CN103251576B

CN103251576B - 一种盐酸苯海拉明在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN103251576B
Application number: CN201310175162.4A
Authority: CN
Inventors: 陈绪林; 廖庆姣
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: CN103251576A

Abstract

本发明公开了一种盐酸苯海拉明在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用。选用完全无毒性浓度的盐酸苯海拉明进行抗病毒实验，结果显示这种小分子化合物具有显著的抗病毒活性并呈剂量依赖相关。接下来分析了盐酸苯海拉明抗流感病毒的作用周期，表明盐酸苯海拉明主要抑制病毒吸附和进入等病毒感染早期事件。最后检测盐酸苯海拉明对不同型和亚型流感病毒的抗病毒活性，结果显示盐酸苯海拉明可以抑制所有检测病毒株的复制且具有剂量依赖效应，表明盐酸苯海拉明抗流感病毒活性具有一定的广谱性。本发明的盐酸苯海拉明可以作为新的抗流感病毒药物进行开发，为治疗流感提供了一种新的途径和手段。

Description

一种盐酸苯海拉明在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体涉及一种盐酸苯海拉明在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用。

背景技术

流感病毒（influenza virus）是严重影响人类健康的，可引起流行性感冒的病原体。根据病毒粒子核蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。这三种不同型的病毒的基因组结构、多肽组成、感染性和致病性等方面都存在显著差异。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13．6kb，分别编码10种结构蛋白（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP）和非结构蛋白（NS1）。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，A型流感病毒可进一步分为16个H(H1-H16)和9个N(N1-N9)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型，而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7、和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，且至今未在除人以外的其它动物中发现其存在。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。

流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属。流感病毒是分节段负链RNA病毒，所以病毒RNA不具有感染性，各个RNA节段必须与RNA聚合酶（PB2、PB1和PA）及核蛋白（NP）结合后形成vRNPs才有活性。感染的起始是病毒颗粒表面的HA刺突识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体。唾液酸与次末端半乳糖的连接键，决定了病毒的宿主特异性，该连接键在禽类中为α（2-3），在人类中为α（2-6）。流感病毒HA蛋白分子中，个别氨基酸的替换及不同的糖基化修饰能改变其受体结合的特异性。病毒吸附细胞后，细胞通过网格蛋白受体介导的胞饮作用摄入病毒。在细胞内，网格蛋白分子解离，病毒与内涵体融合形成吞噬体，使得病毒粒子周围的pH值下降至5．0左右。在此pH条件下，病毒HA蛋白的构象发生变化，使位于轻链（HA2）N端的融合肽暴露，从而引起病毒囊膜与细胞膜融合。低pH环境也致使大量H⁺经由M2离子通道进入病毒粒子内部，导致M1蛋白与vRNPs的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的vRNPs释放到被感染细胞的胞浆。与其它RNA病毒不同，流感病毒基因组的复制和转录均发生在宿主细胞的细胞核内。mRNA在核内合成后转移到胞浆，合成病毒的结构蛋白和非结构蛋白。而后开始装配子代病毒，神经氨酸酶可水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解为HA1和HA2多肽，这样的病毒粒子才具有感染性，从而开始新一轮病毒的复制。

流感病毒在人类中已流行传播了300多年，数年即有一次暴发流行，全球性的流感大流行则数十年暴发一次。流感流行每年可导致25万～50万例死亡，300万～500万重病例，全球约共有5～15％的人被感染。对于全球性流感大流行而言，“在流行期间中疫苗和抗病毒药物是降低发病率和死亡率最重要的应对措施”。但是目前全球每年可生产3亿人份三价流感疫苗－这仅够西方国家的流感预防之用，而不能满足全球性流感大流行的需求，而且由于流感病毒的抗原变异能力强，在新病毒株出现之前不可能研制疫苗。通常一个疫苗的大规模研发和制造至少需要六个月时间，即使到那时，由于全球生产能力有限及生产设施集中在发达国家，许多没有生产设施的国家在第1波流行期间将使用不到疫苗。所以当前疫苗能提供的保护率并不高。抗流感病毒药物不仅问世较晚，而且临床上速效、显效的治疗药物也较少，属于抗感染类药物中的小品种。目前，经美国食品和药物管理局(FDA)批准正式上市的抗流感病毒药物有两类：（1）以金刚烷胺和金刚乙胺为代表的M2离子通道阻断剂。此类药只对甲型流感病毒有预防和治疗作用,研究表明药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于广泛使用使得耐药株普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。（2）神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦的耐药株却不断有报道。

