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CN103282486B - 具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物以及使用该微生物生产鸟氨酸的方法 - Google Patents

具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物以及使用该微生物生产鸟氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物，其中自鸟氨酸至精氨酸的生物合成途径被阻断，细胞内的谷氨酸水平增加，并且自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径被增强，并且本发明涉及一种使用该微生物生产鸟氨酸的方法。

Description

具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物以及使用该微生物生产鸟氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物，以及使用该微生物生产鸟氨酸的方法。
背景技术
鸟氨酸是一种在植物、动物和微生物中广泛出现的物质，并且它可用作精氨酸、脯氨酸和聚胺的生物合成的前体。作为一种非必需氨基酸，鸟氨酸未在蛋白质中发现，但它存在于例如短杆菌酪肽（tyrosidine）和短杆菌肽的肽类抗生素中。在高等动物的体内代谢中，鸟氨酸在通过鸟氨酸循环自氨基酸或氨生成的尿素的排泄途径中发挥了重要作用。
鸟氨酸有助于形成肌肉和减少身体脂肪，因此它可用作营养补剂。含有比例为2:1的鸟氨酸和α-酮戊二酸的鸟氨酸-α-酮戊二酸盐（OKG）可用作免疫增强剂。鸟氨酸还可用作改善肝硬化和肝功能紊乱的药物，因为它有助于自肝脏中除去有害的氨。生产鸟氨酸的已知方法是用消化酶处理乳酪蛋白以及使用转化的大肠杆菌或属于棒状杆菌属的工业微生物，它们广泛用于氨基酸、核酸、酶和抗生素样物质的生产。
在属于棒状杆菌属的微生物中，L-精氨酸是由argCJBDFRGH形式的精氨酸操纵子上的基因表达的酶自谷氨酸合成的。精氨酸操纵子基因在精氨酸的生物合成中发挥了最为重要的作用，使用细胞内的谷氨酸（L-谷氨酸）作为底物合成了精氨酸，而在精氨酸合成期间生成了鸟氨酸作为中间体。特别是，在图2中图解说明了在属于棒状杆菌属的一种微生物中自谷氨酸至精氨酸的合成途径，已知argJ编码了一种在精氨酸合成途径中将谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸的酶，argB编码了一种在精氨酸合成途径中将N-乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸磷酸的酶，argC编码了一种在精氨酸合成途径中将N-乙酰谷氨酸磷酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛的酶，argD编码了一种在精氨酸合成途径中将N-乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸的酶，argJ编码了一种在精氨酸合成途径中将N-乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸的酶，argF编码了一种在精氨酸合成途径中将鸟氨酸转化为瓜氨酸的酶，argG编码了一种在精氨酸合成途径中将瓜氨酸转化为精氨酸琥珀酸的酶，而argH编码了一种在精氨酸合成途径中将精氨酸琥珀酸转化为精氨酸的酶，并且鸟氨酸合成途径包括在精氨酸合成途径中。
已知的精氨酸生产菌株是通过将一个突变诱导至精氨酸操纵子之中或通过启动子突变以增加精氨酸生物合成中涉及的酶的表达水平来开发的。其中，控制和抑制精氨酸操纵子表达的argR和由精氨酸水平抑制的argB已经作为增加精氨酸生产的靶点受到了广泛的研究（韩国专利公开号2010-0060909）。
为了鸟氨酸生产能力的改善，已知可通过在补充有脯氨酸的培养基中培养棒状杆菌微生物或通过改良叶轮混合器并改良该微生物培养期间的培养条件从而鸟氨酸环化脱氢酶（ocd）的作用增加从而生产鸟氨酸。此外，当使用转化的大肠杆菌时，通过在补充有谷氨酸的培养基中培养argF和argR-缺失菌株，或通过使用缺失proB基因的转化菌株来提高鸟氨酸的生产能力，其中proB基因编码了自谷氨酸开始的脯氨酸合成途径而不是自谷氨酸开始的鸟氨酸合成途径的第一步中涉及的γ-谷氨酰激酶。
此外，人们一直在研究谷氨酸棒状杆菌以获得作为鸟氨酸前体的谷氨酸的高产量的生产。已知限制生物素或是用青霉素G或一种脂肪酸酯表面活性剂处理可增强谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸分泌。由于这些处理与细胞壁的损伤相关，因此以前即已认为谷氨酸可被动穿过损伤的细胞壁。
