中乳化剂为油溶性的非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两亲性嵌段共聚物中的一种或至少两种以上的混合物；优选为失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇单油酸酯、对辛基苯酚聚氧乙烯醚、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、AOT、PO-500、PO-310、Arlacel 83、烷基酚聚氧乙烯醚类中的一种或至少两种的混合物；进一步优选为失水山梨醇单油酸酯、对辛基苯酚聚氧乙烯醚、AOT、PO-500、Arlacel 83中的一种或至少两种的混合物。
非离子型表面活性剂是在水溶液中不产生离子的一种表面活性剂，它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。常用的非离子型表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚类、失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇单油酸酯、对辛基苯酚聚氧乙烯醚、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、Arlacel 83等。
离子型表面活性剂是可以形成胶束的一类物质，其分子总是同时含有亲水基团和亲油基团，且其亲水基团为离子型基团。常用的离子型表面活性剂包括AOT、PO-500、PO-310等。
两亲性嵌段共聚物通常借助于活性聚合反应通过加入单体的方式制得，常用的两亲性嵌段共聚物包括聚甲基丙烯酸甲酯-block-聚苯乙烯(PMMA-b-PS)，聚丙烯酸甲酯-block-聚苯乙烯(PMA-b-PS)，聚环氧乙烷-block-聚苯乙烯(PEO-b-PS,PEG-b-PS),聚环氧乙烷-block-聚(烷基)丙烯酸酯(PEO-b-PMMA,PEG-b-PMMA)，聚环氧乙烷-block-聚乳酸(PEG-b-PLA)等。
优选地，所述油相中乳化剂的质量浓度为0.1wt%-30wt%；例如为0.5wt%、1.2wt%、3wt%、4.5wt%、5.5wt%、7wt%、9wt%、11wt%、15wt%、19wt%、24wt%、26wt%、29wt%等，优选为4wt%-20wt%。
优选地，所述油相与水相的体积比为50:1-2:1，例如为45:1、42:1、35:1、32:1、25:1、22:1、20:1、12:1、10:1、8:1、6:1、4:1等，优选为40:1-5:1，进一步优选为30:1-10:1；
优选地，所述搅拌转速为50-500rpm；例如为60rpm、80rpm、100rpm、150rpm、200rpm、260rpm、300rpm、340rpm、360rpm、420rpm、480rpm等，优选为100-300rpm。在升温反应时，所述反应装置应提供一种温和的搅拌方式，使颗粒聚集形成的微球在体系中均匀分散，避免反应过程中微球发生破裂、沉降或聚集，搅拌方式可以是机械搅拌、磁力搅拌或振荡。
优选地，所述加热温度为30-98℃，例如为32℃、36℃、39℃、42℃、46℃、51℃、55℃、61℃、65℃、70℃、74℃、79℃、84℃、88℃、94℃、96℃等，优选为40-95℃，进一步优选为50-80℃；升温方式可以是程序升温、梯度升温或直接升高至反应温度中的一种或几种方式的组合使用。
优选地，所述加热时间为1min-48h，例如为0.5h、1.2h、4h、6h、9h、12h、16h、19h、22h、26h、29h、36h、41h、46h等，优选为1h-40h，进一步优选为5h-30h。
作为优选技术方案，本发明所提供的制备方法，在步骤(3)反应完成后加入交联剂，对微球进行进一步的交联；
优选地，所述交联剂为三聚磷酸钠、氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛、京尼平、1,4-丁二醇双缩水甘油醚，二溴丙醇和二乙烯砜中的一种或至少两种以上的混合物。
本发明的目的之三在于提供本发明所述的微球作为生物分离介质、药物载体、疫苗佐剂、酶固定化载体、细胞分离基质、细胞培养载体、组织工程材料、生物传感器、分析检测试剂、食品及化妆品的功能化载体的用途。所述的生物分离介质比如为色谱填料。
对于药物载体、疫苗佐剂、酶固定化载体、细胞分离基质、细胞培养载体、组织工程材料、生物传感器、分析检测试剂、食品及化妆品的功能化载体等，具有大孔结构的微球也具有独特的优势，较大的孔隙有利于对药物、疫苗、酶、细胞以及其他生物活性物质的负载和释放，作为组织工程材料时还有利于细胞的生长。
