CN103333918B - 一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法 - Google Patents
一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体公开了一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法。本发明对骨髓来源的间充质干细胞进行了分子鉴定，建立了通过6通道流式技术利用少量细胞即可鉴定细胞纯度的方法；然后对猪骨髓间充质干细胞进行基因修饰，获得了表达多种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；利用荧光流式分选方法，分离出了阳性猪骨髓间充质干细胞，将其继续培养3~7days，再作为核供体细胞进行核移植，考察了4RFs-3days，6RFs-3days，4RFs-7days，6RFs-7days？pMSC作为核供体细胞对猪克隆胚胎发育效率提高的影响；结果显示，4RFs-7days？pMSC能更好地促进克隆胚胎的分裂以及囊胚的形成，有助于克隆胚胎形成较均一细胞数量的同质状态，为大规模高效地克隆成年优良品种猪奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法，尤其是一种利用重编程因子对供体细胞进行基因修饰，从而提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法，属于繁殖或授精方法领域。
背景技术
猪拥有与人类非常类似的器官，以及相似的解剖学生理特征，逐渐成为再生医学研究的生物模型材料。人们越来越多地利用核移植技术，生产出拥有某种遗传缺陷或修饰基因的猪作为疾病模型，用来更好地模拟人类疾病的临床治疗。此外，在生猪的实际生产中，一些优质的种质资源由于使用年限制约不能更好地发挥育种优势，并且优秀的个体由于寿命限制而不能持续服务育种工作。克隆技术给予了保存优良种质资源、延续优秀个体服务年限新的曙光。但是，猪的核移植效率还很低下，不仅阻碍了疾病模型的制作速度和规模，也制约了一些优良猪种的大规模克隆。
克隆技术是一个比较复杂的过程，体细胞核移植是克隆技术的基础。很多因素影响着核移植的成功和效率。研究表明，不同类型的供体细胞可以提供不同的发育潜力，影响着克隆胚胎的发育效率。例如，卵丘细胞、类胚胎干细胞、原始肾脏细胞等可以提高猪核移植的效率。这些类型的细胞位于较早的发育地位，可能为核移植提供了较为容易重编程的表观环境和细胞核状态。但是，这些细胞的分离无可避免地会损伤供体的健康甚至生命，无法在生产中推广。
间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）在发育地位上也比较靠前，具有多潜能性。猪的间充质干细胞可以从骨髓中分离纯化出来，对猪的机体损害小，培养方便，成本较小，因此是成年猪进行核移植的理想供体细胞来源。有研究报道称，猪的间充质干细胞可以完成克隆胚胎的构建，但是，对核移植效率的提高程度还不尽人意。因此，还需要对这种较为理想的核移植供体细胞进行改造和修饰。
另外，自从2006年诱导重编程干细胞（inducedpluripotentstemcell,IPSc）技术的发现以来，重编程因子成为了细胞重新拥有多能性的“利器”。重编程因子倾向于改变细胞的表观状态和细胞的核结构，让细胞处于更易于重编程的状态，提升细胞在发育地位上的多能性分化潜力。有报道显示，超表达单个重编程因子Oct4的供体细胞可以提高牛核移植的效率，提高牛克隆胚胎的质量。因此，重编程因子可能有助于让间充质干细胞处于更容易被重编程的状态，从而改善间充质干细胞核移植后的克隆胚胎重编程效率，提升克隆猪胚胎的发育效率和质量，便利于满足实际生产中对成年优秀猪种的大规模克隆。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中猪克隆胚胎体外发育效率低的缺陷，提供一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法，包括如下步骤：
S1.分离纯化猪骨髓间充质干细胞；
S2.将Oct4、Klf4、c-Myc和Sox24种重编程因子或Oct4、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog和Sox26种重编程因子转入猪骨髓间充质干细胞中进行超表达；利用流式荧光筛选技术分选出含有4种重编程因子或6种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；在体外培养3~7天，即可作为核供体细胞进行核移植。
