CN103298922B - 细胞分选和培养的多功能生物反应器系统与方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及生物反应器，尤其是用于生长和分离细胞的生物反应器。该生物反应器包括至少一个细胞培养室，一个可调节的磁场，和多功能细胞支持系统，并且还可以包括一个可选的保护性灌注系统和一个可选的计算机控制系统。

Description

细胞分选和培养的多功能生物反应器系统与方法

技术领域

本发明与细胞培养和细胞分选的多功能生物反应器有关。

背景技术

本项申请总体上与生物反应器有关，更具体地说，与培养和分选细胞的生物反应器有关。

许多种细胞，特别是造血干细胞和免疫细胞，在它们有效扩增和定向分化的培养过程中，需要将它们从原样品分离出来。这种分离程序也称为细胞分选、纯化或细胞游离。以前，细胞分选和培养分别由专门的系统完成，即将靶细胞先游离出来，然后再转入培养容器进行培养。这种传统的方法涉及到使用两种完全不同的装置和系统，很麻烦，而且从细胞分选到细胞培养过程中，细胞污染和损伤、死亡的风险较大。我们当前的发明属于采用新颖设计，可以让这两种程序在一个容器（小室）内完成，因此，最大限度地减少了污染和靶细胞损伤、死亡的风险，极大地提高了操作效率。

一些细胞对培养中的剪切力非常敏感。例如，剪切力可以在干细胞培养中产生非特异性分化，细胞凋亡增加，极大地降低干细胞扩增和定向分化的效率。较高的剪切力还可能在蛋白表达中释放出更多的非特异性蛋白，当减小剪切力使这样的蛋白在培养中比例减小时，蛋白纯化程度可以大大增加。静置培养的剪切力虽然最小，但静置培养的细胞通常在培养容器的底部，那么如果细胞密度较大，一些细胞无法获得足够的营养，因此不适合用于大规模的细胞扩增。一些生物反应器虽然能够降低剪切力，但是，这些生物反应器，必须通过不断地运动、搅拌和/或搅动细胞使细胞保持悬浮。一旦生物反应器停止运转，细胞将累积在底部某个位置，而且是不均匀地分布，不利于绝大多数细胞生长。因此，即使这样的生物反应器作了减少剪切力处理，但是当生物反应器运转时，仍有剪切力连续作用于培养的细胞上。在我们当前的发明中，当生物反应器处于静置状态时，细胞可以均匀地分布于培养室的底部或磁珠的表面。因此，我们的发明让细胞不论在悬浮状态还是静置状态，都处在最好的生长条件下，从而可以实现悬浮培养和静态培养交替进行，将剪切力最大限度地减低。

一些生物反应器使用由磁性叶轮控制的磁性元件（尤其叶片或翼片），用于搅拌培养基，保持细胞于悬浮状态。这种生物反应器专门增加剪切力，用于满足某些细胞的培养要求。除了应用差别以外，我们发明的生物反应器，不使用叶片或翼片作为磁性元件，我们发明中的磁珠如果不在磁场中实际上没有磁性，只有将它们放入磁场，它们才有磁性。我们发明中的磁珠不由叶轮控制，而是由磁场强度变化控制磁珠运动。某些细胞需要合适的微环境，或所谓的小生态环境，这对于干细胞的生长尤其重要。一些装置使用固体材料构建小生态环境或使用胶状材料构建小生态环境。使用这样的装置时，在细胞培养后，细胞可能需要使用特殊的程序从小生态环境中洗出，或者是必须融化或用酶消化构建小生态环境的材料，以释放靶细胞。在我们当前的发明中，磁珠之间的空隙自然形成用于细胞生长小生态环境，而当变换磁场强度提升磁珠时，可以轻易地释放细胞。一些其它的细胞培养系统，尝试使用多孔细胞培养板（例如常见的96孔板）、微型培养室（Hung2005）或微型筛（Zhang2009）构建小生态环境。当前发明的生物反应器，由于磁珠的运动提高培养基流动通量，为细胞生长创造了动态微环境，所以优于这些多孔细胞培养板。另外，由于它生产难度低，使用后易于消毒，通过调整磁珠的规格可以随意更改小生态环境的规模，所以它也优于微型培养室和微型筛。

许多细胞培养容器（室）已设计供生物反应器配套使用，例如常见的细胞培养瓶、透气袋、转壁式容器等。这些容器可以与常见的灌注系统配合使用，通过它，细胞可以稀释，更换培养基。然而，在这种这些容器更换培养基时，细胞因子、蛋白质和其它细胞生长有价值的物质和细胞的产物，也同时从培养中流失。另外，常用透析工艺的效率达不到足够的水准。我们当前发明的细胞培养室，利用培养室两侧渗透室之间的胶体渗透力差，快速地通过透析膜实现培养基交换，同时不流失任何细胞因子、肽、蛋白质和某个规格的其它物质。这种培养室设计，采有全新的灌注方法和系统，称为梯度式渗透灌注系统。

绝大多数生物反应器，以前设计一直都是用于培养粘附细胞或悬浮细胞，还未曾报道有支持部分粘附细胞生长的生物反应器。我们当前发明的生物反应器，可以用于几乎任何细胞的培养，包括悬浮细胞、粘附细胞和部分粘附细胞。