本发明中双孔多糖微球形成的原理在于：将多糖颗粒分散在低沸点的有机溶剂与水的混合液中，再分散于油相中，形成油包水的乳液。对体系升温，由于升温时水相的挥发，毛细管作用力会促使颗粒之间相互聚集，升温还能促使某些多糖颗粒之间发生熔融粘结，如琼脂糖，原理示意图如图4所示。对于其他升温时不会发生熔融的多糖体系，可以采用交联的方式得到由多糖颗粒聚集组成的双孔微球，交联剂选自三聚磷酸钠、氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛、京尼平、1,4-丁二醇双缩水甘油醚，二溴丙醇和二乙烯砜中的一种或几种。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的交联剂、加入量及加入方式等。
在本发明方法的一些实施方案中，还可对双孔多糖微球的表面进行修饰，选择合适的配基接枝在微球的表面，使微球成为不同的分离介质，如离子交换介质、亲和分离介质等。还可选择具有靶向作用的小分子或抗体接枝在微球的表面，使微球具有靶向性，实现对特定部位的靶向释药或疫苗递送。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的修饰剂及制备工艺，如交联剂、反应温度和时间等。
本发明提供的双孔多糖微球不仅可采用球状的实心多糖颗粒聚集制备，还可以采用具有多孔、中空、中空多孔等不同结构或具有棒状、纺锤状、椭球状等不同形貌的多糖颗粒聚集制备，用于不同的用途。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的不同结构或形貌的多糖颗粒进行制备。
本发明提供的双孔多糖微球可包埋或吸附具有药用价值的药物、保健品或化妆品的功能成分，功能成分可选自于蛋白质、多肽、酶、疫苗、细胞、基因、激素、抗菌素、抗癌药物、动植物提取物及其混合物中的一种或者几种。本发明提供的大孔多糖微球中，优选包埋生物活性物质。
本发明提供的双孔微球中还可加入保护剂，有利于生物活性药物的活性保持。保护剂可选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、赖氨酸、明胶、环糊精中的一种或几种的复配。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的保护剂种类及加入量等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明提供的颗粒自组装法制备双孔多糖微球工艺简单，不需要采用致孔剂致孔，一方面避免了后续的致孔剂去除步骤，另一方面也避免了致孔剂残留的问题。
（2）本发明提供的双孔多糖微球的大孔孔径均一，并且可以可控调节。本发明中双孔多糖微球由多个粒径均一的多糖颗粒聚集而成，颗粒间的空隙构成了大孔，由于多糖颗粒具有均一的粒径分布，因此颗粒之间的空隙的孔径也较为均一。并且，通过选用不同粒径的颗粒，可以得到具有不同大孔孔径的多糖微球。
（3）本发明提供的双孔多糖微球的机械强度较高。多糖一般为软基质，其自身机械强度较低，尤其是大孔多糖微球，大孔的存在进一步降低了微球的机械强度。本发明中双孔多糖微球由众多的多糖颗粒聚集而成，在受到一定压力时，压力会分布到各个颗粒表面，造成压强较低，从而赋予了微球较高的机械强度。
（4）本发明还提供了一种粒径均一的双孔多糖微球及其制备方法。文献中报道的大孔多糖微球均采用搅拌法制备，其粒径分布宽，需要经过长时间的筛分来得到一定粒径范围的多糖微球，并且所得到的多糖微球仍然存在粒径分布宽的问题。本发明采用膜乳化技术（包括常规膜乳化法和快速膜乳化法）结合颗粒自组装技术制备双孔多糖微球，所制备的微球粒径分布系数低于20%，有利于后期的应用（如作为生物分离介质、药物释放载体等）。
（5）本发明提供的双孔多糖微球在保证原有多糖凝胶优良性能的基础上，增加了大孔结构，能够在介质内产生对流，提高介质的通透性，扩大了多糖微球的应用范围。
在本发明中使用的术语“均匀乳液”或“均一乳液”是指粒径均一的微球固化前的乳液。
在本发明中使用的术语“膜孔径”是指微孔膜的体积平均孔径。
在本发明中使用的术语“多糖颗粒”是指用于制备本发明中双孔多糖微球的分散多糖颗粒。
在本发明中使用的术语“多糖微球”是指本发明中由众多分散多糖颗粒聚集形成的多糖微球。
在本发明中使用的术语“粒径分布系数”按下式计算：
C.V.=[∑(di-d)2/N]1/2/d×100%
式中：
C.V.代表粒径分布系数；
di代表各个微球的直径；
d代表微球的数均平均粒径；