盐酸苯海拉明为组胺I类抑制剂，为人工合成的小分子化合物，能消除各种过敏症状，其中枢抑制作用显著，具有镇静、防晕动及止吐作用，也有抗胆碱作用，可缓解支气管平滑肌痉挛。用于各种过敏性皮肤疾病，如荨麻疹、虫咬症；亦用于晕动症，恶心、呕吐。盐酸苯海拉明可以用于治疗鼻炎，目前没有盐酸苯海拉明直接用在抗流感病毒方面的应用。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，是在于提供了一种小分子化合物盐酸苯海拉明在制备治疗或预防流感药物中的应用，从而为临床上流感的治疗提供一种安全高效毒副作用小的小分子化合物。盐酸苯海拉明在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的进入，可进一步开发为治疗流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

盐酸苯海拉明的英文名为diphenhydramine hydrochloride,化学式为N，N-二甲基-2-（二苯基甲氧基）乙胺盐酸盐(N-(2-Diphenylmethoxyethyl)-N,N-dimethylamine hydrochloride)，具有结构式Ⅰ所示的结构式：

结构式Ⅰ

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种盐酸苯海拉明在制备治疗或预防流感病毒（甲型或乙型）药物中的应用，其步骤是：

A.盐酸苯海拉明对MDCK细胞的细胞毒性实验：MDCK细胞按5000细胞/孔（100μl）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，用细胞维持液（DMEM+2%血清）将药物以1mM为起始浓度连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度2个复孔，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时后，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT）法检测细胞的存活率。结果显示盐酸苯海拉明对MDCK细胞的CC50（半数致死浓度）为699.7μM。

B.盐酸苯海拉明抗流感病毒活性的评价：将MDCK细胞按2*10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h待细胞长成单层，然后加100TCID₅₀/孔病毒液感染细胞，同时加入各浓度梯度药物共200μl维持培养液（DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶）于37℃细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。结果显示：盐酸苯海拉明明显抑制了流感病毒复制，其EC50为14.67μM。

C.盐酸苯海拉明抗流感病毒作用周期分析：细胞按5*10⁴接种于24孔细胞培养板中，待细胞贴壁为单层后，分别在病毒感染-2～0h，0～2h，2～4h，4～6h给以相同浓度药物培养，在感染后6h固定细胞，通过间接免疫荧光检测病毒NP蛋白表达。结果显示：盐酸苯海拉明在0～2h内给药能抑制病毒感染，主要抑制病毒吸附和进入。

D.盐酸苯海拉明抗流感病毒活性广谱性分析：将MDCK细胞按2*10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h待细胞长成单层，然后加100TCID₅₀/孔病毒液（A/human/Hubei/1/2009（H1N1），A/human/Hubei/3/2005（H3N2），InfluenzaB virus）感染细胞，同时加入各浓度梯度药物共200μl维持培养液（DMEM+0.3%BSA+2．5ug/L胰酶）于37℃细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清

进行神经氨酸酶活性检测。结果显示：盐酸苯海拉明可以明显抑制甲型流感病毒亚型H1N1株、甲型流感病毒H3N2株和乙型流感病毒株的复制，且具有剂量依赖效应。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1．盐酸苯海拉明是小分子化合物，其CC50是699.7μM。盐酸苯海拉明剂量依赖地抑制流感病毒复制，其EC50是14.67μM，治疗指数约为48。这说明盐酸苯海拉明是低毒高效的抗流感病毒的药物。

