CN103290053A - 唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于唾液腺相关基因功能技术领域，公开了一种唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体及其构建方法，该载体可以应用于唾液腺导管细胞相关基因的功能研究。该唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，为连有KLK1启动子的pENTR入门载体与目标载体pAd/PL-DEST的重组体。
Description
技术领域
本发明属于唾液腺相关基因功能技术领域，涉及一种唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体及其构建方法，该载体可以应用于唾液腺导管细胞相关基因的功能研究。
背景技术
复制缺陷型重组腺病毒载体已经广泛应用于各种类型细胞的基因转染。虽然腺病毒的靶细胞广谱而易感，但是腺病毒载体在体内缺乏组织特异性，会导致外源基因在非靶细胞的表达。如果一个外源基因没有特异性的启动子，理论上就可以在任意被腺病毒感染的细胞类型中表达。理想的情况是，一个基因载体应该有效和安全地在希望表达的靶组织和靶细胞上提供外源基因。每个哺乳动物细胞的基因，都有自己的启动子，一些启动子只在特定细胞类型被激活。因此，了解在特定表达载体中一个细胞特异性启动子能否限制外源基因仅在特定类型的细胞中表达是十分重要的。
在唾液腺组织中，有两种类型的上皮细胞——腺泡细胞和导管细胞，两种细胞都参与唾液的生成。腺泡细胞可以分泌各种盐离子，并且水分子可以自由通过腺泡细胞；导管细胞主要负责重吸收各种盐离子，但是对水分子是绝对不通透的。复制缺陷的重组腺病毒载体可以将外源基因无选择性的导入腺泡细胞和导管细胞。因为腺泡细胞和导管细胞在各种唾液腺疾病中的作用不同，所以将外源基因特异性导入唾液腺靶细胞是十分重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体及其构建方法，该腺病毒载体可应用于唾液腺相关基因功能研究，为阐明目的基因在唾液腺中的功能及目的基因在唾液腺疾病中的作用奠定基础。
组织激肽释放酶（Kallikrein,KLK）是一种丝氨酸蛋白酶，在前体肽生成活性形式的肽，即肽链的翻译后加工修饰过程中发挥重要作用。人的激肽释放酶基因有三个成员（KLK1、KLK2和KLK3）。KLK1基因主要表达于人的肝脏、肾脏和唾液腺组织。KLK1编码基因位于19q3.2-q13.4，基因全长有5个外显子和4个内含子，编码262个氨基酸。KLK1作用于其底物激肽原，释放缓激肽，缓激肽与其受体结合后可调节一系列具有生物活性的介质释放，发挥扩张血管、调节血流等多种生物学效应，参与平滑肌收缩、血管重构等多种生理和病理生理过程。
KLK1基因在唾液腺的表达非常特异，仅在唾液腺导管细胞表达，在唾液腺腺泡细胞中不表达。本发明唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体采用唾液腺导管细胞特异性启动子（KLK1启动子）进行构建。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
一种唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，为连有KLK1启动子的pENTR入门载体与目标载体pAd/PL-DEST的重组体。
上述唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建pENTR-KLK1启动子载体
在pENTR入门载体上，将KLK1启动子的两个酶切位点分别位于ccdB基因两侧，酶切连接后替换掉pENTR入门载体上的ccdB基因；然后，将连接产物转化TOP10感受态，铺卡那霉素抗性的平板，挑克隆、提质粒，进行双酶切鉴定；
（2）pENTR-KLK1启动子载体与pAd/PL-DEST目标载体进行LR重组
其LR重组反应条件：25℃反应16h；LR重组反应结束后，用蛋白水解酶K在37℃处理10min以降解重组体系中的蛋白质因子，得LR重组产物；
（3）LR重组产物转化TOP10感受态并克隆得LR重组体