d=∑di/N；
N为用于计算粒径的微球数量，且N≥200个。
附图说明
图1为本发明的双孔多糖微球的第一种制备方法流程图；
图2为本发明的双孔多糖微球的第二种的制备方法(快速膜乳化法)流程图；
图3为本发明的双孔多糖微球的第三种的制备方法(常规膜乳化法)流程图；
图4为本发明的双孔多糖微球的制备原理示意图；
图5为本发明中一种琼脂糖颗粒的粒径分布图；
图6为本发明一种双孔琼脂糖微球的电镜照片；
图7为本发明一种双孔壳聚糖微球的电镜照片；
图8为本发明一种粒径均一的双孔壳聚糖微球的粒径分布图；
图9为本发明一种粒径均一的双孔琼脂糖微球的粒径分布图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在实施例中所用的“疏水处理的SPG膜”是经疏水修饰方法处理后的SPG玻璃膜（SPG TECHNOLOGY Co.,Ltd生产，型号为PJN06L）。例如，化学修饰的疏水SPG膜可经如下疏水处理得到：将亲水性的SPG膜在纯净水中常温下超声30分钟，然后放入3%（V/V）的修饰剂KP-18C（产地：日本）的水溶液中，之后减压（真空度为0.5MPa）超声2h，再在120℃下加热4h。疏水的SPG微孔膜也可经如下疏水处理得到：将亲水性的SPG膜置于所用油相中浸泡过夜或超声半小时以上直至膜孔被油相充分湿润。
实施例1
准确称取一定量湿态的琼脂糖颗粒（琼脂糖分子量为12万道尔顿，琼脂糖颗粒中琼脂糖的质量浓度为10wt%，琼脂糖颗粒的粒径为2μm，琼脂糖颗粒的粒径分布系数为15%，其粒径分布图如图5所示），然后将此琼脂糖颗粒分散到磁力搅拌下的水相（水相为20wt%乙醇水溶液，水相体积为1mL，水相中含有浓度为0.1wt%的聚乙烯醇，水相中琼脂糖颗粒的质量浓度为20wt%）中，磁力搅拌转速为500rpm。将含有琼脂糖颗粒的水相加入到机械搅拌下的油相中（油相为液体石蜡与石油醚的混合溶剂，液体石蜡与石油醚的体积比为11：1，油相体积为5mL，油相中含有质量浓度为4wt%的PO-500，机械搅拌转速为300rpm），得到油包水的乳液。将该乳液缓慢升温（升温速率1℃/min）到50℃后维持温度不变，并持续搅拌（机械搅拌转速为300rpm）24h后，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到产品。所制备双孔琼脂糖微球的电镜图片如图6所示。
实施例2
采用与实施例1同的方法制备大孔琼脂糖微球，其中不同的是琼脂糖颗粒的性质。准确称取一定量湿态的琼脂糖颗粒（琼脂糖分子量为8万道尔顿，琼脂糖颗粒中琼脂糖的质量浓度为4wt%，琼脂糖颗粒的粒径为50nm，琼脂糖颗粒的粒径分布系数为10%），然后将此琼脂糖颗粒分散到磁力搅拌下的水相（水相为50wt%乙醇水溶液，水相体积为1mL，水相中琼脂糖颗粒的质量浓度为50wt%）中，磁力搅拌转速为1000rpm。将含有琼脂糖颗粒的水相加入到机械搅拌下的油相中（油相为液体石蜡与石油醚的混合溶剂，液体石蜡与石油醚的体积比为7：5，油相体积为20mL，油相中含有质量浓度为8wt%的PO-500，机械搅拌转速为100rpm），得到油包水的乳液。将该乳液置入40℃的水浴后维持温度不变，并持续振荡（振荡速率为100rpm）4h后，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到产品。
为了增加双孔琼脂糖微球的机械强度，继续采用传统方法对其进行交联。将10g上述双孔琼脂糖微球分散于20mL去离子水中，逐渐升温至40℃，反应3h。之后，向体系中缓慢滴加1.0mL环氧氯丙烷和1.2mL 40%NaOH溶液（含有2%NaBH4），继续反应12h。交联结束后，用大量去离子水将产品洗至中性，得到交联的双孔琼脂糖微球。
实施例3
采用与实施例1相同的方法制备双孔壳聚糖微球，其中不同的是换用壳聚糖颗粒。准确称取一定量湿态的壳聚糖颗粒（壳聚糖分子量为78万道尔顿，壳聚糖颗粒中壳聚糖的质量浓度为1.5wt%，壳聚糖颗粒的粒径为4μm，壳聚糖颗粒的粒径分布系数为12%），然后将此壳聚糖颗粒在均质的作用下分散到水相（水相为40wt%丙酮水溶液，水相体积为1mL，水相中壳聚糖颗粒的质量浓度为70wt%）中，均质转速为6000rpm，均质时间1min。将含有壳聚糖颗粒的水相加入到磁力搅拌下的油相中（油相为环己烷，油相体积为50mL，油相中含有质量浓度为15wt%的Arlacel 83，磁力搅拌转速为50rpm），得到油包水的乳液。将该乳液梯度升温（50℃保温1h，70℃保温1h）至90℃后维持温度不变，并持续搅拌（磁力搅拌转速为50rpm）12h后，滴加入一定量的三聚磷酸钠水溶液（三聚磷酸钠水溶液的质量浓度为20wt%，水溶液体积为10mL），继续反应4h，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到产品。所制备双孔壳聚糖微球的电镜图片如图7所示。