自从2006年日本京都大学的山中伸弥（ShinyaYamanaka）教授首次利用逆转录病毒将四种重编程因子“Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4”导入已分化完全的小鼠纤维母细胞中，将其重新编排变成全能性的类胚胎细胞，证明了重编程因子具有重编程作用，可以改变细胞的命运。重编程因子就开始受到学术界的高度关注。但是，前人的研究只是发现重编程因子具有重编程作用，但是没有发现重编程因子可以提高胚胎发育效率。本发明提供了一种新型的供体细胞，这种细胞是用特定的重编程因子修饰过的；另外，本发明首次发现利用4种重编程因子（Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2）或6种重编程因子（Oct4、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog和Sox2）修饰的猪骨髓间充质干细胞是可以提高核移植效率的。最后，本研究发现重编程因子修饰并延长培养天数在提高核移植效率上，是有差异的。优选地，将含有4种重编程因子或6种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；在体外培养3天或7天，即可作为核供体细胞进行核移植。更优选地，将含有4种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；在体外培养3天或7天，即可作为核供体细胞进行核移植。最优选地，将含有4种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；在体外培养7天，即可作为核供体细胞进行核移植。
优选地，在分离纯化猪骨髓间充质干细胞后；可以通过6通道流式技术鉴定细胞纯度，得到阴性率低于2%，阳性率高于95%的细胞后再进行基因修饰。
具体地，所述提高猪克隆胚胎发育效率的方法，包括如下步骤：
S1.分离纯化猪骨髓间充质干细胞；利用CD14-APC-780、CD34-FITC、CD45-PE-Cy7、CD73-percp710、CD90-PE和CD105-APC6种抗体检测细胞表面的6种抗原的表达情况，通过6通道流式技术鉴定细胞纯度，得到阴性率低于2%，阳性率高于95%的细胞；
S2.通过电转化的方法将Oct4、Klf4、c-Myc和Sox24种重编程因子或Oct4、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog和Sox26种重编程因子转入猪骨髓间充质干细胞中进行超表达；利用流式荧光筛选技术分选出含有4种重编程因子或6种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；在体外培养3~7天，即可作为核供体细胞进行核移植。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、与常规的细胞供体猪胚胎成纤维细胞（porcineembryonicfibroblast,PEF）相比，pMSC作为细胞供体可以提高克隆胚胎的发育率5.79%（74.23%Vs.80.02%,P=0.14），提高克隆胚胎的囊胚率18.43%（20.15%Vs.38.58%,P<0.05），增加囊胚期克隆胚胎的细胞数15.8（41.60Vs.54.7,P=0.225）。
2、与未含有RFs修饰的pMSC细胞供体相比，4RFs-7days-pMSC和6RFs-7days-pMSC细胞作为供体可以显著提高克隆胚胎的分裂效率，分别提高了9.60%（P<0.05）、11.57%（P<0.05）。
3、与未含有RFs修饰的pMSC细胞供体相比，4RFs-3days-pMSC细胞作为供体可以显著提高克隆胚胎的囊胚率7.31%（P<0.05）。
4、与未含有RFs修饰的pMSC细胞供体相比，4RFs-3days-pMSC、4RFs-7days-pMSC、6RFs-3days-pMSC、6RFs-7days-pMSC细胞作为供体可以增加克隆胚胎的囊胚期细胞数，分别增加了4.5（P=0.414）、10.25（P=0.083）、2.25（P=0.742）、9（P=0.265）。
5、比较上述5类细胞供体对核移植效率的提高程度可知，4RFs-7days-pMSC不仅可以帮助未修饰的pMSC提高分裂率和囊胚期细胞数，还能显著帮助未修饰的pMSC实现较高的囊胚率。