将LR重组产物即用来转化TOP10感受态，铺氨苄青霉素抗性平板，挑克隆，摇菌，得LR重组体
（4）LR重组体鉴定
氯霉素负性筛选鉴定：经过氯霉素负性筛选，若长出的克隆能够在含氯霉素的培养基中生长，则表明未发生重组且ccdB基因突变；若不能生长，则表明重组成功；
PCR鉴定：用KLK1启动子的特异性引物进行PCR，检测LR重组体是否有KLK1启动子存在；
（5）线性化重组体
对鉴定好的LR重组体进行扩增，提取LR重组体质粒，用PacⅠ酶切线性化，得线性化重组体。。
（6）乙醇沉淀回收线性化重组体，即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
（1）本发明所构建的唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，采用唾液腺导管细胞特异性启动子--KLK1启动子。
（2）本发明所构建的唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，可以与目的基因通过同源重组的方式连接成为具有唾液腺导管细胞特异性KLK1启动子加外源目的基因的病毒载体。
（3）本发明所构建的唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，经过实验，在KLK1启动子后连接人NDRG2基因，大鼠颌下腺局部注射上述病毒，免疫组织化学实验证实，NDRG2特异性表达于唾液腺导管细胞，而唾液腺腺泡细胞没有表达。
（4）本发明利用连接KLK1启动子的pENTR入门载体和pAd/PL-DEST目标载体成功构建的唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，连接目的基因后能特异性的在大鼠唾液腺导管细胞中上调目的基因的表达，用于动物模型的构建及唾液腺导管细胞目的基因功能的研究。是从整体水平上研究目的基因在唾液腺中的功能以及目的基因功能和唾液腺疾病相关性的理想模型。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
图1为pENTR入门载体图谱图。
图2为pAd/PL-DEST目标载体图谱图。
图3为构建好的唾液腺导管细胞特异性启动子pAd/KLK1-DEST载体图谱图。
图4为腺病毒包装过程中细胞病变的动态变化过程图。
图5为pAd/KLK1-DEST连接目的基因NDRG2的重组病毒在大鼠颌下腺表达图。
具体实施方式
下面以实施例说明唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体的构建方法以及其一个具体应用(目的基因为NDRG2)，其具体步骤如下：
（1）构建pENTR-KLK1启动子载体
在pENTR入门载体（其图谱如图1所示）上，将KLK1启动子的两个酶切位点分别位于ccdB基因两侧，酶切连接后替换掉pENTR入门载体上的ccdB基因。连接产物转化TOP10感受态，铺卡那霉素抗性的平板，挑克隆、提质粒，进行双酶切鉴定。
需要说明的是：pENTR入门载体与KLK1启动子的连接产物不要转化XL-10感受态，因为它能够耐受ccdB基因的毒性，若pENTR入门载体酶切不完全，转化XL-10感受态后会有克隆生长，增加了筛选的难度。
（2）pENTR-KLK1启动子载体与pAd/PL-DEST目标载体（其图谱如图2所示）进行LR重组
其LR重组体系如表1所示：
表1LR重组体系
重组反应条件：25℃反应16h。LR重组反应结束后，用蛋白水解酶K在37℃处理10min以降解重组体系中的蛋白质因子，得LR重组产物。
（3）LR重组产物转化TOP10感受态并克隆得LR重组体
将LR重组产物即用来转化TOP10感受态，铺氨苄青霉素抗性平板，挑克隆，摇菌。pAd/PL-DEST骨架载体的重组区含有氯霉素抗性基因和ccdB基因，因此，若重组成功，ccdB基因和氯霉素抗性基因被EGFP基因替换，就可在氨苄青霉素抗性平板上生长；若重组失败，ccdB基因未被替换，会导致TOP10菌体死亡，不会生长出克隆。需要说明的是，LR重组产物不能转化XL-10感受态，原因同步骤(1)。
（4）LR重组体鉴定