实施例4
采用与实施例1相同的方法制备双孔葡聚糖微球，其中不同的是换用葡聚糖颗粒。准确称取一定量湿态的葡聚糖颗粒（葡聚糖分子量为5千道尔顿，葡聚糖颗粒中葡聚糖的质量浓度为20wt%，葡聚糖颗粒的粒径为10μm，葡聚糖颗粒的粒径分布系数为15%），然后将此葡聚糖颗粒在超声的作用下分散到水相（水相为60wt%乙醇水溶液，水相体积为1mL，水相中含有浓度为10wt%的聚乙烯吡咯烷酮，水相中葡聚糖颗粒的质量浓度为30wt%）中，超声功率为100W，超声时间为3min。将含有葡聚糖颗粒的水相加入到机械搅拌下的油相中（油相为环己烷与四氯化碳的混合溶剂，环己烷与四氯化碳的体积比为3:1，油相体积为15mL，油相中含有质量浓度为8wt%的AOT，机械搅拌转速为300rpm），得到油包水的乳液。将该乳液迅速升温至60℃后维持温度不变，并持续搅拌（机械搅拌转速为）6h后，向体系中缓慢滴加5.0mL环氧氯丙烷和6mL 40%NaOH溶液（含有2%NaBH4），继续反应10h，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到产品。
实施例5
采用与实施例1相同的方法制备双孔海藻酸钙微球，其中不同的是换用海藻酸钙颗粒。准确称取一定量湿态的海藻酸钙颗粒（海藻酸钙分子量为1万道尔顿，海藻酸钙颗粒中海藻酸钙的质量浓度为10wt%，海藻酸钙颗粒的粒径为18μm，海藻酸钙颗粒的粒径分布系数为15%），然后将此海藻酸钙颗粒在磁力搅拌的作用下分散到水相（水相为40wt%丙酮水溶液，水相体积为1mL，水相中海藻酸钙颗粒的质量浓度为50wt%）中，磁力搅拌转速为100rpm。将含有海藻酸钙颗粒的水相加入到机械搅拌下的油相中（油相为环己烷与四氯化碳的混合溶剂，环己烷与四氯化碳的体积比为5:1，油相体积为25mL，油相中含有质量浓度为15wt%的AOT，机械搅拌转速为500rpm），得到油包水的乳液。将该乳液缓慢升温（升温速率2℃/min）至40℃后，滴加入一定量的氯化钙水溶液（氯化钙水溶液的质量浓度为15wt%，水溶液体积为5mL），继续反应2h，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到产品。
实施例6
采用快速膜乳化技术制备粒径均一的双孔琼脂糖微球：准确称取一定量湿态的琼脂糖颗粒（琼脂糖颗粒中琼脂糖的质量浓度为6wt%，琼脂糖颗粒的粒径为2μm，琼脂糖颗粒的粒径分布系数为15%），然后将此琼脂糖颗粒分散到磁力搅拌下的水相（水相为20wt%乙醇水溶液，水相体积为1mL，水相中琼脂糖颗粒的质量浓度为20wt%）中，磁力搅拌转速为100rpm。将含有琼脂糖颗粒的水相加入到机械搅拌下的油相中（油相为液体石蜡与石油醚的混合溶剂，液体石蜡与石油醚的体积比为5:5，油相体积为10mL，油相中含有质量浓度为4wt%的PO-500，机械搅拌转速为200rpm），得到油包水的预乳液。将该预乳液加入到快速膜乳化装置的预乳液储存器中，在2.0MPa的氮气压力下，使其快速通过疏水的SPG微孔膜（膜孔径为20μm），得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为预乳液在2.0MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化五次，最终得到粒径均一的W/O型乳液；乳化过程耗时约10min，乳化完毕后，将W/O型乳液放入80℃的水浴中，机械搅拌（200rpm）下反应0.5h。离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到粒径均一的双孔琼脂糖微球，平均粒径为15.262μm，粒径分布系数为15%。
以二溴丙醇为交联剂对上述双孔琼脂糖微球进行交联。将15g双孔琼脂糖微球分散于20mL去离子水中，逐渐升温至50℃，反应4h。之后，向体系中缓慢滴加2.0mL二溴丙醇和1.6mL 45%NaOH溶液（含有2.5%NaBH4），继续反应24h。交联结束后，用大量去离子水将产品洗至中性，得到交联的双孔琼脂糖微球。
称取10g上述交联双孔琼脂糖微球，加入15mL 20%NaOH溶液，在60℃下碱化30min，然后加入3.0g DEAE-HCl固体颗粒继续反应3h，反应完成后用去离子水充分洗涤至中性，得到DEAE修饰的双孔琼脂糖阴离子交换介质。
实施例7