说明书附图
图1.本发明的实验流程示意图。
图2.分离纯化出来的猪骨髓间充质干细胞照片及生长曲线测定结果；A.培养3天的状态；B.培养5天的状态；C.培养10天的状态；D.传代培养的状态；E.细胞的7天内的生长曲线。
图3.组化方法检测猪骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨分化能力；A.诱导细胞成脂的对照组油红染色结果；B.诱导细胞成骨的对照组茜素红染色结果；C.诱导细胞成骨的对照组阿尔新蓝染色结果；D.诱导细胞成脂的实验组油红染色结果；E.诱导细胞成骨的对照组茜素红染色结果；F.诱导细胞成脂的实验组阿尔新蓝染色结果。
图4.细胞流式方法一次性鉴定猪骨髓间充质干细胞表面6种抗原的表达情况；A.分析的细胞设门；B为双阴性2通道检测结果；C为单阳单阴性2通道检测结果；D双阳性2通道检测结果；EFG为单阴性单通道检测结果；HIJ为单阳性单通道检测结果。
图5.对猪骨髓间充质干细胞进行重编程因子修饰以及筛选的结果；A.明场下的电转染重编程因子OSKM后的细胞状态；B.荧光激活的电转染重编程因子OSKM后的细胞状态；C.明场下的电转染重编程因子OSKMLN后的细胞状态；D.荧光激活的电转染重编程因子OSKMLN后的细胞状态；E.流式细方法评估电转染重编程因子OSKM效率的结果；F.流式细方法评估电转染重编程因子OSKMLN效率的结果；G.荧光流式细胞筛选细胞前设定的细胞群体门；H.荧光流式细胞筛选细胞前设定的分离4RFs-pMSC的细胞门；I.荧光流式细胞筛选法分选到的4RFs-pMSC结果；J.荧光流式细胞筛选法设定的分选6RFs-pMSC的细胞门及分选结果；K.分选到的4RFs-pMSC培养结果；L.分选到的6RFs-pMSC培养结果。
图6.猪骨髓间充质干细胞对体外克隆胚胎发育效率的影响评估结果；A.对照组pEF作为供体细胞制作出的克隆胚胎；B.实验组pMSC作为供体细胞制作出的克隆胚胎；C.对照组pEF作为供体细胞制作出的克隆胚胎囊胚期阶段的核染色结果；D.实验组pMSC作为供体细胞制作出的克隆胚胎囊胚期阶段的核染色结果；E.pEF和pMSC作为供体细胞对克隆胚胎分裂效率的比较结果；F.pEF和pMSC作为供体细胞对克隆胚胎囊胚形成效率的比较结果；G.pEF和pMSC作为供体细胞对克隆胚胎囊胚期细胞总数的比较结果。
图7.重编程因子修饰的猪骨髓间充质干细胞对体外克隆胚胎发育效率的影响评估结果；A.pMSC、4RFs-3dayspMSC、6RFs-3dayspMSC分别作为供体细胞对克隆胚胎分裂效率、囊胚形成效率的比较结果；B.pMSC、4RFs-3dayspMSC、6RFs-3dayspMSC分别作为供体细胞对克隆胚胎囊胚期细胞总数的比较结果；C.pMSC、4RFs-7dayspMSC、6RFs-7dayspMSC分别作为供体细胞对克隆胚胎分裂效率、囊胚形成效率的比较结果；D.pMSC、4RFs-7dayspMSC、6RFs-7dayspMSC分别作为供体细胞对克隆胚胎囊胚期细胞总数的比较结果；E.pMSC、4RFs-3dayspMSC、6RFs-3dayspMSC、4RFs-7dayspMSC、6RFs-7dayspMSCF分别作为供体细胞对克隆胚胎分裂率提升效果的比较结果；F.pMSC、4RFs-3dayspMSC、6RFs-3dayspMSC、4RFs-7dayspMSC、6RFs-7dayspMSCF分别作为供体细胞对克隆胚胎囊胚形成率提升效果的比较结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一、材料
αMEM培养液购自LifeTechnologies公司；试剂购自sigma公司；抗体购自eBioscience公司；质粒pLv-CMV-ZsGreen-hOct4（O，携带有人Oct4基因序列，Genbank：NM_002701.4）、pLv-CMV-ZsGreen-hKlf4（K，携带有人Klf4基因序列，Genbank：NM_004235.4）、pLv-CMV-ZsGreen-hc-Myc（M，携带有人c-Myc基因序列，Genbank：NM_002467.4）、pLv-CMV-ZsGreen-hLin28（L，携带有人Lin28基因序列，Genbank：NM_024674.4）、pLv-CMV-ZsGreen-hNanog（N，携带有人Nanog基因序列，Genbank：NM_024865.2）、pLv-CMV-ZsGreen-hSox2（S，携带有人Sox2基因序列，Genbank：NM_003106.3）为中山大学生命科学学院动物遗传工程实验室保藏。