来源于野生型谷氨酸棒状杆菌（Cgl13032）的NCg11221蛋白质有助于甜菜碱的流出，它的氨基酸序列与大肠杆菌机械敏感性通道蛋白质yggB的氨基酸序列相似（韩国专利公开号2010-0017581）。
发明内容
技术问题
在该背景下，本发明人付出了大量努力以开发一种能够以较高产量生产有用的鸟氨酸的菌株。因此，他们发现能够通过阻断自鸟氨酸至精氨酸的生物合成途径、通过阻断谷氨酸运出中涉及的蛋白质以增加细胞内的谷氨酸水平以及通过增强自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径来开发过度生产鸟氨酸的菌株，从而完成了本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供一种具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物。本发明的另一个目的是提供一种使用该微生物生产鸟氨酸的方法。
有益作用
本发明的具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物能够更为有效地用于鸟氨酸生产的多种应用。
附图说明
图1显示了本发明的鸟氨酸生物合成途径以及转化谷氨酸棒状杆菌的相关基因。
图2显示了谷氨酸棒状杆菌的已知精氨酸生物合成途径；和
图3显示了一种被插入至属于棒状杆菌属的微生物染色体的pDZ载体。
具体实施例
为了实现本发明的上述目的，一方面本发明提供了一种具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物，其中鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出中涉及的一种蛋白质（NCg11221）的活性与其内源活性相比经修饰被减弱。
本文所用的“鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OCT）”是指介导氨甲酰基磷酸和鸟氨酸之间反应以合成瓜氨酸和磷酸的催化酶。OCT存在于尿素排泄动物的肝脏中以及植物和微生物中，以及存在于精氨酸合成涉及的微生物中。OCT酶包含催化区和调节区，并且当鸟氨酸与该调节区结合时，该酶的活性会受到抑制。
大肠杆菌K12菌株具有两种OCT（ArgF和ArgI），而包括大肠杆菌B和W菌株的肠内微生物具有与ArgI相似的OCT蛋白质。argF和argI编码的OCTs相互之间具有不同的氨基酸序列，但是它们被认为是具有相同功能的同工酶（EMBOJ.(1982)1：853-857）。棒状杆菌属菌株仅具有argF基因编码的OCT。OCT仅在自鸟氨酸至精氨酸的合成途径中发挥作用，因此如果减弱OCT的活性，则可增加细胞内的鸟氨酸的水平。
为了细胞内的鸟氨酸的蓄积，本发明提供了一种自鸟氨酸至精氨酸的合成途径被阻断的棒状杆菌微生物。为了实现该目的，制备一种缺失鸟氨酸氨甲酰基转移酶编码基因的转化菌株。在这方面，鸟氨酸氨甲酰基转移酶可以但不特别被限制为一种具有序列代码编号18的氨基酸序列的蛋白质或是一种具有与该序列同源性为70%或更高、更优选与该序列同源性为80%或更高、最优选与该序列同源性为90%或更高的蛋白质。
本文所用的“同源性”是指核苷酸序列或编码蛋白质的基因的氨基酸序列的相似性。当同源性足够高时，相应基因的产物可以是相同的或是具有相似的活性。
本文所用的“谷氨酸运出相关蛋白质”是指功能为运出细胞内生成的谷氨酸至细胞外环境的一类机械敏感性通道。本发明提供了一种具有改善的鸟氨酸生产能力的棒状杆菌微生物。为此，通过删除一个编码蛋白质的基因来制备一种能够维持高水平细胞内的谷氨酸的转化菌株，该编码蛋白质的基因的功能为分泌鸟氨酸合成中的原料即谷氨酸。
通过增加谷氨酸即鸟氨酸前体的细胞内的水平，可以刺激鸟氨酸生物合成途径。在本发明中，谷氨酸运出可通过降低NCg11221活性来减少或抑制。
谷氨酸运出相关的缺失蛋白质可以是具有一种序列代码编号20的氨基酸序列或是一种具有与该序列同源性为70%或更高、更优选同源性为80%或更高、最优选同源性为90%或更高的蛋白质，但不限于此。
鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出中涉及的蛋白质的活性可通过选自以下组的方法降低，该组包括（1）部分或完全删除编码该蛋白质的基因，（2）修饰表达调控序列以抑制该基因表达，（3）修饰染色体的核苷酸序列以降低蛋白质活性，和（4）以上的组合，但是不限于此。
部分或完全删除编码该蛋白质的多核苷酸可通过引入一个插入微生物染色体的载体，从而用部分删除的多核苷酸或标记基因代替染色体中编码内源靶蛋白质的多核苷酸来完成。“部分”长度可根据多核苷酸的种类而不同，但它特指1至300个核苷酸的长度，优选1至100个核苷酸，更优选1至50个核苷酸。