现在很普遍都使用计算机控制生物反应器的运转，而且许多生物反应器都是可编程的。我们当前发明需强调的是（1）磁场的强度和方向，（2）细胞培养室翻动的频率和速度，和（3）受上述（1）和（2）影响的磁珠运动的频率和速度，以及（4）其他与细胞生长有关的条件都受到预选程序或/和与从检测器接收到和发回给生物反应器的数据相对应的程序的控制，即反馈调节。

与生物反应器控制中计算机的应用类似，已设计采用某些携带特殊光源（例如激光投影仪）的细胞密度检测器，用于监控细胞培养期间的细胞浓度。从检测器或传感器获得的数据，用于确定如果培养需要更换培养基，细胞是否需要稀释。在我们当前的发明中，细胞密度检测仪可以使用普通光源，数据专用于调整磁场的强度、细胞培养室的翻转速度和频率，以及间接调整磁珠的移动速度和频率以及其他与细胞生长有关的条件。

发明内容

通常使用生物反应器让细胞在培养基中生长。但是，在它们培养过程中有效扩增和定向分化前，需要与从原样品分离。这种分离程序也称为细胞分选或细胞游离。以前，细胞分选和培养分别由专门的系统完成，即将靶细胞先游离，然后再转入培养容器。这种传统方法麻烦，涉及到使用两种完全不同的装置和系统，而且从细胞分选到细胞培养过程中，细胞污染、损伤和死亡的风险较大。

另外，许多生物反应器采用旋转叶轮或类似装置搅拌反应器里面的物料。不幸地是，这会在细胞上产生剪切力，可能损坏细胞，降低系统的效率，释放废物，例如非典型性蛋白表达或类似物质。此外，有些生物反应器中，细胞可能累积于细胞培养室底部或细胞培养室内其它位置。细胞在培养室中累积，不利于细胞的有效生长。因此，迫切需要一种既能生长又能分离细胞，同时最大限度减少对细胞剪切力作用的生物反应器。

在我们发明实例中，生长和分离细胞的生物反应器系统由细胞培养室组成，而培养室内部又有第一和第二两个位置；搅拌器位于培养室内部，搅拌器可以在内部任意两个位置之间移动；细胞培养室另接有控制系统，该控制系统可以让搅拌器在内部任意两个位置之间移动。

在一个实例中，出示了生长和分离细胞的方法，它为一个有内部第一位置和内部第二位置的培养室；内部装有搅拌器，搅拌器可以在内部第一位置和内部第二位置间移动；输送细胞培养基到培养室内部；将靶细胞转移到培养室内部；在第一位置与第二位置之间移动搅拌器，搅拌细胞和培养基；从培养室内部移出废料，同时在培养室内部保留靶细胞。

而在另一个实例中，细胞培养室内部分为：第一室，液体可流通于第一室与细胞培养基贮库之间，以便于第一室能够从贮库流入细胞培养基；第二室，它当中装有搅拌器；第一室与第二室之间装有第一道膜，第一道膜可以选择性地让细胞培养基从第一室流入第二室；第三室，液体可流通于第三室与缓冲液贮库，以便于第三室从缓冲箱流入缓冲液，第三室另能够与废料贮箱相通，以便于废料能够从第三贮箱流入到废料贮箱；第二室和第三室之间装有第二道膜，这道膜可以选择性地允许培养基和废料从第二室流入到第三室。

附图说明

附图结合下文的具体实施方式，展示于此，以便于理解要保护的主题。

图1为生物反应器一实施例的示意图。

图2a-2f为生物反应器的一系列示意图，展示搅拌器在培养室内的一系列运动。

图3为培养室等距视图的示意图。

图4为培养室侧视图的示意图。

图5为一种搅拌器的示意图。

具体实施方式

现在参见图1，图上所示为生长和分离细胞的生物反应器系统10。系统10包括细胞培养室15、搅拌器20和控制系统30。

细胞培养室15包括用于在里面细胞培养基中接收和生长靶细胞的内室35，第一位置40和第二位置45。如里面使用的那样，“靶细胞”指位于培养室15当中和在里面生长的那些细胞。当前展示的是生长靶细胞的一个环境，预计该系统可以用于混合化学品或其它任何适合的溶液或物质。另外，第一位置40和第二位置45分别显示在培养室15的顶端和底端，预计两端40和45可以互相采取任何一个适宜的朝向（例如，同在一个水平面），保持在当前显示范围。如下所述，培养室15可能有一个或一个以上的内部隔室。另外，按照相应的工艺技术，培养室15可能由任何适合的材料构建，包括刚性材料、弹性材料、刚性弹性材料组合、透气材料或任何其它适合材料。培养室15还可以包括一个或一个以上端口，用于内室35与一个或多个贮箱之间液体流通。所示的贮箱包括，但不限于细胞培养基贮箱、废物箱、缓冲箱、二氧化碳箱或任何其它适合的贮箱。