采用与实施例6相同的方法制备双孔壳聚糖微球，其中不同的是换用中空壳聚糖颗粒。
准确称取一定量湿态的中空壳聚糖颗粒（壳聚糖分子量为5万道尔顿，壳聚糖颗粒中壳聚糖的质量浓度为0.5wt%，壳聚糖颗粒的粒径为300nm，壳聚糖颗粒的粒径分布系数为10%），然后将此壳聚糖颗粒分散到磁力搅拌下的水相（水相为40wt%乙醇水溶液，水相体积为1mL，水相中壳聚糖颗粒的质量浓度为40wt%）中，磁力搅拌转速为200rpm。将含有壳聚糖颗粒的水相加入到机械搅拌下的油相中（油相为液体石蜡与石油醚的混合溶剂，液体石蜡与石油醚的体积比为3：1，油相体积为20mL，油相中含有质量浓度为20wt%的PO-500，机械搅拌转速为300rpm），得到油包水的预乳液。将该预乳液加入到快速膜乳化装置的预乳液储存器中，在0.5MPa的氮气压力下，使其快速通过疏水的SPG微孔膜（膜孔径为50μm），得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为预乳液在0.5MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化三次，最终得到粒径均一的W/O型乳液；将W/O型乳液放入60℃的水浴中，机械搅拌（300rpm）下反应6h后，滴加入一定量的三聚磷酸钠水溶液（三聚磷酸钠水溶液的质量浓度为20wt%，水溶液体积为10mL），继续反应4h，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到粒径均一的双孔壳聚糖微球，平均粒径为33.388μm，粒径分布系数为12%，其粒径分布曲线如图8所示。
实施例8
采用常规膜乳化技术制备粒径均一的双孔琼脂糖微球：
准确称取一定量湿态的琼脂糖颗粒（琼脂糖分子量为7万道尔顿，琼脂糖颗粒中琼脂糖的质量浓度为4wt%，琼脂糖颗粒的粒径为5μm，琼脂糖颗粒的粒径分布系数为10%），然后将此琼脂糖颗粒分散到机械搅拌下的水相（水相为20wt%丙酮水溶液，水相体积为1mL，水相中琼脂糖颗粒的质量浓度为50wt%）中，机械搅拌转速为200rpm。
将含有琼脂糖颗粒的水相装入常规膜乳化装置的水相贮罐中，在1kPa的氮气压力下，使其通过疏水的SPG微孔膜（膜孔径为30μm），进入到磁力搅拌下的油相溶液中（油相为环己烷，油相体积为25mL，油相中含有质量浓度为10wt%的Arlacel 83，磁力搅拌转速为250rpm），乳化2h后，含有琼脂糖颗粒的水相完全进入到油相中，形成粒径均一的W/O型乳液。将W/O型乳液程序升温（每分钟升温5℃）至70℃，机械搅拌（300rpm）下反应18h。离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到粒径均一的双孔琼脂糖微球，平均粒径为94.8μm，粒径分布系数为15%，其粒径分布曲线如图9所示。
实施例9
采用与实施例8相同的方法制备双孔魔芋葡聚糖微球，其中不同的是换用魔芋葡聚糖颗粒。
准确称取一定量湿态的魔芋葡聚糖颗粒（魔芋葡聚糖分子量为10万道尔顿，魔芋葡聚糖颗粒中魔芋葡聚糖的质量浓度为0.5wt%，魔芋葡聚糖颗粒的粒径为300nm，魔芋葡聚糖颗粒的粒径分布系数为10%），然后将此魔芋葡聚糖颗粒分散到磁力搅拌下的水相（水相为40wt%丙酮水溶液，水相体积为1mL，水相中魔芋葡聚糖颗粒的质量浓度为70wt%）中，磁力搅拌转速为500rpm。
将含有魔芋葡聚糖颗粒的水相装入常规膜乳化装置的水相贮罐中，在1.5MPa的氮气压力下，使其通过疏水的聚四氟乙烯微孔膜（膜孔径为5μm），进入到机械搅拌下的油相溶液中（油相为环己烷与四氯化碳的混合溶液，环己烷与四氯化碳的体积比为5：1，油相体积为30mL，油相中含有质量浓度为15wt%的Arlacel83，机械搅拌转速为150rpm），乳化3h后，含有魔芋葡聚糖颗粒的水相完全进入到油相中，形成粒径均一的W/O型乳液。将W/O型乳液梯度升温（50℃保温1h，70℃保温1h）至85℃，机械搅拌（150rpm）下反应0.5h。向体系中缓慢滴加3.0mL环氧氯丙烷和5mL 40%NaOH溶液（含有2%NaBH4），继续反应8h，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到产品。离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到粒径均一的双孔魔芋葡聚糖微球，平均粒径为15.4μm，粒径分布系数为12%。
实施例10
采用与实施例8相同的方法制备双孔海藻酸钙微球，其中不同的是换用海藻酸钙颗粒。