此外，可以通过核苷酸序列的删除、插入、非保守或保守取代以及它们的组合来诱导表达调控序列的修饰，从而降低表达调控序列的活性，或是用活性较弱的核苷酸序列代替表达调控序列来完成表达调控序列的修饰以降低多核苷酸的表达。表达调控序列包括一个启动子、一个操纵子序列、一个编码核糖体结合位点的序列以及一个调控转录和翻译终点的序列。
此外，可以通过多核苷酸序列的删除、插入、非保守或保守取代以及它们的组合来诱导序列突变以降低酶活性，或是用修饰后活性较弱的多核苷酸序列进行代替来完成染色体上编码本发明的酶的多核苷酸序列的修饰。
本文所用的“内源活性”是指微生物在天然状态下具有的酶活性。在本发明中，内源活性是指鸟氨酸氨甲酰基转移酶和微生物天然具有的谷氨酸运出相关酶即NCg11221的活性。此外，本文所用的“修饰以获得比内源活性弱的活性”是指鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关酶即NCg11221由于基因缺失或突变不能正确发挥功能，因此鸟氨酸氨甲酰基转移酶和微生物天然具有的谷氨酸运出相关酶即NCg11221的活性被减弱。
本文所用的术语“具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物”是指具有比亲本菌株更高的鸟氨酸生产能力的微生物，并且具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物可能是但不特别限于进一步转化以具有比内源活性更高的乙酰谷氨酸合成酶（ArgJ）（将谷氨酸转化为乙酰谷氨酸（N-乙酰谷氨酸））或鸟氨酸乙酰转移酶（ArgJ）（将乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸）、乙酰谷氨酸激酶（ArgB）（将乙酰谷氨酸转化为乙酰谷氨酸磷酸（N-乙酰谷氨酸磷酸））、乙酰γ谷氨酸磷酸还原酶（ArgC）（将乙酰谷氨酸磷酸转化为乙酰谷氨酸半醛（N-乙酰谷氨酸半醛））、乙酰鸟氨酸氨基转移酶（ArgD）（将乙酰谷氨酸半醛转化为乙酰鸟氨酸（N-乙酰鸟氨酸））等活性的微生物，以增强自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径。
通过与开发鸟氨酸生产菌株的已知方法不同的方法来制备转化的微生物，已知方法是通过消除或减弱在精氨酸生物合成途径中用作转录抑制剂的ArgR的功能来增加鸟氨酸生产，或是通过进一步删除鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因和诱导抗回复N-乙酰谷氨酸合成酶来增加鸟氨酸生产而进行制备的（韩国专利公开号2010-0060909）。
在这方面，乙酰γ谷氨酸磷酸还原酶（ArgC）、乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶（ArgJ）、乙酰谷氨酸激酶（ArgB）和乙酰鸟氨酸氨基转移酶（ArgD）分别可优选具有但不特别限于序列代码编号为23、25、27和29的氨基酸序列，或分别具有与这些序列同源性为70%或更高、优选与这些序列同源性为80%或更高、最优选与这些序列同源性为90%或更高的氨基酸序列。可通过选自以下组中的任何一种或多种方法来增加这些酶的活性，该组包括1）增加编码该蛋白质的多核苷酸的拷贝数，和2）通过修饰表达控制序列增加多核苷酸的表达，3）通过修饰染色体上的多核苷酸序列增强酶活性，和4）通过以上方法的组合获得增强。
具体而言，通常可以使用多种方法来增加微生物的酶活性。例如，提高多核苷酸的表达水平可通过转化相关的质粒插入、同源重组、结合和转位以增加多核苷酸的拷贝数；修饰多核苷酸的表达调控序列；扩增编码刺激该多核苷酸表达的调控因子的基因；或是删除或抑制编码抑制该多核苷酸表达的调控因子的基因来实现。更具体的说，可通过可操作地连接一个包含多核苷酸的基因片段和一个可在棒状杆菌属菌株中被复制的多拷贝载体、在染色体中引入一个或多个拷贝的多核苷酸、或是用活性增加且包括一个强启动子的序列代替多核苷酸的表达调控序列来提高多核苷酸的表达水平。
例如，可使用pHC139T载体将argCJBD基因组转化至一个微生物中以制备具有显著改善的鸟氨酸生产能力的微生物。或者，可通过改进调控微生物染色体中的argCJBD基因表达的启动子区域，或是使用具有更强活性的启动子代替启动子区域，来制备鸟氨酸生物合成途径得到了增强的微生物。特别是，一种改进启动子区域的方法可包括制备一个基因片段来代替染色体内的启动子，这个基因片段包含但是不限于染色体上与靶部位相邻的两个末端部位的核苷酸序列以及一个将以与原始染色体相同的形式并且使用pDZ载体按照相同的基因删除方法插入的启动子序列，其中pDZ载体公开于韩国专利公开号2009-0082702中。在本发明中，改进的启动子可优选但是不限于具有序列代码编号30的核苷酸序列的pcj7（或P(CJ7)）启动子（韩国专利登记号0620092）。pDZ载体可优选但是不限于图3显示的裂解图代表的载体。