现在参见图3，图上所示为另一种培养室15。在这个实例中，培养室15包括第一室75、第二室80和第三室85。其中第一室75可能包括一个或多个端口18a，用于第一室与一个或多个贮箱，例如细胞培养基箱之间的液体流通，以方便向第一室添加和/或从第一室回收培养基；缓冲箱，以方便向第一室添加和/或从第一室回收缓冲液；废物箱，以方便从第一室75回收废料；二氧化碳箱，以方便向第一室添加和/或第二室回收二氧化碳；或任何其它适合的贮箱。第一室75和第二室80之间由第一道膜90分隔。第一道膜可选择性地让培养基从第一室75流到第二室80。膜90可能有孔隙、孔眼或任何其它适合的配置，和/或其它半渗透方式，让培养基从第一室75流到第二室80。在一个实例中，膜90为透析膜。膜90可以采用任何适合的材质，包括但不限于纤维素和赛璐玢。

第二室80，按其配置，用于固定安装搅拌器，确保搅拌器如图1所示的那样，可以在室内移动。靶细胞一般生长和保存在第二室80内。第二室80可以有一个或多个端口18b，用于一个或多个贮箱之间的液体流通，例如第一室75有关的那些类型贮箱。第二室80和第三室85可由第二道膜95分隔。第二道膜可选择性地让培养基和/或废料从第二室80流到第三室85。膜95可能有穿孔、孔眼或任何其它适合的配置，和/或其它半渗透方式，让培养基和/或废料从第二室80流到第三室85。在一个实例中，膜95采用的是透析膜。膜95可以采用任何适合的材质，包括但不限于纤维素和赛璐玢。第三室85可以有一个或多个端口18c，用于第三室85与一个或多个贮箱之间的液体流通，如第一室75有关的那些类型贮箱。另外，在至少一个实例中，培养室外部的至少一部分可以使用透气材料构建。如果培养室外部至少有一部分使用透气材料，那么该系统（可以是部分而不一定全部）可以不包含注气到培养室和保持培养基pH值的部件。第一室75和第三室85可以布置相对于第二室80的任何适合位置，本专利并不限定置于第一室75和第三室85之间的第二室80的具体位置。另外，任何适合数量的隔室都是可取的，本专利并没有限定只有三个隔室。

在一个实例中，由合适溶液组成的含有数量相对较少的大分子量和/或大极性分子的培养基被送入第一室75，有适合于细胞生长的胶体渗透压的相同或类似的培养基则被送入第二室80。适合的培养基可以是用于生长或培养靶细胞的任何培养基。与第一和/或第二室75、80相比，用于产生和保持较高胶质渗透力的更大浓度的大分子量和/或大极性分子的缓冲液，送入第三室85。第三室用于产生和保持较高胶质渗透力的材料，可能有但不限于PEG80000、白蛋白和其它蛋白质或任何其它适合的物质或溶液。膜90、95可以有相同或不同的渗透性及配置，方便培养基和/或新细胞生长产生的废料可以从第一和/或第二室75、80借助渗透作用流入到第三室85。控制系统可以控制培养基、缓冲液和/或一个或多个室75、80及85的灌入和排出，以保持每个室75、80、85中恒定的溶液量与渗透压，以及保持第二室80供应新鲜的培养基。另外，控制系统，借助任何适合的检测设备、机构或方法，可以监控靶细胞生长中有关的任何参数，例如但不限于靶细胞数量的变化、pH值、CO₂、葡萄糖、钙、钾、钠、温度、湿度或任何其它适合的因数，并调整间隔时间、和/或第二室内搅拌器移动的频率和速度和/或监测培养基容量、培养基类型、缓冲液数量、缓冲液类型、二氧化碳浓度或根据系统测量结果执行任何适合的调整，以提高或促进培养室内靶细胞的生长。

现在参见图4，图上显示的是培养室15的另一个示意图。在这个实例中，培养室可以有一个或多个端口100，用于培养室内室35与废料箱之间的液体流通。培养室15可以有一个或多个端口110，用于培养室内室35与细胞培养基箱之间的液体流通。培养室15也可以有一个或多个端口110，用于培养室内室35与缓冲箱之间的液体流通。另外，培养室15可以有一个或多个端口115，用于搅拌器移入培养室内室35。在一个实例中，培养室15由Telflon FEP构成。这种构造材料形成的特例，在靶细胞粘附或以其它方式偶联于搅拌器上时可以使用，以方便从培养室内室35冲出废料时，靶细胞仍保留在培养室内室35之内。但是，只要不超过本专利所示范围，使用任何适合的材质来制备培养室35都是可取的。

