CN103237894A

CN103237894A - 包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)活性的序列的组合物和方法

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Publication number: CN103237894A
Application number: CN2011800491807A
Authority: CN
Inventors: 亨里克·艾伯特; 艾瑞卡·R·波姆德兹; 琳达·A·卡索耳; 董玉霞; 马修·J·赫克特; 侯晶彤; 侯正林; 吕健; 丹尼尔·L·西赫尔; 陶余敏
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-08-07
Also published as: WO2012021794A1; US20120042413A1; AU2011289274A1; US8993837B2; US20150275190A1; AU2015202867A1; CA2805941A1; AU2011289283A1; WO2012021785A1; CA2805803A1; US20160017351A1; BR112013003135A2; AU2011289283B2; WO2012021797A1; BR112013003221A2; CA2805937A1; US9139842B2; AU2011289286B2; US20120042414A1; AU2011289274B2

Abstract

提供了包含多核苷酸和多肽的组合物和方法，所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对HPPD抑制剂的不敏感性。还提供了具有HPPD序列的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷类。提供了利用HPPD序列的不同方法。所述方法包括，例如，产生对HPPD抑制剂耐受的植物、植物细胞、外植体或种子的方法，以及利用本文公开的植物和/或种子来控制具有农作物的田地中的杂草的方法。还提供了鉴定其他HPPD变体的方法。还提供了允许不同HPPD多肽及其变体和片段在叶绿体中表达或被转运至叶绿体的不同方法和组合物。

Description

包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性的序列的组合物和方法

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及通过表达能赋予对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂(HPPD)的耐受性的序列所提供的除草剂耐受性。

通过EFS-WEB以文本文件提交的序列表的引用

根据美国国家信息交换标准(American Standard Code for InformationInterchange(ASCII))，与本说明书同时通过EFS-Web提交了文本文件形式的序列表的正式文本，文件名为408391SEQLIST.txt，创建时期为2011年8月11日，大小为1.58MB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并因此通过引用整体并入本文。

发明背景

在农作物的商业生产中，希望的是能从农作物田地容易且快速地去除不希望的植物(即，“杂草”)。理想的处理是能施加到整体田地中，但仅会去除不希望的植物，同时不会使农作物受到伤害。一种这样的处理系统涉及使用能耐受除草剂的农作物，从而当将除草剂喷洒到耐除草剂的农作物的田地中时，农作物会继续成长，同时会杀死或严重损伤不耐除草剂的杂草。理想情况下，这些处理系统会利用不同的除草剂性质，从而杂草控制能提供灵活性和经济性的最佳可能组合。例如，各种除草剂具有不同的田地中的寿命，并且某些除草剂在施加到田地中后能在相对长的时间中存留并有效，而其他除草剂则快速分解为其他化合物和/或无活性化合物。理想的处理系统能允许使用不同的除草剂，从而种植者能针对具体情况调整除草剂的选择。

通过将编码合适的除草剂代谢酶和/或不敏感除草剂靶标的基因工程化入农作物可以赋予对具体除草剂的农作物耐受性。在某些情况下，这些酶以及编码其的核酸源于植物。在其他情况下，它们来源于其他生物，例如微生物。参见，例如，Padgette et al.(1996)“New weed controlopportunities:Development of soybeans with a Roundup gene”和Vasil(1996)“Phosphinothricin-resistant crops,”两篇文献都记载于Herbicide-Resistant Crops,ed.Duke(CRC Press,Boca Raton,Florida)54-84页和85-91页。事实上，已设计出能表达来自多种生物的多种除草剂耐受性基因的转基因植物。

尽管目前可购到多种耐除草剂的农作物，仍不断需要在农作物生产、杂草控制选择、长期的残余杂草控制以及农作物产量的提高中的每个方面的改进。特别是，由于优势杂草种类以及优选农作物种类的局部性和地域性差异，不断需要能适合于具体地域、地理和/或地区的需求的定制化农作物保护和杂草管理系统。因此，不断需要农作物保护和杂草管理的组合物和方法。

发明概述

提供了包含多核苷酸和多肽的组合物和方法，所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对至少一种HPPD抑制剂的不敏感性。还提供了具有HPPD序列的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷类。

提供了利用HPPD序列的不同方法。所述方法包括产生对HPPD抑制剂耐受的植物、植物细胞、外植体或种子的方法，以及利用本文公开的植物和/或种子来控制具有农作物的田地中的杂草的方法。

还提供了鉴定其他HPPD变体的方法。

还提供了允许不同HPPD多肽及其变体和片段在叶绿体中表达或被转运至叶绿体的不同方法和组合物。所述方法和组合物可用于产生对不同HPPD抑制剂具有耐受性的植物细胞、植物和外植体。

附图简要描述

图1提供了4-羟基苯丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸、再转化为马来酰乙酰乙酸的化学反应。HPPD=4-羟基苯丙酮酸双加氧酶；HGD=尿黑酸双加氧酶。

图2显示了玉米野生型HPPD与改进的变体的接触反应速率，间隔为70-90秒。图2A显示了利用硝磺草酮抑制剂的玉米野生型HPPD表征。图2B显示了具有提高的ON速率比的HPPD变体(D0223944)。

图3显示了玉米野生型HPPD和改进的变体从硝磺草酮解离的时间跨度的对比，这在加速反应速率中能反映出来。图3A代表玉米野生型HPPD的反应。图3B显示了具有提高的OFF速率比的HPPD变体(D0223944)的反应。

图4提供了来自不同单子叶植物的HPPD的氨基酸比对。来自大麦(Hordeum vulgare)的HPPD显示于SEQ ID NO:328。来自燕麦(Avenasativa)的HPPD显示于SEQ ID NO:329。来自稻(Oryza sativa)的HPPD显示于SEQ ID NO:330。来自小麦(Triticum aestivum)的HPPD显示于SEQID NO:331。来自玉米(Zea mays)的HPPD显示于SEQ ID NO:392。下划线部分显示出享有同一性的氨基酸残基并且还显示了共有区。

图5A-5D提供了来自不同双子叶植物的HPPD的氨基酸比对。来自玉米的HPPD显示于SEQ ID NO:1。来自胡萝卜(Daucus carota)的HPPD显示于SEQ ID NO:332。来自彩叶草(Solenosteman sautellarioides)的HPPD显示于SEQ ID NO:333。来自北美云杉(Picea Sitchensis)的HPPD显示于SEQ ID NO:334。来自苘麻(Abutilon theophrasti)的HPPD显示于SEQ ID NO:335。来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HPPD显示于SEQID NO:336。来自芜菁(Brassica rapa)的HPPD显示于SEQ ID NO:337。来自日本黄连(Coptis japonica)的HPPD显示于SEQ ID NO:338。来自葡萄(Vitis vinifera)的HPPD显示于SEQ ID NO:339。来自大豆(Glycine max)的HPPD显示于SEQ ID NO:2。来自蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的HPPD显示于SEQ ID NO:340。灰色底纹部分显示了共有区。

图6提供了HPPD叶绿体转化载体的实例。

图7A-C提供了用叶绿体靶向的或非靶向的DsRed转染的玉米叶组织的荧光显微镜检查。图7A显示了用ZmRCA1-Pro::RCA1CTP-Ds-Red2转染的玉米叶中观察到的荧光(1000×)。图7B显示了用ZmRCA1-Pro::N-term-ZmHPPD-Ds-Red2转染的玉米叶中观察到的荧光(1000×)。图C显示了用非靶向的Ds-Red2转染的玉米叶中观察到的荧光(1000×)。

图8A-D提供的比对显示了来自单子叶植物、双子叶植物、微生物和哺乳动物的HPPD多肽的N末端氨基酸中发现的多样性。SEQ ID NO:341提供了玉米的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:342提供了稻的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:343提供了燕麦的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:344提供了大麦的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:345提供了小麦的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:346提供了丁香假单胞菌(Pseudommonassyringae)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:347提供了嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:348提供了青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:349提供了苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:350提供了橙色绿曲挠菌(chloroflexus aurantiacus)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:351提供了不动杆菌(Acinetobacter)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:352提供Catenulispora acidphila的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:353提供了橙黄小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:354提供了Calinispora tropica的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:355提供了昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilusobscurus)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:356提供了Kibbella flavida的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:357提供了阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:358提供了Ostreococcustauri的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:359提供了胡萝卜的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:360提供了彩叶草的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:361提供了芜菁的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:362提供了日本黄连的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:363提供了大豆的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:364提供了葡萄的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:365提供了蒺藜苜蓿的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:366提供了智人(Homosapiens)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:367提供了褐家鼠(Rattusnorvegicus)的N末端氨基酸序列；SEQ ID NO:368提供了小家鼠(Musmusculus)的N末端氨基酸序列；以及SEQ ID NO:369提供了家牛(BosTaurus)的N末端氨基酸序列。

图9A提供了高粱(Sorghum bicolor)天然HPPD(SEQ ID NO:394)；高粱变体HPPD(SEQ ID NO:393)，图9B提供了大豆天然HPPD(SEQ IDNO:396)和大豆变体HPPD(SEQ ID NO:395)，其中变体序列是基于改进的玉米HPPD序列的独特基序。加粗的下划线序列代表改进的玉米HPPD序列的独特HPPD基序。

图10A-I提供了其他HPPD序列的比对。玉米HPPD序列显示于SEQ ID NO:392；稻HPPD序列显示于SEQ ID NO:330；燕麦HPPD序列显示于SEQ ID NO:329；大麦HPPD序列显示于SEQ ID NO:328；小麦HPPD序列显示于SEQ ID NO:331；不动杆菌HPPD序列显示于SEQID NO:466；丁香假单胞菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:467；嗜肺军团菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:468；青枯雷尔氏菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:469；苏云金芽孢杆菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:470；橙色绿曲挠菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:471；Catenulispora acidphilaHPPD序列显示于SEQ ID NO:472；橙黄小单孢菌HPPD序列显示于SEQID NO:473；Salinispora tropica HPPD序列显示于SEQ ID NO:474；昏暗地嗜皮菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:475；Kribbella flavida HPPD序列显示于SEQ ID NO:476；阿维链霉菌HPPD序列显示于SEQ ID NO:477；Ostreococcus tauri HPPD序列显示于SEQ ID NO:478；胡萝卜HPPD序列显示于SEQ ID NO:479；彩叶草HPPD序列显示于SEQ ID NO:480；芜菁HPPD序列显示于SEQ ID NO:481；日本黄连HPPD序列显示于SEQID NO:482；大豆HPPD序列显示于SEQ ID NO:483；葡萄HPPD序列显示于SEQ ID NO:484；蒺藜苜蓿HPPD序列显示于SEQ ID NO:485；智人HPPD序列显示于SEQ ID NO:486；褐家鼠HPPD序列显示于SEQID NO:487；小家鼠HPPD序列显示于SEQ ID NO:488；以及，家牛HPPD序列显示于SEQ ID NO:489。

图11显示了携带H2B-NSF1盒的T0事件的分数，其显示了2X硝磺草酮喷雾后的每个损伤评分。0指示无可见损伤，而100指示植物死亡。

图12显示了携带单独的HPPD盒(H8891)或相同HPPD盒加NSF1盒(H+N8894)的T0事件，其显示了2X硝磺草酮喷雾后的每个损伤评分。0指示无可见损伤，而100指示植物死亡。

图13显示了携带单独的HPPD盒(H9426)或相同HPPD盒加NSF1盒(H+N9514)的T0事件的分数，其显示了2X硝磺草酮喷雾后的每个损伤评分。0指示无可见损伤，而100指示植物死亡。

图14提供了高粱天然HPPD(SEQ ID NO:394)；高粱变体HPPD(SEQ ID NO:459)；大豆天然HPPD(SEQ ID NO:396)和大豆变体HPPD(SEQ ID NO:458)，其中变体序列是基于改进的玉米HPPD序列的独特基序。加粗的下划线序列代表改进的玉米HPPD序列的独特HPPD基序。

发明详细描述

以下参考幅图更详细地描述本发明，其中显示了本发明的部分、但并非全部的实施方案。事实上，这些发明可以以不同的形式实施，并且不应当被解释为限制本文所述的实施方案；而是应当认为，提供这些实施方案是为了使本文满足适用的法律要求。在本文中，相似的数字指代相似的元件。

在本发明相关领域的技术人员获益于上文描述和相关幅图中提供的教导之后，能够明白本文描述的本发明的很多改变和其他实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，改变和其他实施方案意图包括在后附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语，但是它们仅用于一般性和描述性含义，而不是限制的目的。

I.组合物

A.羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多核苷酸和多肽

羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)将来源于芳香氨基酸生物合成途径的羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。尿黑酸是生育酚和质体醌的前体，是类胡萝卜素生物合成中必需的电子载体。因此，当HPPD受到除草剂抑制剂的抑制时，植物不能保护自身对抗叶绿素的光活化产生的自由基。更具体而言，HPPD多肽的抑制导致植物组织中保护性色素的耗竭，从而导致组织的白化，这使得植物易受到光损伤的攻击。HPPD抑制剂一类重要的除草剂，赋予农作物对HPPD抑制剂的耐受性的转基因会特别有价值，特别是用于控制草甘膦的杂草抗性。

本文所用的“羟基苯丙酮酸双加氧酶”、“HPPD”、“4-羟基苯丙酮酸(或丙酮酸)双加氧酶(4-HPPD)”和“p-羟基苯丙酮酸(或丙酮酸)双加氧酶(p-OHPP)”是同义的，是指非血基铁依赖性加氧酶，其催化4-羟基苯丙酮酸转变为尿黑酸。参见，图1。在降解酪氨酸的生物中，HPPD催化的反应是该途径的第二步骤。在植物中，尿黑酸的形成是合成质体醌(必需的氧化还原辅因子)以及生育酚所必需的。不同HPPD多肽的结构是已知的。参见，例如，图4，其提供了数种单子叶植物HPPD多肽的系统发生多样性，包括来自大麦、燕麦、稻、小麦以及玉米的序列。图5提供了数种双子叶植物HPPD多肽的系统发生多样性，包括胡萝卜、彩叶草、北美云杉、苘麻、拟南芥、芜菁、日本黄连、葡萄、大豆以及蒺藜苜蓿。

提供了利用多核苷酸和多肽的不同方法和组合物，所述多肽具有HPPD活性，并且与合适的对照相比，具有对至少一种HPPD抑制剂的增加的不敏感性。所述HPPD多肽包括以下所示中的任一个：SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、383、384、385、386、387、388、389、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、452、453、454、455、456、457、458或549，以及以上的生物活性变体和片段。还提供了编码这些不同多肽及其活性变体和片段的多核苷酸。

还提供了新类别的HPPD多肽和编码其的多核苷酸。具体而言，提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，包括SEQ ID NO:372、373、374、375、376、377、378、379、380、382、460、461、462和/或463所示的至少一个或多个基序。也可参见实施例16中的表18。在具体实施方案中，提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述序列包含至少一个下述HPPD基序：SEQ ID NO:372、373、374、375、376、377、378、379、380、382、460、461、462、463、467、468-489中任一个或以上的任意组合，其中所述序列还包含或编码与天然HPPD多肽具有至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的HPPD序列，天然HPPD多肽所述包括，例如，来自细菌、植物、真菌、昆虫或哺乳动物的天然HPPD，包括，例如，SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、465、467-489中的任一个。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置414的氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或丙氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括谷氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸，并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸，和/或对应于氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸和对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置209的氨基酸残基包括缬氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸；以及编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸；以及所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396或465中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。

还提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述HPPD多肽包含任何以下氨基酸中的至少1、2、3、4、5或6个：编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，和/或对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、465、3-164、383-389、165-326、397-457中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

在其他实施方案中，提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，以及其中所述HPPD多肽包含任何以下氨基酸中的至少1、2、3、4、5或6个：编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。在其他实施方案中，HPPD多肽还包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、465、3-164、383-389、165-326、397-457中的任一个至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

本文所用的"分离的"或"纯化的"多核苷酸或多肽或其生物活性部分基本上或本质上不含有在其天然存在的环境中存在的、通常伴随其或与其相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽当通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或培养基，或通过化学方式合成时基本上不含有化学前体或其他化学物质。最佳情况下，"分离的"多核苷酸不含有在所述多核苷酸来源于的生物的基因组DNA中天然位于所述多核苷酸侧翼的(即，位于所述多核苷酸的5'和3'端的序列)的序列(最佳是蛋白编码序列)。例如，在各实施方案中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述多核苷酸来源于的细胞的基因组DNA中天然位于所述多核苷酸侧翼的核苷酸序列。基本上不含有细胞物质的多肽包括具有少于约30%、20%、10%、5%或1%(以重量计)杂质蛋白的多肽制备物。当本发明的多肽或其生物活性部分是重组产生时，最佳情况下，培养基提供少于约30%、20%、10%、5%或1%(以重量计)的化学前体或非目的蛋白的化学物质。

当本文所用的多核苷酸或多肽是人工的或工程化的或来自人工的或工程化的蛋白或核酸时，所述多核苷酸或多肽是“重组”的。例如，当多核苷酸被插入载体或任何其他异源位置(例如，重组生物的基因组)，使得其不与自然界中存在的天然位于所述多核苷酸侧翼的核苷酸序列相联时，所述多核苷酸是重组多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的多肽是重组多肽的实例。同样地，自然界中不存在的多核苷酸序列(例如，天然存在的基因的变体)是重组的。

“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于检测主题植物或植物细胞的表型改变的参考点，并且可以是任何合适的植物或植物细胞。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型或天然植物或细胞，即，与作为用于带来主题植物或细胞的遗传改变的起始材料为相同基因型；(b)与起始材料为相同基因型，但用空构建体(即，对目的性状不具有已知影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)主题植物或植物细胞的后代中的未转化的分离体的植物或植物细胞；(d)在遗传学上与主题植物或植物细胞相同、当不暴露于与主题植物或植物细胞相同的处理(例如，除草剂处理)的植物或植物细胞；或(e)在目的基因不表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。

i.羟基苯丙酮酸双加氧酶活性

本文所用的“羟基苯丙酮酸双加氧酶活性”或“HPPD活性”是指4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。本文所用的具有“HPPD活性”的多肽包括HPPD多肽或其活性变体或片段，其保留足够的HPPD活性，使得(i)当在生存能力需要HPPD活性的细胞中以足够的水平表达时，HPPD多肽或活性变体或片段表现出足够的HPPD活性，从而保持表达所述HPPD多肽或活性变体或片段的细胞的生存能力；或(ii)当在生存能力需要HPPD活性的细胞中表达时，所述HPPD多肽或其活性变体或片段与一个或多个其他HPPD多肽的联合表达为细胞带来存活能力。在一个实施方案中，HPPD多肽或其活性变体或片段的HPPD活性为，在缺少HPPD抑制剂的情况下，所述多肽或其活性变体或片段表现出天然HPPD多肽(即，SEQ ID NO:2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394或396中的任一个)所表现出的HPPD活性的至少约5%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高百分比。测定这些动力参数(即，K_m、k_cat、k_cat/K_m)的方法是已知的，并且在本文其他部分讨论。

在其他实施方案中，HPPD多肽或其活性变体或片段具有的活性至少等同于天然HPPD多肽，或具有的活性高于天然HPPD多肽。“等同”HPPD活性是指通过任何酶学动力参数(包括例如，通过K_m、k_cat、k_cat/K_m)测定的，与对照无统计学显著差异的活性水平。增加的HPPD活性包括通过任何酶学动力参数(例如，K_m、k_cat、k_cat/K_m)测定的，任何统计学显著的HPPD活性增加。在具体实施方案中，HPPD活性的增加包括与SEQ ID NO:1所示的玉米野生型HPPD序列或天然HPPD多肽相比，给定动力参数中至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍的提高。测定这些动力参数的方法是已知的。

简言之，HPPD催化4-羟基苯丙酮酸(HPP)向尿黑酸的转化。底物和产物在任何有用的波长下没有光吸收值的差异。然而，尿黑酸双加氧酶(HGD)催化尿黑酸向马来酰乙酰乙酸的转化，马来酰乙酰乙酸在320nm下具有强吸收。因此，通过在合适的反应条件下将4-羟基苯丙酮酸与HPPD和HGD相结合，可以测定HPPD活性。

本文所用的“天然”HPPD多肽包括任何野生型HPPD序列。这些序列是本领域已知的，并且来自不同单子叶植物和双子叶植物的代表性的天然/野生型HPPD序列显示于图4、5和9以及SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394或396。在具体实施方案中，HPPD序列的生物活性片段和变体与玉米野生型HPPD多肽(SEQ ID NO:1)或天然HPPD多肽相比较。

本文所用的“对应的天然”HPPD多肽包括生物活性变体所来源于的天然或野生型序列。例如，对于大豆HPPD多肽的生物活性变体或片段，对应的天然HPPD多肽是SEQ ID NO:2所示的天然大豆序列。相似地，对于稻HPPD多肽的生物活性变体或片段，对应的天然HPPD多肽是SEQID NO:330所示的天然稻序列。

ii.对HPPD抑制剂的不敏感性

为了向植物提供对商业用施用量的至少一种所需HPPD抑制剂的耐受性，使用编码HPPD多肽的多核苷酸是有利的，所述HPPD多肽具有足够的HPPD活性并具有对至少一种或多种HPPD抑制剂产生的抑制的不敏感性。因此，在具体实施方案中，本文提供的HPPD多核苷酸和多肽以及它们的变体和片段与对应的天然HPPD多肽相比，表现出对HPPD抑制剂的增加的不敏感性，和/或与玉米天然HPPD多肽(SEQ ID NO:1)相比，表现增加的不敏感性。

本文所用的“HPPD抑制剂”包括降低HPPD催化4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸的能力的任何化合物或化合物组合。在具体实施方案中，HPPD抑制剂包含HPPD的除草活性抑制剂。HPPD抑制剂的非限制性实例包括三酮(例如，硝磺草酮、磺草酮、苯吡唑草酮以及环磺酮)；异噁唑(例如，磺酰草吡唑和异噁唑草酮)；吡唑(例如，吡草酮、苄草唑以及吡唑特)；以及苯并双环酮。不同抑制剂的农业可接受的盐包括盐，用于形成农业或园艺用途的盐的阳离子或阴离子是本领域已知的且公认的。参见，例如，WO2005/053407，通过引用将其并入本文。

“增加的”或“提高的”不敏感性在本文中可互换使用。对HPPD抑制剂的“增加的”或“提高的”不敏感性包括HPPD多肽对抑制剂的不敏感性的任何统计学显著的增加，这可通过任何酶学动力参数测定，例如，酶-抑制剂复合物的解离常数(K_D)、抑制剂与酶的缔合速率(k_ON)，或抑制剂从酶的解离速率(k_OFF)或k_OFF/k_ON的比值。本发明还定义了新的参数，“ON速率比”、“OFF速率比”以及“不敏感性参数”，它们不是on和off速率的直接测量结果，而是当酶暴露于抑制剂时，具体HPPD酶固有的on和off速率对其催化功能的影响的测量结果。不敏感性的提高不需要表现出所有动力参数的提高。单个动力参数或其任何组合的提高足以将改变划分为不敏感性的提高。在具体实施方案中，通过测量酶的这些新的不敏感性参数来确定对HPPD抑制剂的增加的不敏感性。因此，在具体实施方案中，对HPPD抑制剂的增加的不敏感性包括当与天然HPPD多肽和/或SEQ ID NO:1所示的玉米野生型HPPD序列相比，给定动力参数的至少0.2、0.3、0.5、0.7、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70倍或更大的提高。