本文所用的“载体”是指包含一个可操作地被连接至适合的表达调控序列以在合适的宿主细胞中表达靶基因的核苷酸序列基因的DNA构建体。表达调控序列包含一个可引起转录的启动子，一个可选的调控该转录的操纵子序列，一个编码适合mRNA核糖体结合位点的序列，以及一个调控转录和翻译终点的序列。常见载体的例子包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体。pDZ载体、pBR类型、pUC类型、pBluescriptII类型、pGEM类型、pTZ类型、pCL类型和pET类型可用作质粒载体。可用载体没有特别限制，可使用任何已知表达载体，优选pDZ载体。
同时，本发明的微生物可以是但不特别限于由属于埃希氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸细菌属、沙门氏菌属、肠杆菌属、耶尔森氏菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、乳酸菌属、单胞菌属或弧菌属的微生物转化制备而成，具有鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关蛋白（NCg11221）的微生物。
本发明的微生物可优选为棒状杆菌属菌株，更优选为谷氨酸棒状杆菌。更具体来说，可使用但是不限于野生型菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032或谷氨酸过度生产菌株KCCM-10785P（韩国专利公开号2008-0034334）。KCCM-10785P菌株是通过在谷氨酸生产菌株（KFCC-11074）中删除cg2624（NCBILOCUSIDYP_226636）和cg2115（NCBILOCUSIDYP_226173）基因形成的谷氨酸过度生产菌株，该谷氨酸生产菌株是使用例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NTG）的诱变剂生成的。尽管在上述出版物之前没有鉴别出通过删除cg2624和cg2115引起的谷氨酸过度生产，但cg2524被鉴别为pcaR，是一种IclR家族调控蛋白，而cg2115被鉴别为sugR，是一种糖代谢的转录调控因子。
根据本发明的一个实施例，制备了一种缺失argF基因（ATCC13032ΔargF和KCCM-10785PΔargF）的谷氨酸棒状杆菌菌株（实施例1）、一种缺失argF和NCg11221基因（ATCC13032ΔargFΔNCg11221和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221）的谷氨酸棒状杆菌菌株（实施例2）、一种缺失argF和NCg11221基因并且引入了argCJBD基因（ATCC13032ΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)）的谷氨酸棒状杆菌菌株（实施例3-1）以及一种缺失argF和NCg11221基因并且在染色体中用argCJBD基因簇启动子代替（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）的谷氨酸棒状杆菌菌株（实施例3-2）。对它们的鸟氨酸生产能力进行比较的结果显示缺失argF和NCg11221基因并且在染色体中用argCJBD基因簇启动子代替（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）的谷氨酸棒状杆菌菌株具有出色的鸟氨酸生产能力（表5和6）。
因此，将具有改善的鸟氨酸生产能力的鸟氨酸生产菌株命名为“CC01-0061（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）”，并按照布达佩斯条约于2010年11月24日在中心地址为首尔，西大门区，弘济－1－洞的韩国微生物保藏中心保藏，登记号为KCCM1137P。
在本发明实现上述目的的另一个方面，本发明提供了一种生产鸟氨酸的方法，包括以下步骤(i)培养具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物以获得培养物；和(ii)从培养的微生物或培养物中回收鸟氨酸。
在该方法中，优选但不限于通过本领域已知的分批培养、连续培养和分批补料培养来完成微生物的培养。此外，对于培养条件，可使用碱性化学品（例如：氢氧化钠、氢氧化钾或氨水）或酸性化学品（例如：磷酸或硫酸）pH值维持在5至9的最佳pH值，优选pH值6至8，最优选pH值6.8。此外，可通过在细胞培养基中添加氧气或含氧气体混合物来维持需氧条件。培养温度可维持在20℃至45℃，优选25℃至40℃。此外，优选培养大约10至160小时。按照上述培养条件生产的鸟氨酸可被分泌至培养基中或仍留在细胞内。