氯霉素负性筛选鉴定：由于ccdB基因有可能发生突变，导致其毒性作用丧失，引起未发生重组的克隆也可能生长。因而，上面获得的克隆还要经过氯霉素负性筛选，若长出的克隆能够在含氯霉素的培养基中生长，则表明未发生重组且ccdB基因突变；若不能生长，则表明重组成功。
PCR鉴定：用KLK1启动子的特异性引物（上游引物
5’TTGCCTCACTGGCTGCTCC3’；下游引物
5’AACCACATGGTGACAGAGGTG3’）进行PCR，检测LR重组体是否有KLK1启动子存在。
（5）线性化重组体
对鉴定好的LR重组体进行扩增，提取LR重组体质粒，用PacⅠ酶切线性化，得线性化重组体。其中，Pac I酶切体系如表2所示。
表2Pac I酶切体系
酶切反应条件：37℃反应5h。PacⅠ酶切线性化会扔掉目标载体上的细菌复制起点和氨苄抗性基因，共约2kb大小。
（6）乙醇沉淀回收线性化重组体
由于线性化重组体比较大，达35kb左右，因此采用凝胶回收纯化的方法不仅回收效率低下，还容易导致线性化重组体发生断裂。本实施例，优选采用乙醇沉淀的方法回收线性化重组体。
试剂准备3mol/L乙酸钠，pH5.2；-20℃乙醇；-20℃70％乙醇。操作步骤：①Pac I酶切体系中加入5μL乙酸钠，振荡混匀；②加2.5倍体积的冰冷乙醇，轻微振荡混匀，冰浴15min，4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；③1ml70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000r/min离心5min，弃上清液，烘干，用50μL的灭菌去离子水溶解沉淀。在乙醇沉淀回收线性化重组体的整个过程中，动作要轻柔，混匀时用手指弹或用振荡器振荡，不要用枪吹打，以防止DNA发生断裂。
（7）在293A细胞中包装腺病毒
在25cm2培养瓶内接种1×106个293A细胞，培养基为5mL。待细胞密度达90%时，用脂质体2000（Lipofectin2000）转染乙醇沉淀回收的线性化重组体。PacⅠ酶切了10μg的线性化重组体，需20μL的脂质体2000。转染完成后，在37℃，5%CO2的条件下培养5-12d，腺病毒包装过程中的细胞动态变化如图4所示。其中，（A）4d左右有腺病毒产生的细胞逐渐收缩变圆；（B）6d左右细胞内腺病毒大量产生而导致有些细胞破裂，释放的病毒感染临近的细胞；（C）8d左右病变范围不断扩大形成较为明显的病变；（D）10d左右最终大部分细胞都形成病变。
细胞病变的时程是相对的，受到293A细胞状态、细胞密度、转染的重组体量等因素影响。有时病变出现很快，5d左右即可完全病变，有时即使10d也不会完全病变。待70%-80％细胞出现病变时，用滴管吹打细胞，将细胞与上清液一起收集，-80℃-37℃反复冻融3次，12000r/min离心10min，收集上清液，共约5mL，-80℃保存。此即为初代腺病毒，滴度约为每毫升1×107-10×107个噬斑形成单位（plaque forming unit，PFU）。
（8）小量扩增腺病毒
在75cm2培养瓶内接种3×106293A细胞，待细胞密度达90%时，加入初代病毒液约100μl，2-3d后待80%-90％的细胞出现病变时，收集细胞与培养基，-80℃-37℃反复冻融3次，12000r/min离心10min，收集上清液，共约10mL，-80℃保存。此即为第二代的腺病毒，滴度约为每毫升1×108-10×108PUF。若只是进行小规模的细胞实验，扩增得到的病毒就可以满足实验需要；若要进行大规模实验如动物试验，则还需进行病毒扩增。扩增时初代病毒的用量是相对的，根据扩增的结果可以调整用量，但一般要求所用的量要保证细胞在2-3d后有80%-90％的细胞出现病变。
（9）大量扩增腺病毒
可用上面得到的第二代腺病毒进行后续的大规模扩增，扩增的量根据实验要求而定。多个75cm2培养瓶内每瓶接种3×106个293A细胞，待细胞密度达90%时，每瓶加入第二代病毒液约100μl，2-3d后待80%-90％的细胞出现病变时，收集细胞及上清液，方法同步骤（8）。若进行动物试验，获得的病毒液要进行纯化。此时得到的病毒为第三代，如果还要进行病毒的扩增，最好用第一代或第二代的病毒，不要用第三代的，因为代数越高，扩增产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA）的可能性越大。但一般来说，第三、四代的病毒出现RCA的可能性是很低的。
