CN103233028B - 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列 - Google Patents
一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构DNA序列，属于基因工程领域。该方法的步骤为：（1）CRISPR/Cas9和嵌合RNA的设计与构建；（2）Cas9mRNA体内翻译后形成Cas9核酸酶与嵌合RNA结合，实现定点剪切，剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因。该方法步骤简单，识别位点灵活且消耗低。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构DNA序列。
背景技术
基因打靶（gene targeting）技术是一种定向改变生物体遗传信息的实验方法。近年来随着生物技术的发展，锌指核酸酶（ZFN）技术和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术被应用于基因打靶中，这两项技术大大提高了定向修饰的特异性。ZFN是由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3～4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶是来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6～8bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到DNA定点剪切的目的。剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“同源定向修复”或“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因。
锌指核酸酶技术突破了基因打靶限制性的因素-打靶效率，将基因打靶的效率由原来的10-6～10-7提高至10-1～10-2。但是锌指核酸酶在进行基因修饰过程中会产生脱靶现象（off-target），引起细胞剂量依赖性毒性。Gupta等通过不同的锌指核酸酶对斑马鱼kdrl基因座进行靶向修饰研究，利用Illumina测序评估了斑马鱼中141处潜在的脱靶位点，发现只有少数的脱靶位点导致细胞累积损伤。为此尚需对锌指核酸酶-基因打靶技术进行深入研究。
TALEN技术是利用植物病原菌黄单胞菌（Xanthomonas）自然分泌的蛋白---即激活因子样效应物（TAL effectors,TALEs）能够识别特异性DNA碱基对的功能，设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，再在TALEs后附加一个非特异性核酸内切酶FokI，构建出TALEN，从而实现了在特定位点切断DNA双链，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程，在细胞基因组中引入新的遗传物质。相对锌指核酸酶技术而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。
但是到目前为止，无论是ZFN还是TALEN，对其识别序列都有很多要求，无法实现靶向每一种可能的DNA序列，而且不容易进行两个或更多位点的同期打靶，并且组装ZFN或TALEN蛋白也是一个耗时、耗力且花费很高的过程，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的ZFNs或TALENs。
发明内容
1.发明要解决的技术问题
针对现有技术中通过ZFNs或TALENs实现特异性基因组改造存在的局限性大、耗时耗力且成本高的问题，本发明提供了一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构DNA序列，该方法步骤简单、识别位点灵活且消耗低。
2.技术方案
发明原理：利用原核生物的规律成簇间隔短回文重复（CRISPR/Cas）系统的定向识别和剪切功能，本发明的方法通过增加这一系统在真核生物中的核定位，实现对真核生物中靶向DNA的特定位点的剪切，在剪切后的修复过程中会引入靶向DNA序列的突变，从而实现基因打靶的目的。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法，其步骤为：
（1）CRISPR/Cas9和嵌合RNA的设计与构建
1）优化编码Cas9的密码子
2）Cas9核酸酶载体构建和Cas9核酸酶mRNA合成
根据步骤1）优化后的序列，定制合成编码Cas9核酸酶的DNA序列，并将其分别插入到如下表达载体中形成：pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9；
利用Cas9C-NLS Cla For和Cas9C-NLS Apa Rev两个引物，通过链式聚合酶反应（PCR）扩增一个DNA片段，使用ClaI和ApaI两个限制性内切酶消化扩增的DNA片段和pST1374-NLS-Flag-Cas9，将扩增的DNA片段插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9，构建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS载体；