此外，培养所用介质可包含糖和碳水化合物（例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素）、油和脂肪（例如：豆油、葵花籽油、花生油和椰子油）、脂肪酸（例如：软脂酸、硬脂酸和亚油酸）、醇类（例如：丙三醇和乙醇）和有机酸（例如：乙酸）单独或组合作为碳源；含氮有机化合物（例如：蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽膏、玉米溶液、大豆粉和尿素）或无机化合物（例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵）单独或组合作为氮源；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐单独或组合作为磷源；其它必需的生长刺激物质包括金属盐（例如：硫酸镁或硫酸亚铁）、氨基酸和维生素。
发明模式
在下文中，本发明通过实施例进行了更为详细的描述。但是，这些实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的。
实施例1：argF-缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株的制备
在该实施例中，根据野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032和谷氨酸过度生产菌株KCCM-10785P制备了一种argF-缺失菌株，谷氨酸过度生产菌株KCCM-10785P是通过在谷氨酸生产菌株KFCC-11074中删除cg2624和cg2115基因而生成的，而KFCC-11074是通过使用例如NTG（韩国专利公开号2008-0034334）的诱变剂以阻断自鸟氨酸至精氨酸的合成途径制成的。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的精氨酸生物合成基因被安排在具有argCJBDFRGH形式的操纵子上，而删除的靶基因argF（序列代码编号17）与染色体上编码鸟氨酸合成途径相关酶的基因相邻。因此，根据位置与删除的靶基因argF相邻的argD和argR的核苷酸序列制备删除基因argF的质粒。
具体来说，根据ATCC13032菌株的argD和argR的核苷酸序列，构建邻近argF的N-末端序列的同源重组片段和邻近argF的C-末端序列的同源重组片段。为此，通过使用引物（序列代码编号1和2）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒）来获得邻近argF的N-末端序列的片段。同样，通过使用引物（序列代码编号3和4）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板在相同PCR条件下通过PCR获得邻近argF的C-末端序列的片段（表1）。
表1
制备argF缺失菌株（ΔargF）的引物
使用BamHI和SalI对以上制备的邻近argF的N-末端序列的同源重组片段进行消化，并且使用SalI和XbaI对邻近argF的C-末端序列的同源重组片段进行消化。然后将每个断开的片段插入至也用BamHI和XbaI消化的pDZ载体，从而生成质粒pDZ-argF（K/O）。
将以上制备的质粒pDZ-argF（K/O）转化至ATCC13032菌株和KCCM-10785P菌株。然后，在含有卡那霉素（25μg/ml）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚啉-β-D-半乳糖苷）的BHIS平板（37g/l的Braine心脏浸出液，91g/l的山梨醇，2%的琼脂）上进行转化菌株的铺板和培养，使菌落在平板上生长。在平板上形成的菌落之中，收集蓝色的菌落以选择被插入了质粒pDZ-argF（K/O）的菌株。
以上选择的菌株于30℃在CM培养基（10g/l的葡萄糖，10g/l的多价蛋白胨，5g/l的酵母提取物，5g/l的牛肉浸膏，2.5g/l的NaCl，2g/l的尿素，pH值6.8）中振摇培养8小时。然后，将每个细胞培养物自10-4连续稀释至10-10。然后在含有X-gal的固体培养基上铺板并培养稀释的样品，使菌落生长。在平板上形成的菌落之中，仅收集以相对较低频率出现的白色菌落，以选择argF缺失菌株。
通过使用上述选择菌株的染色体DNA作为模板以及序列代码编号1和4的引物一起进行PCR来验证质粒pDZ-argF（K/O）成功插入至上述选择的菌株之中。通过PCR确认后，可以证明上述选择的菌株是argF缺失菌株（即ATCC13032ΔargF和KCCM-10785PΔargF）。
实施例2：制备argF-和NCg11221-缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株