2．盐酸苯海拉明作用于流感病毒复制早期，主要抑制病毒吸附和进入等早期事件。

3．盐酸苯海拉明能抑制甲型流感病毒亚型H1N1株、甲型流感病毒H3N2株和乙型流感病毒株的复制，具有广谱的抗病毒活性。

4．利用现代常用药物制剂手段，可将盐酸苯海拉明可以作成活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

附图说明

图1为一种盐酸苯海拉明化学结构式。

图2为一种盐酸苯海拉明的细胞毒性检测示意图。

图3为一种盐酸苯海拉明处理流感病毒感染细胞的培养液上清中的神经氨酸酶活示意图。

图4为一种检测盐酸苯海拉明对病毒单轮复制周期不同阶段的影响结果示意图。

图5为一种检测盐酸苯海拉明抗流感病毒活性广谱性检测示意图。

图5A图为甲型流感病毒亚型H1N1株（A/human/Hubei/1/2009（H1N1）；

图5B图为甲型流感病毒H3N2株（A/human/Hubei/3/2005（H3N2）；

图5C图为乙型流感病毒株（Influenza B virus）。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

目前，抗流感病毒药物体外筛选模型分为细胞培养模型和病毒酶的无细胞系统筛选模型。酶反应筛选模型具有高通量的特点，但筛选的化合物仍需进行更多的细胞学、组织学和体内毒性、药效实验等以确定其效果。细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于：可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。本发明采用细胞培养筛选法检测盐酸苯海拉明对流感病毒感染MDCK细胞，检测病毒上清中病毒粒子的含量，定量分析盐酸苯海拉明抗流感病毒活性。

实施例1：盐酸苯海拉明抗流感病毒活性的评价

1．实验材料与方法

1．1细胞、病毒和药物

MDCK细胞购自ATCC，病毒A/PR8/34H1N1由鸡胚培养扩增得到，盐酸苯海拉明购于Sigma公司；

1．2实验仪器

多功能检测仪PerkinElmer，倒置显微镜Costar

2．实验方法：

2．1细胞培养：

37℃，5%（体积比，以下相同）CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10％（体积比，以下相同）FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3–1/4。

2．2病毒培养：

取9～11日龄SPF鸡胚，接种病毒前用验蛋器检查，并在远离胚胎的位置标记，消毒并打孔后按0.2ml/枚接种2⁴血凝效价的病毒液，用指甲油封口，置37℃恒温箱孵育48h（接种24h后死亡的鸡胚一般为操作不当致死，弃之）。取出鸡胚置4℃冷胚12h。75%酒精消毒鸡胚气室，无菌操作剪去气室外壳，毛细吸管吸取鸡胚尿囊液和羊水，3000rpm4℃离心30min，检测血凝效价，200μl/管分装并置-70℃冻存备用。

（一）药物细胞毒性检测：

1．MDCK细胞按5000细胞/孔（100μl）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；

2．用细胞维持液（DMEM+2%血清）将药物以1mM为起始浓度连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度2个复孔。培养48h后于每孔中加入5mg/ml MTT20μl，置细胞培养箱中继续培养；

3．培养4h后，弃培养液上清，每孔加入100μl/孔三联溶解液（溶解液由SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl0.1ml，用双蒸水溶解配成100ml），37℃培养箱中溶解4h以上或过夜后酶联检测仪检测570nm波长处吸光值，校正波长为630nm，并计算各药物浓度细胞存活率，结果见图2。

结果显示：盐酸苯海拉明在浓度<250μM范围内对MDCK细胞没有明显细胞毒性，说明盐酸苯海拉明有比较安全的适用范围。

（二）盐酸苯海拉明抗A/PR8/34 H1N1病毒株的活性检测：

A．基于神经氨酸酶活性检测盐酸苯海拉明抗流感病毒作用：

1．实验原理：MUNANA（4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate）是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的变化，可以灵敏反应神经氨酸酶活性，从而可反应细胞上清中病毒数量。