搅拌器20布置在培养室内部35中，可以在培养室的第一端40和培养室的第二端45之间移动。另外，搅拌器20则可配置在任何两个或更多点之间或两个或更多单元之间移动，只要是在培养室内室35内。在所示的实例中，搅拌器由许多磁珠21组成，也可以采用其它的搅拌器配置，但都在当前展示的范围内，而且任何特定的实例不限于如搅拌器那样专门使用磁珠。在一个实例中，磁珠21由可磁化材料构成，例如硅钢、Fe₃O₄或任何其它适合的材料。如这里所用的那样，可磁化材料意味着，搅拌器（例如磁珠）在有磁场时有磁荷，但一旦远离磁场，或者是磁场离开搅拌器附近，便不再有磁荷，例如，当磁场发生器失电的时候。磁性材料一般由每个磁珠21的磁芯组成。磁芯可以用任何适合的材料包裹。在一个实例中，磁芯裹以聚苯乙烯；但是，磁芯可以被包裹上以任何适合的材料并保持在本专利展示的范围内。例如，但不限于此种情况，磁芯可以裹以任何适合的热塑或热固性聚合物。虽然磁珠21所示采用可磁化材料建造，但是这些磁珠可以采用任何适合的材料制成，磁性的或非磁性的，并均在本专利展示的范围。另外，最好将磁珠21每个都裹以任何适合的材料，使得靶细胞在培养室15内生长时附连于磁珠上，然而，不包裹能使靶细胞粘附的特殊材料的磁珠也在在本专利展示的范围内。一些实例中，可能需要让磁珠21能够在细胞培养基中浮动；因此，磁珠芯可能有气穴或气泡，如采用轻型泡沫、塑料或任何其它适合的材料，磁珠21可以在培养基内浮动。

磁珠21在设计上，能够保证它们在聚集在一处时，磁珠21之间可以形成一个或多个小生态环境或微环境。一些实例中，这些小生态环境可以促进里面额外靶细胞的生长。在一个实例中，如果磁珠实质为球形，每个磁珠21的直径可以介于1-10毫米，可以形成适合的小生态环境。但是，最好能让磁珠21可以做任何适合的规格和/或形状，以方便在这些磁珠21叠加在一处时，当中形成一个或多个适合的小生态环境。另外，最好还能在一些磁珠与培养室的一面或多面内壁之间形成至少若干小生态环境。

在另外实例中，如图5所示，搅拌器20a可以为板状件21a，当中有许多孔眼22。板件21a的横截面可能适合于培养室15的截面形状，以方便搅拌器20a在培养室内室35内移动。孔眼22便于培养基在搅拌器20a在培养室内室35之中移动时通过搅拌器20a流动。搅拌器20a可以使用磁性或非磁性材料制造，做成浮动式或非浮动式，和/或裹以前面所说的磁珠20的包被物。

再参见图1，控制系统30可以包括控制器55和计算机60，一台或两台都有，用于控制系统10的动作。另外，系统10也可以手动操作。控制系统30可配置为以反馈方式连接培养室15。控制系统30可以有个暗盒50，用于放置培养室15，但是最好能将培养室15可以通过任何适合的方法或配置形式（例如夹片、挂钩、磁铁、钩环组件、摩擦密合等）连到控制系统50，并保持在当前展示范围内。

控制系统30还可以包括光源2和细胞检测器9，用于检测培养室15内的细胞数量，检测培养室15内细胞数量的变化和类似条件，以及报告结果给控制系统30。但是，最好能使用采用任何已知工艺技术的检测器、机构或技术，去监控细胞数量或细胞数量的变化，并保持在当前展示范围内。另外，控制系统30，借助任何适合的检测装置、机制或方法，可以监控靶细胞生长过程中任何相应的参数，例如（无限制地），靶细胞数量的变化、pH值、CO₂、葡萄糖、钙、钾、钠、温度、湿度或任何其它适合的因数，和调整培养室内搅拌器移动的频率和/或速度，和/或调整培养基数量、培养基类型、缓冲液数量、缓冲液类型、二氧化碳量或根据控制系统任何测量值执行任何其它适合的调整，以提高或促进培养室15内靶细胞的生长。

控制系统30可以让搅拌器在培养室15的内室35中移动。可以有许多种实现方式。在所示实例中，控制系统包括一台电机65，在第一个位置和第二个位置之间驱动旋转培养室15。将如下所示，第一个位置与第二个位置相隔大约180度，但第一个和第二个位置互相间可以采用任何适合的角度，均不超出当前展示范围。培养室15可以水平面旋转、垂直面旋转或旋转、移动、滑动或以任何适合方式移动，只要是让搅拌器20在培养室15内移动便可。

另外，控制系统30可以有第一和第二台磁场发生器70、72，用于激发磁珠21或其它的搅拌器20的磁性，以便在培养室15内移动磁珠21，混合靶细胞和培养基。在所示实例中，每台磁场发生器为电磁铁，带电时产生磁场，失电时失去磁场。带电时，每个磁场发生器吸引搅拌器20，例如磁珠21朝向带电的磁场发生器移动。而在另外一个实例中，使用的是永磁铁，控制系统30可操纵磁铁远离培养室15附近，或者是以其它方式阻隔磁铁的磁场，防止其影响培养室15。虽然所示实例同时采用培养室翻转和电磁铁在培养室内移动搅拌器，但是翻转培养室和电磁铁均可以单独采用。而且，在培养室内移动搅拌器的任何工艺技术均适用，并保持在本专利权力要求范围内。