在实施例1中获得的ATCC13032ΔargF菌株和KCCM-10785PΔargF菌株中还进一步被删除了编码谷氨酸运出相关蛋白质的NCg11221基因，以增加鸟氨酸前体谷氨酸的细胞内的水平。
具体来说，根据ATCC13032菌株的NCg11221的核苷酸序列（序列代码编号19），构建一个邻近NCg11221的N-末端序列的同源重组片段和一个邻近NCg11221的C-末端序列的同源重组片段。为此，通过使用引物（序列代码编号5和6）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR来获得邻近NCg11221的N-末端附近序列的片段，并且通过使用引物（序列代码编号7和8）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR以获得邻近NCg11221的C-末端序列的片段（表2），PCR条件与实施例1相同。
表2
制备NCg11221缺失菌株的引物
使用BamHI和SalI对以上制备的邻近NCg11221的N-末端序列的同源重组片段进行消化。同样，使用SalI和XbaI对邻近NCg11221的C-末端序列的同源重组片段进行消化。然后将每个断开的片段插入至用BamHI和XbaI消化的pDZ载体，从而生成质粒pDZ-NCg11221（K/O）。
将以上制备的质粒pDZ-NCg11221（K/O）转化至ATCC13032ΔargF菌株和KCCM-10785PΔargF菌株。然后，在含有卡那霉素（25μg/ml）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚啉-β-D-半乳糖苷）的BHIS平板（37g/l的Braine心脏浸出液，91g/l的山梨醇，2%的琼脂）上进行转化菌株的铺板和培养，使菌落在平板上生长。在平板上形成的菌落之中，收集蓝色的菌落以选择插入了质粒pDZ-NCg11221（K/O）的菌株。
以上选择的菌株于30℃在CM培养基中振摇培养8小时。然后，将每个细胞培养物自10-4连续稀释至10-10。然后在含有X-gal的固体培养基上铺板并培养稀释的样品，使菌落生长。在平板上形成的菌落之中，仅收集以相对较低频率出现的白色菌落，以选择NCg11221缺失菌株。
通过使用上述选择菌株的染色体DNA作为模板以及序列代码编号5和8的引物一起进行PCR来验证质粒pDZ-NCg11221（K/O）成功插入至上述选择的菌株之中。选择的NCg11221缺失菌株相应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221或KCCM-10785PΔargFΔNCg11221。
实施例3：引入argCJBD的谷氨酸棒状杆菌菌株的制备
实施例3-1：argCJBD基因的克隆和转化株的制备
在该实施例中，制备一个插入了argC、argJ、argB和argD基因（序列代码编号分别为22、24、26和28）的载体，并且通过引入相同基因来制备转化株，从而通过增加argCJBD操纵子（序列代码编号21，包含启动子区域）的拷贝数来增强鸟氨酸合成途径，其中argCJBD操纵子编码了自谷氨酸至鸟氨酸的合成途径中的相关酶。
首先，使用ATCC13032菌株的染色体作为模板和引物（序列代码编号9和10，表3）一起进行PCR以获得argCJBD基因（30个循环，95℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸150秒），从而获得大小为4900bp的基因片段。
表3
获得ATCC13032的argCJBD基因片段的引物
在0.8%的琼脂糖凝胶上进行以上制备的基因片段的凝胶电泳，并且切出目标大小的条带并分离上面的DNA样品。使用KpnI和XbaI对分离的DNA进行消化以获得片段，然后将断裂的片段克隆至pHC139T-gfp载体（韩国专利公开号2008-0074286），从而生成表达载体pHC139T-argCJBD(Cgl)。
然后，通过电穿孔法将制备用于增加细胞中鸟氨酸生产水平的表达载体pHC139T-argCJBD(Cgl)引入ATCC13032ΔargFΔNCg11221菌株和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221菌株。然后，将转化的细胞在含有25μg/ml的卡那霉素的BHIS平板上进行铺板，选择得到成功的转化株。最后，将每个选择的转化株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)。
实施例3-2：取代染色体中argCJBD基因的启动子
在该实施例中，使用本申请人新近开发的CJ7启动子代替染色体中argCJBD的启动子，目的是通过除去argCJBD基因的调控而增加表达水平，其中argCJBD基因编码自谷氨酸至鸟氨酸的合成途径的相关酶。
首先，制备一个包含CJ7启动子和该启动子两个末端位点的核苷酸序列的同源重组片段。