编码三个细胞核定位信号NLS的序列是利用Cas9-N-3NLS For和Cas9-N-3NLS Rev引物以寡核苷酸为模板PCR扩增出来的，PCR产物经NheI和NotI两个限制性内切酶消化后，再由同样的酶切位点插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9载体中，构建pST1374-3XNLS-Flag-Cas9；
螺旋结构（Helix）DNA序列经定制合成后插入到编码标签蛋白Flag的序列和编码Cas9核酸酶序列中间，形成pST1374-NLS-Flag-Helix-Cas9载体；
Cas9系统来源于原核细胞，在真核细胞中难于向细胞核转移，因而无法保证这一系统在真核细胞中实现其剪切功能。本发明通过在细胞核核定位信号序列和Cas9编码序列间添加螺旋结构DNA序列增加Cas9在真核生物细胞核内的表达，解决了这一问题，见图2。在这个过程中使用了人类293T。
Cas9核酸酶系列载体经AgeI线性化后，利用T7Ultra Kit体外转录后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶；由于mRNA的不稳定性，不会长期存在生物体内，不会对环境产生进一步影响，因而没有生物安全性问题。
3）嵌合RNA的合成
嵌合RNA模板上的T7启动子序列，是以合成的寡核苷酸为模板通过PCR产生，利用T7Shortscript Kit体外转录出嵌合RNA，它包含crRNA以及tracrRNA结构，可以定向结合靶向DNA上的位点；
（2）Cas9mRNA体内翻译后形成Cas9核酸酶与嵌合RNA结合，实现定点剪切，剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因。
一种螺旋结构DNA序列，该螺旋结构DNA序列在核定位信号指导下增强蛋白的核转移能力以及与核酸结合的能力，其基因序列为：
ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
（1）准确性更高。采用本发明的方法，只要RNA靶向序列和基因组序列之间存在任何碱基对的差异，Cas9都不会结合，因而无法实现对DNA的剪切；
（2）基因组多位点打靶。采用本发明的方法，可以同时对靶基因上的多个位点实行剪切，实现基因组改造的目的；
（3）使用更方便，费用更低。无论是ZFN还是TALEN都需要针对不同靶点改变核酸酶前面的识别序列，这些识别序列的合成或组装耗时耗力且费用很高。本发明的方法中，CRISPR/Cas系统只需改变很短的RNA序列就可以实现不同位点的特异性识别。在动物基因工程模型的建立中，如果使用ZFN或TALEN技术，还要将ZFN或TALEN质粒转录为mRNA，这又增加了费用和实验的难度，采用CRISPR/Cas系统只需转录一次Cas核酸酶就可完成多次实验，极大地降低了成本；
（4）无生物安全性问题。本发明采取mRNA和RNA做为基因打靶原材料，没有任何筛选用抗性基因，因而不存在生物安全性问题；
（5）采用本发明的方法，无物种限制。
附图说明
图1为Cas9与嵌合RNA结合实现定点剪切导致DNA双链断裂过程示意图；
图2为Cas9核酸酶各载体的共聚焦显微镜拍摄荧光照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。
实施例1
本实施例的一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法，其步骤为：
（1）CRISPR/Cas9和嵌合RNA的设计与构建
1）优化编码Cas9的密码子
Cas9属于第二类CRISPR/Cas系统，来源于原核细胞，为了使其能更好地在真核细胞内表达，首先对Cas9编码序列经过优化，在不改变氨基酸的前提下，使用真核细胞内编码氨基酸的密码子；
2）Cas9核酸酶载体构建和Cas9核酸酶mRNA合成
根据步骤1）优化后的序列，定制合成编码Cas9核酸酶的DNA序列，并将其分别插入到如下表达载体中形成：pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9（这个载体上除含有载体pST1374-Cas9所有序列外，还有一个编码细胞核定位信号的序列NLS和一个编码标签蛋白Flag的序列）；
利用Cas9C-NLS Cla For和Cas9C-NLS Apa Rev两个引物（引物序列见表1），通过链式聚合酶反应（PCR）扩增一个DNA片段，使用ClaI和ApaI两个限制性内切酶消化扩增的DNA片段和pST1374-NLS-Flag-Cas9，将扩增的DNA片段插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9，构建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS载体，该载体上除含有载体pST1374-Cas9所有序列外，还有前后两个编码细胞核定位信号的序列NLS和一个编码标签蛋白Flag的序列；
编码三个细胞核定位信号NLS的序列是利用Cas9-N-3NLS For和Cas9-N-3NLS Rev引物（引物序列见表1）以寡核苷酸为模板（模板序列见表1）PCR扩增出来的，PCR产物经NheI和NotI两个限制性内切酶消化后，再由同样的酶切位点插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9载体中，构建pST1374-3XNLS-Flag-Cas9，该载体上除含有载体pST1374-Cas9所有序列外，还有三个编码细胞核定位信号的序列NLS和一个编码标签蛋白Flag的序列；