在具体实施方案中，对HPPD抑制剂的提高的不敏感性包括(a)较慢的酶和抑制剂的缔合速率，其是例如通过高于天然HPPD的ON速率比来定量的；(b)较快的抑制剂从酶的解离速率，其是例如通过高于天然HPPD的OFF速率比来定量的；和/或(c)较慢的抑制剂与酶的缔合速率和较快的抑制剂从酶的解离速率，其是例如通过高于天然HPPD的ON速率比和OFF速率比的结果来定量的。

为了测量HPPD对抑制剂的不敏感性的测定动力参数的方法是已知的。还可参见，实施例1、4、5以及7-11。简言之，HPPD的除草活性抑制剂与酶通过双重机制形成紧密复合物，所述双重机制为通过一对羰原子与活性位点铁原子的配位和一对活性位点苯丙氨酸之间的抑制剂芳香环的π堆砌(pi stack)。因此，常规I₅₀测定不能区分不同形式的HPPD和抑制剂之间的结合亲和力差异。所有值都会是相同的，即，酶浓度的50%。为了设计能用于检测抑制剂结合亲和力改变的参数(K_D)，可以利用KD与抑制剂(I)与酶(E)的结合速率和抑制剂(I)从酶(E)的释放速率之间的关系。

在平衡时，结合速率和释放速率是相等的。因此，

k_ON[E][I]=k_OFF[EI]

写成解离(产物在反应物之上)，方程式可重新排列为：

\frac{[E] [I]}{[EI]} = \frac{k_{OFF}}{k_{ON}} = K_{D}

数值上较小的ON速率、较大的OFF速率或两者可以得到较高的K_D(降低的亲和力或增加的不敏感性)。为了检测ON和OFF速率的改变，可以观察抑制剂结合酶并使酶失活(ON速率)或抑制剂从预先形成的酶-抑制剂复合物释放(OFF速率)的HPPD反应时程。参见，例如，实施例1。

通过在存在和不存在抑制剂(例如硝磺草酮)的情况下监测HPPD反应的时程可以获得ON速率的定量指标。在70至90秒的反应间隔中，存在抑制剂的反应速率与不存在抑制剂的反应速率的比值是“ON速率比”。

通过观察HPPD抑制剂(例如硝磺草酮)从预先形成的酶-抑制剂复合物释放的HPPD反应时程可以获得OFF速率的定量指标。随着抑制剂从酶释放，反应速率加速，直至达到稳态，在稳态中反应速率是不变的。含硝磺草酮(或其他除草活性抑制剂)的混合物的稳态速率与缺少抑制剂的混合物的初始速率的比值称为“OFF速率比”。记录的另一参数是存在抑制剂的反应达到稳态所需的时间跨度。在其他实施方案中，为了确保能考虑到ON速率的提高，将ON和OFF速率比相乘，结果被称为“不敏感性参数”。

通过测定表达所述HPPD多肽或其活性片段或变体的细胞、植物、植物细胞的增加的不敏感性，也可以确定HPPD抑制剂的增加的不敏感性。在这些情况下，表达具有对HPPD抑制剂的增加的不敏感性的HPPD序列的细胞、植物或植物细胞与不表达所述HPPD序列的对照细胞、植物或植物细胞相比，会表现出对HPPD抑制剂或HPPD抑制剂组合的增加的耐受性。当表现出对除草剂的增加的耐受性的植物受到HPPD抑制剂处理时，展现出对除草剂的“增加的耐受性”，并且其剂量/反应曲线相比于合适的对照植物提供的剂量/反应曲线会向右移动。在这些剂量/反应曲线中，在X轴记录“剂量”，在Y轴记录“损伤百分比”、“除草活性效应”等。当用农业领域通常用来杀死田地中杂草的浓度和速率的除草剂来处理植物时，基本上能“抵抗”或“耐受”除草剂的植物表现出很少的(如果有的话)白化、坏死、溶解、褪绿或其他损伤，并且不会生长受阻、枯萎或畸形。

例如，表达展现出对HPPD抑制剂的增加的不敏感性的HPPD多肽的植物能耐受的HPPD抑制剂水平统计学上显著高于不表达所述HPPD多肽的对照植物。在具体实施方案中，表达本文公开的HPPD序列及其活性变体和片段的植物允许对HPPD抑制剂的增加的不敏感性，包括，例如，与未转化的植物相比，指定性能参数增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、100倍或更多倍。也可参见，实施例9、10和11的示例性测定。

不同HPPD多肽可提供对不同HPPD抑制剂除草剂的不同水平的耐受性。尽管给定的HPPD多肽可以提供对某些HPPD抑制剂除草剂的有用的耐受性水平，但其可能不足以提供对不同HPPD抑制剂除草剂的商用的耐受性水平，所述不同HPPD抑制剂除草剂例如，可以控制不同的杂草谱、制造成本更低或提供环境益处。因此，本文公开的不同HPPD多肽可以在单一植物、植物外植体或植物细胞中联合使用，从而扩展和/或提高目标HPPD除草剂或HPPD除草剂组合的耐受性。

B.HPPD序列的活性片段和变体

提供了利用多核苷酸和多肽的方法和组合物，所述多肽具有HPPD活性并具有对至少一种HPPD抑制剂的不敏感性。

i.多核苷酸和多肽片段

本发明还包括HPPD多核苷酸和多肽的片段和变体。"片段"意图表示多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列以及蛋白的一部分。多核苷酸的片段可以编码保留HPPD活性和HPPD抑制剂不敏感性的蛋白片段。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可以为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，以及最长为编码HPPD多肽的全长多核苷酸。

编码本发明的HPPD蛋白的生物活性部分的HPPD多核苷酸片段会编码至少50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、410、415、420、425、430、435或440个连续氨基酸，或最多至全长HPPD多肽中存在的氨基酸总数。可用作杂交探针或PCR引物的HPPD多核苷酸片段通常不需要编码HPPD蛋白的生物活性部分。

因此，HPPD多核苷酸的片段可以编码HPPD多肽的生物活性部分，或可以是可利用下文公开的方法作为杂交探针或PCR引物的片段。通过分离一种HPPD多核苷酸的一部分、表达编码的HPPD多肽部分(例如，通过体外重组表达)以及评价HPPD蛋白的HPPD部分的活性可以制备HPPD多肽的生物活性部分。作为HPPD核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1、000、1100、1200、1300或1400个连续核苷酸，或最多至本文公开的全长HPPD多核苷酸中存在的核苷酸的数量。

在一个实施方案中，HPPD多核苷酸和/或多肽包含或编码HPPD多肽的N末端截短形式。这样的活性HPPD片段包含SEQ ID NO:1-164和383-389、404-430和/或458-459中任一个的HPPD多肽的至少前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸的N末端缺失。在具体实施方案中，所述N末端缺失被设计为包含N末端上的蛋氨酸残基。在具体实施方案中，包含或编码N末端截短的HPPD多肽的HPPD多肽或多核苷酸的片段包含或编码具有SEQ IDNO:1-164、404-430和/或458-459中的任一个的氨基酸2-23缺失的多肽。所述N末端截短如SEQ ID NO:165-326、397-403和/或431-457所示。

ii.多核苷酸和多肽变体

“变体”蛋白意图表示通过缺失(即，5′和/或3′端的截短)和/或天然蛋白的一个或多个内部位点的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或天然蛋白中一个或多个位点的一个或多个氨基酸的取代从所述蛋白获得的蛋白。所包括的变体蛋白是具有生物活性的，即，它们继续具有天然蛋白的所需生物活性，即，如本文所述，具有HPPD活性和/或表现出对HPPD抑制剂的不敏感性。这些变体可以来自例如遗传多态性或人为操作。

“变体”意图表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括多核苷酸具有5′和/或3′端的缺失(即，截短)和/或天然多核苷酸中一个或多个内部位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸中一个或多个内部位点的一个或多个核苷酸的取代。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守型变体包括由于遗传密码的简并性而能编码本发明的HPPD多肽之一的氨基酸序列的序列。天然存在的变体例如可以是利用公知的分子生物学技术鉴定出的变体，例如，下文所述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括通过合成方式获得的多核苷酸，例如通过利用定点诱变或基因合成而产生的仍然能编码HPPD多肽的多核苷酸。

HPPD多肽的生物活性变体(以及编码其的多核苷酸)与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、383、384、385、386、387、388、389、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、458、或459中任一个的多肽或相对于具有本文公开的不同HPPD基序的任何HPPD多肽具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、95.7%、95.9%、96%、96.3%、96.5%、96.9%、97%、97.3%、97.5%、97.9%、98%、98.3%、98.5%、98.9%、99%、99.3%、99.5%、99.6%或更高的序列同一性，所述同一性是通过本文其他部分所述的序列比对程序和参数测定出的。

在具体实施方案中，生物活性多肽变体(1)与全长SEQ ID NO:90具有至少96%序列同一性；(2)与SEQ ID NO:158具有至少98.5%序列同一性；(3)与SEQ ID NO:103或104所示的全长序列具有至少98.7%序列同一性；(4)与SEQ ID NO:163所示的全长序列具有至少99.2%序列同一性；或(5)与SEQ ID NO:383所示的全长序列具有至少96.7%序列同一性；其中同一性百分比是利用BLAST比对测定的，其中使用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。

在其他实施方案中，HPPD多肽的变体(以及编码其的多核苷酸)与具有N末端缺失的HPPD多肽具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、95.7%、95.9%、96%、96.3%、96.5%、96.9%、97%、97.3%、97.5%、97.9%、98%、98.3%、98.5%、98.9%、99%、99.3%、99.5%或更高的序列同一性。例如，包含SEQ ID NO:1-164和/或383-389、404-430和/或458-459中任一个的N末端截短的这些多肽包含至少前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个氨基酸的N末端缺失，其中所述HPPD多肽的活性变体包含与HPPD多肽的N末端缺失的至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、95.7%、95.9%、96%、96.3%、96.5%、96.9%、97%、97.3%、97.5%、97.9%、98%、98.3%、98.5%、98.9%、99%、99.3%、99.5%或更高的序列同一性。在其他实施方案中，N末端截短体还包含N末端的蛋氨酸氨基酸残基。在具体实施方案中，HPPD多肽的片段具有SEQ ID NO:1-164和383-389，404-430、以及458-459中任一个的氨基酸2-23的缺失。这些多肽如SEQ ID NO:165-326和397-403和431-457所示。因此，还提供了与SEQ ID NO:165-326和397-403和431-457中任一个所示的氨基酸序列包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、95.7%、95.9%、96%、96.3%、96.5%、96.9%、97%、97.3%、97.5%、97.9%、98%、98.3%、98.5%、98.9%、99%、99.3%、99.5%或更高的序列同一性的HPPD多肽。

在具体实施方案中，生物活性变体多肽(以及编码其的多核苷酸)(1)与全长SEQ ID NO:250或246具有至少97%序列同一性；(2)与SEQ IDNO:320具有至少98.7%序列同一性；(3)与SEQ ID NO:265、266或277所示的全长序列具有至少99.1%序列同一性，(4)与SEQ ID NO:324或325所示的全长序列具有至少99.6%序列同一性；或(6)与SEQ ID NO:264或319所示的全长序列具有至少99.9%序列同一性，其中同一性百分比是利用BLAST比对测定的，其中使用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。

在其他实施方案中，通过本文其他部分所述的参数测定，具体多肽的变体(以及编码其的多核苷酸)与SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、383、384、385、386、387、388、389、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、458、或459中任一个的多肽具有至少700、710、720、721、722、723、724、725、726、728、729、730、731、732、733、734、735、736、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、828、829、830、831、832、833、834、835、836、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890或更大的二进制值(bit score)。

在具体实施方案中，生物活性多肽变体(以及编码其的多核苷酸)(1)与SEQ ID NO:109具有至少718的二进制值；(2)与SEQ ID NO:101具有至少719的二进制值；(3)与SEQ ID NO:50具有至少722的二进制值；(4)与SEQ ID NO:54或164具有至少723的二进制值；(5)与SEQ ID NO:131具有至少735的二进制值；(6)与SEQ ID NO:103具有至少878的二进制值；或(7)与SEQ ID NO:147具有至少881的二进制值，其中二进制值是利用BLAST比对测定的，其中使用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。

在其他实施方案中，具体HPPD多肽的变体(以及编码其的多核苷酸)与HPPD多肽的N末端缺失体具有至少650、675、700、710、720、721、722、723、724、725、726、728、729、730、731、732、733、734、735、736、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、828、829、830、831、832、833、834、835、836、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890或更高的二进制值。例如，这些多肽包含SEQ ID NO:1-164和383-389、404-430以及458-459中任一个的N末端截短，包括至少前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个氨基酸的N末端缺失，其中所述HPPD多肽的活性变体与包含HPPD多肽饿N末端缺失的多肽包含至少650、675、700、710、720、721、722、723、724、725、726、728、729、730、731、732、733、734、735、736、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、828、829、830、831、832、833、834、835、836、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890或更高的二进制值。在其他实施方案中，N末端截短体还包含N末端的蛋氨酸氨基酸残基。在具体实施方案中，HPPD多肽的片段(以及编码其的多核苷酸)具有氨基酸2-23的缺失。这些多肽如SEQ ID NO:165-326和397-403和431-457所示。因此，提供的变体与SEQ ID NO:165-326和397-403和431-457中的任一个包含至少650、675、700、710、720、721、722、723、724、725、726、728、729、730、731、732、733、734、735、736、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、828、829、830、831、832、833、834、835、836、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890或更高的二进制值。

在具体实施方案中，生物活性变体多肽(以及编码其的多核苷酸)(1)与SEQ ID NO:263具有至少710的二进制值；(2)与SEQ ID NO:212或218具有至少713的二进制值；(3)与SEQ ID NO:320具有至少834的二进制值；(4)与SEQ ID NO:322具有至少842的二进制值，(5)与SEQ IDNO:265具有至少843的二进制值；或(6)与SEQ ID NO:266具有至少844的二进制值，其中二进制值是利用BLAST比对测定的，其中利用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。

在其他实施方案中，通过本文其他部分所述的参数测定，具体多肽的变体(以及编码其的多核苷酸)与编码SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、383、384、385、386、387、388、389、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、458或459中任一个的多核苷酸具有至少1800、1805、1810、1815、1820、1825、1830、1835、1840、1845、1850、1855、1859、1860、1865、1870、1875、1880、1885、1890、1895、1900、1905、1910、1915、1920、1925、1930、1935、1940、1945、1950、1955、1960、1965、1970、1975、1980、1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015、2020、2025、2030、2035、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2105、2110、2115、2120、2125、2130、2135、2140、2145、2150、2155、2160、2165、2170、2175、2180、2185、2190、2195、2200、2205、2210、2215、2220、2225、2230、2235、2240、2245、2250、2255、2260、2265、2270、2275、2280、2285、2290、2295或更高的相似性评分。

在具体实施方案中，生物活性多肽变体(以及编码其的多核苷酸)(1)与SEQ ID NO:109具有至少1853的相似性评分；(2)与SEQ ID NO:101具有至少1855的相似性评分；(3)与SEQ ID NO:50具有至少1862的相似性评分；(4)与SEQ ID NO:56或164具有至少1864的相似性评分；(5)与SEQ ID NO:103具有至少2267的相似性评分；(6)与SEQ ID NO:160具有至少2267的相似性评分；或(7)与SEQ ID NO:412具有至少1855的相似性评分；其中相似性评分是利用BLAST比对测定的，其中使用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。

在其他实施方案中，HPPD多肽的变体(以及编码其的多核苷酸)与包含HPPD多肽的N末端缺失多肽的具有与至少1820、1825、1830、1835、1840、1845、1850、1855、1859、1860、1865、1870、1875、1880、1885、1890、1895、1900、1905、1910、1915、1920、1925、1930、1935、1940、1945、1950、1955、1960、1965、1970、1975、1980、1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015、2020、2025、2030、2035、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2105、2110、2115、2120、2125、2130、2135、2140、2145、2150、2155、2160、2165、2170、2175、2180、2185、2190、2195、2200、2205、2210、2215、2220、2225、2230、2235、2240、2245、2250、2255、2260、2265、2270、2275、2280、2285、2290、2295或更高的相似性评分。例如，这些多肽包含SEQ ID NO:1-164和383-389、404-430、以及458-459中任一个的N末端截短，其包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个氨基酸的缺失，其中所述HPPD多肽的活性变体至少与包含HPPD多肽的N末端缺失的多肽包含至少1800、1805、1810、1815、1820、1825、1830、1835、1840、1845、1850、1855、1859、1860、1865、1870、1875、1880、1885、1890、1895、1900、1905、1910、1915、1920、1925、1930、1935、1940、1945、1950、1955、1960、1965、1970、1975、1980、1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015、2020、2025、2030、2035、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2105、2110、2115、2120、2125、2130、2135、2140、2145、2150、2155、2160、2165、2170、2175、2180、2185、2190、2195、2200、2205、2210、2215、2220、2225、2230、2235、2240、2245、2250、2255、2260、2265、2270、2275、2280、2285、2290、2295或更高的相似性评分。在其他实施方案中，N末端截短体还包含N末端的蛋氨酸氨基酸残基。在具体实施方案中，HPPD多肽的片段具有SEQ ID NO:1-164或383-389、404-430、458以及459中任一个的氨基酸2-23的缺失。这些多肽如SEQ ID NO:165-326和397-403以及431-457所示。因此，提供的变体与SEQ ID NO:165-326和397-403和431-457中任一个包含至少1800、1805、1810、1815、1820、1825、1830、1835、1840、1845、1850、1855、1859、1860、1865、1870、1875、1880、1885、1890、1895、1900、1905、1910、1915、1920、1925、1930、1935、1940、1945、1950、1955、1960、1965、1970、1975、1980、1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015、2020、2025、2030、2035、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2105、2110、2115、2120、2125、2130、2135、2140、2145、2150、2155、2160、2165、2170、2175、2180、2185、2190、2195、2200、2205、2210、2215、2220、2225、2230、2235、2240、2245、2250、2255、2260、2265、2270、2275、2280、2285、2290、2295或更高的相似性评分。

在具体实施方案中，生物活性变体多肽(以及编码其的多核苷酸)(1)与SEQ ID NO:263具有至少1830的相似性评分；(2)与SEQ ID NO:212具有至少1839的相似性评分；(3)与SEQ ID NO:218具有至少1840的相似性评分；(4)与SEQ ID NO:320具有至少2152的相似性评分；(5)与SEQ ID NO:275具有至少2176的相似性评分；(6)与SEQ ID NO:275具有至少2177的相似性评分；或(7)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分；其中相似性评分中使用的BLAST比对是利用BLOSUM62替代矩阵、空位存在罚分为11、以及空位延伸罚分为1测定的。

在其他实施方案中，HPPD蛋白的生物活性变体可以与该蛋白的差异在于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16个氨基酸残基，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10（例如6-10），少至10、9、8、7、6、5，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。

可以以不同方式改变HPPD多肽及其活性变体和片段，包括氨基酸取代、缺失、截短以及插入。这样的操作的方法是本领域公知的。例如，通过DNA中的突变可以制备HPPD蛋白的氨基酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域公知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492;Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154:367-382;美国专利第4,873,192号;Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,NewYork)以及其中引用的文献。关于不会影响目的蛋白的生物活性的合适的氨基酸取代的指导可以见于Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequenceand Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型，通过引用将其并入。保守型取代可以是理想的，例如将一个氨基酸替换为具有相似性质的另一氨基酸。

显而易见的是，在编码变体的DNA中制造的突变不能将序列置于读码框之外，并且理想地是不会产生能产生二级mRNA结构的互补区。参见，EP专利申请公布第75,444号。

变体多核苷酸和蛋白还包括来自致突变和致重组操作(例如DNA重排)的序列和蛋白。在该操作中，可以操控一个或多个不同HPPD编码序列来产生具有所需性质的新的HPPD。按此方式，从包含具有高序列同一性并可以体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群体产生重组多核苷酸文库。例如，利用该方法，编码目的结构域的序列基序可以在本文公开的HPPD序列和其他已知HPPD基因之间重排，从而获得编码具有改进的目的性质的蛋白的新基因，例如，对于酶来说，K_m降低。这些DNA重排的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature370:389-391;Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15:436-438;Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347;Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Crameri et al.(1998)Nature391:288-291;和美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。

在其他实施方案中，已对HPPD多肽或其活性变体和片段进行修饰，去除存在于是过敏原的其他蛋白中的一个或多个序列。本文所用的“匹配序列”包括存在于已知蛋白过敏原中的8个连续相同氨基酸的区。参见，例如，Ladics(2008)Food and Chemical Toxicology46:S20-S23，通过引用并入本文。然而，这些鉴定出的8氨基酸序列不一定具有任何致过敏可能性或赋予致过敏性。尽管如此，为了符合为控制致过敏交叉反应性的可能性的所建立的标准(FAO/WHO2001，Codex2003)，可以改变匹配序列，从而得到的多肽不再含有8残基连续匹配。通过比较转基因产物的预测的氨基酸序列和已知或假定蛋白过敏原的数据库的氨基酸序列并随后改变鉴定出的氨基酸序列而去除致过敏匹配，进行这些匹配序列的鉴定。用于该分析的数据库是内布拉斯加大学的已知蛋白过敏原的过敏原在线数据库(www.allergenonline.org)。应当认识到，在具体实施方案中，与合适的对照相比，通过氨基酸的取代、缺失和/或添加来去除匹配序列不会影响蛋白的HPPD活性或HPPD抑制剂不敏感性。TAAAAGAA(玉米野生型HPPD SEQ ID NO:1中的氨基酸6-13)被改变成TATAAGAA(SEQ ID NO:370)，从而去除与数据库中的过敏原序列的8氨基酸匹配。这样的变化不会改变HPPD酶的活性或对除草剂的不敏感性。参见，例如，Codex Alimentarius Commission,Alinorm03/34:Joint FAO/WHO FoodStandard Programme,Codex Alimentarius Commission,Twenty-Fifth Session,Rome,Italy,June30–July5,2003.Appendix III,Guideline for the conductof food safety assessment of foods derived from recombinant-DNA plants,and Appendix IV,Annex of the assessment of possible allergenicity,47-60and FAO/WHO,2001.Evaluation of allergenicity of genetically modifiedfoods.Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Allergenicity ofFoods Derived from Biotechnology.January22-25,2001.Rome,Italy。

C.叶绿体转运肽

还提供了包括HPPD多肽及其活性变体和片段以及编码以上的多核苷酸的不同方法和组合物，其中HPPD序列包含叶绿体转运肽。本文所用的术语"叶绿体转运肽"缩写为"CTP"，并且是指叶绿体前体蛋白的N末端部分，其引导叶绿体前体蛋白进入叶绿体并随后被叶绿体加工蛋白酶切掉。当CTP可操作地连接于多肽的N末端时，多肽被转运到叶绿体中。从天然蛋白去除CTP降低或废除天然蛋白被转运到叶绿体中的能力。可操作地连接的叶绿体转运肽位于待靶向于叶绿体的蛋白的N末端，位于转运肽切割位点的上游并紧邻转运肽切割位点，转运肽切割位点将转运肽与待靶向于叶绿体的成熟蛋白分开。

术语"叶绿体转运肽切割位点"是指叶绿体加工蛋白酶所作用于的叶绿体靶向序列中两个氨基酸之间的位点。叶绿体转运肽将所需蛋白靶向于叶绿体，并且可促进蛋白转运到细胞器中。这是由叶绿体天然的叶绿体加工蛋白酶在合适的转运肽切割位点将转运肽从成熟多肽或蛋白切割下来所伴随的。因此，叶绿体转运肽还包含合适的切割位点，用于蛋白前体正确加工为叶绿体中含有的成熟多肽。