准确称取一定量湿态的海藻酸钙颗粒（海藻酸钙分子量为5万道尔顿，海藻酸钙颗粒中海藻酸钙的质量浓度为1wt%，海藻酸钙颗粒的粒径为500nm，海藻酸钙颗粒的粒径分布系数为10%），然后将此海藻酸钙颗粒分散到机械搅拌下的水相（水相为20wt%丙酮水溶液，水相体积为1mL，水相中含有20wt%的Tween20，水相中海藻酸钙颗粒的质量浓度为30wt%）中，机械搅拌转速为50rpm。
将含有海藻酸钙颗粒的水相装入常规膜乳化装置的水相贮罐中，在1MPa的氮气压力下，使其通过疏水的聚乙烯微孔膜（膜孔径为7μm），进入到磁力搅拌下的油相溶液中（油相为液体石蜡，油相体积为50mL，油相中含有质量浓度为2wt%的Arlacel 83，磁力搅拌转速为400rpm），乳化1h后，含有海藻酸钙颗粒的水相完全进入到油相中，形成粒径均一的W/O型乳液。将W/O型乳液迅速升温至70℃，机械搅拌（300rpm）下反应6h，滴加入一定量的氯化钙水溶液（氯化钙水溶液的质量浓度为15wt%，水溶液体积为5mL），继续反应2h，离心，分别用石油醚、乙醇和水洗球，得到粒径均一的双孔海藻酸钙微球，平均粒径为20.3μm，粒径分布系数为11%。
实施例11
采用与实施例8相同的方法制备双孔壳聚糖微球，其中不同的是换用壳聚糖颗粒。
准确称取一定量湿态的壳聚糖颗粒（壳聚糖分子量为1万5千道尔顿，壳聚糖颗粒中壳聚糖的质量浓度为0.1wt%，壳聚糖颗粒的粒径为20nm，壳聚糖颗粒的粒径分布系数为10%），然后将此壳聚糖颗粒分散到机械搅拌下的水相（水相为45wt%乙醇水溶液，水相体积为1mL，水相中壳聚糖颗粒的质量浓度为25wt%）中，机械搅拌转速为500rpm。
将含有壳聚糖颗粒的水相装入常规膜乳化装置的水相贮罐中，在2MPa的氮气压力下，使其通过疏水的SPG微孔膜（膜孔径为1μm），进入到磁力搅拌下的油相溶液中（油相为液体石蜡与石油醚的混合溶液，液体石蜡与石油醚的体积比为2:1，油相体积为50mL，油相中含有质量浓度为8wt%的PO-500，磁力搅拌转速为100rpm），乳化5h后，含有壳聚糖颗粒的水相完全进入到油相中，形成粒径均一的W/O型乳液。将W/O型乳液放入70℃的水浴中，机械搅拌（50rpm）下反应6h，滴加入一定量的三聚磷酸钠水溶液（三聚磷酸钠水溶液的质量浓度为20wt.%，水溶液体积为10mL），继续反应4h，。离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到粒径均一的双孔壳聚糖微球，平均粒径为7.2μm，粒径分布系数为10%。
准确称量1g上述双孔壳聚糖微球，加入10mL含有1g甘草次酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液，磁力搅拌（200rpm）下向混合体系中缓慢滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液，室温下反应24h后，将反应体系倒入800mL丙酮中，静置24h，离心，依次用丙酮、乙醇、乙醚、去离子水离心洗涤，得到具有肝靶向效果的甘草次酸修饰的大孔壳聚糖微球。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (44)
1.一种双孔多糖微球，其特征在于，所述微球由多个小粒径的多糖颗粒堆积而成，微球的平均粒径为500nm-500μm，并具有包括多糖本身的凝胶孔及由多糖颗粒之间空隙所形成的大孔的双孔道结构，并通过如下方法制备：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相与含有乳化剂的油相混合，形成油包水乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球；
其中，所述多糖为琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、卡拉胶、阿拉伯胶中的一种或至少两种以上的混合物；
所述水相为有机溶剂与水的混合溶液；所述有机溶剂的沸点≤85℃，并可溶于水。
2.一种双孔多糖微球，其特征在于，所述微球由多个小粒径的多糖颗粒堆积而成，微球的平均粒径为500nm-500μm，并具有包括多糖本身的凝胶孔及由多糖颗粒之间空隙所形成的大孔的双孔道结构，并通过如下方法制备：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相与含有乳化剂的油相混合，形成油包水预乳液；将预乳液在压力作用下通过孔径为0.1-100μm的微孔膜得到乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球；