螺旋结构（Helix）DNA序列（见表2）经定制合成后插入到编码标签蛋白Flag的序列和编码Cas9核酸酶序列中间，形成pST1374-NLS-Flag-Helix-Cas9载体，该载体上除含有载体pST1374-Cas9所有序列外，还有一个编码细胞核定位信号的序列NLS，一个编码标签蛋白Flag的序列和一个螺旋结构DNA序列；
Cas9系统来源于原核细胞，在真核细胞中难于向细胞核转移，因而无法保证这一系统在真核细胞中实现其剪切功能。本发明通过在细胞核核定位信号序列和Cas9编码序列间添加螺旋结构DNA序列增加Cas9在真核生物细胞核内的表达，解决了这一问题，见图2。在这个过程中使用了人类293T。
本实施例还构建了一系列含有Cas9的表达载体，将这些载体转染到细胞内后通过免疫染色反应就可以展示Cas9在细胞内的定位情况。细胞转染前，要将细胞培育在多聚赖氨酸包被的盖片上，利用Lipofectamine2000转染试剂将Cas9系列质粒DNA转染入293T细胞中。在免疫染色实验中，用4%的多聚甲醛在室温下将细胞固定15分钟，用缓冲液PBS洗两次，再用PBS加0.2%的Triton X-100浸泡5分钟，再用PBS洗两次。之后用正常的山羊血清室温下封闭1小时，再将抗标签蛋白FLAG的抗体加入封闭液中，室温孵育2小时。用PBS清洗后，再用溶解于PBS中的cy3结合的山羊抗小鼠的二抗和Hoechst室温孵育细胞1小时，用PBS清洗后，将细胞用Vectashield培育液封闭，然后用Olympus Flueview1000共聚焦显微镜拍摄荧光照片（见图2）。只有在细胞核核定位信号序列和Cas9编码序列间添加螺旋结构DNA序列才能使Cas9在真核生物细胞核内得以表达，进一步保障了其在基因打靶中行使剪切功能。
Cas9核酸酶系列载体经AgeI线性化后，利用T7Ultra Kit体外转录后得到Cas9核酸酶mRNA，可直接用于基因打靶；由于mRNA的不稳定性，不会长期存在生物体内，不会对环境产生进一步影响，因而没有生物安全性问题。
3）嵌合RNA的合成
嵌合RNA模板上有段T7启动子序列，这是以合成的寡核苷酸为模板通过PCR产生的（模板序列见表1），利用T7Shortscript Kit体外转录出嵌合RNA，它包含crRNA以及tracrRNA结构，可以定向结合靶向DNA上的位点；
（2）Cas9mRNA体内翻译后形成Cas9核酸酶与嵌合RNA结合，实现定点剪切，剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因；见图1。
表1
斜体，结合序列；黑体，T7启动子。
表2
Claims (2)
1.一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法，其步骤为：
(1)CRISPR/Cas9和crRNA及tracrRNA组成的嵌合RNA的设计与构建
1)优化编码Cas9的密码子
2)Cas9核酸酶载体构建和Cas9核酸酶mRNA合成
根据步骤1)优化后的序列，定制合成编码Cas9核酸酶的DNA序列，并将其分别插入到表达载体中形成：pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9；
螺旋结构DNA序列经定制合成后插入到编码标签蛋白Flag的序列和编码Cas9核酸酶序列中间，形成pST1374-NLS-Flag-Helix-Cas9载体；
Cas9核酸酶载体经AgeI线性化后，利用T7Ultra Kit体外转录后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶；
3)crRNA及tracrRNA组成的嵌合RNA的合成
crRNA及tracrRNA组成的嵌合RNA模板上的T7启动子序列，是以合成的寡核苷酸为模板通过链式聚合酶反应产生，利用T7Shortscript Kit体外转录出crRNA及tracrRNA组成的嵌合RNA；
(2)Cas9mRNA体内翻译后形成Cas9核酸酶与crRNA及tracrRNA组成的嵌合RNA结合，实现定点剪切，剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因；
其中，该螺旋结构DNA序列在核定位信号指导下增强蛋白的核转移能力以及与核酸结合的能力，其基因序列为：
ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。
2.一种螺旋结构DNA序列，其特征在于，该螺旋结构DNA序列在核定位信号指导下增强蛋白的核转移能力以及与核酸结合的能力，其基因序列为：
ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。
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| US9567603B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-14 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided FokI nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103233028A (zh) | 2013-08-07 |
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