二、试验步骤：本发明的整个流程示意图见如图1所示。
S1.分离纯化得到骨髓间充质干细胞
S11.分离骨髓：
抽取猪胫骨骨髓5~10mL，肝素钠和生理盐水稀释后，加入血红细胞裂解液（血红细胞裂解液组成：10×储存液，1.5MNH4Cl，100mMKHCO3，1mMEDTA，0.22μm过滤后，-20℃保存）室温放置5min，1600rpm离心10min，收集细胞沉淀；将细胞沉淀用αMEM培养液（αMEM培养液组成：20%FBS、2mML-glutamax、1%NAA、50Unit/mLpenicillin、50μ/mLstreptomycin）洗涤后，再次离心。
S12.分离纯化细胞：
将步骤S11获得的细胞用αMEM培养液重悬后，按照1×106/cm2的比例接种到塑料培养皿中，放置5%CO2，37℃条件下培养；培养12h后，轻轻晃动培养液，然后完全移除培养液，加入新鲜培养液继续培养；培养24h后，轻轻晃动培养液，然后半量移除培养液，加入新鲜培养液继续培养；继续培养细胞5~10days，出现的成纤维状细胞，即为猪的骨髓间充质干细胞；如图2中的A、B、C、D所示。
S13.骨髓间充质干细胞鉴定：
（1）生长曲线测定：将步骤S12纯化的骨髓间充质干细胞接种到96孔板（2000/孔）上进行培养，贴壁后，PBS洗2次，加入含有Alamarblue的培养液中，继续培养8天，每天固定时间检测570nm、600nm吸光值，然后进行计算、分析，绘制生长曲线，结果如图2中的E所示。
（2）将细胞培养至100%汇合后，分别添加成脂、成骨诱导液进行21天的培养。成脂诱导液配方：MEMalpha(Gibico)，FBS20%(PAA)，2mML-Glumax(Gbico)，1%NonEssentialAminoAcid，3–isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)(0.5mM)，Dexamethasone(0.25μM)，Insulin(50μg/mL)；成骨诱导液配方：MEMalpha(Gibico)，FBS20%(PAA)，Glumax(Gbico)，NonEssentialAminoAcid，β-Glycerophosphatedisodiumsalthydrate(10mM)，Dexamethasone(100nM)，Acorbicacid(50μg/mL)，然后分别用油红O、茜素红染色检测成脂、成骨效果，结果见图3，分离的细胞可形成红色的脂肪滴和含有钙质的骨结节。将汇合后的细胞收集到离心管中进行成软骨诱导培养。软骨诱导液配方：MEMalpha(Gibico)，FBS20%(PAA)，Glumax(Gbico)，NonEssentialAminoAcid，TGF-β(10ng/mL)(R&D)，Dexamethasone(100nM)，Acorbicacid(50μg/mL)，ITS+1(Gibico)，21天后用阿尔新蓝染色方法检测，结果如图3中的F，分离的细胞可以形成含有软骨黏多糖的软骨组织。表明分离得到的pMSC保持有较好的发育潜力。
（3）利用不同荧光标记的抗体（CD14-APC-780、CD34-FITC、CD45-PE-Cy7、CD73-percp710、CD90-PE、CD105-APC），孵育猪的骨髓间充质干细胞，然后利用6通道流式细胞仪鉴定分离纯化出来的猪的骨髓间充质干细胞；多通道流式鉴定方法：
1）收集细胞：PBS洗2次后，0.25%胰酶消化后，1600rpm×5min收集细胞；
2）抗体孵育：将细胞用PBS轻轻吹打成1×106/mL单细胞悬液，分装成1mL/管；分别加入5~10μLCD105、CD34、CD45、CD90、CD73、CD14一抗，同时设置阴性对照、空白对照，充分吹打均匀，冰上避光孵育30min；
3）细胞固定：2000r/min、离心10min，洗液（洗液组成：2%BSA、PBS、0.1%NaN3）洗涤2遍，加入4%，pH7.4的多聚甲醛固定液300μL；
4）流式检测：300目细胞筛过滤细胞后，上流式细胞仪分析；先用空白对照设置电压，画出细胞群体门；再使用带有不同荧光的标准品进行参数调试和荧光补偿；然后检测实验组样品，利用用FlowJ分析系统对检测结果进行分析、画图。结果见图4。分离的细胞表现出CD14、CD34、CD45阴性，CD73、CD90、CD105阳性，同时阴性率低于国际干细胞协会规定的2%，阳性率高于标准规定的95%。表明分离得到的pMSC是比较均一的细胞群体。
S2.对骨髓间充质干细胞进行基因修饰
S21.电转细胞：