其中，所述多糖为琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、卡拉胶、阿拉伯胶中的一种或至少两种以上的混合物；
所述水相为有机溶剂与水的混合溶液；所述有机溶剂的沸点≤85℃，并可溶于水。
3.一种双孔多糖微球，其特征在于，所述微球由多个小粒径的多糖颗粒堆积而成，微球的平均粒径为500nm-500μm，并具有包括多糖本身的凝胶孔及由多糖颗粒之间空隙所形成的大孔的双孔道结构，并通过如下方法制备：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相在压力作用下通过孔径为0.1-100μm的微孔膜进入含有乳化剂的油相，搅拌油相，形成油包水乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球；
其中，所述多糖为琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、卡拉胶、阿拉伯胶中的一种或至少两种以上的混合物；
所述水相为有机溶剂与水的混合溶液；所述有机溶剂的沸点≤85℃，并可溶于水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微球，其特征在于，所述凝胶孔的平均孔径为2-50nm；所述大孔的平均孔径为80nm-6μm，大孔之间相互贯通。
5.根据权利要求1-3任一项所述的微球，其特征在于，所述微球的平均粒径为500nm-100μm，其粒径分布系数≤20％。
6.根据权利要求5所述的微球，其特征在于，所述微球的平均粒径为5μm-100μm。
7.根据权利要求1-3任一项所述的微球，其特征在于，所述微球中多糖颗粒的数量≥10个。
8.根据权利要求7所述的微球，其特征在于，所述微球中多糖颗粒的数量≥30个。
9.根据权利要求1-3任一项所述的微球，其特征在于，所述多糖颗粒的平均粒径为微球平均粒径的0.1％-30％。
10.根据权利要求9所述的微球，其特征在于，所述多糖颗粒的平均粒径为微球平均粒径的1％-20％。
11.根据权利要求10所述的微球，其特征在于，所述多糖颗粒的平均粒径为微球平均粒径的5％-20％。
12.根据权利要求1-3任一项所述的微球，其特征在于，所述多糖颗粒的粒径分布系数≤20％。
13.一种权利要求1-12任一项所述微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相与含有乳化剂的油相混合，形成油包水乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。
14.一种权利要求1-12任一项所述微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相与含有乳化剂的油相混合，形成油包水预乳液；将预乳液在压力作用下通过孔径为0.1-100μm的微孔膜得到乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。
15.一种权利要求1-12任一项所述微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将多糖颗粒分散在水相中；
(2)将分散有多糖颗粒的水相在压力作用下通过孔径为0.1-100μm的微孔膜进入含有乳化剂的油相，搅拌油相，形成油包水乳液；
(3)将步骤(2)所得乳液加热，搅拌，即得双孔多糖微球。
16.根据权利要求14或15所述的制备方法，其特征在于，所述微孔膜的孔径为0.8-50μm。
17.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述压力为0kPa-20MPa，通过微孔膜的次数为1次以上。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，通过微孔膜的次数为1-5次。
19.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述压力为0kPa-2MPa。
20.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯或四氢呋喃中的一种或至少两种以上的混合物。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇或丙酮，或其混合物。