现在参见图2a-2f，系统10的操作方式以一个非限制性的实例进行说明。靶细胞和细胞培养基送入培养室15的内室35。在这个实例中，磁珠21为浮动式，在培养室15内细胞培养基的顶端浮动。在图2a中，第一台磁场发生器70带电，磁珠21吸在培养室15的第一位置40附近。培养室15然后旋转大约180度到图2b所示位置，在那一点，第一台磁场发生器70将磁珠吸在培养室第一位置40的附近。然后第一台磁场发生器70断电，如图2c所示，磁珠21开始朝培养室15的第二位置45浮动。在磁珠21有可以让靶细胞粘附其上的涂层的实例中，磁珠21从一端移动到另一端的移动，将容许新生长出来的靶细胞附着其上。靶细胞可以粘附于磁珠21上，同时废料从培养室15上冲洗掉和/或当向培养室注入新的培养基时，培养室内仍可留有大部分的原生长和新生长的靶细胞。另外，靶细胞特异性的磁标抗体，可以加入到培养室15的内部，结合于靶细胞上，而当培养室接通磁场后，结合抗体的靶细胞能以可逆的方式吸附到磁场发生器附近的磁珠21和/或培养室壁上。在这个实例中，一台或两台磁场发生器70、72处于产生磁场的工作状态，而未吸附的细胞和/或废料则从培养室冲出和/或在培养室送入新的培养基时，培养室内仍可留有大部分的原生长和新生长的靶细胞。另外，可以使用磁性试剂，例如Annexin V或其它适合的试剂，用于将损坏或死亡的细胞吸附到磁珠，而健康的靶细胞从系统10冲出。此外，在培养室15中使用磁性抗体和/或试剂，而没有使用搅拌器的情况下，当冲洗培养室时，靶细胞或损坏/死亡的细胞仍然可以保留在培养室内。

这些示意图还标明，一旦磁珠21位于培养室第二位置45的附近，第二台磁场发生器72可以启动，磁珠因此吸持在培养室第二端45的附近（图2d），培养室旋转到图2e所示位置。然后，第二台磁场发生器72断电，如图2f所示，磁珠21朝向培养室第一端40浮动。这些工艺也适用于下述过程，即根据先前讨论过的控制系统的监测指标，在本过程当中任何需要的时间点选择性地添加各种添加剂、培养基、缓冲液、二氧化碳和类似物质到培养室，和/或选择性撤除废料，以促进或提高新细胞的生长。

在另一个实例中，可以使用非浮动的磁珠，在不受磁场影响的情况下，磁珠可以通过培养室的旋转在培养室内移动。这里，借助培养室旋转，使用重力和离心力，让磁珠在培养室5内两个或两个以上位置之间移动。然而在另一个实例中，第一和第二磁场发生器70、72可以交替启动，以便于在培养室内两个或两个以上位置之间移动磁珠，而不必旋转培养室15。虽然前例采用磁珠21作为搅拌器，但只要不超过当前展示范围，本发明也包括使用其它适合的装置作为搅拌器，包括但不限于图5所示的内容。另外，使用可以在培养室内移动搅拌器的任何方法或工艺技术，均在本专利的权利要求范围之内。

此外，如果培养室15全部或部分采用透气材料，那么可将该系统置于二氧化碳培养箱或二氧化碳培养室内。如果没有二氧化碳培养箱、二氧化碳培养室，或也没有应用透气材料，那么可以采用某些试剂，例如HEPES，或者直接从二氧化碳气储存装置将二氧化碳注入到培养室内。

尽管通过一些无限制的示例展示了当前发明和它的若干优点，但是，应该理解，只要不背离后面所附的专利申请内容，任何修改、替代、排列和变更均在本专利的权利要求范围之内。前述任何一个实例的任何特性所适用于的任何其它的实例也在本专利的权利要求范围之内。

尽管生物反应器设计上用于细胞分选和细胞培养，但是它的任何一个功能都可以单独使用。以下是一些示例，展示使用生物反应器进行细胞分选和/或细胞培养的方法。

示例1。从巴菲层细胞中分选造血干细胞（HSC），然后进行细胞培养。软层细胞可以从脐带血、骨髓、周围血液或其它组织中，使用标准的Ficoll分级程序获取。使用常规方法计数软层细胞，并将之用所需要的缓冲液（例如1%人白蛋白PBS）重新悬浮到正确的容积中，然后添加正确量的有磁性标记的抗CD34，充分混合，在4°C的环境下培育10到30分钟。在培育期间，将生物反应器的操作系统接入二氧化碳培养箱，连接控制箱所有接线，连接计算机。接通生物反应器和计算机电源，选择细胞分选和细胞培养程序。根据细胞要求，编辑每个具体步骤的程序或选择一个通用程序。待培养后，细胞放入含有磁珠的培养室。可以使用图4所示的培养袋。将培养室内充满清洗缓冲液，然后将培养室放入暗盒。将暗盒和培养室装到生物反应器的翻转臂上，连接一个进口（底部）管用于注射（或其它类型的容器，余下步骤同）清洗缓冲液，另一个进口（底部）则接到培养基注射器，顶部口接到收集废料的注射器。按此程序，尝试消除培养室和管线中的所有气泡（若干小气泡不影响反应）。按下计算机屏幕上的开始按钮，生物反应器自动开始分离CD34+细胞，然后注入培养基，开始培养。培养前和培养期间，计算机通过分析细胞密度检测器取得的数据记录和报告细胞的生长指数，提供补充培养基、变更培养基或停止培养的建议。如使用的是细胞分选和细胞培养的通用程序，那么在按下开始按钮后，生物反应器开始翻转细胞培养室数次（5-8），让磁珠充分搅拌细胞（图1-6）。在翻转的最后，磁珠的位置和废料口位于底部，两个进口则位于培养室的顶部。这个时候，用于废料收集的注射器开始缓慢地从培养室中抽出缓冲液，然后，带细胞的缓冲液缓慢地流过磁珠，磁性抗体细胞被磁珠捕获，而其它细胞则流入到废料注射器。