利用电转的方法，将4种重编程因子（Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2）或6种重编程因子（Oct4、Klf4、c-Myc,Lin28、Nanog、Sox2）分别转入猪的骨髓间充质干细胞，电转成功的猪骨髓间充质干细胞将携带有绿色荧光标记蛋白（ZsGreen）；具体电转步骤为：
（1）准备细胞：骨髓间充质干细胞培养至80~90%汇合度时，胰酶消化后，离心收集细胞；用100μL电转液重悬。
（2）准备电转试剂：分别将1μg/μL的pLv-CMV-ZsGreen-hOct4、pLv-CMV-ZsGreen-hKlf4、pLv-CMV-ZsGreen-hc-Myc、pLv-CMV-ZsGreen-hSox24种质粒和1μg/μL的pLv-CMV-ZsGreen-hOct4、pLv-CMV-ZsGreen-hKlf4、pLv-CMV-ZsGreen-hc-Myc、pLv-CMV-ZsGreen-hLin28、pLv-CMV-ZsGreen-hNanog、pLv-CMV-ZsGreen-hSox26种质粒加入细胞液中，混匀，室温放置3min；
（3）电转：设置Nero细胞核电转仪的电转参数，1700V，20ms，1plus，使用电转枪何100μL的tips进行电转。
（4）培养：电转后的细胞在新鲜的培养液中继续培养，12h后换液。
（5）鉴定：利用细胞流式技术检测细胞荧光强度，参考空白细胞进行细胞设门；然后根据细胞单个质粒电转荧光强度，设置筛选高荧光强度的细胞即为阳性细胞，如图5BD，利用流式分选技术筛选出具有较强荧光强度的细胞。
S22.筛选细胞：
利用流式荧光筛选方法，分别分离出携带有4种重编程因子（Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2）、6种重编程因子（Oct4、Klf4、c-Myc,Lin28、Nanog、Sox2）的猪骨髓间充质干细胞；继续在5%CO2，37℃条件下培养2~6天；流式荧光筛选细胞步骤：
（1）收集细胞：PBS洗2次后，0.25%胰酶消化后，1600rpm×5min收集细胞；
（2）抗体孵育：将细胞用PBS轻轻吹打成1×106/mL单细胞悬液；300目细胞筛过滤细胞后，上流式细胞仪分析；
（4）流式检测：先用空白对照设置电压，画出细胞群体门；再使用带有单个质粒的荧光的对照品进行参数调试；然后检测实验组样品，调整目的细胞门（如图5GHIJ），筛选出高荧光强度的阳性细胞，继续进行培养，如图5KL。筛选得到的细胞为4RFs-3days（即培养3天含4种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞），6RFs-3days（即培养3天含6种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞），4RFs-7days（即培养7天含4种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞），6RFs-7days（即培养7天含6种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞）。
S3.制作克隆胚胎
将步骤S2培养得到的4RFs-3days，6RFs-3days，4RFs-7days，6RFs-7days猪骨髓间充质干细胞作为核供体细胞进行猪克隆胚胎的制作，同时也用pEF细胞和不用基因修饰的pMSC细胞作为供体细胞制作克隆胚胎。
S31.受体细胞准备：分离卵巢后，收集卵母细胞，放入0.5μg/mL卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)、0.5μg/mL黄体化激素（Luteinizinghormone,LH）、10ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、10%猪卵泡液(porcinefollicularfluid,PFF)和0.57mM半胱氨酸的培养液（TCM-199，26.19mMNaHCO3，3.05mMD-葡萄糖，0.91mM丙酮酸钠，75μg/mL青霉素钠盐，50μg/mL链霉素硫酸盐，0.1%PVA）中培养22h；再在不含有激素和半胱氨酸的上述培养基中培养22h；再用0.1%的透明质酸酶处理去除卵丘细胞，放入胚胎操作液制作成液滴，放在矿物油下。