22.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述多糖颗粒在水相中的质量浓度为5wt％-95wt％。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述多糖颗粒在水相中的质量浓度为20wt％-95wt％。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述多糖颗粒在水相中的质量浓度为50wt％-95wt％。
25.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述油相为液体石蜡、环己烷、甲苯、四氯化碳、石油醚中的一种或至少两种以上的混合物。
26.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述油相为液体石蜡与石油醚的混合物或环己烷与四氯化碳的混合物。
27.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述油相中乳化剂为油溶性的非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两亲性嵌段共聚物中的一种或至少两种以上的混合物。
28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述油相中乳化剂为失水山梨醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、AOT、PO-500、PO-310、烷基酚聚氧乙烯醚类中的一种或至少两种的混合物。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其特征在于，所述油相中乳化剂为失水山梨醇单油酸酯、对辛基苯酚聚氧乙烯醚、AOT、PO-500、Arlacel 83中的一种或至少两种的混合物。
30.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述油相中乳化剂的质量浓度为0.1wt％-30wt％。
31.根据权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述油相中乳化剂的质量浓度为4wt％-20wt％。
32.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述油相与水相的体积比为50:1-2:1。
33.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述油相与水相的体积比为40:1-5:1。
34.根据权利要求33所述的制备方法，其特征在于，所述油相与水相的体积比为30:1-10:1。
35.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌转速为50-500rpm。
36.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述加热温度为30-98℃。
37.根据权利要求36所述的制备方法，其特征在于，所述加热温度为40-95℃。
38.根据权利要求37所述的制备方法，其特征在于，所述加热温度为50-80℃。
39.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述加热时间为1min-48h。
40.根据权利要求39所述的制备方法，其特征在于，所述加热时间为1h-40h。
41.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述加热时间为5h-30h。
42.根据权利要求13-15任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)反应完成后加入交联剂，对微球进行进一步的交联。
43.根据权利要求42所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为三聚磷酸钠、氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛、京尼平、1,4-丁二醇双缩水甘油醚，二溴丙醇和二乙烯砜中的一种或至少两种以上的混合物。
44.权利要求1-12任一项所述的微球作为制备生物分离介质、药物载体、疫苗佐剂、酶固定化载体、细胞分离基质、细胞培养载体、组织工程材料、生物传感器、分析检测试剂、食品及化妆品的功能化载体的用途。
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