（10）氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒
溶液制备：透析缓冲液50mmol/L，MgCl210ml,甘油100ml,10×PBS100ml,加去离子水定容至1000ml,CsCl溶液用灭菌的20mmol/L Tris（pH8.0）配制。
操作步骤：（1）收集扩增后的病毒上清液液，按每20ml上清液中加入10ml20％PEG8000/2.5mol/L NaCl，混匀后冰浴1h；（2）4℃，12000r/min离心30min，弃上清液；（3）沉淀用5ml1.1g/ml CsCl溶解；（4）4℃，12000r/min离心10min，取上清液；（5）超速离心管中依次加入2ml1.4g/mlCsCl、3mL1.3g/ml CsCl、5mL上清液；（6）20℃，60000g离心2h，吸出病毒带（1.3-1.4g/ml CsCl之间）；（7）病毒转入透析袋，4℃透析过夜，分装后-80℃保存。
（11）唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体pAd/KLK1-DEST应用——唾液腺导管细胞特异性启动子的NDRG2腺病毒构建和鉴定
将NDRG2基因利用分子克隆技术连接到本发明所构建的唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体pAd/KLK1-DEST上，连接位点为图3PKLK1之后，重复上述（7）到（10）步骤，获得纯化的腺病毒，大鼠颌下腺局部注射该病毒1×109PFU，72小时后，取颌下腺做免疫组化分析NDRG2表达，如图5所示（注：d为导管细胞，a为腺泡细胞）。图5结果表明：NDRG2特异性表达于唾液腺导管细胞，而唾液腺腺泡细胞没有表达。证实pAd/KLK1-DEST腺病毒载体是一种唾液腺导管细胞特异性的表达载体，作为一种新的工具载体，可以应用于唾液腺相关基因和唾液腺疾病的研究。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现,或不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。特别需要指出的是，上述所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明保护范围内。
Claims (2)
1.一种唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体，为连有KLK1启动子的pENTR入门载体与目标载体pAd/PL-DEST的重组体。
2.根据权利要求1所述的唾液腺导管细胞特异性启动子的腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建pENTR-KLK1启动子载体
在pENTR入门载体上，将KLK1启动子的两个酶切位点分别位于ccdB基因两侧，酶切连接后替换掉pENTR入门载体上的ccdB基因；然后，将连接产物转化TOP10感受态，铺卡那霉素抗性的平板，挑克隆、提质粒，进行双酶切鉴定；
（2）pENTR-KLK1启动子载体与pAd/PL-DEST目标载体进行LR重组
其LR重组反应条件：25℃反应16h；LR重组反应结束后，用蛋白水解酶K在37℃处理10min以降解重组体系中的蛋白质因子，得LR重组产物；
（3）LR重组产物转化TOP10感受态并克隆得LR重组体
将LR重组产物即用来转化TOP10感受态，铺氨苄青霉素抗性平板，挑克隆，摇菌，得LR重组体
（4）LR重组体鉴定
氯霉素负性筛选鉴定：经过氯霉素负性筛选，若长出的克隆能够在含氯霉素的培养基中生长，则表明未发生重组且ccdB基因突变；若不能生长，则表明重组成功；
PCR鉴定：用KLK1启动子的特异性引物进行PCR，检测LR重组体是否有KLK1启动子存在；
（5）线性化重组体
对鉴定好的LR重组体进行扩增，提取LR重组体质粒，用PacⅠ酶切线性化，得线性化重组体。
（6）乙醇沉淀回收线性化重组体，即可。
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