本文所用的“异源”CTP包括对于与其可操作地连接的多肽是外源的转运肽序列。在一个实施方案中，异源叶绿体转运肽包括SEQ ID NO:1的野生型玉米HPPD中存在的叶绿体转运肽。因此，在具体实施方案中，异源叶绿体转运肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-10、SEQ ID NO:1的氨基酸1-15、SEQ ID NO:1的氨基酸1-20、SEQ ID NO:1的氨基酸1-23、SEQ ID NO:1的氨基酸1-25、SEQ ID NO:1的氨基酸1-30、SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸1-40、SEQ ID NO:1的氨基酸1-45或SEQ ID NO:1的氨基酸1-50(SEQ IDNO:490)，或叶绿体转运肽的生物活性变体或片段。在其他实施方案中，叶绿体转运肽包含SEQ ID NO:1的至少前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或更多个氨基酸。SEQ ID NO:371(MGPTPTAAAAGAAVAAASAAEQA)包含玉米HPPD多肽的前23个氨基酸。SEQ ID NO:490包含玉米HPPD多肽的前50个氨基酸。在其他实施方案中，可使用SEQ ID NO:371或490的活性变体，其中所述变体保留将与其可操作地连接的蛋白靶向于叶绿体的能力。这些变体可包含这样的多肽(以及编码其的多核苷酸)，其包含与SEQ ID NO:371或490至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。

在另一实施方案中，异源叶绿体转运肽包括SEQ ID NO:465的野生型大豆HPPD中存在的叶绿体转运肽。因此，在具体实施方案中，异源叶绿体转运肽包括SEQ ID NO:465的氨基酸1-10、SEQ ID NO:465的氨基酸1-15、SEQ ID NO:465的氨基酸1-20、SEQ ID NO:465的氨基酸1-23、SEQ ID NO:465的氨基酸1-25、SEQ ID NO:465的氨基酸1-30、SEQ ID NO:465的氨基酸1-35、SEQ ID NO:465的氨基酸1-35、SEQ IDNO:465的氨基酸1-40、SEQ ID NO:465的氨基酸1-45、SEQ ID NO:465的氨基酸1-50、SEQ ID NO:46的氨基酸1-605、SEQ ID NO:465的氨基酸1-70、SEQ ID NO:465的氨基酸1-80，或叶绿体转运肽的生物活性变体或片段。在其他实施方案中，叶绿体转运肽包含SEQ ID NO:465的至少前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85或更多个氨基酸。在其他实施方案中，可以使用来自SEQ ID NO:465的CTP的活性变体，其中所述变体保留将与其可操作地连接的蛋白靶向于叶绿体的能力。这些变体可包含这样的多肽(以及编码其的多核苷酸)，其包含与SEQ ID NO:465的CTP至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。

因此，SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169.170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、383、384、385、386、387、388、389、397、398、399、400、401、402、或403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、452、453、454、455、456、457、458或549中任一个所示的多肽或编码其的多核苷酸或以上的活性变体和片段中的任一个可包含异源CTP序列。此外，HPPD多肽或编码具有至少一个表18所示的HPPD基序(即，SEQ ID NO:372-382和/或460-463)的HPPD的多核苷酸中的任一个或本文公开的其他变体(例如实施例16、18和20中的变体)中的任一个可包含异源CTP序列。可使用来自HPPD多肽的其他CTP。参见，例如，与本文同时提交的名称为“用于将目的序列靶向于叶绿体的方法和组合物(Methods and Compositions for靶向Sequences of Interest to a氯plast)”的美国实用专利，通过引用将其并入本文。

在其他实施方案中，提供了HPPD多肽以及编码其的多核苷酸，其中所述HPPD多肽包含不是来自于野生型玉米HPPD多肽的异源叶绿体转运肽或其活性变体或片段。这些异源叶绿体转运肽是已知的，包括但不限于，来源于豌豆属(JP1986224990;E00977)、胡萝卜(Luo et al.(1997)Plant Mol.Biol.,33(4),709-722(Z33383)、烟草属(Bowler et al.,EP0359617;A09029)、稻属(de Pater et al.(1990)Plant Mol.Biol.,15(3),399-406(X51911)的异源叶绿体转运肽，以及合成序列，例如EP0189707、美国专利第5,728,925号、美国专利第5,717,084号(A10396和A10398)中提供的合成序列。在一个实施方案中，the异源叶绿体转运肽来自从任何植物分离的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(二磷酸核酮糖羧化酶)小亚基前体蛋白。从多种植物良好地表征了二磷酸核酮糖羧化酶小亚基，来自其中任何一种的转运肽适合用于本发明。参见，例如，小立碗藓属(Quatranoet al.,AW599738)；莲花(Poulsen et al.,AW428760)；西瓜属(J.S.Shin,AI563240)；烟草属(Appleby et al.(1997)Heredity79(6),557-563)；苜蓿(Khoudi et al.(1997)Gene,197(1/2),343-351)；马铃薯和西红柿(Fritz et al.(1993)Gene,137(2),271-4)；小麦(Galili et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81(1),98-104))；以及稻(Xie et al.(1987)Sci.Sin.,Ser.B(Engl.Ed.),30(7),706-19)。例如，转运肽可以来源于分离自以下植物的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基，包括但不限于，大豆、油菜籽、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、稻、拟南芥、甜菜、甘蔗、卡诺拉、稷、豆类、豌豆、黑麦、亚麻、以及牧草。优选用于本发明的是来自例如拟南芥或烟草的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基前体蛋白。

在其他实施方案中，HPPD多肽及其活性变体和片段以及编码以上的多核苷酸不包含CTP。在这些情况下，HPPD多肽及其活性变体和片段或编码以上的多核苷酸不包含叶绿体转运肽。这些多肽可以表达在植物、植物细胞或外植体的细胞质中，并且仍能赋予所述细胞、植物或植物细胞对HPPD抑制剂的不敏感性。在其他实施方案中，缺少叶绿体转运肽的HPPD多核苷酸通过叶绿体转化被直接引入叶绿体。这些叶绿体转化方法在本文其他部分详细讨论。

因此，本文还提供了具有HPPD活性、表现出对HPPD抑制剂的不敏感性并缺少叶绿体转运肽的HPPD多核苷酸和多肽及其变体和片段。这些HPPD多肽包括以下所示的任一个：SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、383、384、385、386、387、388、389、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、458或459或其活性变体和片段，以及编码以上的多核苷酸，其中所述序列缺少叶绿体转运肽。不同的N末端截短体如本文其他部分所述。

在一个实施方案中，HPPD多核苷酸和/或多肽包含或编码HPPD多肽的N末端截短体，使得CTP被移除或被失活。因此，在具体实施方案中，编码HPPD多肽的HPPD多核苷酸或多肽包括SEQ ID NO:1-164或383-389，404-430或458-459中的任一个，其中所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-10；所述序列缺少或不编码对应的SEQID NO所示的氨基酸1-15；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-20；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-23；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-25；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-30；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-35；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示氨基酸1-40的；所述序列缺少或不编码对应的SEQ ID NO所示的氨基酸1-45；或所述序列缺少或不编码对应的SEQID NO所示的氨基酸1-50。

在其他实施方案中，HPPD多肽或编码其的多核苷酸缺少SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、383、384、385、386、387、388、389、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、458或459或其生物活性变体或片段中任一个的前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、。37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或更多个氨基酸。在具体实施方案中，SEQ ID NO:1-164、383-389、404-430、458-459中任一个所示的序列或编码其的多核苷酸缺少对应的SEQ ID NO的前2-23个氨基酸。此外，可以移除本文公开的具有表18所示的HPPD基序(即，SEQ ID NO:372-382或460-463)的多肽或任一个本文公开的变体(例如，实施例16、18和20中的变体)中的任一个中的CTP，包括蛋白的至少前个23氨基酸。

D.序列比较

以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)"参考序列"，(b)"比较窗"，(c)"序列同一性"以及(d)"序列同一性百分比"。

(a)本文所用的"参考序列"是用作序列比较的基础的规定序列。参考序列可以是规定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或基因序列的节段，或完整的cDNA或基因序列或蛋白序列。

(b)本文所用的"比较窗"指多肽序列的连续的、规定的节段，其中为了两个多肽的最佳比对，比较窗中的多肽序列可以包含与参考序列(不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即，空位)。通常，比较窗的长度为至少5、10、15或20个连续氨基酸，或可以为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员理解，为了避免由于多肽序列中包含空位而得到对参考序列的高相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除。

用于比较的序比对列方法是本领域公知的。因此，可以利用数学算法实现任何两个序列之间的序列同一性百分比的测定。这些数学算法的非限制性实例是Myers and Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法；Smith etal.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的搜索局部比对法；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中进行修改。

这些数学算法的计算机执行可用于比较序列来测定序列同一性。这些执行包括但不限于：PC/Gene程序(可获自Intelligenetics，MountainView，California)中的CLUSTAL；ALIGN程序(2.0版)以及GCG WisconsinGenetics Software Package第10版(可获自Accelrys Inc.，9685ScrantonRoad，San Diego，California，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA。可以利用默认参数进行利用这些程序的比对。CLUSTAL程序详细描述于Higgins et al.(1988)Gene73:237-244(1988);Higgins et al.(1989)CABIOS5:151-153;Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90;Huang et al.(1992)CABIOS8:155-65;以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。ALIGN程序是基于Myers and Miller(1988)(同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序中可以使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分。Altschul etal(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序是基于Karlin and Altschul(1990)(同上)的算法。可利用BLASTN程序、评分=100、字长=12进行BLAST核苷酸搜索，而获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序、评分=50、字长=3进行BLAST蛋白搜索，而获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。可利用默认参数进行BLASTP蛋白搜索。参见，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST(BLAST2.0)，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389所述。或者，可使用PSI-BLAST(in BLAST2.0)来进行检测分子之间的远距离关系的迭代搜索。参见，Altschul et al.(1997)(同上)。当利用BLAST、空位BLAST或PSI-BLAST时，可使用各程序(例如，对于核苷酸序列的BLASTN，对于蛋白的BLASTP)的默认参数。参见，www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以通过观察手动进行比对。

在一个实施方案中，本文提供的序列同一性/相似性值指利用第10版GAP、利用以下参数获得的值：对于氨基酸序列的%同一性和%相似性，利用GAP权重=8，长度权重=2，以及BLOSUM62评分矩阵或其任何等同程序。"等同程序"意图指如下所述的任何序列比较程序：对于任何两个目标序列，与第10版GAP生成的对应的比对相比，能产生比对具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比。

GAP利用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的算法以发现两个完整序列的比对，其最大化匹配数并最小化空位数。GAP考虑到所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大的匹配碱基数和最少的空位的比对。其允许提供匹配碱基的单元中的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP必须为其插入的每个空位获得匹配的空位产生罚分数的利益。如果选择空位延伸罚分大于0，GAP必须还为每个插入的空位获得空位的长度乘以空位延伸罚分的利益。对于蛋白序列，第10版GCGWisconsin Genetics Software Package中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生和空位延伸罚分可表达为选自0至200的整数。因此，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP提供了最佳比对的一个家族成员。该家族可以有很多成员，但是没有其他成员具有更好的性能。GAP表现出4方面比对优点：质量、比率、同一性以及相似性。质量是为了比对序列而最大化的度量标准。比率是质量除以较短节段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略空位对侧的符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50的相似性阈值，进行相似性评分。第10版GCG Wisconsin Genetics Software Package中使用的评分矩阵是BLOSUM62(参见，Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。

(c)对于两个多核苷酸或多肽序列，本文所用的"序列同一性"或"同一性"涉及在规定的比较窗上进行最大对应性的比对时，两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比用于涉及蛋白时，应当意识到，不相同的残基位置通常区别在于保守型氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代。当序列区别在于保守型取代时，可以向上调整序列同一性百分比，从而校正取代的保守性质。区别在于所述保守型取代的序列被称为具有"序列相似性"或"相似性"。进行所述调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守型取代评分为一部分，而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同氨基酸给定评分为1，非保守型取代给定的评分为0时，保守型取代给定的评分为0和1之间。例如，按照程序PC/Gene(Intelligenetics,Mountain View,California)中执行来计算保守型取代的评分。

(d)本文所用的"序列同一性百分比"表示通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来测定的值，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗中多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)。通过测定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算百分比，从而得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗中的总位置数并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。

(e)当将两个序列进行比对用于利用规定的氨基酸取代矩阵(例如，BLOSUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分的相似性评分而能达到这对序列的最高可能评分时，两个序列是“最佳比对”的。氨基酸取代矩阵以及其在定量两个序列之间的相似性之间的应用是本领域公知的，并描述于，例如，Dayhoff et al.(1978)"A model of evolutionary change in proteins."In"Atlas of Protein Sequence and Structure,"Vol.5,Suppl.3(ed.M.O.Dayhoff),pp.345-352.Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC和Henikoff et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919。BLOSUM62矩阵(图10)通常用作序列比对方法(例如Gapped BLAST2.0)中的默认评分取代矩阵。空位存在罚分是用于在比对的序列之一中引入单个氨基酸空位，空位延伸罚分是用于插入已经开放的空位中的每个额外的空白氨基酸位置。空位存在罚分是用于在比对的序列之一中引入单个氨基酸空位，空位延伸罚分是用于插入已经开放的空位中的每个额外的空白氨基酸位置。比对是由每个序列中比对开始和终止的氨基酸位置限定，以及任选地由一个或两个序列中一个空位或多个空位的插入限定，从而达到最高可能评分。尽管可以手动实现最佳比对和评分，但是通过利用计算机执行的比对算法，例如，Altschul et al,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的以及国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可公开获得的空位BLAST2.0，可以使得该过程更方便。可以利用例如通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov可获得的和Altschul et al,(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中描述的PSI-BLAST准备最佳比对，包括多重比对。

本文所用的相似性评分和二进制值是利用BLAST比对测定的，其中使用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。对于相同的序列对，当利用一个或另一个序列作为问询序列时获得的评分之间有差异时，选择较大的相似性评分值。

植物

提供了具有本文公开的HPPD序列的植物、植物细胞、植物部分和种子以及谷类。在具体实施方案中，植物和/或植物部分稳定并入了本文公开的至少一个异源HPPD多肽或其活性变体或片段。因此，提供的植物、植物细胞、植物部分和种子包含至少一个异源HPPD序列，所述异源HPPD序列为SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、212、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、或168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、383、384、385、386、387、388、389、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、452、453、454、455、456、457、458或549中的任一个，本文公开的任何具有至少一个表18所示的HDDP基序(即，SEQ ID NO:372-382或460-463)的HPPD多肽或本文公开的任一其他变体(例如实施例16、18和20中的变体)或HPPD序列的生物活性片段和/或变体。在具体实施方案中，HPPD序列的特征为具有HPPD活性且具有对HPPD抑制剂的不敏感性。

还提供了具有HPPD序列的植物、植物细胞、植物部分和种子和谷类，所述HPPD序列具有本文其他部分讨论的异源CTP。根据利用具有和不具有CTP序列的HPPD，术语“稳定并入”植物、植物细胞或外植体是指多核苷酸整合入基因组DNA或多核苷酸整合入质体(即，叶绿体、造粉体、色质体、平衡石、白色体、造油体以及蛋白质体)的基因组。

在具体实施方案中，植物或植物部分中的异源多核苷酸可操作地连接于用于在植物表达中的组成型启动子、组织偏好型启动子或其它启动子。

本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生成植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物或植物部分中完整的植物细胞，例如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核仁、穗、穗轴、外皮、秆、根、根尖、花药等。谷类意图表示商业种植者为了种植或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生植物的后代、变体以及突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含引入的多核苷酸。

本文公开的HPPD序列及其活性变体和片段可以用于转化任何植物种类，包括，但不限于，单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物种类的实例包括但不限于，玉米(corn)(玉米(Zea mays))，芸苔属植物(例如，欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))、特别是可用作种子油来源的芸苔属植物种类，苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))，稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)，稷(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(proso millet)(Panicum miliaceum)、狐尾稷(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthusannuus)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycinemax)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachishypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))，甘薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属植物(Coffea spp.))，椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属植物(Citrus spp.))、可可豆(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(芭蕉属植物(Musa spp.))、鳄梨(Per sea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Betavulgaris)，甘蔗(甘蔗属植物(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、生菜(例如莴苣(Lactucasativa))、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)成员，例如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃属植物(Rhododendron spp.))、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属植物(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属植物(Tulipaspp.))、水仙花(水仙属植物(Narcissus spp.))、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(Euphorbia pulcherrima)以及菊花。

可以用于实施本发明的针叶树包括，例如，松树，例如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加拿大铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉，例如银冷杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；以及雪松，例如北美乔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体实施方案中，本发明的植物为农作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、大麦、稷、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最优的，仍然在其他实施方案中，玉米植物是最优的。

其他感兴趣的植物包括能提供感兴趣的种子的谷类植物，含油种子植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜尔豆、槐豆(locust bean)、胡芦巴、大豆、青刀豆(garden beans)、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

“主题植物或植物细胞”是关于目的基因的遗传改变(例如转化)已产生影响的植物或植物细胞，或者是作为上述改变的植物或细胞的后代并包含所述改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测定主题植物或植物细胞的表型改变的参考点。

对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即，具有与用于进行遗传改变从而获得主题植物或细胞的起始材料相同基因型；(b)具有与起始材料相同的基因型、但用无效构建体(即，对目的性状不具有已知影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)作为主题植物或植物细胞的后代中未转化的分离子的植物或植物细胞；(d)与主题植物或植物细胞在遗传学上相同、但不暴露于能诱导目的基因表达的条件或刺激下的植物或植物细胞；或(e)处于目的基因不表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。

F.多核苷酸构建体

使用术语"多核苷酸"并未意图将本发明限制于包含DNA的多核苷酸。本领域技术人员应当认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括所有序列形式，包括但不限于，单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

本文公开的HPPD多核苷酸能够提供在表达盒中，用于在目的植物中表达。盒可以包括可操作地连接于HPPD多核苷酸或其活性变体或片段的5'和3'调节序列。"可操作地连接"意图表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即，启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当涉及两个蛋白编码区的连接时，可操作地连接表示编码区位于同一读码框内。盒可以还含有至少一个其他待转化入生物的基因。或者，其他基因可以提供在多个表达盒上。表达盒可以提供有多个限制位点和/或重组位点，用于插入处于调节区的转录调节下的HPPD多核苷酸或其活性变体或片段。表达盒可以还含有选择标记基因。

表达盒在转录的5'-3'方向可以包括在植物中有功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、HPPD多核苷酸或其活性变体或片段，以及转录和翻译终止区(即，终止区)。调节区(即，启动子、转录调节区以及翻译终止区)和/或HPPD多核苷酸或其活性变体或片段对于宿主细胞或相对于彼此可以是天然的/类似的。或者，调节区和/或HPPD多核苷酸或其活性变体或片段对于宿主细胞或相对于彼此可以是异源的。正如在本文其他部分所详细讨论的，表达盒可以包含嵌合多核苷酸，其包含可操作地连接于HPPD多核苷酸的异源CTP。

涉及序列时，本文所用的“异源”是来源于外来物种的序列，或者，如果来源于相同物种，其是通过有目的的人为干预、在组成和/或基因组位点上从其天然形式进行了实质性改动。例如，可操作地连接于异源多核苷酸的启动子所来源于的种类不同于该多核苷酸所来源于的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，其中一个或两者在其原始形式和/或基因组位点上进行了实质性改动，或该启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

尽管利用异源启动子表达序列可能是最佳的，但也可以使用天然启动子序列。这样的构建体可以改变HPPD多核苷酸在植物或植物细胞中的表达水平。因此，可以改变植物或植物细胞的表型。

终止区相对于转录起始区可以是天然的，相对于可操作地连接的HPPD多核苷酸或其活性变体或片段可以是天然的，相对于植物宿主可以是天然的，或可以来源于相对于启动子、HPPD多核苷酸或其活性片段或变体、植物宿主的另一来源(即，外源或异源)，或以上的任何组合。方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也可参见，Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261-1272;Munroeet al.(1990)Gene91:151-158;Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903;和Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

如果合适的话，可以优化多核苷酸用于增加转化的植物中的表达。也就是说，可以利用植物优选的密码子合成多核苷酸，用于提高表达。关于使用宿主优选密码子的讨论，参见，例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。本领域中提供了合成植物优选基因的方法。参见，例如，美国专利5,380,831，以及5,436,391，以及Murray et al.(1989)NucleicAcids Res.17:477-498，通过引用并入本文。

已知其他序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括去除编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子接合位点信号、转位子样重复的序列，以及充分表明可能不利于基因表达的其它序列。可以将序列的G-C含量调整到给定细胞宿主的平均水平，这可以通过参考宿主细胞中已知基因的表达来计算。如果可能的话，修饰序列以避免能预测到的发夹二级mRNA结构。

表达盒还可以含有5'前导序列。前导序列可用于增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括：细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130)；马铃薯y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene165(2):233-238)，MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virology154:9-20)，以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒的包衣蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA4)(Jobling et al.(1987)Nature325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in Molecular Biology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology81:382-385。还可参见，Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968。

在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以便将DNA序列提供于正确的定位，如有必要，在合适的读框内。为此，可以使用接头或连接子来连接DNA片段，或者可以涉及其他操作来提供方便的限制位点、移除过剩的DNA、移除限制位点等。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，例如转换和颠换。

多种启动子可用于表达本文公开的各种HPPD序列，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。可以基于所需的结果选择启动子。所述启动子包括，例如，组成型、组织优选型或用于植物中表达的其它启动子。

组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及WO99/43838和美国专利第6,072,050号所公开的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell et al.(1985)Nature313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell2:163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利第5,608,149号、第5,608,144号、第5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5,399,680号、第5,268,463号、第5,608,142号和第6,177,611号。

组织优选型启动子可以用于在特定植物组织中靶向增强HPPD表达。组织优选型启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265;Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803;Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343;Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2):157-168;Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341;VanCamp et al.(1996)Plant Physiol.112(2):525-535;Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2):513-524;Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778;Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196;Orozco etal.(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138;Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505中描述的启动子。如果需要的话，可以修饰此类启动子，用于弱表达。

叶片优选型启动子在本领域内是已知的。参阅，例如，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265;Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105:357-67;Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778;Gotor et al.(1993)Plant J.3:509-18;Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138和Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590。

如本文其他部分更详细地讨论的，能指导质体(例如,叶绿体)中的表达的启动子也可用于表达HPPD序列或其生物活性变体和片段。

合成的启动子可用于表达HPPD序列或其生物活性变体和片段。在一个非限制性实施方案中，利用合成的组成型启动子(例如，美国专利6,072,050和6,555,673)或利用与本申请同时提交的名为“嵌合启动子及其使用方法”的美国申请号_______中公开的启动子(通过引用并入本文)表达HPPD序列。在其他实施方案中，可操作地连接于所述合成的启动子的HPPD变体还包含拟南芥泛素3基因终止子(Callis et al.(1995)Genetics139(2),921-939;Genbank L05363)。

表达盒也可以包含选择标记基因，用于选择转化的细胞。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物例如草甘膦、草铵膦、溴苯腈、磺脲类、麦草畏、2,4-二氯苯氧乙酸。其他的可选标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Suet al.(2004)Biotechnol Bioeng85:610-9和Fetter et al.(2004)Plant Cell16:215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science117:943-54和Kato et al.(2002)Plant Physiol129:913-42)和黄色荧光蛋白(Evrogen的PhiYFP^TM，参阅，Bolte et al.(2004)J.Cell Science117:943-54)。对于其他的选择标记，通常参阅，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318；Yao et al.(1992)Cell71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon,pp.177-220；Hu et al.(1987)Cell48:555-566；Brown et al.(1987)Cell49:603-612；Figgeet al.(1988)Cell52:713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553；Deuschle et al.(1990)Science248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921；Labow et al.(1990)Mol Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956；Bairn et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics MolStruc.Biol.10:143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry27:1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossenet al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919；Hlavka et al.(1985)Handbookof Experimental Pharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)；Gill et al.(1988)Nature334:721-724。通过引用将这些公开内容并入本文。以上选择标记基因的名录不是意图限制。任何选择标记基因可以用于本发明中，包括例如，实施例14和图7中所述的DsRed。