S32.卵母细胞去核：选择具有极体、细胞质均匀的成熟卵母细胞放在显微注射操作台上，使用盲吸法去除极体。(固定针口外径为150~200μm，内径为30~50μm；去核针口外径为20~30μm，内径为6~10μm，45°斜口)
S33.细胞质内注射核移植：将消化收集的供体细胞移入显微操作盘的注核操作液（TCM-199，HEPES）滴中，用去核针吸取15μm左右的供体细胞，然后沿着去核时在透明带上留下的切口将供体细胞直接注入卵母细胞的细胞质内，完成克隆胚胎的构建。使用ECM电融合仪，1.2kV/cm的直流电脉冲电击30μsec。
S34.胚胎培养：克隆胚胎转移到PZM-5（Porcinezygotemedium5）中培养，36~48h时和6天分别在体式显微镜下计数分裂的胚胎数和囊胚数，并计算分裂率和囊胚形成率；利用DAPI染色计数囊胚期胚胎的细胞数。
结果分析：
分裂率：培养的4RFs-3days，6RFs-3dayspMSC作为核供体细胞，均可以提高分裂率，但是无统计学意义；培养的4RFs-7days，6RFs-7dayspMSC作为核供体细胞，均可以提高分裂率，具有统计学意义（P<0.05）。如图7A。
囊胚率：培养的6RFs-3dayspMSC作为核供体细胞，均可以提高分裂率，但是无统计学意义；培养的4RFs-7days，6RFs-7dayspMSC作为核供体细胞，均可以提高分裂率，具有统计学意义（P<0.05）。如图7C。
细胞数：虽然6RFs-7days的pMSC作为核供体细胞可以增加囊胚期胚胎的细胞数，使克隆胚胎产生出最多的细胞数目，但是，4RFs-7days的pMSC的细胞数SD（Std.Deviation）值最小，显示克隆胚胎处于较均一细胞数量的同质状态，如图7D。
S4.判断提高胚胎发育效率
S41pMSC可以提高克隆胚胎发育效率：
在应用未加基因修饰的pMSC作为供体细胞制作克隆胚胎时，结果显示，相对于传统的细胞供体pEF细胞，pMSC克隆胚胎的分裂率、囊胚率和细胞数都有提高。如图6。分离得到的间充质干细胞表现出良好的发育潜力，可以显著提高克隆胚胎的发育效率，提高胚胎的分裂率和囊胚期胚胎细胞数。这有助于实现：
（1）最低损害地从猪体获得优秀的供体细胞。由于PEF是来源于胚胎期的机体，极大地损害了孕猪的健康、损害了胎儿；而骨髓来源的pMSC，可以减少对机体的损伤，应激反应小，操作简便。
（2）更适合于成年猪种的克隆。由于pMSC可以通过简单的操作步骤从骨髓血液中获取，并且一次即可获得足够数量的细胞用于纯化、培养和鉴定，培养方式简单、培养要求简易，非常便利于成年个体的规模化的克隆操作。
S42重编程因子修饰的pMSC可以更好地提高克隆胚胎发育效率：
由于猪的干细胞细胞系仍未成功建立，IPS细胞在核移植方面表现的性能差强人意。使用重编程因子来进一步提高pMSC的克隆胚胎构建能力，不仅可以帮助实现更高的分裂率、囊胚率、细胞数，进一步提高克隆胚胎发育质量，还可以为胚胎移植奠定良好基础。并且相对于pMSC作为细胞供体，含有重编程因子的pMSC更能进一步提高克隆胚胎的分裂率。
（1）随着重编程因子的增加，克隆胚胎的分裂率得到了进一步的提高，如图7E，6RFs比4RFspMSC更能提高克隆胚胎的分裂率。
（2）随着培养天数的增加，克隆胚胎的分裂率得到了显著的提高，如图7E，4RFs-7days比4RFs-3dayspMSC更能显著提高克隆胚胎的分裂率（P<0.05）。
（3）但是，随着重编程因子的增加和培养天数的增加，克隆胚胎的囊胚率却没有得到显著的提高；如图7F。
（4）然而，随着重编程因子的增加，囊胚期胚胎的细胞数得到了提高；虽然没有统计学上的意义，但是4RFs-7dayspMSC可以获得较为均匀的细胞数。如图7D。
（5）综合以上结果，4RFs-7dayspMSC更适合作为核移植的供体细胞，可以得到较高发育质量和同质性的克隆胚胎。
Claims (1)
1.一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.分离纯化猪骨髓间充质干细胞；利用CD14-APC-780、CD34-FITC、CD45-PE-Cy7、CD73-percp710、CD90-PE和CD105-APC6种抗体检测细胞表面的6种抗原的表达情况，通过6通道流式技术鉴定细胞纯度，得到阴性率低于2%，阳性率高于95%的细胞；
S2.通过电转化的方法将Oct4、Klf4、c-Myc和Sox24种重编程因子转入猪骨髓间充质干细胞中进行超表达；利用流式荧光筛选技术分选出含有4种重编程因子的猪骨髓间充质干细胞；在体外培养7天，即可作为核供体细胞进行核移植。
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