等培养袋抽空后，再注入新鲜的缓冲液（大约袋子的一半）。重复上述抽空和加注步骤两到三次，清洗剩余的无标记的细胞。然后，再用细胞培养基（袋子容积的1/5–1/3）清洗细胞一次，然后袋子注满培养基，开始培养。培养期间，细胞根据程序和细胞密度增加的结果，用磁珠定期重新悬浮。培养后，可以收获整袋细胞，或者是将细胞倒入另一个容器。

示例2。CMV特异性CD8+细胞毒T细胞扩增。从CMV抗体阳性个体获取的软层细胞。该应用可以使用2中方法。第一种方法与示例1所示的大致相同，但是使用了磁性标记的抗CD8和CMV特异性CD8+细胞毒T细胞扩增的培养基，代替了磁性标记的抗CD34和HSC扩增的培养基，在培养最后增加了受损细胞清除（见以下第二种方法的描述）。当细胞数量较低时，例如小于一百万，首选使用第二种方法，CD8+细胞在扩增程序的中间分离，而不是在开始。在第0天，在Ficoll分离后，软层细胞使用CTL Medium清洗两次，再在含IL-2和IL-7的CTL Medium中重新悬浮至10⁷/ml，37°C时添加10ul CMV pp65/10⁷cells/ml PBMC，持续5-10分钟。细胞然后用刺激介质稀释到10⁶/ml，再放入生物反应器的细胞培养室，如图3所示，而培养室的所有外壁全部采用透气膜制作。细胞在5%二氧化碳37°C培养6天。在此6天期间，灌注保护系统应始终保持运行。这意味着高渗透室和低渗透室都注满适当的溶液，泵系统程控运行。在第6天，抽出低渗透室的培养基，然后让低渗透室保持清空若干小时（通常2-4小时），直至细胞培养室中的培养基减到原容积的1/5到1/4。此时，按计算机说明（提示），通过连接到进口的三通旋塞，手动添加正确量的磁性标记抗CD8抗体到细胞培养室。点击“continue”（继续）按钮保持机器运行。生物反应器将让培养室翻动若干次（6-8），以混合抗体和细胞，然后在图2b所示位置停止进行10-30分钟的孵育。孵育后，如示例1所示，生物反应器自动开始排空、清洗和加注程序。与此同时，低渗透室也充满新鲜培养基。再经过两天的培养，细胞失去所有的磁性材料，不再受磁场影响。因此，在第三天，便可用磁性标记的Annexin V或其它试剂，即专门粘附受损或死亡细胞的，排除受损细胞。受损细胞的排除程序与CD34或CD8阳性细胞选择的程序大致相同，但废料容器或注射器需要更换，或者是使用三通旋塞更换排空方向，收集扩增的活细胞，原因是这次磁珠捕获的是受损或死亡的细胞。

示例3。成纤维细胞培养。成纤维细胞为一种典型的粘附细胞。

在胰蛋白酶消化和清洗后，成纤维细胞被悬浮于合适的培养基，例如10%BSARPMI1640，重新悬浮为10000-40000/ml。将细胞倒入细胞培养室，例如图4所示的细胞培养袋。将培养室口与管线相连，将暗盒与培养袋装到二氧化碳培养箱翻转臂，如示例1所示。启动标准粘附细胞的培养程序。在这个程序，细胞培养室保持缓慢翻动24小时，让细胞粘附到磁珠上。在第二天，包含未粘附细胞的培养基排入废料容器或注射器，然后再加入新鲜培养基。缓慢而间歇翻动细胞培养室培养细胞，然后在翻转期间，通过程控更换培养基。根据预设程序，或者是当细胞密度检测器报告计算机培养基中的浮动细胞快速增加时，停止细胞培养。待细胞培养停止，细胞培养室中的培养基排入废料容器或注射器，细胞用1xPBS清洗三次。清洗后，从三通旋塞，工作浓度的胰蛋白酶人工加入到培养室，加入液位保证在底部磁场接通时能够浸没所有磁珠。待37°C温度培育3-5秒后，再完全排出胰蛋白酶。保持培育总计5分钟。由于一些粘附细胞非常紧密地粘到磁珠上，所以细胞应放在较大量的胰蛋白酶中，并且孵培育时间可达10分钟，还应保持细胞培养室的翻转。等细胞分离后，立即加入新鲜培养基充满培养室。与此同时，应更换废料容器或注射器用于收集细胞，或者是切换三通旋塞到收集细胞的容器或注射器。待准备就绪后，点击计算机屏幕上的“drain”（排放）按钮，收集分离的细胞。要捕获所有分离的细胞，可能需要再清洗两或三次。