G.叠加其他性状目的

在一些实施方案中，将本文公开的HPPD多核苷酸或其活性变体和片段工程化到分子堆(molecular stack)中。因此，本文公开的各种植物、植物细胞和种子还可以包含一个或多个目的性状，以及在更具体的实施方案中，所述植物、植物部分或植物细胞叠加了目的多核苷酸序列的任何组合，从而产生具有所需性状组合的植物。本文所用的术语“叠加”包括在相同植物中存在多种性状(即，两种性状合并到核基因组中，一种性状合并到核基因组中而一种性状合并到质体基因组中，或两种性状合并到质体基因组中)。在一个非限制性实例中，“叠加的性状”包括分子堆，其中序列在物理学上彼此邻近。本文所用的“性状”指来源于具体的序列或序列组的表型。在一个实施方案中，分子堆包含也能赋予对至少一种HPPD抑制剂耐受性的至少一个其他多核苷酸和/或赋予对第二除草剂的耐受性的至少一个其他多核苷酸。

因此，在一个实施方案中，本文公开的具有HPPD多核苷酸或其活性变体或片段的植物、植物细胞或植物部分叠加了至少一个其他HPPD序列。这些HPPD序列包括本文公开的HPPD序列及其变体和片段，以及其他HPPD序列，包括但不限于，美国专利6,245,968B1；6,268,549；以及6,069,115中所示的HPPD序列；以及国际公开WO99/23886，通过引用将每篇文献并入本文。

在其他实施方案中，包含HPPD序列或其活性变体和片段的植物、植物细胞、外植体和表达盒叠加了通过不同于HPPD多肽的机制赋予对HPPD抑制剂的耐受性的序列。例如，可以使用P450序列，其通过除草剂的代谢提供对HPPD抑制剂的耐受性。这些序列包括但不限于，NSF1基因。参见，US2007/0214515和US2008/0052797，通过引用将上述两篇文献整体并入本文。

在一些实施方案中，具有HPPD多核苷酸或其活性变体或片段的植物或植物细胞可以叠加其他除草剂耐受性性状，从而产生具有进一步提高的性质的本发明的转基因植物。可用于这些实施方案的其他除草剂耐受性多核苷酸包括赋予对草甘膦的耐受性的多核苷酸，例如，草甘膦N-乙酰基转移酶。参见，例如，WO02/36782，美国公布2004/0082770和WO2005/012515，美国专利7,462,481，美国专利7,405,074，通过引用将每篇文献并入本文。

其他草甘膦耐受性性状包括编码草甘膦氧化还原酶的序列，其详细描述于美国专利5,776,760和5,463,175。可以与本文公开的HPPD序列组合的其他性状包括来源于能赋予植物产生较高水平或草甘膦不敏感的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的能力的多核苷酸的那些，例如，详细描述于美国专利6,248,876B1;5,627,061;5,804,425;5,633,435;5,145,783;4,971,908;5,312,910;5,188,642;4,940,835;5,866,775;6,225,114B1;6,130,366;5,310,667;4,535,060;4,769,061;5,633,448;5,510,471;Re.36,449;RE37,287E;and5,491,288；以及国际公布WO97/04103；WO00/66746；WO01/66704；以及WO00/66747。可以与本文公开的HPPD序列组合的其他性状包括赋予对磺酰脲和/或咪唑啉酮的耐受性的那些，例如，详细描述于美国专利5,605,011;5,013,659;5,141,870;5,767,361;5,731,180;5,304,732;4,761,373;5,331,107;5,928,937;and5,378,824；以及国际公布WO96/33270。

能赋予对除草剂的耐受性并可用于本文公开的方法和组合物中的其他已知基因包括，例如，植物生长素、HPPD、草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲、溴草腈和达草灭除草剂可以叠加为分子堆或与表达本文公开的性状的植物叠加为繁育堆(breeding stack)。编码参与除草剂耐受性的蛋白的多核苷酸分子包括但不限于，多核苷酸分子编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)公开于美国专利US39,247；6,566,587，用于赋予草甘膦耐受性；编码草甘膦氧化还原酶(GOX)的多核苷酸分子公开于美国专利5,463,175，草甘膦-N-乙酰基转移酶(GAT)公开于美国专利7,622,641;7,462,481;7,531,339;7,527,955;7,709,709;7,714,188和7,666,643，也用于提供草甘膦耐受性；麦草畏单加氧酶公开于美国专利7,022,896和WO2007146706A2，用于提供麦草畏耐受性；编码AAD12的多核苷酸分子公开于美国专利申请公布2005731044或WO2007053482A2，或编码AAD1的多核苷酸分子公开于US20110124503A1或US7,838,733，用于提供对植物生长素除草剂(2,4-D)的耐受性；用于提供对HPPD抑制剂的耐受性(例如，羟基苯丙酮酸双加氧酶)的编码羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的多核苷酸分子公开于例如，US7935869；US20090055976A1；以及US20110023180A1；通过引用将每篇公布文献整体并入本文。

在其他实施方案中，具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分叠加了，例如，赋予对ALS抑制剂的耐受性的序列。本文所用的“ALS抑制剂耐受多肽”包括在植物中表达时，能赋予对至少一种ALS抑制剂的耐受性的任何多肽。多种ALS抑制剂是已知的，包括，例如，磺酰脲，咪唑啉酮，三唑嘧啶，嘧啶氧代(硫代)苯甲酸盐和/或磺酰氨基羰基三唑啉酮除草剂。其他ALS抑制剂是已知的，并公开于本文其它部分。本领域中已知的是，关于对磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶以及嘧啶(硫代)苯甲酸盐的耐受性，ALS突变落入不同类别，包括具有以下特征的突变：(1)对于所有这四组的宽耐受性；(2)对咪唑啉酮和嘧啶(硫代)苯甲酸盐的耐受性；(3)对磺酰脲和三唑嘧啶的耐受性；以及(4)对磺酰脲和咪唑啉酮的耐受性。

可使用不同ALS抑制剂耐受多肽。在一些实施方案中，ALS抑制剂耐受多核苷酸含有至少一个导致ALS多肽中一个氨基酸改变的核苷酸突变。在具体实施方案中，改变发生在乙酰乳酸合酶的七个基本上保守的区域之一。参见，例如，Hattori et al.(1995)Molecular Genetics and Genomes246:419-425;Lee et al.(1998)EMBO Journal7:1241-1248;Mazur et al.(1989)Ann.Rev.Plant Phys.40:441-470；以及美国专利5,605,011，通过引用将每篇文献整体并入本文。ALS抑制剂耐受多肽可以由例如ALS的SuRA或SuRB基因座编码。在具体实施方案中，ALS抑制剂耐受多肽包括C3ALS突变体、HRA ALS突变体、S4突变体或S4/HRA突变体或以上的任何组合。ALS中的不同突变已知能赋予对不同除草剂和除草剂组(和/或亚组)的耐受性；参见，例如，Tranel and Wright(2002)Weed Science50:700-712。还可参见，美国专利5,605,011，5,378,824，5,141,870，以及5,013,659，通过引用将每篇文献整体并入本文。大豆、玉米以及拟南芥HRA序列公开于，例如，WO2007/024782，通过引用并入本文。

在一些实施方案中，ALS抑制剂耐受多肽赋予对磺酰脲和咪唑啉酮除草剂的耐受性。耐磺酰脲的植物和耐咪唑啉酮的植物的产生详细描述于美国专利5,605,011;5,013,659;5,141,870;5,767,361;5,731,180;5,304,732;4,761,373;5,331,107;5,928,937;和5,378,824；以及国际公布WO96/33270，通过引用将它们整体并入本文用于所有目的。在具体实施方案中，ALS抑制剂耐受多肽包含耐磺酰胺的乙酰乳酸合酶(也称为耐磺酰胺的乙酰醇酸合酶)或耐咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(也称为耐咪唑啉酮的乙酰醇酸合酶)。

在其他实施方案中，具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分叠加了例如赋予对ALS抑制剂的耐受性和草甘膦耐受性的序列。在一个实施方案中，HPPD序列或其活性变体或片段叠加了HRA和草甘膦N-乙酰基转移酶。参见，WO2007/024782，2008/0051288和WO2008/112019，通过引用将每篇文献并入本文。

在其他实施方案中，具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以叠加例如芳氧基链烷酸酯双加氧酶多核苷酸(其赋予对2,4-D和其他苯氧基植物生长素除草剂以及芳氧苯氧丙酸酯除草剂的耐受性，描述于例如，WO2005/107437)和麦草畏耐受性多核苷酸，描述于例如，Herman et al.(2005)J.Biol.Chem.280:24759-24767，植物生长素多肽和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)多肽。

可以与具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分组合的除草剂耐受性性状的其它实例包括编码外源膦丝菌素乙酰基转移酶的多核苷酸所赋予的那些，描述于美国专利5,969,213;5,489,520;5,550,318;5,874,265;5,919,675;5,561,236;5,648,477;5,646,024;6,177,616;和5,879,903。含有外源膦丝菌素乙酰基转移酶的植物可以表现出对抑制谷氨酰胺合酶的草铵膦除草剂的提高的耐受性。可以与具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分组合的除草剂耐受性性状的其它实例包括赋予改变的原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogenoxidase)(原卟啉原氧化酶(protox))活性的多核苷酸所赋予的那些，描述于美国专利6,288,306B1；6,282,837B1；以及5,767,373；以及国际公布WO01/12825。含有该多核苷酸的植物可以表现出对靶向于原卟啉原氧化酶的任何多种除草剂(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的提高的耐受性。

可以与具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分组合的除草剂耐受性性状的其它实例包括赋予对植物(例如，玉米植物或加拿大飞篷)中至少一种除草剂的耐受性的那些。耐除草剂的杂草是本领域已知的，所述植物对特定除草剂的耐受性是变化的。参见，例如，Green and Williams(2004)“Correlation of Corn(Zea mays)InbredResponse to Nicosulfuron and Mesotrione,”poster presented at the WSSAAnnual Meeting in Kansas City,Missouri,February9-12,2004;Green(1998)Weed Technology12:474-477;Green and Ulrich(1993)Weed Science41:508-516。负责这些耐受性的性状可以通过育种或其他方法与具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分组合，而提供本发明的植物及其使用方法。

在其他实施方案中，HPPD序列可以叠加至少一个编码尿黑酸茄尼基转移酶(HST)的多核苷酸。参见，例如，WO2010023911，通过引用将其整体并入本文。在这些实施方案中，全部或部分通过抑制HST发挥作用的除草化合物种类可被施加到具有HTS多肽的植物上。

具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分还可以与至少一个其他性状组合，而产生还包含多种所需性状组合的植物，所述性状包括但不限于，对于动物饲料所需的性状，例如高油含量(美国专利第6,232,529号)；平衡的氨基酸含量(例如hordothionins(例如美国专利第5,990,389号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,703,409号，美国专利第5,850,016号)；大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106和WO98/20122)和高蛋氨酸蛋白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261:6279；Kirihara et al.(1988)Gene71:359和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:123))；增强的可消化性(例如修饰的贮藏蛋白(美国申请系列第10/053,410号，2001年11月7日提交)和硫氧还蛋白(美国申请系列第10/005,429号，2001年12月3日提交))；以上公开在此通过引用并入。所需性状组合还包括LLNC(低亚麻酸含量；参见，例如，Dyer et al.(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.59:224-230)和OLCH(高油酸含量；参见，例如，Fernandez-Moya et al.(2005)J.Agric.Food Chem.53:5326-5330)。

具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分还可以与其他所需性状组合，例如，伏马毒素解毒基因(美国专利第5,792,931号)；无毒性和抗病性基因(Jones et al.(1994)Science266:789；Martin et al.(1993)Science262:1432；Mindrinos et al.(1994)Cell78:1089)；以及加工或工艺产品所需的性状，例如，改良的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5,952,544号；WO94/11516))；改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；以及多聚体或生物塑料(例如美国专利第5,602,321号；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)促进聚羟基脂肪酸酯(PHA)的表达)；以上公布在此通过引用并入。也可以将本发明的耐除草剂多核苷酸与提供农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状例如雄性不育(例如，参阅美国专利第5.583,210号)、茎强度、开花时间或转化技术性状，例如细胞周期调节或基因靶向(例如WO99/61619、WO00/17364和WO99/25821)；以上公开在此通过引用并入。

在其他实施方案中，具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分可以叠加编码具有杀害虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸，例如，苏云金芽孢杆菌毒蛋白(描述于美国专利第5,366,892号、第5,747,450号、第5,737,514号、第5,723,756号、第5,593,881号和Geiser et al.(1986)Gene48:109，Lee et al.(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:4648-4657(Vip3A);Galitzky et al.(2001)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57:1101-1109(Cry3Bb1);和Herman et al.(2004)J.Agric.Food Chem.52:2726-2734(Cry1F))、凝集素(Van Damme et al.(1994)PlantMol.Biol.24:825、pentin(描述于美国专利第5,981,722号)等。所产生的组合可以还包括任一目的多核苷酸的多重拷贝。

在另一实施方案中，具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物或植物细胞或植物部分还可以与Rcg1序列或其生物活性变体或片段组合。Rcg1序列是玉米中的炭疽茎腐病抗性基因in。参见，例如，美国专利申请11/397,153，11/397,275，以及11/397,247，通过引用将每篇文献并入本文。

这些叠加的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规方法对植物进行育种或基因转化。如果序列是通过基因转化植物来叠加，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间、以任何顺序进行组合。在共转化的方案中，可以用转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸同时引入性状。例如，如果要引入两个序列，那么这两个序列可以包含在不同的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入可以抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以通过与其他抑制盒或过表达盒的任意组合进行组合来在植物中产生所需的性状组合。还应当认识到，可以使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置叠加多核苷酸序列。参阅，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上在此通过引用并入。

H.引入的方法

不同方法可用于将目的序列引入植物或植物部分。"引入"意图表示为植物、植物细胞或植物部分提供多核苷酸或多肽，由此序列能够进入植物细胞的内部。本发明的方法不依赖于将序列引入植物或植物部分的具体方法，只要多核苷酸或多肽能够进入植物至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化方法，瞬时转化方法，以及病毒介导的方法。

“稳定转化”意图表示引入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代继承。“瞬时转化”意图表示多核苷酸被引入植物并且没有整合到植物的基因组内或多肽被引入植物内。

转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案根据转化的目标植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)的不同而不同。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques4:320-334)，电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606，农杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055号和美国专利第5,981,840号)，直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717-2722)，弹道粒子加速(参阅，例如，美国专利第4,945,050号、美国专利第5,879,918号、美国专利第5,886,244号和第5,932,782号；Tomes et al.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:FundamentalMethods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology6:923-926)；和Lecl转化(WO00/28058)。也可参阅Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology5:27-37(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology8:736-740(稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米)；Klein et al.(1988)Biotechnology6:559-563(玉米);美国专利第5,240,855号、美国专利第5,322,783号、美国专利第5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311:763-764；美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合)；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulationof Ovule Tissues,ed.Chapman et al.(Longman,New York),pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports9:415-418和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(噬菌体颈须介导的转化)；D'Halluinet al.(1992)Plant Cell4:1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant CellReports12:250-255和Christou and Ford(1995)Annals of Botany75:407-413(稻)；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology14:745-750(玉米通过根癌农杆菌)；以上均在此通过引用并入。

在具体的实施方案中，可以使用多种瞬时转化方法将HPPD序列或其活性变体或片段提供给植物。瞬时转化方法包括但不限于将HPPD蛋白或其变体和片段直接引入植物。此类方法包括，例如，显微注射和粒子轰击。参阅，例如，Crossway et al.(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185;Nomura et al.(1986)Plant Sci.44:53-58;Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:2176-2180和Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science107:775-784；以上均在此通过引用并入。

在其他实施方案中，本发明的多核苷酸可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入植物。通常，此类方法包括将本发明的核酸构建体并入病毒DNA或RNA分子。应当认识到，HPPD序列可以在开始被合成为病毒多聚蛋白的一部分，其然后可以通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。此外，应当认识到，本发明的启动子也包括病毒RNA聚合酶转录所用的启动子。将多核苷酸引入植物和在其中表达编码的蛋白的方法，包括病毒DNA或RNA分子，在本领域内是已知的。参阅，例如，美国专利第5,889,191号、美国专利第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号、第5,316,931号和Porta et al.(1996)MolecularBiotechnology5:209-221；在此通过引用并入。

在植物基因组的特定位置靶向插入多核苷酸的方法在本领域内是已知的。在一个实施方案中，使用位点特异性重组系统完成在希望的基因组位置插入多核苷酸。参阅，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上均在此通过引用并入。简而言之，本发明的多核苷酸可以被包含在侧翼为两个非重组发生的重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，该植物具有稳定并入其基因组的靶位点，该靶位点的侧翼为对应于转移盒的位点的两个非重组发生的重组位点。提供合适的重组酶，转移盒在靶位点上整合。据此，目的多核苷酸被整合到植物基因组中的特定染色体位置。靶向多核苷酸的其它方法描述于WO2009/114321(通过引用并入)，其描述了产生用于修饰植物基因组、特别是玉米基因组的“定制的"大范围核酸酶。也可参阅，Gao et al.(2010)Plant Journal1:176-187。

可以根据常规方式使转化后的细胞生长成植物。参阅，例如，McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports5:81-84。然后，可以种植这些植物，并且用相同的转化株或不同株授粉，从而得到具有鉴定出的所需表型特征的组成型表达的后代。可以种植两代或更多代，以确保所需的表型特征的表达稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需的表型特征的表达已实现。如此，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，该种子具有稳定并入其基因组的本发明的多核苷酸，例如，本发明的表达盒。

I.叶绿体转化

在具体实施方案中，HPPD多肽及其活性变体和片段以及编码其的多核苷酸不包含或编码CTP。这些多核苷酸可以从植物、植物细胞或外植体的核基因组表达，从细胞质发挥作用的多肽仍能赋予细胞、植物或植物细胞对HPPD抑制剂的不敏感性。在其他实施方案中，缺少叶绿体转运肽的HPPD多核苷酸通过叶绿体转化被直接引入叶绿体。叶绿体转化的方法在本文其他部分详细讨论。因此，提供了本文所述的叶绿体，所述叶绿体具有稳定并入其基因组的编码缺少CTP的HPPD多肽或其活性变体或片段的多核苷酸。

在其他实施方案中，仅有HPPD多肽或其活性变体和片段位于植物或植物细胞的叶绿体中。在这些情况下，HPPD多肽可以包含叶绿体转运肽并且可以从合并到核基因组中的多核苷酸表达。在这样的情况下，HPPD多肽被转运到叶绿体中，CTP被移除，然后成熟形式的HPPD多肽位于叶绿体中。

在其他实施方案中，编码HPPD多肽或其活性变体或片段的多核苷酸被直接并入叶绿体的基因组中。在这些情况下，HPPD多肽不需要包含CTP。

可以优化需要被靶向至叶绿体的序列，用于在叶绿体中表达，从而解决植物细胞核和该细胞器之间密码子利用的差异。按此方式，可以利用叶绿体优选密码子合成目的多核苷酸。参见，例如，美国专利5,380,831，通过引用并入本文。

本文所用的“质体”是指存在于植物细胞中的细胞器，其贮存和制造细胞利用的化学化合物(例如淀粉，脂肪酸，萜烯)，并且已从前质体衍生出来。因此，植物的质体通常具有相同的遗传物质。质体包括负责光合成的叶绿体、造粉体、色质体、平衡石、白色体、造油体以及蛋白质体。

质体基因组是环形的，并且大小在各个植物种类中不同，从约120至约217千碱基对(kb)。基因组通常包含大的倒转重复，其可以含有多至约76千碱基对，但是更通常为约20至约30千碱基对。不同生物的质体基因组中的倒转重复已有描述(Palmer(1990)Trends Genet6：115-120)。

将基因引入质体基因组的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab etal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530;Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917;Svab and Maliga(1993)EMBO J.12:601-606；以及美国专利5,451,513和5,545,818；通过引用将每篇文献整体并入本文。

一种方法涉及通过同源重组将目的多核苷酸整合入质体基因组。该方法涉及将目的多核苷酸引入植物细胞，所述目的多核苷酸的侧翼为与质体基因组的区域具有同源性的区域。将目的多核苷酸递送入植物细胞可以通过本领域已知的任何转化方法，包括本文其他部分所述的方法。这些方法包括但不限于，粒子枪递送(Svab,Z.et al.(1990)Proc Natl AcadSci USA87:8526-8530;Svab and Maliga(1993)Proc Natl Acad Sci USA90:913-917;和Staub and Maliga(1993)EMBO J12:601-606；以及美国专利5,451,513和5,545,818；通过引用将每篇文献整体并入本文)。在一些种类中，原生质体也可以用于叶绿体转化(O'Neill et al.(1993)Plant J3:729-38;and Spoerlein et al.(1991)Theor Appl Gen82:717-722；通过引用将每篇文献整体并入本文)。当侧翼具有同源区的目的多核苷酸进入细胞时，目的多核苷酸会被整合到质体基因组中。

位于目的多核苷酸侧翼的同源区，以及在一些实施方案中，其可操作地连接的启动子，以及在具体实施方案中，选择标记基因的长度可以不同。在一些实施方案中，与质体基因组的同源区的长度为约50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000碱基对或更长。在多数情况下，重组的频率以及获得具有转化的质体的植物的频率随着同源区大小的减小而减小。在同源区存在于质体基因组的倒转重复区中的实施方案中，每个转化的质体预期有两个目的多核苷酸拷贝。

在一些实施方案中，目的多核苷酸可以与在质体中具有活性的选择标记基因共同递送。选择标记基因和目的多核苷酸可以存在于单一DNA构建体上或分别的构建体上。已开发出了多种用于植物细胞的标记，例如对氯霉素、氨基糖苷类抗生素G418、潮霉素等的抗性。赋予对卡那霉素(NPTII或AphA6)的抗性的基因已被用作质体转化的选择标记(Carrer etal.(1993)Mol Gen Genetics241:49-56;和Huang et al.(2002)Mol GenGenomics268:19-27；通过引用将每篇文献整体并入本文)。编码参与叶绿体代谢的产物的其它基因也可以用作选择标记。

用于质体转化的选择标记基因的另一实例是能赋予对抑制质体蛋白合成的物质的抗性的选择标记基因，从而通过将细胞与抑制质体蛋白合成的物质接触来选择获得表型的细胞。编码非致死性选择表型的质体DNA可以包含16S核糖体DNA，其被突变为能赋予对链霉素、或对大观霉素、或同时对这两种抗生素的作用的抗性。表达能通过磷酸化、腺苷酰化或乙酰化修饰非致死性抗生素(例如链霉素或大观霉素)的异源基因也适合于选择质体转化事件。赋予对链霉素和大观霉素的抗性的基因的另一非限制性实例是细菌aadA基因，其编码链霉素/大观霉素腺嘌呤转移酶(Svab et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA90:913-917)。在细胞的叶绿体包含选择标记基因产物时，aadA基因产物允许在链霉素或大观霉素存在下细胞持续生长和绿色化。不含有选择标记基因产物的细胞被白化。因此，选择aadA基因标记是基于鉴定在植物生长培养基中存在链霉素或大观霉素的情况下不被白化的植物细胞。