2．将MDCK细胞按2*10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，加100TCID50/孔病毒液感染细胞，同时加入各浓度梯度（以200μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释7个梯度，每梯度2个复孔）药物共200μl维持培养液（DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶）于37℃细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。

3．黑色96孔微量板中加入40μl缓冲液（32．5mmol/L MES，pH 6.5，4mmol/L CaCl₂）配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20μl，37℃避光孵育30min，加入反应终止液（0.014μM NaOH， 83%乙醇）100μl/孔，多功能检测仪上测定荧光值（激发光波长355nm，发射光波长465nm）。

4．计算各检测孔中NA被抑制率。抑制率（%）=100-（样品孔-空白对照）/（酶活对照-空白对照）*100%。

结果显示：盐酸苯海拉明明显抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系（见图3）

不同浓度盐酸苯海拉明对流感病毒复制抑制率如下所示：

浓度(μM)	抑制率(%)
		200	98.53±1.46
100	101.93±2.99
		50	81.65±5.77
25	62.45±10.47
		12.5	43.54±15.19
6.25	27.25±8.81
		3.125	14.41±8.56

实施例2：盐酸苯海拉明对病毒复制周期不同阶段的抑制作用

1．细胞按5*10⁴接种于24孔细胞培养板中，待细胞贴壁为单层后备用。流感病毒生活周期约6h，所以我们分别在病毒感染-2～0h，0～2h，2～4h，4～6h给以50μM的药物培养，在感染后6h固定细胞，按照下列步骤进行间接免疫荧光检测药物处理后病毒蛋白的表达水平。

2．弃培养液上清，用固定液将细胞在室温固定15-20min；用PBS洗3次，每次5min；用封闭液室温封闭1h；弃封闭液，加入结合液稀释的一抗（鼠源NP单抗）室温孵育1h；用PBS洗3次，每次5min；加入结合液稀释的荧光标记的二抗和DAPI染液室温孵育1h；用PBS洗3次，每次5min；于倒置荧光显微镜下观察。

实验所用溶液：固定液：4%（质量体积比）多聚甲醛溶于PBS(pH7.4)；结合液：3%（质量体积比）BSA，0.3%（质量体积比）TritonX-100溶于PBS(pH7.4)；封闭液：含10%FCS的结合液。

结果显示：盐酸苯海拉明在0～2h内给药能抑制病毒感染，推测主要抑制病毒吸附和进入等病毒感染早期事件（见图4）。

实施例3：盐酸苯海拉明抗流感病毒活性广谱性研究

本实验检测盐酸苯海拉明对甲型流感病毒亚型H1N1株、甲型流感病毒H3N2株和乙型流感病毒株的抗病毒活性。

1．实验使用病毒株包括：A/human/Hubei/1/2009（H1N1），A/human/Hubei/3/2005（H3N2），Influenza B virus

2．将MDCK细胞按2*10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，加100TCID50/孔病毒液感染细胞，同时加入各浓度梯度药物（以200μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度2个复孔）共200μl维持培养液（DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶）于37℃细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。

3．黑色96孔微量板中加入40μl缓冲液（32.5mmol/L MES，pH6.5，4mmol/L CaCl₂）配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20μl，37℃避光孵育30min，加入反应终止液（0.014μM NaOH，83%乙醇）100μl/孔，多功能检测仪上测定荧光值（激发光波长355nm，发射光波长465nm）。

4．计算各检测孔中NA被抑制率。抑制率（%）=100-（样品孔-空白对照/（酶活对照-空白对照）*100%

结果显示：盐酸苯海拉明明显抑制了其它流感病毒株复制，并且呈剂量依赖关系（见图5）。

不同浓度盐酸苯海拉明对流其它感病毒株复制抑制率如下所示：

Claims

1.盐酸苯海拉明作为唯一有效成分在制备抑制流感病毒复制的药物中的应用；所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。