示例4。杂交瘤细胞的培养。杂交瘤细胞广泛地用于生产单克隆抗体。一些杂交瘤细胞属于部分粘附细胞。

培养杂交瘤细胞的原理与粘附细胞的相同，但由于我们的灌注保护系统可以避免未粘附细胞和细胞生产抗体的损失，所以应使用培养室组（图3）。

当前发明的生物反应器可以用于所有类型的细胞培养。

对于悬浮细胞，由于这种生物反应器可以最大限度的减少造成造血干细胞非特异性分化的剪切力，所以它对造血干细胞具有最大的优势。另外，造血干细胞通常需要在开始培养前，从原样品中分离，原因是原样品含有其它类型的细胞。由于剪切力可能增加非特异性活化的淋巴细胞，所以淋巴细胞也需要最大限度的减少剪切力，而且临床应用和基本研究，都需要纯净的淋巴细胞培养。

一些其它有悬浮细胞，即特别需要在细胞培养过程中降低剪切力的那些，都为蛋白（包括抗原和抗体）表白细胞或细胞系。一般而言，降低剪切力，可以减少细胞损坏和细胞凋亡。对粘附细胞，我们当前发明的生物反应器，不但效率高，而且使用很方便。这种生物反应器也可以用于部分粘附细胞的培养。

Claims (25)

1.用于细胞分选、细胞生长、细胞定向分化和人工组织构建的生物反应器，其特征在于：

A包括至少一个可以翻转的反应培养室，用于容纳细胞、细胞培养基和细胞载体,在同一个反应培养室中进行细胞分选和细胞生长，细胞分选可以在细胞培养之前、之后或期间进行；

B包括至少一个可调节的磁场，用于控制细胞分选程序和培养程序；

C包括多功能细胞支持系统，由可磁化的搅拌器构成，可磁化的搅拌器包括磁珠，用于在细胞分选中捕获阳性细胞、作为粘附细胞的载体、构成细胞生长的微环境和保持细胞悬浮；

D有保护性灌注系统，用于在细胞培养、分选及分选和培养转换期间快速更换培养基且选择性保留细胞、肽类和蛋白类；反应培养室为保护性灌注系统的一部分，至少包括三个隔室，第一隔室，含有较低胶体渗透压浓度，为低渗透室，第二隔室为反应培养内室，第三隔室含有较高的胶体渗透压浓度，为高渗透室，隔室之间用膜隔开，根据培养室两侧之间胶体渗透压不同，选择性地让液体从低渗透室流入培养内室，从培养内室流入高渗透室。

2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于具有计算机控制系统，由计算机和反应条件检测器、控制生物反应器的反馈系统构成。

3.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于其中反应培养室包括：

A第一隔室，适合于该室与细胞培养基储库之间的液体交换，从而使第一隔室能够从储库获得细胞培养基；

B第二隔室，与第一隔室连接，第二隔室里面装有搅拌器；

C第一道膜，位于第一隔室与第二隔室之间，用于选择性地让培养基或缓冲液从第一隔室流入第二隔室；

D第三隔室，适合于该室与高渗缓冲液容器之间的液体交换，保证高渗缓冲液能够从高渗缓冲液容器流入第三隔室，而且第三隔室还能够与废料容器形成液体交换，保证废料能够从第三隔室流入废料容器；

E第二道膜，位于第二隔室与第三隔室之间，第二道膜用于选择性地让培养基和废料从第二隔室流入第三隔室；

F反应培养室至少一面侧壁应使用透气材料，否则应使用注气系统和/或特定的培养基组分；

G反应培养室可以使用卡盒和支架与生物反应器的翻转臂固定。

4.根据权利要求1所述的生物反应器，里面装有多功能细胞支持系统，系统由可磁化搅拌器组成，其用途包括作为细胞载体和减少细胞损坏；权利要求1的生物反应器里面安装的搅拌器，至少有一个部位使用可磁化材料制作，位于磁场附近，就有磁性，磁场消失或远离反应区，就变得无磁力或磁力非常弱；

上述磁珠的规格大于1毫米直径，小于权利要求1和权利要求3当中反应培养室的容积。

5.根据权利要求4所述的生物反应器里面装有可磁化搅拌器，用作细胞分选和粘附细胞培养的细胞载体；在细胞分选时，它们用于捕获分选细胞中带磁性标记的细胞，让这些细胞粘附于上述磁性搅拌器的表面；磁性标记由抗体或Annexin V介导；当磁场消失或远离时，磁性标记的细胞便与磁珠脱离；在粘附细胞培养中，磁性搅拌器使细胞粘附到它上面，在上面生长。

6.根据权利要求4所述的生物反应器，其特征在于里面装有磁性搅拌器，通过在反应培养室两端之间移动对培养基进行搅拌，保持细胞悬浮于液态培养基中，或轻轻地搅拌反应培养室保持细胞悬浮；磁性搅拌器可以在生物反应器中移动，包括以下三种机制：1)周围磁场的引力和2)浮力，当磁珠密度低于反应培养室中的培养基的密度，或/和3)重力，当磁珠密度高于反应培养室中培养基的密度。