选择标记基因的其他实例是赋予对除草剂的抗性的基因，除草剂包括光合体系II除草剂，例如三嗪除草剂，特别是三嗪除草剂阿特拉津。该表型不仅提供了非致死性选择，还提供了除草剂抗性。提供对植物除草剂(例如草甘膦、溴草腈、或咪唑啉酮)的抗性的基因可以用作选择标记基因。这些基因已有报道(Stalker et al.(1985)J Biol Chem260:4724-4728(草甘膦抗性EPSP)；Stalker et al.(1985)J Biol Chem263:6310-6314(溴草腈抗性腈水解酶基因)；以及Sathasivan et al.(1990)Nucl Acids Res18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)；通过引用将每篇文献整体并入本文)。

可以将选择标记基因和/或目的多核苷酸置于叶绿体5'启动子和3'转录终止区(例如，烟草16S rRNA启动子rrn区和rps163'终止区)的调节控制下。多种其他启动子区也可以用于驱动选择标记基因和/或目的多核苷酸的表达，包括已被证实能在植物质体中发挥功能的各种质体启动子和细菌启动子。此外，如果不希望选择标记基因和/或目的多核苷酸的核表达，可以将质体内含子合并到选择标记基因和/或目的多核苷酸中。某些种类的质体内含子不能在核中正确剪接出来，从而阻止选择标记基因和/或目的多核苷酸在核中的表达。可以优化目的多核苷酸和/或编码细胞增殖因子的异源多核苷酸，用于在叶绿体中表达，从而解决植物细胞核和该细胞器之间密码子利用的差异。按此方式，可以利用叶绿体优选密码子合成多核苷酸。参见，例如，美国专利5,380,831，通过引用并入本文。

质体转化的其他方法通过核编码、质体定向的RNA聚合酶的组织优选表达来反式激活沉默的质体携带转基因而发生。这样的系统已报道于McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305，通过引用将其整体并入本文。在这些方法中，编码细胞增殖因子的异源多核苷酸被引入细胞，并在质体定向的RNA聚合酶表达之前、过程中或之后立即表达。

为了在引入叶绿体转化载体后选择具有转化的质体的细胞，将处理的组织置于含有合适的选择剂的组织培养基上。在选择培养基上孵育合适的时间后，可以鉴定转化的细胞并使其生长到允许完整植物再生的阶段。再生过程标准核转化事件中使用的过程基本相同。必须特别注意确保选择和再生条件能促进大部分野生型叶绿体基因组的去除。通过标准分子学技术(包括Southern和PCR分析)可以监测野生型与转化的叶绿体基因组的比例状态。

对于烟草和多种其他物种，叶是质体转化的优选靶标。关于烟草(Svab,Zora;Hajdukiewicz et al.(1990)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America87(21):8526-30)，拟南芥(Sikdar,S.R.;Serino,G.;Chaudhuri,S.;Maliga,P(1998)Plant Cell Reports18(1-2):20-24)，西红柿(Ruf et al.(2001)NatureBiotechnology:19(9):870-875)，马铃薯(Sidorov et al.(1999)Plant Journal19(2):209-216)的叶绿体转化已有描述。对于大豆，可以靶向于胚胎发生悬浮培养物进行转化(Dufourmantel et al.(2004)Plant Molecular Biology:55(4),479-489;US20070039075A1)。

II.使用方法

A.增加植物或植物部分中至少一个HPPD序列或其活性变体或片段的表达和/或浓度的方法

提供了增加植物、植物细胞、植物部分、外植体、种子或叶绿体中本文公开的HPPD多肽或其活性变体或片段的活性和/或浓度的方法。HPPD活性和对HPPD抑制剂的不敏感性在本文其他部分详细讨论。在其他实施方案中，相对于不具有HPPD序列的合适的对照植物、植物部分或细胞，植物或植物部分中HPPD多肽的浓度/水平增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%、5000%、或10000%。在其他实施方案中，与天然HPPD序列的水平相比，植物或植物部分中HPPD多肽的水平增加10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多倍。可以以多种方式实现HPPD多肽水平的增加，包括，例如，通过表达多个拷贝的一个或多个HPPD多肽和/或通过利用启动子来驱动较高水平的序列表达。

在具体实施方案中，将多肽或HPPD多核苷酸或其活性变体或片段引入植物、植物细胞、外植体或植物部分。随后，利用本领域技术人员已知的方法选择具有引入的本发明序列的植物细胞，例如，但不限于，Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。使通过上述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在植物形成条件下生长足以调节植物中本发明多肽的浓度和/或活性的时间。植物形成条件是本领域公知的，并且在本文其他部分简要讨论。

在一个实施方案中，提供了产生HPPD除草剂耐受植物细胞的方法，包括用编码HPPD多肽或其活性变体或片段的多核苷酸转化植物细胞。在具体实施方案中，该方法还包括通过使植物细胞生长于足够浓度的HPPD除草剂，使得除草剂能白化不包含目的HPPD多肽的植物细胞，从而选择对HPPD除草剂抵抗或耐受的植物细胞。

应当意识到，细胞与HPPD除草剂孵育可以发生在用HPPD目的多核苷酸转化之前或之后。例如，在一个实施方案中，该方法包括在足够浓度的HPPD除草剂存在下培养植物细胞，使得所述植物细胞表现出白化，然后将编码本文公开的HPPD多肽的多核苷酸转化入白化的植物细胞。然后，使植物细胞生长，其中转化的植物细胞不再表现出白化。参见，例如，美国专利6,791,014，通过引用将其整体并入本文。

还应当意识到，通过利用在转化的植物中不能指导蛋白或RNA表达的多核苷酸，可以改变植物中天然HPPD序列的水平和/或活性。例如，本文公开的HPPD多核苷酸或其活性变体或片段可以用于设计多核苷酸构建体，其可以用于改变或突变生物中基因组核苷酸序列的方法中。所述多核苷酸构建体包括但不限于，RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA:DNA寡核苷酸、以及致重组寡核碱基。这些核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见，美国专利5,565,350;5,731,181;5,756,325;5,760,012;5,795,972;和5,871,984；通过引用将以上全部并入本文。还可参见，WO98/49350，WO99/07865，WO99/25821，以及Beetham et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8774-8778；通过引用并入本文。

因此应当意识到，本发明的方法不依赖于整体多核苷酸并入基因组，只要植物或其细胞由于多核苷酸被引入细胞而发生改变。在本发明的一个实施方案中，可以在将多核苷酸引入细胞之后改变基因组。本发明基因组的改变包括但不限于，基因组中核苷酸的添加、缺失以及取代。尽管本发明方法不依赖于任何特定数量的核苷酸的添加、缺失以及取代，但应当意识到，这些添加、缺失或取代包含至少一个核苷酸。

B.产生农作物和控制杂草的方法

提供了控制栽培区域中的杂草、防止栽培区域中发展出或出现除草剂抗性杂草、产生农作物以及增加农作物安全性的方法。术语“控制”和及其派生词，例如，“控制杂草”，是以下中的指一个或多个：抑制杂草”的生长、发芽，繁殖和/或扩散；和/或杀死、去除、破坏或减弱杂草的出现和/或活性。

本文所用的“栽培区域”包括希望种植植物的任何区域。栽培区域括但不限于，栽培植物的田地(例如，农作物田地、草皮场、林场、施业林、培养水果和蔬菜的田地等)、温室、生长间等。

本文所用的“选择性控制”意图表示栽培区域中的大部分杂草被显著破坏或杀死，而如果田地中也存在农作物，大部分农作物不会受到显著破坏。因此，当至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的杂草被显著破坏或杀死，而如果田地中也存在农作物，少于45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、或1%的农作物被显著破坏或杀死时，该方法被认为能选择性控制杂草。

提供的方法包括用具有本文公开的HPPD序列或其活性变体或片段的植物或来源于其的转基因种子种植栽培区域，以及在具体实施方案中，向农作物、种子、杂草或其栽培区域施加有效量的目的除草剂。应当意识到，可以在栽培区域种植农作物之前或之后施加除草剂。除草剂施加可以包括施加HPPD抑制剂，包括但不限于，三酮(例如，硝磺草酮、磺草酮、苯吡唑草酮以及环磺酮)，并包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；异噁唑(例如，磺酰草吡唑和异噁唑草酮)，并包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；吡唑(例如，吡草酮、苄草唑以及吡唑特)，并包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；以及苯并双环酮，并包括其包括农业上合适的盐(例如，钠盐)。参见，WO2005/053407。在具体实施方案中，施加两种或更多种HPPD抑制剂的组合。通常，向田地施加的有效量的除草剂足以选择性控制杂草，而不会显著影响农作物。

本文所用的“杂草”是指在一定区域不希望的植物。相反，本文所用的“农作物植物”是指在一定区域希望的植物，例如，玉米或大豆植物。因此，在一些实施方案中，杂草是非农作物植物或非农作物种类，而在一些实施方案中，杂草是农作物种类，但需要从一定区域中清除，例如，例如，用具有本文公开的HPPD序列或其活性变体或片段的植物种植的田地中的较差的和/或非转基因大豆植物。

还提供了通过在能使得农作物植物产生农作物条件下，种植由于用本文公开的HPPD多核苷酸或其活性变体或片段转化而对HPPD除草剂耐受的农作物来产生农作物，以及收获农作物的方法。优选地，将HPPD抑制剂以能有效控制杂草而不会使转基因农作物无法生长和产生农作物的浓度施加到植物或植物附近。施加HPPD抑制剂可以在种植之前，或种植后的任何时间，直至并包括收获时。HPPD抑制剂可以施加一次或多次。HPPD抑制剂施加的时间安排、施加量、施加模式、以及其他参数会根据农作物的具体性质和生长环境而不同，以及本领域技术人员能够容易地确定。本发明还提供了通过该方法产生的农作物。

还提供了繁殖含有HPPD多肽或其活性变体或片段的植物的方法。植物可以是，例如，单子叶植物或双子叶植物。一方面，繁殖需要使含有HPPD多核苷酸转基因的植物与第二植物杂交，使得杂交的至少部分后代表现出HPPD抑制剂耐受性。

本发明的方法还允许开发用于具有HPPD序列或其活性变体或片段的植物的除草剂施加。在该方法中，评价栽培区域中的环境条件。可以评价的环境条件包括但不限于，土地和表面水污染问题、农作物的预期用途、农作物耐受性、土壤残留物、栽培区域中存在的杂草、土壤质地、土壤pH、土壤中有机质的量、施加环境以及耕作措施。评价环境条件后，可以将有效量的除草剂组合施加到农作物、农作物部分、农作物种子或栽培区域。

可以将任何除草剂或除草剂组合施加到具有本文公开的HPPD序列或其活性变体或片段的植物或来源于其的转基因种子、农作物部分或具有农作物的栽培区域。用“除草剂组合处理”或将“除草剂组合施加”农作物，栽培区域或田地意图表示用表明可作为组合的一部分的除草剂和/或化学品中的每种处理具体田地、农作物或杂草，从而实现理想的效果，即，选择性控制杂草，同时不显著破坏农作物。每种除草剂和/或化学品的施加可以是同时的或施加可以在不同时间(依次)，只要能实现所需的效果。此外，施加可以发生在农作物种植之前。

除草剂的分类(即，将除草剂分为各个类和亚类)是本领域公知的，包括分类by HRAC(除草剂抗性工作委员会(Herbicide Resistance ActionCommittee))和WSSA(美国杂草科学学会(Weed Science Society ofAmerica))(还可参见，Retzinger and Mallory-Smith(1997)Weed Technology11：384-393)。HRAC分类的精简版(标注了对应的WSSA组别)列于表1中。

除草剂可以根据其作用方式和／或作用位点分类，也可以根据施用的时间(例如，出土前或出土前后)、施用方法(例如，叶面施用或土壤施用)或如何被植物摄取或影响植物、或其结构分类。“作用方式”通常是指除草剂抑制或损伤的植物中的代谢或生理学过程，而“作用位点”通常是指植物中除草剂作用或直接相互作用的物理学位置或生物化学位点。除草剂可以以不同方式分类，包括作用方式和／或作用位点(参见，例如，表1)。

通常，能赋予表达除草剂耐受性基因的植物对具体除草剂或其它化学品的耐受性的除草剂耐受性基因也能赋予相同类或亚类(例如，表1所示的类或亚类)中的其它除草剂或化学品的耐受性。因此，在一些实施方案中，转基因植物耐受相同类或亚类中的多种除草剂或化学品，例如，HPPD抑制剂、草甘膦、ALS化学品、PPO抑制剂、磺酰脲和／或合成植物生长素。

通常，本发明的植物可以耐受不同类型的除草剂(即，除草剂具有不同作用方式和／或不同作用位点)的处理，从而实现改进的杂草控制策略，为了降低耐除草剂杂草的发生和流行，这种策略是值得推荐的。

表1：HRAC除草剂分类的精简版

在其它方法中，可以单独施加HPPD抑制剂或与另一目的除草剂联合施加，并且可以施加到具有本文公开的HPPD序列的植物或其栽培区域。

可以施加到具有HPPD多肽或其活性变体和片段的植物或种子的其他除草剂处理包括但不限于：乙草胺、三氟羧草醚及其钠盐、苯草醚、丙烯醛(2-丙烯醛)、甲草胺、禾草灭、莠灭净、氨唑草酮、酰嘧磺隆、氯氨吡啶酸、氨基三唑、磺胺酸铵、莎稗磷、黄草灵、阿特拉津、四唑嘧磺隆、氟丁酰草胺、草除灵、草除灵乙酯、bencarbazone、氟草胺、呋草黄、苄嘧黄隆、地散磷、噻草平、苯并双环酮、吡草酮、治草醚、双丙氨膦、双草醚及其钠盐、除草定、溴丁酰草胺、杀草全、溴草腈、溴草腈辛酸酯、丁草胺、氟丙嘧草酯、抑草磷、地乐胺、丁氧环酮、苏达灭、唑草胺、长杀草、唑酮草酯、儿茶素、甲氧除草醚、草灭平、氯溴隆、整形醇甲酯、杀草敏、氯嘧磺隆、绿麦隆、氯苯胺灵、氯磺隆、氯酞酸二甲酯、草克乐、吲哚酮草酯、环庚草醚、醚磺隆、烯草酮、炔草酯、广灭灵、氯甲酰草胺、二氯吡啶酸、二氯吡啶酸乙醇胺、氯酯磺草胺-甲基、CUH-35(2-甲氧基乙基2-[[[4-氯-2-氟-5-[(1-甲基-2-丙炔基)-氧基]苯基](3-氟-苯甲酰)氨基]羰基]-1-环己烯-1-羧酸)、苄草隆、氰草津、环草敌、环丙嘧磺隆、噻草酮、氰氟草酯、2,4-D及其butotyl、丁酯、isoctyl和异丙酯以及其二甲基铵、二乙醇胺和三乙醇胺盐、杀草隆、茅草枯、茅草枯钠盐、棉隆、2,4-DB及其二甲基铵、钾和钠盐、甜菜安、敌草净、麦草畏及其二甘醇铵、二甲基铵、钾和钠盐、敌草腈、2,4-滴丙酸、禾草灵、双氯磺草胺、甲硫野燕枯、吡氟酰草胺、二氟吡隆、恶唑隆、哌草丹、二甲草胺、二甲莠灭净、二甲吩草胺、对二甲吩草胺、噻节因、二甲基次胂酸及其钠盐、敌乐胺、特乐酚、双苯酰草胺、二溴敌草快、氟硫草定、敌草隆、DNOC、茵多酸、EPTC、戊草丹、丁氟消草、胺苯磺隆、乙呋草黄、氟乳醚、乙氧嘧磺隆、乙氧苯草胺、恶唑禾草灵、精恶唑禾草灵、四唑酰草胺、非草隆、非草隆-TCA、麦草氟甲酯、麦草氟间异丙酯、麦草氟间甲酯、啶嘧磺隆、双氟磺草胺、丁基吡氟禾草灵、精恶氟禾草灵、氟酮磺隆、氟吡磺隆、氟消草、氟噻草胺、氟哒嗪、氟哒嗪乙酯、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、伏草隆、乙羧氟草醚、氟啶嘧磺隆及其钠盐、芴醇、芴醇丁酯、氟啶草酮、氟咯草酮、氟草烟、呋草酮、氟噻甲草酯、氟磺胺草醚、甲酰胺磺隆、杀木膦铵盐、草铵膦、草铵膦、草甘膦及其盐(例如铵、异丙铵、钾、钠(包括倍半钠)和三甲基硫盐(也称为草硫膦)(参见，WO2007/024782，通过引用并入本文))、氯吡嘧磺隆、氟吡甲禾灵、甲基氟吡甲禾灵、六嗪酮、HOK-201(N-(2,4-二氟苯基)-1,5-二氢-N-(1-甲基乙基)-5-氧-1-[(四氢-2H-吡喃-2-基)-甲基]-4H-1,2,4-三唑-4-甲酰胺)、甲基咪草酸、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、咪唑喹啉酸、咪唑喹啉酸铵盐、咪唑乙烟酸、咪唑乙烟酸铵盐、唑吡嘧磺隆、茚草酮、甲基碘甲磺隆、碘苯腈、碘苯腈辛酸酯、碘苯腈钠盐、异丙隆、异恶隆、异恶草胺、异噁唑草酮、磺酰草吡唑、乳氟禾草灵、环草定、利谷隆、马来酰肼、MCPA及其盐(例如，MCPA二甲基铵盐、MCPA钾盐和MCPA钠盐、酯(例如，MCPA-2-乙基己基酯、MCPA丁氧酯)和硫酯(例如，MCPA硫乙酯)、MCPB及其盐(例如，MCPB钠盐)和酯(例如，MCPB乙酯)、氯苯氧丙酸、对氯苯氧丙酸、苯噻酰草胺、氟磺酰草胺、甲基二磺隆、硝磺草酮、威百亩钠盐、恶唑酰草胺、苯嗪草酮、吡唑草胺、甲基苯噻隆、甲基胂酸及其钙、单铵、单钠和二钠盐、甲基杀草隆、吡喃隆、秀谷隆、异丙甲草胺、S-异丙甲草胺、甲氧磺草胺、甲氧隆、赛克津、甲磺隆、草达灭、绿谷隆、萘丙胺、敌草胺、抑草生、草不隆、烟嘧磺隆、达草灭、坪草丹、黄草消、丙炔恶草酮、恶草酮、环氧嘧磺隆、恶嗪草酮、乙氧氟草醚、二氯百草枯、克草猛、壬酸、二甲戊乐灵、五氟磺草胺、甲氯酰草胺、戊基恶唑酮、黄草伏、pethoxyamid、苯敌草、毒莠定、毒莠定钾盐、氟吡酰草胺、唑啉草酯、piperofos、丙草胺、甲基氟嘧磺隆、氨氟乐灵、氯苯噻草酮、扑灭通、扑草净、扑草胺、敌稗、喔草酯、扑灭津、苯胺灵、异丙草胺、丙苯磺隆、戊炔草胺、苄草丹、氟磺隆、双唑草腈、吡草醚、磺酰草吡唑、pyrazogyl、吡唑特、苄草唑、乙基吡嘧磺隆、嘧啶肟草醚、稗草畏、哒草特、环酯草醚、甲基嘧草醚、吡丙醚、嘧硫草醚、嘧硫草醚钠盐、吡唑磺草胺、二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸、灭藻醌、乙基喹禾灵、喹禾灵、喹禾糠酯、砜嘧磺隆、稀禾定、环草隆、西玛津、西草净、磺草酮、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、2,3,6-TBA、TCA、TCA钠盐、牧草胺、丁噻隆、tefuryltrione、环磺酮、吡喃草酮、特草定、甲氧去草净、特丁津、去草净、噻吩草胺、噻草啶、thiencarbazone、甲基噻吩磺隆、禾草丹、仲草丹、苯吡唑草酮、肟草酮、野麦畏、醚苯磺隆、三嗪氟草胺、甲基苯磺隆、绿草定、绿草定丁氧基酯、绿草定三乙基铵、灭草环、草达津、三氟啶磺隆、氟乐灵、甲基氟胺磺隆、三氟甲磺隆和灭草猛。

其他除草剂包括施加到具有尿黑酸茄尼基转移酶(HST)多肽的植物的除草剂，例如描述于WO2010029311(A2)，通过引用将其整体并入本文。

其它合适的除草剂和农业化学品是本领域已知的，例如，描述于WO2005/041654。其它除草剂还包括生物除草剂，例如，Alternaria destruensSimmons,胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes(Penz.)Penz.&Sacc.),Drechsiera monoceras(MTB-951),疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)(Albertini&Schweinitz)Ditmar:Fries,棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora)(Butl.)Butl.和Puccinia thlaspeos Schub。不同除草剂的组合可以导致对杂草的大于加成作用(即，协同)和/或对农作物或其他希望植物的小于加成作用(即，安全)。在一些情况下，HPPD除草剂与具有相似的控制谱、但具有不同作用方式的其他除草剂的组合会特别有利于防止出现抗性杂草。

除草剂施加到目的区域(以及其中的任何植物)的时间对于优化杂草控制是重要的。可以参考目的区域中(例如，区域中生长的农作物植物或杂草)植物的大小和/或生长阶段和/或植物的发育确定施加除草剂的时间。

除草剂的有效量范围可以见于，例如，University Extension services的各种出版物中。参见，例如，Bernards et al.(2006)Guide for WeedManagement in Nebraska(www.ianrpubs.url.edu/sendlt/ec130);Regher etal.(2005)Chemical Weed Control for Fields Crops,Pastures,Rangeland,andNoncropland,Kansas State University Agricultural Extension Station andCorporate Extension Service;Zollinger et al.(2006)North Dakota WeedControl Guide,North Dakota Extension Service,和the Iowa State UniversityExtension at www.weeds.iastate.edu，通过引用将每篇文献并入本文.