具体来说，通过使用ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板和引物（序列代码编号11和12）一起进行PCR（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒）来获得CJ7启动子的5’-末端位点的核苷酸序列。同样，通过使用引物（序列代码编号13和14）在相同PCR条件下获得CJ7启动子区域的核苷酸序列，并且通过使用ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板和引物（序列代码编号15和16）在相同PCR条件下进行PCR获得CJ7启动子的3’-末端位点的核苷酸序列。
表4
取代argCJBD基因启动子的引物
使用BamHI和EcoRI对以上制备的启动子5’-末端位点片段（argC-L）进行消化，使用EcoRI和XbaI对CJ7启动子区域片段进行消化，并使用XbaI和SalI对启动子3’-末端位点片段（argC-R）进行消化。然后将每个断开的PCR产物克隆至也用BamHI和SalI消化的pDZ载体，从而生成表达载体pDZ-CJ7(arg)，其中argCJBD的启动子被CJ7启动子代替。
通过电穿孔法将以上制备的表达载体pDZ-CJ7(arg)转化至ATCC13032ΔargFΔNCg11221菌株和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221菌株和KCCM-10785PΔargF菌株。然后，在CM培养基中振摇培养（30℃，8小时）转化株，并将细胞培养物自10-4连续稀释至10-10。然后，将稀释的样品置于含有25μg/ml的卡那霉素和X-gal的BHIS平板上并进行培养，使菌落生长。
在大部分蓝色菌落中分离出低频率出现的白色菌落，从而仅选择通过双交换CJ7启动子成功代替arg启动子的菌株。通过进行PCR验证了染色体中的argCJBD启动子成功被引入的表达载体pDZ-CJ7(arg)取代，其中PCR使用以上选择的菌株的基因组DNA作为模板和引物（序列代码编号13和16）一起来进行（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒）。最后，将确认的菌株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD。
实施例4：通过删除argF和NCg11221基因提高鸟氨酸的生产能力和增加argCJBD表达 水平
实施例4-1：ATCC13032谷氨酸棒状杆菌来源菌株的鸟氨酸生产能力
为了检查鸟氨酸生产能力是否受到argF和NCg11221基因缺失以及ATCC13032谷氨酸棒状杆菌来源菌株的argCJBD表达水平增加的影响，对实施例2和实施例3中制备的菌株之间的鸟氨酸生产能力进行比较。
具体来说，将实施例2和实施例3中制备的每个菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221、ATCC13032ΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)、ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）铺在含有1mM的精氨酸的CMA平板上，在37℃培养24小时。每个培养的菌株被接种于25ml的滴定培养基（2%（w/v）的葡萄糖，1%（w/v）的多价蛋白胨，0.5%（w/v）的酵母提取物，0.5%（w/v）的(NH4)2SO4,0.15%（w/v）的尿素，0.4%（w/v）的KH2PO4，0.8%（w/v）的K2HPO4，0.05%（w/v）的MgSO4,100μg/l的生物素和1mg/l的硫胺素），然后在30℃下以200rpm振摇培养48小时，并测定每个培养物中生成的鸟氨酸浓度并相互比较（表5）。此时，使用没有进行基因组修饰的ATCC13032菌株作为对照组。
表5
ATCC13032来源菌株的鸟氨酸生产能力的比较
如图表5所示，argF和NCg11221缺失菌株生成了6.0g/l的鸟氨酸，野生型菌株未生成鸟氨酸。至于argCJBD基因表达水平的增加，当argCJBD基因被引入至载体时，生成的鸟氨酸的浓度是6.4g/l，并且当染色体上的argCJBD启动子被CJ7代替时，生成的鸟氨酸的浓度轻微增加至7.7g/l。
实施例4-2：生产谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌KCCM-10785P来源菌株的鸟氨酸生产能力
为了检查鸟氨酸生产能力是否受到argF和NCg11221基因缺失以及谷氨酸棒状杆菌KCCM-10785P谷氨酸（鸟氨酸前体）过度生产菌株的argCJBD表达水平增加的影响，对实施例2和实施例3中制备的菌株的鸟氨酸生产能力进行比较。