7.根据权利要求4所述的生物反应器，其特征在于里面装有磁性搅拌器，用于形成保障细胞生长的微环境；当磁性搅拌器在每次运动后停顿时，磁珠间的空间便形成一个细胞生长的完美的微环境，避免过度拥挤或成团可能对细胞生长造成的损害，并降低干细胞的非特异性分化。

8.根据权利要求1、4、5、6或7的生物反应器，磁场可以更改磁场强度和/或方向。

9.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述可调整的磁场由电磁铁形成，通过变换电流和/或电压或电磁铁的位置与方向，调整磁场强度而调整磁场；或者是上述可调整的磁场用永磁铁形成，通过变更永磁铁的位置和方向而调整磁场。

10.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于保护性灌注系统包括在反应培养内室和梯度渗透隔室之间的一面或多面透析膜、与反应室相邻的一个或多个梯度渗透隔室、梯度渗透缓冲液、梯度渗透缓冲液容器、相关的渗透缓冲液循环的动态装置和废料收集容器；来自低渗透室的新鲜培养基流经透析膜到反应隔室，同时来自反应隔室的旧的培养基经透析膜流到高渗透隔室，然后再排入废料容器。

11.根据权利要求10的生物反应器，其特征在于里面所说的梯度渗透缓冲液由高渗透缓冲液和低渗透缓冲液组成；高渗透缓冲液含有高浓度的大分子，以形成大的胶体渗透力，而低渗透缓冲液含有很少甚至没有大分子。

12.根据权利要求2的生物反应器，其特征在于里面装有计算机控制系统，包括计算机、相连的反应条件检测器和反馈系统；检测器监控的条件包括：细胞密度、pH值、葡萄糖、二氧化碳、氧气、氮气浓度和反应培养内室中的温度、湿度；上述检测器可以是传感器或传感器与信号发生器的组合形式；这些传感器可以直接输入数据到内置或外置计算机；待分析完数据后，计算机发出反馈信号给生物反应器，调整这些条件，以满足细胞生长的要求；计算机也能提供预选的程序，让生物反应器按程序运行；控制系统还包括一台电机，电机连到细胞培养室，驱动在第一位置和第二位置之间旋转培养室，培养室从第一位置旋转到第二位置，使得搅拌器从反应培养室内室第一部位移向反应培养室内室第二部位。

13.细胞分选、细胞和工程组织生长的方法；包括：细胞分选准备、生物反应器中靶细胞分离、去除未选中的细胞和旧的培养基、实时监控细胞密度和细胞生长条件、实时调整和优化用于细胞生长和定向分化的细胞培养条件、编程和应用计算机系统调整和优化细胞培养条件、在培养室内培养细胞，和在权利要求1的生物反应器内收集细胞。

14.根据权利要求13的方法，其特征在于上述细胞分选在有细胞生长微环境的培养室内进行培养细胞。

15.根据权利要求13的方法，其特征在于上述细胞分选可以通过权利要求4中靠近权利要求的磁场发生器的磁性搅拌器或/和培养室壁捕获的磁性标记的细胞进行，其中，磁性搅拌器由权利要求1中可调节的磁场控制；任何非靶细胞可以洗出、排放；当磁场撤离后，靶细胞可以立即从磁珠上释放。

16.根据权利要求15的方法，上述磁性标记的细胞可以使用磁性标记的抗体、Annexin V或无标记方式制备。

17.根据权利要求13的方法，其中所述的实时监控细胞密度，根据光学或/和生物化学原理进行。

18.根据权利要求13的方法，其中所述的细胞生长是在细胞保持悬浮、静置状态或悬浮与静置状态交替方式时进行。

19.根据权利要求18的方法，其中所述的细胞可以通过磁性搅拌器的移动来保持悬浮，而磁性搅拌器由可调磁场控制，选择性地单独利用重力、浮力、磁场的调控或利用它们的任意组合进行调控。

20.根据权利要求19的方法，其中所述的可调磁场控制移动的磁性搅拌器，可在反应培养室的任何两个位置之间以任何方向移动，而磁性搅拌器由可调磁场控制，选择性地单独利用重力、浮力、磁场的调控或利用它们的任意组合进行调控。

21.根据权利要求14的方法，其中所述的细胞生长微环境在磁性搅拌器处于实际静止时形成，这些细胞生长微环境也可以通过移动磁性搅拌器调整。

22.根据权利要求13的方法，其中所述的计算机控制系统为可编程式，可为生物反应器的全部或部分功能编程。

23.根据权利要求13的方法，其中所述的实时监控和优化细胞生长和定向分化的细胞培养条件，由计算机控制的综合系统执行，包括细胞培养检测器、计算机和对应的程序，以及反馈操作控制系统。

24.根据权利要求13的方法，其中所述的定向分化的细胞培养条件，适用于所有有分化潜能的细胞，上述定向分化可以同时采用生化和物理方法，用于两个或更多方向的诱导。

25.根据权利要求1的生物反应器，其中所述的生物反应器，可以为所有细胞提供理想的细胞生长条件，包括各种组织细胞、癌细胞和细胞系以及转化细胞和细胞系。