通过本文所述的除草剂可以控制(即，杀死或破坏)许多植物种类。因此，当这些植物种类是不希望的时(即，是杂草的情况能下)，本发明的方法可用于控制这些植物种类。这些植物种类包括农作物以及通常被认为是杂草的种类，包括但不限于，诸如以下的种类：大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides)、大狗尾草(Setaria faberi)、马唐(Digitaria sanguinalis)、伏生臂形草(Brachiaria decumbens)、野燕麦(Avena fatua)、普通苍耳(Xanthiumpensylvanicum)、藜(Chenopodium album)、牵牛花(Ipomoea coccinea)、苋(Amaranthus spp.)、青麻(Abutilion theophrasti)、普通稗草(Echinochloacrus-galli)、狗牙根(Cynodon dactylon)、旱雀麦(Bromus tectorum)、蟋蟀草(Eleusine indica)、狗尾草(Setaria viridis)、多花黑麦草(Lolium multiflorum)、约翰逊草(Sorghum halepense)、小子虉草(Phalaris minor)、windgrass(Aperaspica-venti)、wooly cupgrass(Erichloa villosa)、yellow nutsedge(Cyperusesculentus)、普通繁缕(Stellaria media)、普通豚草(Ambrosia artemisiifolia)、地肤(Kochia scoparia)、加拿大飞蓬(Conyza canadensis)、黑麦草(Loliumrigidum)、牛筋草(Eleucine indica)、香丝草(Conyza bonariensis)、长叶车前(Plantago lanceolata)、热带紫露草(Commelina benghalensis)、田旋花(Convolvulus arvensis)、香附(Cyperus rotundus)、redvine(Brunnichiaovata)、大果田菁(Sesbania exaltata)、决明(Senna obtusifolia)、德克萨斯蓝蓟(Helianthus ciliaris)和长角胡麻(Proboscidea louisianica)。在其他实施方案中，杂草包括抗除草剂黑麦草，例如，抗草甘膦黑麦草、抗百草枯黑麦草、抗ACCase-抑制剂黑麦草以及抗非选择性除草剂黑麦草。

在一些实施方案中，具有本文公开的HPPD序列或其活性变体和片段的植物不会被施加到该植物上的HPPD抑制剂处理显著破坏，而合适的对照植物被相同处理显著破坏。

通常，HPPD抑制剂被施加到具体田地(以及生长其中的任何植物)不超过每年1、2、3、4、5、6、7或8次，或不超过每种植季1、2、3、4、或5次。

因此，本发明的方法包括的施加除草剂为“出土前”、“出土后”、“种植前掺入”和/或涉及种植之前的种子处理。

在一个实施方案中，提供了包被种子的方法。该方法包括用有效量的除草剂或除草剂组合(如本文其他部分所公开的)包被种子。然后，可以在栽培区域中种植种子。还提供了具有包被的种子，所述包被包含有效量的除草剂或除草剂组合(如本文其他部分所公开的)。在其他实施方案中，种子可以包被有至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂和/或至少一种除草剂或以上的任何组合。

“出土前”是指在可看到植物从土壤萌出之前，向目的区域(例如，田地或栽培区域)施加除草剂。“出土后”是指在可看到植物从土壤萌出之后，向区域施加除草剂。在某些情况下，术语“出土前”和“出土后”是相对于目的区域中的杂草而言，以及在某些情况下，这些术语是相对于目的区域中的农作物而言。当涉及杂草时，这些术语可以仅适用于存在于或认为存在于目的区域中的具体杂草类型或杂草种类。尽管任何除草剂可以被施加在出土前和/或出土后处理中，某些除草剂已知在出土前或出土后处理时能更有效地控制杂草。例如，砜嘧磺隆具有出土前和出土后活性，而其他除草剂主要具有出土前(异丙甲草胺)或出土后(草甘膦)活性。具体除草剂的这些性质是本领域已知的，并且本领域技术人员可容易地确定。此外，本领域技术人员能容易地选择合适的用于本发明的转基因植物和/或要种植本发明的转基因植物的区域的除草剂和施加次数。“种植前掺入”涉及在种植前将化合物掺入土壤。

因此，提供了种植农作物和/或控制杂草(例如，“种植前烧毁”)的改进的方法，其中在种植目的农作物之前，用除草剂处理区域，从而更好地控制杂草。本发明还提供了种植农作物和/或控制杂草的方法，其是“免耕”或“低耕”(也称为“少耕”)。在这些方法中，与传统方法相比，在种植周期中不耕种土壤或耕种土壤频率较低；这些方法可以节省额外耕种所产生的费用，包括劳动力和燃料费用。

术语“安全剂”是指当添加到除草剂制剂中能消除或降低除草剂对某些农作物的植物性毒素作用的物质。本领域技术人员应当理解，安全剂的选择在一定程度上取决于目的农作物和具体除草剂或除草剂组合。适合用于本申请公开的除草剂组合物中的示例性的安全剂包括但不限于，公开于美国专利4,808,208；5,502,025；6,124,240和美国专利申请公布2006/0148647；2006/0030485；2005/0233904；2005/0049145；2004/0224849；2004/0224848；2004/0224844；2004/0157737；2004/0018940；2003/0171220；2003/0130120；2003/0078167的那些，通过引用将以上文献整体并入本文。本发明的方法可以涉及联合使用除草剂和除草剂安全剂(例如解草嗪，BCS(1-溴-4-[(氯甲基)磺酰基]苯)，解毒喹，解草胺腈，二氯丙烯胺，2-(二氯甲基)-2-甲基-1,3-二氧戊环(MG191)，解草唑，解草啶，解草安，氟草肟，解草恶唑，双苯恶唑酸，吡唑解草酯，甲氧基酰苯((4-甲氧基-3-甲基苯基)(3-甲基苯基)-甲酮)，萘二甲酸酐(1,8-萘二甲酸酐)和解草腈)以增加农作物安全。解毒有效量的除草剂安全剂可以与本发明的化合物同时施加或应用为种子处理。因此，本发明的一方面涉及使用包含HPPD抑制剂、至少一种其他除草剂以及解毒有效量的除草剂安全剂的混合物。

种子处理在选择性杂草控制中是有用的，因为其在物理上将解毒限制于农作物。因此，在一个实施方案中，选择性控制田地中的杂草生长的方法包括用解毒有效量的安全剂处理长出农作物的种子，并用有效量的除草剂处理田地以控制杂草。

当用安全剂处理所需的植物，使得与除草剂对未用安全剂处理的植物的影响相比，除草剂对植物的影响降低时，认为提供了解毒有效量的安全剂；通常，解毒有效量的安全剂防止对用安全剂处理的植物造成损伤或严重损伤。本领域技术人员能确定使用安全剂是否是合适的，并能确定应当给予农作物的安全剂的剂量。

本文所用的“佐剂”是添加到喷雾溶液或制剂用来改变农业化学品的作用或喷雾溶液的物理性质的任何材料。参见，例如，Green and Foy(2003)“Adjuvants:Tools for Enhancing Herbicide Performance,”in Weed Biologyand Management,ed.Inderjit(Kluwer Academic Publishers,TheNetherlands)。佐剂可以分类为或亚分类为活化剂、酸化剂、缓冲剂、添加剂、粘附剂、防絮凝剂、消泡剂、去沫剂、防冻剂、引诱剂、基本混合物、螯合剂、清洁剂、着色剂或染料、相容剂、助溶剂、偶联剂、农作物油浓缩物、沉积剂、去垢剂、分散剂、流动控制剂、乳化剂、蒸发减弱剂、填充剂、肥料、泡沫标记、配制剂、惰性剂、润湿剂、甲基化种子油、高负荷COC、聚合物、改良植物油、渗透剂、防护剂、矿物油浓缩物、防腐剂、防雨剂、助流剂、增溶剂、表面活性剂、散播剂、粘性剂、增效剂、增稠剂、易位辅佐剂、紫外线防护剂、植物油、净水剂以及润湿剂。

此外，本发明的方法可以包括使用除草剂或除草剂与一种或多种其他杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学不孕剂、化学信息素、驱虫剂、引诱剂、外激素、取食刺激剂或其他生物活性化合物或昆虫致病性细菌、病毒或真菌的混合物，从而形成能提供更广的农业保护谱的多组分混合物。可以用于本发明的方法的农业保护剂的实例包括：杀虫剂，例如阿巴克丁、高灭磷、啶虫脒、磺胺螨酯(S-1955)、阿维菌素、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、联苯肼酯、噻嗪酮、卡巴呋喃、巴丹、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、可尼丁、丁氟螨酯、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、狄氏剂、二氟脲、四氟甲醚菊酯、乐果、呋虫胺、苯虫醚、埃玛菌素、硫丹、顺式氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威、苯氧威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、氟蚁腙、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、氯芬奴隆、马拉松、氰氟虫腙、聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、甲氧普林、甲氧滴滴涕、甲氧苄氟菊酯、久效磷、甲氧虫酰肼、烯啶虫胺、硝乙脲噻唑、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、草氨酰、对硫磷、甲基对硫磷、苄氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷酰胺酮、抗蚜威、丙溴磷、丙氟菊酯、吡蚜酮、pyrafluprole、除虫菊酯、啶虫丙醚、pyriprole、吡丙醚、鱼藤酮、利阿诺定、多杀菌素、螺螨酯、螺甲螨酯(BSN2060)、螺虫乙酯、硫丙磷、虫酰肼、氟苯脲、七氟菊酯、特丁磷、四氯乙烯磷、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫单、四溴菊酯、唑蚜威、敌百虫和杀铃脲；杀真菌剂，例如，活化酯、aldimorph、吲唑磺菌胺、氧环唑、嘧菌酯、苯霜灵、苯菌灵、苯噻菌胺、异丙基苯噻菌胺、binomial、联苯、联苯三唑醇、杀稻瘟素、波尔多混合剂(三元硫酸铜)、啶酰菌胺(boscalid/nicobifen)、糠菌唑、乙嘧酚磺酸酯、丁硫啶、萎锈灵、环丙酰菌胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、乙菌利、克霉唑、氯氧化铜、酮盐(例如硫酸铜和氢氧化铜)、氰霜唑、环氟菌胺、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、抑菌灵、双氯氰菌胺、哒菌酮、氯硝胺、乙霉威、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、甲氧菌平、烯唑醇、烯唑醇-M、阿乐丹、discostrobin、二噻农、十二环吗啉、多果定、益康唑、乙环唑、克瘟散、氟环唑、噻唑菌胺、乙菌定、土菌灵、恶唑酮菌、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、丙森锌、甲呋酰胺、环酰菌胺、氰菌胺、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、三苯基乙酸锡、三苯基氢氧化锡、福美铁、ferfurazoate、嘧菌腙、氟啶胺、咯菌腈、flumetover、氟吡菌胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟喹唑、氟硅唑、磺菌胺、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、乙磷铝、呋喃基苯并咪唑、呋霜灵、福拉比、己唑醇、恶霉灵、双胍盐、伊米萨利、亚胺唑、双胍辛胺、硫双威、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、丙森锌、异康唑、富士一号、春日霉素、甲氧胺菌灵、代森锰锌、双炔酰菌胺、代森锰、嘧菌胺、甲霜灵、灭锈胺、甲霜林、叶菌唑、磺菌威、代森联、苯氧菌胺/fenominostrobin、嘧菌胺、苯菌酮、咪康唑、腈菌唑、甲胂铁铵(ferricmethanearsonate)、氟苯嘧啶醇、辛噻酮、呋酰胺、肟醚菌胺、恶霜灵、恶喹酸、oxpoconazole、氧基萎锈灵、多效唑、戊菌唑、戊菌隆、吡噻菌胺、perfurazoate、膦酸、苯酞、picobenzamid、啶氧菌酯、多氧菌素、烯丙苯噻唑、咪鲜胺、腐霉利、霜霉威、盐酸霜霉威、丙环唑、甲基代森锌、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、定菌磷、啶斑肟、嘧霉胺、啶斑肟、吡咯尼群、咯喹酮、quinconazole、喹氧灵、五氯硝基苯、硫硅菌胺、硅氟唑、螺环菌胺、链霉素、硫磺、戊唑醇、techrazene、叶枯酞、四氯硝基苯、四氟醚唑、噻苯咪唑、噻氟菌胺、硫菌灵、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、甲基立枯磷、甲苯氟磺胺、三唑酮、三唑醇、嘧菌醇、咪唑嗪、十三吗啉、替瑞酰胺、三环唑、肟菌酯、嗪氨灵、灭菌唑、烯效唑、井冈霉素、农利灵、代森锌、福镁锌、以及苯酰菌胺；杀线虫剂，例如涕灭威、草氨酰和苯线磷；杀细菌剂，例如链霉素；杀螨剂，例如双甲脒、灭螨猛、克氯苯、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、乙螨唑、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、霸螨灵、噻螨酮、克螨特、哒螨灵和吡螨胺；以及生物剂，包括昆虫致病性细菌，例如苏云金芽孢杆菌Aizawai亚种，苏云金芽孢杆菌Kurstaki亚种，以及封装的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素(例如，细胞cap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，例如绿僵病真菌；以及昆虫致病性病毒，包括杆状病毒，核型多角体病毒(NPV)，例如HzNPV，AfNPV；以及颗粒型病毒(GV)，例如CpGV。

控制杂草的方法还可以包括施加生物学有效量的目的除草剂或除草剂与有效量的至少一种其他生物活性化合物或生物活性剂的混合物，并且还可以包含表面活性剂、固体稀释剂或液体稀释剂中的至少一种。生物活性化合物或生物活性剂的实例是：杀虫剂，例如阿巴克丁、高灭磷、啶虫脒、磺胺螨酯(S-1955)、阿维菌素、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、binfenazate、噻嗪酮、卡巴呋喃、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、可尼丁、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、二氟脲、乐果、苯虫醚、埃玛菌素、硫丹、顺式氰戊菊酯、乙虫腈、fenothicarb、苯氧威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、τ-氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、氯芬奴隆、马拉松、聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、甲氧普林、甲氧滴滴涕、久效磷、甲氧虫酰肼、硝乙脲噻唑、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、草氨酰、对硫磷、对硫磷-甲基、苄氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷酰胺酮、抗蚜威、丙溴磷、吡蚜酮、啶虫丙醚、吡丙醚、鱼藤酮、多杀菌素、螺甲螨酯(BSN2060)、硫丙磷、虫酰肼、氟苯脲、七氟菊酯、特丁磷、四氯乙烯磷、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威杀虫单、四溴菊酯、敌百虫和杀铃脲；杀真菌剂，例如活化酯、嘧菌酯、苯菌灵、杀稻瘟素、波尔多混合剂(三元硫酸铜)、糠菌唑、环丙酰菌胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、氯氧化铜、铜盐、环氟菌胺、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、(S)-3,5-二氯-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)-4-甲基苯甲酰胺(RH7281)、双氯氰菌胺(S-2900)、哒菌酮、氯硝胺、苯醚甲环唑、(S)-3,5-二氢-5-甲基-2-(甲硫基)-5-苯基-3-(苯基-氨基)-4H-咪唑-4-酮(RP407213)、烯酰吗啉、甲氧菌平、烯唑醇、烯唑醇-M、多果定、克瘟散、氟环唑、恶唑酮菌、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、丙森锌(SZX0722)、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、三苯基乙酸锡、三苯基氢氧化锡、氟啶胺、咯菌腈、flumetover(RPA403397)、flumorf/flumorlin(SYP-L190)、氟嘧菌酯(HEC5725)、氟喹唑、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、乙磷铝、呋霜灵、福拉比(S-82658)、己唑醇、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、富士一号、春日霉素、甲氧胺菌灵、代森锰锌、代森锰、甲霜灵、灭锈胺、甲霜林、叶菌唑、苯氧菌胺(metomino-strobin/fenominostrobin)(SSF-126)、苯菌酮(AC375839)、腈菌唑、甲胂铁铵(ferric methane-arsonate)、啶酰菌胺(BAS510)、肟醚菌胺、恶霜灵、戊菌唑、戊菌隆、烯丙苯噻唑、咪鲜胺、霜霉威、丙环唑、碘喹唑酮(DPX-KQ926)、丙硫菌唑(JAU6476)、啶斑肟、唑菌胺酯、嘧霉胺、咯喹酮、喹氧灵、螺环菌胺、硫磺、戊唑醇、四氟醚唑、噻苯咪唑、噻氟菌胺、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、三唑酮、三唑醇、三环唑、肟菌酯、灭菌唑、井冈霉素和农利灵；杀线虫剂例如涕灭威、草氨酰和苯线磷；杀细菌剂，例如链霉素；杀螨剂例如双甲脒、灭螨猛、克氯苯、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、乙螨唑、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、霸螨灵、噻螨酮、克螨特、哒螨灵和吡螨胺；以及生物剂，包括昆虫致病性细菌，例如苏云金芽孢杆菌Aizawai亚种，苏云金芽孢杆菌Kurstaki亚种，以及封装的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素(例如，细胞cap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，例如绿僵病真菌；以及昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核型多角体病毒(NPV)，例如HzNPV，AfNPV；以及颗粒型病毒(GV)，例如CpGV。本发明的方法还可以包括使用经过遗传转化而表达对无脊椎害虫有毒性的蛋白(例如苏云金芽孢杆菌δ-内毒素)的植物。在这些实施方案中，外源施加的无脊椎害虫控制化合物的效果可以与表达的毒素蛋白协同作用。关于农业保护剂的一般文献包括ThePesticide Manual,13th Edition,C.D.S.Tomlin,Ed.,British Crop ProtectionCouncil,Farnham,Surrey,U.K.,2003and The BioPesticide Manual,2^ndEdition,L.G.Copping,Ed.,British Crop Protection Council,Farnham,Surrey,U.K.,2001。

在一些情况下，与具有相似的控制谱、但不同作用方式的其他无脊椎害虫控制化合物或试剂组合特别有利于抗性控制。因此，本发明的组合物可以还包含生物学有效量的至少一种具有相似的控制谱、但不同作用方式的其他无脊椎害虫控制化合物或试剂。将经过遗传修饰而表达植物保护化合物(例如，蛋白)的植物或植物的基因座与生物学有效量的本发明化合物接触也可以提供更宽的植物保护谱并且有利于抗性控制。

因此，控制杂草的方法可利用除草剂或除草剂组合，并且可以还包括使用杀虫剂和/或杀真菌剂，和/或其它农业化学品，例如肥料。使用本发明的这些组合处理可以拓宽对于其他杂草种类的活性谱并抑制任何抗性生物型的增殖。

该方法可以还包括使用植物生长调节剂例如avi甘氨酸，N-(苯基甲基)-1H-嘌呤-6-胺、乙烯利、丙酰芸苔素内酯、赤霉酸、赤霉素A4和A7、过敏蛋白、助壮素水剂、调环酸钙盐、茉莉酸诱导体、复硝酚钠和抗倒酯，以及植物生长改良生物，例如蜡样芽胞杆菌株BP01。

C.检测方法

提供了检测HPPD多肽或其活性变体或片段的方法。所述方法包括分析植物组织以检测所述多肽或编码其的多核苷酸。检测方法可以直接测定HPPD多肽或多核苷酸的存在，或检测方法可以通过测定细胞植物、植物细胞或植物外植体表达序列的表型来间接测定序列。

在一个实施方案中，利用免疫测定检测植物组织中的HPPD多肽，所述免疫测定包含一种或多种能特异性地识别HPPD多肽或其活性变体或片段的抗体。在具体实施方案中，所用的抗体是针对本文公开的HPPD多肽或其活性变体或片段而引发的。

“特异性地或选择性结合”意图表示结合剂对于本文公开的给定HPPD多肽或片段或变体的结合亲和力大于对已知HPPD序列的结合亲和力的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。本领域技术人员能够知晓实施该测定所需的合适的对照。

“能特异性地结合的抗体”意图表示该抗体基本上不与另一多肽交叉反应。“基本上不交叉反应”意图表示该抗体或其片段对于另一多肽的结合亲和力少于对HPPD多肽或其活性片段或变体的结合亲和力的10%、5%或1%。

在其他实施方案中，可以通过检测编码任何多种HPPD多肽或其活性变体和片段的多核苷酸的存在来检测植物组织中的HPPD多肽或其活性变体或片段。在一个实施方案中，检测方法包括利用PCR扩增检测植物组织。

本文所用的“引物”是分离的多核苷酸，其能通过核酸杂交与互补靶DNA链退火而形成引物与靶DNA链的杂交体，然后通过聚合酶(例如，DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。本发明的引物对指其在扩增靶多核苷酸中的用途，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法。“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增具体DNA区段的技术(参见，美国专利4,683,195和4,800,159；通过引用并入本文)。

探针和引物具有足够的核苷酸长度而能结合靶DNA序列并特异性地检测和/或鉴定编码本文其它部分所述的HPPD多肽或其活性变体或片段的多核苷酸。应当意识到，操作人员可以确定杂交条件或反应条件来实现该结果。所述长度可以是任何长度，其足以用于所选的检测方法。探针和引物可以在高严紧性杂交条件下与靶序列特异性地杂交。按照本发明实施方案的探针和引物可以与靶序列中的连续核苷酸具有完全DNA序列同一性，但是可以通过常规方法设计与靶DNA序列不同并保留特异性地检测和/或鉴定靶DNA序列的能力的探针。因此，探针和引物可以与靶多核苷酸享有约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性或互补性。

制备和使用探针和引物的方法描述于，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2.sup.nd ed,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1989(本文称为“Sambrook et al.,1989”);Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(以及定期更新)(本文称为“Ausubel et al.,1992”);和Innis et al.,PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San Diego,1990。PCR引物对可以来源于已知序列，例如，利用用于该目的的计算机程序，例如Vector NTI第10版(Invitrogen)中的PCR引物分析工具；PrimerSelect(DNASTAR Inc.,Madison,Wis.);和Primer(Version0.5.COPYRGT.,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)。此外，利用本领域技术人员已知的指南可以肉眼检查序列并手动鉴定引物。

D.鉴定HPPD变体的方法

各种方法可以可用于鉴定其它HPPD变体。本发明的多核苷酸除了在例如Ausubel、Berger和Sambrook中所述的标准克隆方法中使用之外，还可被任选地用作多种多样性产生操作(例如，突变、重组和回归重组反应)中的基础，即，产生具有所需性质的其他HPPD多核苷酸和多肽。可以使用多种多样性产生操作。所述操作可以分别使用和/或联合使用来产生多核苷酸或多核苷酸组的一个或多个变体，以及编码蛋白的变体。这些操作单独地以及总体地提供了稳健、广泛可用的产生多样性多核苷酸和多核苷酸组(包括，例如，多核苷酸文库)的方式，所述多核苷酸和多核苷酸组可用于例如使多核苷酸、蛋白、通路、细胞和/或生物获得或快速进化出新的和/或改进的特征。改变序列的过程可以导致例如，核酸序列区的单核苷酸取代、多核苷酸取代以及插入或缺失。

尽管在后续讨论中为了清楚进行了区别和分类，但应当理解，所述技术通常不是互相排斥的。事实上，不同方法可以单独使用或联合使用(平行进行或依次进行)来获得不同序列变体。

本文所述的任何多样性产生操作的结果可以是得到一个或多个多核苷酸，可以选择或筛选其中编码具有或赋予所需性质的蛋白的多核苷酸。在通过本文中的或本领域技术人员可获得的一种或多种方法进行多样化之后，可以选择产生的任何多核苷酸的所需的活性或性质，例如改变的Km、其它辅因子的用途，增加的k_cat等。这可以包括鉴定可以通过本领域中的任何测定例如在自动化或可自动化形式中被检测出的任何活性。例如，通过测定对HPPD抑制剂的增加的不敏感性可以检测修饰的HPPD多肽。测量该活性的检测如本文其他部分所述。操作人员根据判断可以(平行或依次)评价多种相关的(或甚至不相关的)性质。

多种多样性产生操作(包括家族重排)和产生编码多个酶学结构域的修饰的核酸序列的方法的描述见于以下出版物和其中引用的文献：SoongN.et al.(2000)Nat Genet25(4):436-39;Stemmer et al.(1999)TumorTargeting4:1-4;Ness et al.(1999)Nature Biotechnology17:893-896;Changet al.(1999)Nature Biotechnology17:793-797;Minshull and Stemmer(1999)Current Opinion in Chemical Biology3:284-290;Christians et al.(1999)Nature Biotechnology17:259-264;Crameri et al.(1998)Nature391:288-291;Crameri et al.(1997)Nature Biotechnology15:436-438;Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Patten et al.(1997)CurrentOpinion in Biotechnology8:724-733;Crameri et al.(1996)Nature Medicine2:100-103;Crameri et al.(1996)Nature Biotechnology14:315-319;Gates etal.(1996)Journal of Molecular Biology255:373-386;Stemmer(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”In:The Encyclopedia of MolecularBiology.VCH Publishers,New York.pp.447-457;Crameri and Stemmer(1995)BioTechniques18:194-195;Stemmer et al.(1995)Gene:164:49-53;Stemmer(1995)Science270:1510;Stemmer(1995)Bio/Technology13:549-553;Stemmer(1994)Nature370:389-391;和Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751。也可参见，WO2008/073877和US20070204369，通过引用将两篇文献整体并入本文。

产生多样性的突变方法包括，例如，定点诱变(Ling et al.(1997)AnalBiochem.254(2):157-178;Dale et al.(1996)Methods Mol.Biol.57:369-374;Smith(1985)Ann.Rev.Genet.19:423-462;Botstein&Shortle(1985)Science229:1193-1201;Carter(1986)Biochem.J.237:1-7;和Kunkel(1987)NucleicAcids&Molecular Biology(Eckstein,F.and Lilley,D.M.J.eds.,SpringerVerlag,Berlin));利用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492;Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154,367-382;and Bass et al.(1988)Science242:240-245);oligonucleotide-directed mutagenesis(Methods in Enzymol.100:468-500(1983);Methods in Enzymol.154:329-350(1987);Zoller&Smith(1982)Nucleic Acids Res.10:6487-6500;Zoller&Smith(1983)Methods inEnzymol.100:468-500;和Zoller&Smith(1987)Methods in Enzymol.154:329-350);硫代磷酸修饰的DNA诱变(Taylor et al.(1985)Nucl.AcidsRes.13:8749-8764;Taylor et al.(1985)Nucl.Acids Res.13:8765-8787(1985);Nakamaye&Eckstein(1986)Nucl.Acids Res.14:9679-9698;Sayerset al.(1988)Nucl.Acids Res.16:791-802;和Sayers et al.(1988)Nucl.AcidsRes.16:803-814);利用缺口双链DNA的诱变(Kramer et al.(1984)Nucl.Acids Res.12:9441-9456;Kramer&Fritz(1987)Methods in Enzymol.154:350-367;Kramer et al.(1988)Nucl.Acids Res.16:7207;和Fritz et al.(1988)Nucl.Acids Res.16:6987-6999)。

其他合适的方法包括但不限于，点错配修复(Kramer et al.(1984)Cell38:879-887),利用修复缺陷型宿主株的诱变(Carter et al.(1985)Nucl.Acids Res.13:4431-4443;和Carter(1987)Methods in Enzymol.154:382-403),缺失诱变(Eghtedarzadeh&Henikoff(1986)Nucl.Acids Res.14:5115),restriction-selection and restriction-purification(Wells et al.(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423),mutagenesis by total genesynthesis(Nambiar et al.(1984)Science223:1299-1301;Sakamar andKhorana(1988)Nucl.Acids Res.14:6361-6372;Wells et al.(1985)Gene34:315-323;和

et al.(1985)Nucl.Acids Res.13:3305-3316),以及双链断裂修复(Mandecki(1986);Arnold(1993)Current Opinion inBiotechnology4:450-455and Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181)。很多上述方法的其他细节可以见于方法Methods in Enzymology Volume154，其还描述了解决不同诱变方法的问题的可用对照。

关于不同多样性产生方法的其他细节可以见于以下美国专利、PCT公布以及EPO公布：美国专利5,605,793、美国专利5,811,238、美国专利5,830,721、美国专利5,834,252、美国专利5,837,458、WO95/22625、WO96/33207、WO97/20078、WO97/35966、WO99/41402、WO99/41383、WO99/41369、WO99/41368、EP752008、EP0932670、WO99/23107、WO99/21979、WO98/31837、WO98/27230、WO98/13487、WO00/00632、WO00/09679、WO98/42832、WO99/29902、WO98/41653、WO98/41622、WO98/42727、WO00/18906、WO00/04190、WO00/42561、WO00/42559、WO00/42560、WO01/23401以及PCT/US01/06775。也可参见WO20074303，通过引用并入本文.