具体来说，使用与实施例4-1相同的方式对实施例2和实施例3中制备的每个菌株（KCCM-10785PΔargFΔNCg11221、KCCM-10785PΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)、KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）进行接种，然后在30℃下以200rpm振摇培养48小时，测定每个培养物中生成的鸟氨酸浓度并相互比较（表6）。此时，使用没有进行基因组修饰的KCCM-10785P菌株作为对照组。
表6
KCCM-10785P来源菌株中鸟氨酸生产能力的比较
如表6所示，argF和NCg11221缺失的谷氨酸过度生产菌株显示了7.6g/l的鸟氨酸生产，野生型菌株未生成鸟氨酸。至于argCJBD基因表达水平的增加，当argCJBD基因被引入载体时，生成的鸟氨酸的浓度是7.9g/l，并且当染色体上的argCJBD启动子被CJ7代替时，生成的鸟氨酸的浓度轻微增加至9.0g/l。
因此，可以看出可通过增加argCJBD基因表达水平来增强鸟氨酸的合成途径从而提高鸟氨酸的生产。
因此，本发明人将实施例3-2中制备的具有最出色的鸟氨酸生产能力的菌株命名为“CC01-0061（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）”，并于2010年11月24日将其按照布达佩斯条约保藏在地址为韩国，首尔，西大门区，弘济－1－洞的韩国微生物保藏中心，登记号为KCCM11137P。
对本领域技术人员来说，很明显可在不偏离本发明的范围和精神下进行多种变化和改变。因此，应当理解以上实施例在所有方面仅作说明用而没有进行限定。所以所有在权利要求的边界和范围之内的改变和变化，或等同于其边界和范围的改变和变化均预计被包含在本权利要求中。
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
致：CJ第一制糖株式会社由本页下方签章的国际保藏管理机构
韩国，首尔，根据条约7.1的规定颁发的保藏证明
中区，南大门路5街500号
1．根据第6.4(d)条的要求，该日期是取得国际保存单位资格的保藏机构获得该微生物的日期；如果在布达佩斯条约以外的取得国际保存单位资格的保藏机构所作的保藏被转移到根据布达佩斯条约的保藏机构，该日期是该国际保藏机构收到该微生物的日期。

Claims (9)

1.一种具有改善的鸟氨酸生产能力的微生物，其中鸟氨酸氨甲酰基转移酶ArgF和谷氨酸运出相关蛋白NCg11221的活性与其内源活性相比经修饰被减弱,其中所述的微生物是属于谷氨酸棒状杆菌的微生物。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述的ArgF由序列代码编号18的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述的NCg11221由序列代码编号20的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述的ArgF和NCg11221的活性通过选自以下组的方法被减弱，所述的组包括（1）部分或完全删除编码所述的蛋白质的基因，（2）修饰表达调控序列以抑制所述的基因表达，（3）修饰染色体的核苷酸序列以降低所述的蛋白质活性，和（4）以上的组合。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中乙酰γ谷氨酸磷酸还原酶ArgC、乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶ArgJ、乙酰谷氨酸激酶ArgB和乙酰鸟氨酸氨基转移酶ArgD的活性与其内源活性相比进一步被增强。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD分别由序列代码编号为23、25、27和29的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求5所述的微生物，其中所述的蛋白质的活性可通过选自以下组中的方法来增强，所述的组包括（1）增加编码所述的蛋白质的多核苷酸的拷贝数，（2）修饰表达控制序列以增加所述的多核苷酸的表达，（3）修饰染色体上的所述的多核苷酸序列以增强酶活性，和（4）以上方法的组合。
8.根据权利要求1所述的微生物，其中所述的属于谷氨酸棒状杆菌的微生物是谷氨酸棒状杆菌KCCM11137P。
9.一种生产鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
(i)培养权利要求1所述的微生物，和
(ii)从培养的微生物或培养物中回收鸟氨酸。
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