简而言之，数种不同大类的序列修饰方法(例如突变，重组等)适用于本发明，并描述于例如上文的文献。即，可以在序列连接之前或连接步骤之后通过任何数量的所述操作来改变组成核酸序列以产生修饰的基因融合构建体。以下示例性地描述了在本发明中用于产生多样性的部分不同类型的优选形式，包括例如，某些基于重组的多样性产生形式。

可以通过上文的文献中讨论的任何多种技术体外重组核酸，包括例如，待重组的核酸的DNA酶消化，然后进行核酸的连接和/或PCR重新组装。例如，可以使用有性PCR诱变，其中进行DNA分子的随机(或假随机，或甚至非随机)片段化，然后基于序列相似性，进行DNA分子与不同、但相关的DNA序列之间的体外重组，然后通过在聚合酶链式反应中延伸来固定交换。该过程和很多过程变形描述与上文的数篇文献中，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751。

相似地，可以体内回归重组核酸，例如，通过允许重组在细胞中的核酸之间发生。很多这样的体内重组形式描述于上文的文献。这些形式任选地提供目的核酸之间的直接重组，或提供包含目的核酸的载体、病毒、质粒等之间的重组，以及其他形式。关于这些操作的细节见于上文的文献中。

也可以使用全基因组重组方法，其中细胞或其他生物的全基因组被重组，任选地包括用所需文库组成部分(例如，对应于本发明的通路的基因)强化基因组重组混合物。这些方法具有很多应用，包括在靶基因的身份是未知的情况下。这些方法的细节见于，例如，WO98/31837和PCT/US99/15972。因此，任何这些重组、回归重组以及全基因组重组(单独使用或组合使用)的过程和技术可用于产生本发明的修饰的核酸序列和/或修饰的基因融合构建体。

也可以使用合成重组方法，其中在PCR或连接反应中合成和重新组装对应于目的靶标的寡核苷酸，所述反应包括对应于多个母体核酸的寡核苷酸，从而产生新的重组核酸。寡核苷酸可以通过标准核苷酸加成方法来制备，或可以通过例如三核苷酸合成方法来制备。关于这些方法的细节可见于上文的文献中，包括，例如，WO00/42561，WO01/23401，WO00/42560和WO00/42559。

可以使用电子重组方法，其中在计算机中使用基因算法来重组对应于同源(或甚至非同源)核酸的序列串。通过合成对应于重组序列的核酸，得到的重组序列串被任选地转化为核酸，例如，联合寡核苷酸合成/基因重新组装技术。该方法可以产生随机的、部分随机的或设计的变体。关于电子重组的很多细节(包括计算机系统中基因算法的使用、遗传算子等，与产生对应核酸(和/或蛋白)联合，以及设计的核酸和/或蛋白(例如，基于交叉位点选择)的组合以及设计的、假随机或随机重组方法)描述于WO00/42560和WO00/42559。

相似地，可以使用很多获得天然多样性的方法，例如，不同核酸或核酸片段与单链模板杂交，然后聚合和/或连接来再生全长序列，任选地，然后进行模板的降解并回收得到的修饰的核酸。在利用单链模板的一种方法，来自基因组文库的片段集合与部分的或通常接近全长的ssDNA或对应于相对链的RNA退火。然后，通过未杂交片段末端的核酸酶-碱基移除、进行聚合来填充这些片段之间的空位以及后续的单链连接来介导来自该集的复合嵌合基因的组装。可以通过消化(例如，如果含有RNA或尿嘧啶)、变性条件下的磁性分离(如果以能进行该分离的方式进行了标记)和其他可用的分离/纯化方法去除母体多核苷酸链。或者，母体链任选地与嵌合链共同纯化，并在后续筛选和加工步骤中去除。关于该方法的其他细节可见于，例如，PCT/US01/06775。

在另一方法中，单链分子被转变为双链DNA(dsDNA)，dsDNA分子通过配体介导的结合与固体支持物结合。分离未结合的DNA之后，选定的DNA分子从支持物释放，并被引入合适的宿主细胞，从而产生富含与探针杂交的序列的文库。按该方式产生的文库提供了用于利用本文所述的任何操作进一步多样化的理想基础。

可以反复实施任何上述一般重组形式(例如，一个或多个突变/重组循环或其它多样性产生方法，任选地随后进行一个或多个选择方法)，从而产生更多样化的重组核酸集合。

利用多核苷酸链终止法的诱变也被推荐(参见，例如，美国专利5,965,408和上文的文献)，并且可用于本发明。在该方法中，在存在或不存在一个或多个享有序列相似性区的基因的特异性引物的情况下，将对应于所述基因的双链DNA组合和变性。然后，使单链多核苷酸退火，并在聚合酶和链终止剂(例如，紫外线，γ或X射线辐射；溴化乙锭或其他嵌入剂；DNA结合蛋白，例如单链结合蛋白，转录激活因子或组蛋白；多环芳香碳氢化合物；三价铬或三价铬盐；或快速热循环介导的缩短聚合等)的存在下孵育，导致产生部分双链分子。然后，在后续轮次的复制或部分复制中使部分双链分子(例如，含有部分延伸的链)变性和再退火，从而得到享有不同的序列相似性度并与起始DNA分子群体不同的多核苷酸。任选地，可以在过程中的一个或多个阶段扩增产物或部分的产物库。链终止法(例如按照上述)产生的多核苷酸适合作为任何其它所述重组形式的基础。

还可以利用称为“用于产生杂合酶的逐步截短(“ITCHY”)”的重组操作在核酸或核酸集合中产生多样性，其描述于Ostermeier et al.(1999)Nature Biotech17:1205。该方法可以用于产生变体的初始文库，其可以任选地作为一个或多个体外或体内重组方法的基础。也可参见，Ostermeieret al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:3562-67;Ostermeier et al.(1999),Biological and Medicinal Chemistry7:2139-44。

能导致单个核苷酸或连续或非连续的核苷酸组的改变的突变方法可以有利地用于将核苷酸多样性引入本发明的核酸序列和/或基因融合构建体。很多诱变方法可见于上文的文献；关于诱变方法的其他细节可见于以下内容，以下内容也可以用于本发明。

例如，易错PCR可以用于产生核酸变体。利用该技术，在低DNA聚合酶拷贝保真度的条件下进行PCR，使得能沿着PCR产物的整个长度获得高水平的点突变。这类技术的实例可见于上文的文献，并例如，Leunget al.(1989)Technique1:11-15和Caldwell et al.(1992)PCR Methods Applic.2:28-33。相似地，可以使用组装PCR，该过程涉及从小DNA片段混合物组装PCR产物。大量不同的PCR反应可以在同一反应混合物中平行地发生，一个反应的产物引发另一反应的产物。

寡核苷酸定向诱变可以用于在目的核酸序列中引入位点特异性突变。该技术的实例可见于上文的文献，并例如，Reidhaar-Olson et al.(1988)Science241:53-57。相似地，可以使用盒诱变，该过程将双链DNA分子的小区域替换为不同于天然序列的合成的寡核苷酸盒。寡核苷酸可以含有例如完全和/或部分随机化的天然序列。

回归整体诱变是这样的过程，其中蛋白诱变的算法被用于产生表行相关突变体的多样化群体，该群体的成员在氨基酸序列上不同。该方法使用反馈机制来监控连续轮次的组合盒诱变。该方法的实例可见于Arkin&Youvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815。

指数整体诱变可以用于产生具有高独特性百分比的组合文库和功能性突变体。目的序列中的小组残基被平行地随机化来鉴定每个改变的位置上能得到功能性蛋白的氨基酸。该方法的实例可见于Delegrave&Youvan(1993)Biotechnology Research11:1548-1552。

体内诱变可以通过在例如携带一个或多个DNA修复通路中的突变的大肠杆菌株中使DNA扩增，而被用于在任何科隆的目的DNA中产生随机突变。这些"突变"株比野生型母体具有更高的随机突变速率。使DNA在这些株之一中扩增最终会产生DNA中的随机突变。这些方法描述于上文的文献中。

将多样性引入基因组(例如，细菌、真菌、动物或植物基因组)的其它方法可以可以与上文所述的和/或引用的方法联合使用。例如，除了上文的方法之外，还推荐产生适于转化入多个物种的核酸多聚体的技术(参见，例如，美国专利5,756,316和上文的文献)。用由相对于彼此不同(例如，来源于天然多样性或通过施加定点诱变、诱变PCR、通过致突变细菌株的传代等)的基因组成的多聚体转化合适的宿主提供DNA多样化的核酸多样性来源(例如，通过上文所述的体内重组过程)。

或者，享有部分序列相似性区的大量单体多核苷酸可以被转化入宿主种类并由宿主细胞体内重组。后续轮次的细胞分裂可以用于产生文库，文库的成员包括单个的同质群体或单体多核苷酸的库。或者，可以通过标准技术(例如，PCR和/或克隆)回收单体核酸，并以任何重组形式进行重组，包括上文所述的回归重组形式。

产生多物种表达文库的方法已有描述(除上文的文献之外，参见，例如，美国专利5,783,431和美国专利5,824,485)以及其在鉴定蛋白目的活性中的应用已被推荐(除上文的文献之外，参见，美国专利5,958,672)。多物种表达文库通常包括包含来自多个物种或品种的cDNA或基因组序列的文库，所述序列在表达盒中可操作地连接于合适的调节序列。cDNA和/或基因组序列任选地随机连接以进一步增强多样性。载体可以是适于在多个宿主生物物种(例如，细菌种类，真核细胞)中转化和表达的穿梭载体。在某些情况下，通过预先选择编码目的蛋白或与目的核酸杂交的序列使文库偏向。任何这些文库可以被提供为本文所述的任何方法的基础。

上文所述的方法主要致力于增加核酸和/或编码蛋白的多样性。然而，在很多情况下，并非所有的多样性都是有用的(例如，有功能的)，并且仅会增加必须进行筛选或选择以鉴定少数有利变体的变体背景。在某些应用中，需要在多样化(例如，通过基于重组的诱变方法)之前预先选择或预先筛选文库(例如，扩增的文库、基因组文库、cDNA文库、标准化的文库等)或其他基础核酸，或将基础偏向于编码功能性产物的核酸。例如，对于抗体工程化，通过在利用任何所述的方法进行操作之前利用体内重组事件，可能将多样性产生过程偏向于具有功能性抗原结合位点的抗体。例如，在按照任何本文所述的方法进行多样化之前，可以将来源于B细胞cDNA文库的重组CDR扩增并组装入框架区(例如，Jirholt et al.(1998)Gene215:471)。

文库可以偏向于编码具有所需酶活性的蛋白的核酸。例如，在从文库鉴定表现出规定活性的变体之后，可以利用任何已知的引入DNA改变的方法对进行变体诱变。然后，筛选包含诱变同源物的文库中所需的活性，其可以与初始规定的活性相同或不同。该方法的实例在美国专利5,939,250中提议。可以通过本领域已知的任何方法鉴定所需活性。例如，通过将来自基因文库的提取与获自代谢丰富的细胞的组分组合并鉴定表现出所需活性的组合，可以筛选WO99/10539提议基因文库。还提议了(例如，WO98/58085)，通过将生物活性底物插入文库的样品并利用荧光分析仪(例如，流式细胞仪、CCD、荧光计或分光光度计)检测对应于所需活性的产物的生物活性荧光，可以鉴定具有所需活性的克隆。

文库还可以偏向于具有规定特征(例如，与选定核酸探针杂交)的核酸。例如，申请WO99/10539提议，可以按照以下方式从基因组DNA序列鉴定多核苷酸编码所需活性(例如，酶活性，例如：脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷酶、糖基转移酶、磷酸酶、激酶、加氧酶、过氧化物酶、水解酶、水合酶、腈水解酶、转氨酶、酰胺酶或酰基转移酶)。来自基因组DNA群体的单链DNA分子与配体偶联探针杂交。基因组DNA可以来源于培养的或非培养的微生物，或来源于环境样品。或者，基因组DNA可以来源于多细胞生物或来自其的组织。在从或不从捕捉培养基先行释放的情况下或通过本领域已知的多种其他策略，可以从捕捉中使用的杂交探针直接进行第二链合成。或者，分离的单链基因组DNA群体可以在不进行进一步克隆的情况下被片段化，并直接用于例如基于本文所述的利用单链模板的重组方法。

产生核酸和多肽的“非随机”方法可见于WO00/46344。包括推荐的非随机多核苷酸重新组装和位点饱和诱变方法的这些方法也可用于本发明。利用掺杂或简并寡核苷酸的随机或半随机诱变还描述于，例如，Arkinand Youvan(1992)Biotechnology10:297-300;Reidhaar-Olson et al.(1991)Methods Enzymol.208:564-86;Lim and Sauer(1991)J.Mol.Biol.219:359-76;Breyer and Sauer(1989)J.Biol.Chem.264:13355-60);和美国专利5,830,650和5,798,208,以及EP专利0527809B1。

应当容易地理解，适于在多样化之前浓缩文库的任何上述技术还可以用于筛选多样性产生方法所生成的产物或产物文库。可以回归地或组合地实施任何上述方法以改变核酸，例如，HPPD编码多核苷酸。

上文的文献提供很多突变形式，包括重组、回归重组、回归突变和与其他形式的诱变组合或重组，以及这些形式的很多改变。不考虑所用的多样性产生形式，本发明的核酸可以重组(彼此或与相关(或甚至不相关)序列)，从而产生多样化的重组核酸集合，用于本发明的基因融合构建体和修饰的基因融合构建体，包括例如同源核酸集合以及对应的多肽。

上述产生修饰的多核苷酸的方法中的多种能产生母体序列的大量多样化变体。在一些实施方案中，修饰技术(例如，某些形式的重排)被用于产生变体的文库，然后筛选所述文库中编码一些所需功能属性(例如，提高的HPPD抑制剂不敏感性和/或保持的或提高的HPPD活性)的修饰的多核苷酸或修饰的多核苷酸库。

选择所需酶活性的一个实例需要在抑制不充分表达目的酶活性(例如HPPD活性)的细胞的生长和/或存活的条件下，使宿主细胞生长。利用这样的选择过程可以无需考虑除了编码所需酶活性的多核苷酸之外的所有修饰的多核苷酸。例如，在一些实施方案中，本发明的宿主细胞被保持在缺少足够的HPPD水平(例如，致死性或能抑制缺少或不表达HPPD多核苷酸或其活性变体或片段的相同品种的野生型植物的生长的一定浓度的HPPD抑制剂)下能抑制细胞生长或存活的条件下。在这些条件下，仅有携带编码能催化足够水平的产物产生的酶活性的修饰的核酸宿主细胞能存活和生长。本发明的一些实施方案利用渐增的HPPD抑制剂浓度下的多轮筛选。

为了方便和通量，通常需要筛选/选择微生物中的所需的修饰的核酸，例如，细菌，例如大肠杆菌。另一方面，在某些情况下，在植物细胞或植物中筛选可以是优选的，如果最终目的是产生用于在植物系统中表达的修饰的核酸。

在本发明的一些优选实施方案中，通过筛选表达不同修饰的核酸的宿主细胞库增加通量，所述核酸是单独的或作为基因融合构建体的一部分。表现出显著活性的任何库可以去卷积来鉴定表达所需活性的单个变体。

在高通量检测中，可能在一天筛选多至数千个不同变体。例如，微量滴定板的每个孔可以用于进行独立的测试，或者，如果希望观察浓度或孵育时间效应，可以每5-10个孔测试一个变体。

除了流体方法之外，如上文所述，能够简单地使细胞在能选择所需酶学或代谢功能的培养板上生长。该方法提供了简单且高通量的筛选方法。

已开发出多种公知的机器人系统，用于检测系统中可用的溶液相化学。这些系统包括自动化工作站，其类似于Takeda Chemical Industries,LTD.(Osaka,Japan)开发的自动化合成装置和许多利用机器人臂、能模拟科研工作者的手动合成操作的机器人系统(Zymate II,Zymark Corporation,Hopkinton,MA.;Orca,Hewlett-Packard,Palo Alto,CA)。任何上述装置都适合用于本发明。可以对这些装置进行改动(如果存在的话)，使其可以像本文关于综合系统所讨论地那样工作，而这些改动的性质和实施对于相关领域技术人员是显而易见的。

高通量筛选系统能够商购(参见，例如，Zymark Corp.,Hopkinton,MA;Air Technical Industries,Mentor,OH;Beckman Instruments,Inc.Fullerton,CA;Precision Systems,Inc.,Natick,MA等.)。这些系统通常使整个过程都成为自动化，包括所有样品和试剂的移液、液体分配、定时孵育以及适于测定的检测仪中微量板的最终读取。这些可配置的系统提供了高通量且快速的准备，以及高度的灵活性和定制化。

这些系统的生产商提供了用于不同高通量装置的详细工作说明。因此，例如，Zymark Corp.，提供了描述用于检测基因转录调节、配体结合等的筛选系统的技术公告。试剂操作的微流体方法也被开发出来，例如，Caliper Technologies(Mountain View,CA)。

非限制性实施方案包括：

1.分离的或重组的多核苷酸，其包含编码HPPD多肽的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码包括以下的多肽：

a.在SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394或396中任一个的全长上具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性，并且具有SEQ ID NO:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462、463、467、468、469-488或489所示的氨基酸序列中至少一个的氨基酸序列，其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性；或

b.包含SEQ ID NO:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462或463所示的氨基酸序列的HPPD多肽，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性。

2.分离的或重组的多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对至少一种HPPD抑制剂的不敏感性，所述多肽包括如下所述的氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO:109具有至少1853的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:101具有至少1855的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:50具有至少1862的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:164具有至少1864的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:103具有至少2267的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:160具有至少2268的相似性评分；

(g)与SEQ ID NO:412具有至少1855的相似性评分；

其中所述相似性评分是利用BLAST比对程序产生的，其中利用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1。

3.分离的或重组的多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对至少一种HPPD抑制剂的不敏感性，所述多肽包括如下所述的氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO:263具有至少1830的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:212具有至少1839的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:218具有至少1840的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:320具有至少2152的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:275具有至少2176的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:265具有至少2177的相似性评分；或，

(j)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分；

4.分离的或重组的多核苷酸，其包含编码HPPD多肽的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394或396中任一个具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，其中

a)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置414的氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或丙氨酸；

b)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸；

c)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1氨基酸位置341的的氨基酸残基包括半胱氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸，对应于SEQID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包含蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

d)编码的多肽中对应于的氨基酸残基SEQ ID NO:1的氨基酸位置341包括谷氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

e)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸，并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸，和/或对应于氨基酸SEQID NO:1的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸；

f)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

g)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或SEQ ID NO:1的氨基酸位置327包括亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸，以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸；

h)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置209的氨基酸残基包括缬氨酸和SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括亮氨酸；以及编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸；

i)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸和SEQ ID NO:1的氨基酸位置328包括脯氨酸；以及所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸；或，

j)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸；或，

k)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ IDNO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。

5.如实施方案1、2、3或4中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多肽与SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD多肽相比，具有对HPPD抑制剂提高的不敏感性。

6.如实施方案5所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述对HPPD抑制剂提高的不敏感性包括：

a.酶和抑制剂的较慢的缔合速率，其是通过高于SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD的ON速率比来定量的；

b.抑制剂从酶的较快的解离速率，其是通过高于SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD的OFF速率比来定量的；和/或，

c.抑制剂与酶的较慢的缔合速率和抑制剂从酶的较快的解离速率，其是通过高于SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD的ON速率比和OFF速率比结果来定量的。

7.如实施方案1-6中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多肽包含叶绿体转运肽序列，所述叶绿体转运肽序列包括：

a.编码SEQ ID NO:490，371或464所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

b.编码与SEQ ID NO:490、371或464的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有叶绿体转运肽活性；或，

c.编码异源叶绿体转运肽序列的核苷酸序列。

8.包含实施方案1-7中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸的核酸构建体。

9.如实施方案8所述的核酸构建体，还包含可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。

10.如实施方案9所述的核酸构建体，其中所述启动子相对于所述多核苷酸是异源的，或所述启动子相对于所述多核苷酸是同源的。

11.包含实施方案1-7中任一项所述的至少一个多核苷酸或实施方案8-10中任一项所述的核酸构建体的细胞，其中所述多核苷酸对于所述细胞是异源的。

12.如实施方案11所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。

13.如实施方案12所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述核酸构建体被稳定并入所述植物细胞的基因组。

14.如实施方案12所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述核酸构建体被稳定并入所述植物细胞的叶绿体基因组。

15.如实施方案9-14中任一项所述的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

16.如实施方案15所述的细胞，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、甘蔗、高粱或黑麦。

17.如实施方案12-14中任一项所述的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

18.如实施方案17所述的细胞，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。

19.包含实施方案12-18中任一项所述的植物细胞的植物。

20.包含实施方案12-18中任一项所述的植物细胞的植物外植体。

21.如实施方案12-20中任一项所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细胞与相同种类、品种或栽培品种的不包含实施方案1-7中任一项所述的至少一个多核苷酸的植物、外植体或植物细胞相比，表现出对HPPD除草剂的增加的不敏感性。

22.如实施方案12-21中任一项所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细胞还包含至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽。

23.如实施方案22所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽包括：

(a)耐磺酰脲的乙酰乳酸合酶；

(b)耐咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶；

(c)耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶；

(d)耐草甘膦的草甘膦氧化还原酶；

(e)草甘膦-N-乙酰基转移酶；

(f)膦丝菌素乙酰基转移酶；

(g)原卟啉原氧化酶。

(h)生长素酶；

(i)P450多肽；或，

(j)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)。

24.如实施方案22所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽包括乙酰乳酸合酶(HRA)和/或草甘膦-N-乙酰基转移酶多肽的高抗性等位基因。

25.如实施方案12-24中任一项所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细胞还包含至少一种赋予对HPPD除草剂的耐受性的其他多肽。

26.如实施方案25所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述至少一种多肽包括P450多肽或NSF1。

27.实施方案19或21-26中任一项所述的植物产生的转基因种子。

28.分离的或重组的多肽，其包含下述氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO:109具有至少1853的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:101具有至少1855的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:50具有至少1862的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:164具有至少1864的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:103具有至少2267的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:160具有至少2268的相似性评分；或，

(j)与SEQ ID NO:412具有至少1855的相似性评分；

其中所述相似性评分是利用BLAST比对程序产生的，其中利用BLOSUM62替代矩阵，空位存在罚分为11，以及空位延伸罚分为1，其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并具有对HPPD除草剂的不敏感性。

29.分离的或重组的多肽，其包含下述氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO:263具有至少1830的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:212具有至少1839的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:218具有至少1840的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:320具有至少2152的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:275具有至少2176的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:265具有至少2177的相似性评分；或，

(j)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分；

30.分离的或重组的多肽，其包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394或396中任一个具有至少60%，70%，80%或90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，其中

a)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置414的氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或丙氨酸；

b)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸；

c)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸，对应于SEQID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于的氨基酸残基SEQ ID NO:1的氨基酸位置417包括甘氨酸。

d)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括谷氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

e)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸，并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸，和/或对应于氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸；

f)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括赖氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

g)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或SEQ ID NO:1的氨基酸位置327包括亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸和对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸；

h)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置209的氨基酸残基包括缬氨酸和SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括亮氨酸；以及编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸；

i)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸和SEQ ID NO:1的氨基酸位置328包括脯氨酸；以及所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置233的氨基酸残基包括亮氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸；或，

j)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，或对应于SEQID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸；或，

k)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ IDNO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。

31.分离的或重组的多肽，其包含

(a)在SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、460、461、462或463中任一个的全长上具有至少60%、70%、80%或90%序列同一性的氨基酸序列；以及

(b)具有SEQ ID NO:372、373、374、375、376、377、378、379、380、381或382所示的氨基酸序列中至少一个，

其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性。

32.如实施方案28-31中任一项所述的分离的或重组的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD多肽相比，具有对HPPD除草剂的增加的不敏感性。

33.如实施方案32所述的分离的或重组的多肽，其中所述对HPPD抑制剂的提高的不敏感性包括：

34.如实施方案28-33中任一项所述的分离的或重组的多肽，其中所述多肽包含叶绿体转运肽序列，所述叶绿体转运肽序列包含：

a.SEQ ID NO:490、371或464所示的氨基酸序列；

c.包含异源叶绿体转运肽序列的氨基酸序列。

35.产生能耐受4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂的植物细胞的方法，包括用实施方案1-7中任一项所述的多核苷酸或实施方案8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体转化植物细胞。

36.如实施方案35所述的方法，还包括通过使植物细胞在一定浓度的HPPD除草剂的存在下生长来选择对HPPD除草剂具有抗性的植物细胞，所述浓度的HPPD除草剂能白化不包含实施方案1-7中任一项所述的多核苷酸或实施方案8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体的植物细胞。

37.如实施方案36所述的方法，其中所述方法包括

a.在足够浓度的HPPD除草剂存在下培养所述植物细胞，使得所述植物细胞表现出白化；

b.将实施方案1-7中任一项所述的多核苷酸或实施方案8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体转化入步骤(a)中的所述植物细胞；

c.使(b)中的所述植物细胞生长，其中转化的植物细胞不再表现出白化。

38.如实施方案35、36或37所述的方法，其中所述方法还包括从所述植物细胞再生出转基因植物。

39.如实施方案35-38中任一项所述的方法，其中转化植物细胞导致所述多核苷酸被稳定整合入所述植物细胞的基因组。

40.如实施方案35-38中任一项所述的方法，其中转化植物细胞导致所述多核苷酸被稳定整合入所述植物细胞中叶绿体的基因组。

41.控制具有农作物的田地中的杂草的方法，包括：

(a)将实施方案27所述的转基因种子或实施方案19或21-26中任一项所述的植物种植在所述田地中；以及

(b)向田地中的任何农作物和杂草施用足够量的HPPD除草剂，从而控制杂草，而不会显著影响农作物。

42.如实施方案36、37或41中任一项所述的方法，其中所述HPPD除草剂包括以下中的至少一个：三酮、异噁唑、吡唑或苯并双环酮或以上的活性衍生物或农业可接受的盐。

43.如实施方案42所述的方法，其中所述HPPD除草剂包括以下中的至少一个：硝磺草酮、磺草酮、苯吡唑草酮、环磺酮、磺酰草吡唑、异噁唑草酮、吡草酮、苄草唑或吡唑特或以上的活性衍生物或农业可接受的盐。

44.如实施方案41所述的方法，还包括向田地中的农作物和杂草施用足够量的至少一种其他除草剂，包括草甘膦、双丙氨膦、膦丝菌素、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、草硫膦、草铵膦、ALS抑制剂或原卟啉原氧化酶抑制剂。

45.检测HPPD多肽的方法，包括利用免疫测定分析植物组织，所述免疫测定包括一种或多种能特异性地识别实施方案28-34中任一项所述的多肽的抗体，其中所述一种抗体或多种抗体是由作为抗原的实施方案28-34中任一项所述的多肽引发的。

46.检测实施方案1-7中任一项所述的多核苷酸的存在的方法，包括利用PCR扩增分析植物组织和检测所述多核苷酸。

实验

4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是非血红素、铁依赖性加氧酶，其催化4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸(Moran(2005)Arch Biochem Biophys433:117-128)。在能降解酪氨酸的生物中，HPPD催化的反应是该通路中的第二步。在植物中，形成尿黑酸是合成质体醌(必需的氧化还原辅因子)以及生育酚所必需的(DellaPenna(2006)Ann Rev Plant Biol57:711-738)。某些天然存在的多酮是异株克生的，这是由于它们具有抑制HPPD的能力，从而阻止尿黑酸的产生，进而阻止质体醌的产生。这些化合物之一，由植物种类橙色红千层(Callistemon citrinus)产生的纤精酮是在商业除草剂硝磺草酮的发现过程中的主要化合物(Mitchell G et al.(2001)PestManag Sci57:120-128)。DNA重排已被用于改变不同酶的性质，从而使它们更适合于商业应用(Castle et al.,(2004)Science,304,1151-1154)。在本发明中，通过DNA重排改变玉米HPPD，从而使其对除草活性抑制剂的抑制不敏感。在本领域技术人员熟悉的化学常数方面，目标是提升对抑制剂(例如硝磺草酮)的K_D，同时保留接近野生型玉米HPPD的催化参数。较高的K_D表示在除草活性抑制剂的存在下，大部分的酶能自由与底物反应，从而保持通过生物合成途径达到质体醌的流动。

实施例1.野生型玉米(SEQ ID NO:1)和大豆(SEQ ID NO:2)HPPD蛋白的表征

HPPD表达和纯化

从商业合成的寡核苷酸组装出合成的玉米野生型HPPD基因(本文称为玉米野生型序列)，从而获得氨基酸序列SEQ ID NO:1。在基因合成中，将NcoI限制性位点加入序列的起始部分以便于克隆。与WO1997049816中SEQ ID NO:11(在本文编号为SEQ ID NO:392)的玉米野生型蛋白相比，密码子从(C)ATG CCC改变为(C)ATG GGT导致SEQ ID NO:1中第2位的脯氨酸被取代为甘氨酸。

野生型和重排变体基因被克隆到pVER7062中，pVER7062是改进版的pET24a(+)(Novagen)，其将6个组氨酸残基置于表达蛋白的N末端。载体被电穿孔入大肠杆菌宿主株BL21(DE3)。使细胞在30C下生长在富集培养基中，例如含有选择抗生素卡那霉素的2xYT。在约0.6的OD600时，添加IPTG至0.2mM。30C下进一步生长60分钟后，温度降至16C，继续生长24小时。通过离心收获细胞，并保存在-80C。将细胞团在BPER(Pierce)蛋白提取试剂中裂解，该蛋白提取试剂含有0.2mg/ml溶菌酶，1mM二硫苏糖醇，蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,细菌用混合物)和核酸内切酶。通过离心除去不溶性细胞碎片。利用氮三乙酸的镍形式(Ni-NTA)树脂(Qiagen)的亲和层析，从可溶性蛋白溶液纯化HPPD蛋白。通过由Bio-Rad提供的Bradford法测定蛋白浓度。

HPPD测定

HPPD催化4-羟基苯丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸。参见，图1。底物和产物在任何可用的波长下的光吸收值中无法区分。然而，酪氨酸代谢中后续反应的产物马来酰乙酰乙酸在320nm下有强吸收。此外，催化该反应的酶也是双加氧酶，其与HPPD具有相似的机制和缓冲要求，这使得尿黑酸双加氧酶(HGD)成为偶联测定中的理想伴侣，如下文所示。

将来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的HDG基因(Amaya(2004)Arch Biochem Biophys421,135-142)克隆入pVER7062，并电穿孔入大肠杆菌株BL21(DE3)。通过与对HPPD的描述中相似的方法产生该酶。纯化的酶对尿黑酸的K_M为23uM，k_cat为100/sec，性质非常适合于将HPPD产生的尿黑酸立即转化为马来酰乙酰乙酸。

通过将小份(例如，6ul)底物HPP以所需终浓度的50倍浓度加入低UV吸收测定板的孔中来测定HPPD活性。通过添加含有25mM Hepes(pH7)、2mM抗坏血酸盐、10uM FeSO4、1至100uM HPP、50nM HGD和5至240nM HPPD的混合物(例如，294ul)来启动反应。在平板读数分光光度计(Spectramax，Molecular Devices)中持续监测320nm下的吸收值。HPPD活性参数

通过测定底物饱和参数来评价野生型HPPD和通过重排产生的变体的催化性能。Spectramax软件的Michaelis-Menten动力学方法被设定为HPP浓度为3.33uM至100uM，或如果需要可高至1mM。如上文所述测定每个HPP浓度的反应速率。软件利用Michaelis-Menten方程的Lineweaver-Burke变换给出K_M和Vmax值。从大肠杆菌表达的来自玉米和大豆的野生型HPPD获得的值显示于表2。

表2.来自玉米和大豆的野生型HPPD的动力学参数

HPPD	K_M，uM	k_cat，min^-1	k_cat/K_M
				玉米野生型	5.2	207	39.8
大豆野生型	3.00	100	33.3

HPPD抑制剂敏感性参数

所有HPPD的除草活性抑制剂与酶通过双重机制形成紧密复合物，所述双重机制为通过一对羰基氧与活性位点铁原子的配位和一对活性位点苯丙氨酸之间的抑制剂芳香环的π堆砌(pi stack)。因此，常规I₅₀测定不能区分不同形式的HPPD和抑制剂之间的结合亲和力差异。所有值都会是相似的，即，约酶浓度的50%。为了设计能用于检测抑制剂结合亲和力改变的参数(K_D)，可以利用K_D与抑制剂与酶的结合速率和抑制剂从酶的释放速率之间的关系。

在平衡时，结合速率和释放速率是相等的。因此，

k_ON[E][I]=k_OFF[EI]

写成解离，方程式可重新排列为：

\frac{[E] [I]}{[EI]} = \frac{k_{OFF}}{k_{ON}} = K_{D}

数值上较小的ON速率、较大的OFF速率或两者可以得到较高的K_D(降低的亲和力或增加的不敏感性)。为了检测ON和OFF速率的改变，可以观察抑制剂结合酶并使酶失活(ON速率)或抑制剂从预先形成的酶-抑制剂复合物释放(OFF速率)的HPPD反应时程。在实践中，通过监测HPPD反应的时程获得ON速率的定量指标，所述反应含有60或120nMHPPD和100uM HPP，存在和不存在4uM抑制剂(例如硝磺草酮)。在反应的70至90秒间隔中，存在抑制剂时的反应速率与不存在抑制剂时的反应速率的比称为“ON速率比”。实际k_ON越小，HPPD反应降速越慢，ON速率比的值越高。图2显示了玉米野生型HPPD(图2A)与改进的变体(D0223944)(图2B)在70-90秒间隔中的对比反应速率。

通过观察硝磺草酮从预先形成的酶-抑制剂复合物释放的HPPD反应时程可以获得OFF速率的定量指标。将HPPD和硝磺草酮一起孵育，浓度分别为7.2和8uM。平行地进行与相同浓度的酶、但没有硝磺草酮的孵育。室温下1小时后，将5至10ul的酶-抑制剂复合物分散到测定板的孔中。添加290至295ul的25mM Hepes(pH7)、2mM抗坏血酸盐、10uMFeSO4、100uM HPP和50nM HGD来启动反应。320nm下监测反应12分钟。随着抑制剂从酶释放，反应速率加速，直至达到稳态，在稳态中反应速率是不变的。含有硝磺草酮(或其它除草活性抑制剂)的混合物的稳态速率与缺少抑制剂的混合物的初始速率的比称为“OFF速率比”。记录的另一参数是存在抑制剂的反应达到稳态所需的时间跨度。图3显示了玉米野生型HPPD(图3A)和改进的变体(D0223944)(图3B)从硝磺草酮解离的对比时间跨度，正如加速的反应速率所示。

吸收值的平稳期是由于底物耗竭。对于改进的变体，不仅达到稳态的时间跨度较短(变体为80秒，而野生型为280秒)，达到的速率是野生型的两倍，但存在的酶的浓度是相同的(240nM)。这是因为，与野生型酶相比，较大比例的变体酶脱离抑制剂，并且两者的k_cat基本相同，约220min^-1。

OFF速率反应中达到的稳态未必实际代表OFF速率等于ON速率的平衡。因为底物和抑制剂结合相同位点，存在高浓度的底物可能竞争性地捕获抑制剂并阻止其再次结合。为了确保能考虑到ON速率的提高，将ON和OFF速率比相乘，结果称为“不敏感性参数”。

实施例2.基于系统发生多样性的DNA重排以产生具有提高的不敏感性参数的玉米HPPD变体

基因重排是反复的过程，其由独立的循环(称为“轮”)组成。每个重复是母体选择、文库构建、基因评价和命中选择的循环。来自一轮的最佳命中成为下一轮的母体基因。

将HPPD优化的第一阶段设计为引入天然存在的HPPD蛋白中发现的氨基酸取代。基于玉米HPPD蛋白模板(SEQ IDNO:1)、利用包括家族重排、单基因重排、回交、半合成和合成重排(Zhang J-H et al.(1997)ProcNatl Acad Sci94,4504-4509;Crameri et al.(1998)Nature391:288-291;Ness et al.(2002)Nat Biotech20:1251-1255)的技术，制备重排的基因变体文库。文库是基于系统发生序列多样性、随机诱变以及基于Protein DataBank(PDB;www.pdb.org/pdb/home/home.do)中蛋白晶体结构的结构特征。数种单子叶植物HPPD蛋白的系统发生多样性显示于图4，与玉米HPPD相比的双子叶植物多样性显示于图5。多样性被定义为蛋白集合中在所有蛋白不含有相同氨基酸的任何位置处存在的氨基酸。重排过程导致产生变体，所述变体具有氨基酸取代、由于致突变pcr导致的非计划的氨基酸取代、缺失以及插入的重组。

实施例3.基于三级结构模型重排HPPD

连接不同抑制剂的数种HPPD酶的结构坐标保存于Protein DataBank，并被用于选择合并天然多样性的位置。通过构建连接硝磺草酮的玉米HPPD的模型(参见下文)，实现靶向于与除草活性抑制剂直接相互作用的氨基酸的更精确的设计。

活性位点的

以内的天然多样性

通过取代与结构1TG5的拟南芥HPPD(Yang et at.,Biochemistry43,10414-10423,2004)结合的抑制剂DAS645的

以内的氨基酸寻找HPPD的活性位点，拟南芥HPPD具有来自单子叶植物基因的系统发生多样性，其序列可在公开数据库获得。参见表3。

表3.取代，从活性位点的

(氨基酸残基位置是基于玉米野生型HPPD序列SEQ ID1)。

残基	野生型残基	设计的文库
			219	I	V
247	T	A
			253	A	T
260	M	V
			289	F	Y
301	M	I
			303	L	V
327	M	L
			328	A	P
330	P	R
			331	T	P、C、L
352	K	N
			377	V	L
383	L	F
			387	I	M
418	Q	E

操控β折叠

“β-折回(β-back)”文库关注位于β折叠上、形成HPPD的活性位点的氨基酸残基，并且被限制为侧链指向远离活性位点的那些残基。“β-折回”文库的设计目的是通过引入其他侧链构象来降低抑制剂结合亲和力，所述其他侧链构象可以导致整个链移动到抑制剂会占据的空间，从而减小活性位点的大小，同时保留关键活性位点残基。通过分析与2-{羟基[2-硝基-4(三氟甲基)苯基]亚甲基}环己烷-1,3-二酮(Brownlee JM,et al.(2004)Biochemistry43:6370-6377PDB1T47)连接的阿维链霉菌酶的结构来选择取代。该策略随后被扩展到其他二级结构构象的残基。位置选择的标准，侧链远离的模型化抑制剂的

以内的主链(N，C，C-α)原子，包括位于除β链之外的结构元件中的位置。参见表4。

表4.“β-折回”结构文库

玉米-硝磺草酮结构模型

文库设计中最感兴趣的结构模型，即，与玉米酶结合的可商购除草活性抑制剂的结构模型，无法从PDB获得。因此，从可获得的结构数据构建模型，并将其称为玉米-硝磺草酮模型。玉米HPPD的起始坐标取自X射线结构PDB:1SP8。利用作为参考的PDB:1T47中的对应肽的构象，手动构建晶体结构中缺少的残基248-254。通过旋转残基Asn415、Gly414和Lys413中的φ扭转角和ψ扭转角，手动构建螺旋11的开放构象。利用InsightII’s MODELER模块Discovery Studio2.5(Accelrys，San Diego)和Antechamber改进的参数(Wang et.al.(2006)Journal of MolecularGraphics and Modelling,25:247260)，构建硝磺草酮的初步结构，并手动停靠玉米HPPD活性位点，类似于链霉菌结构中(PDB：1T47)的NTBC。在不同限制条件下，利用CHARMm(Chemistry at HARvardMacromolecular Mechanics,www.charmm.org)进行能量最小化，使结构逐渐放松，首先在真空中，带有结晶水。基于晶体结构的氢键结合模式，测定NE2或ND1上的组氨酸质子化态。以下文库是从该模型设计的。

靶向于环己烷二酮类的抑制剂的环己二烯环的取代

模型显示出选择性阻止环己烷二酮抑制剂的结合的一种明显的策略是向通过抑制剂的环己二烯环的β链(底物中不存在的特征)中引入取代。对于“六环(Hexring)”文库1，鉴定出两条这样的链，并通过半合成重排改变为具有相似化学性质的较大侧链而被靶向，如表5所示：

表5.“六环”文库1

位置	野生型AA	设计的改变
			219	V	L、M、F、I
220	V	I、L、M
			221	G	V、A、S、C
259	S	T、N、Y
			260	M	I、L、F
261	V	I、L、F、M
			262	L	I、F、W

“六环”文库2包括侧链的“重”原子(除氢以外的任何原子)位于硝磺草酮的环己二烯环的重原子的

以内的位置。这些仅靶向于指向活性位点的侧链。所有靶向的位置具有疏水侧链。为了最大化破坏结合相互作用的机会，除了较大疏水侧链之外，设计的改变还引入带电的和极性的侧链。参见表6。

表6.“六环”文库2

残基	野生型残基	设计的文库
			220	V	Q、K、M、I、D、E、R、L、N
245	F	H、K、L、W、Y、E、R、I
			257	L	W、E、R、K、H
261	V	R、N、I、D、L、Q、F、E、M、K
			270	L	K、Q、N、R、E、D
411	F	W、I、L、E、D

靶向于硝磺草酮的甲磺酰基和硝基取代基以及酶的C末端尾部的取代

硝磺草酮在芳香环上具有取代基，这使它能区别于其底物HPP。取代基包括第2位的硝基和第4位的甲磺酰基。HPP在第2位没有取代基，在第4位具有羟基，这远小于甲磺酰基。此外，由于其位置接近活性位点的入口，推测甲磺酰基能影响抑制剂释放。设计的取代意图破坏酶和这些取代基之间的氢键，或增加侧链的大小，从而制造空间阻碍。相似的原理适用于硝基。

C末端螺旋两性圆柱体，其疏水面在无配体结构下包裹活性位点，并且在在连接的结构中伸出到溶剂中(Yang C et al.(2004)Biochemistry43:10414-10423,Fritze et al.(2004)Plant Phys134:1388-1400,2004)。因此，认为螺旋的功能为闸门机制(Fritze I et al.(2004)Plant Phys134,1388-1400)。观察螺旋中的氨基酸，它们的接触作为底物和抑制剂的结合和释放的可能的决定区，并因此能影响抑制剂结合亲和力和催化效率。因此，取代被设计为能破坏与硝磺草酮的接触(第282、285、299、360、384、418、419位)或引入尾部螺旋上的额外柔性(位置417)。用下表所示的两个文库检验这些设计。参见表7和8。

表7“尾部”文库

残基	野生型残基	设计的文库
			254	E	D、N、Q
255	S	T
			282	R	G、K
360	L	M、I、V
			384	F	L
385	L	F、I、V、M
			391	I	L、V
394	M	L、V
			417	S	K、G、T、R
418	Q	E、A、N、G、D
			425	D	N、Q
426	Y	H、F
			431	E	K、G、Q、D

表8“其余”文库

实施例4.随机和定点诱变

随机诱变重排过程的结果，可以操控其频率，但不能完全消除。随机突变提供了得到无法预测的可能改变的可能性。通过修改不同重排过程的PCR条件，有意识地增加野生型和HPPD D0193494基因中随机突变的频率。

来自野生型随机文库的最佳命中之一HPPD D0206042具有很好的OFF速率比(0.54)和高k_cat(表9)。其相对于野生型具有6处取代。为了产生具有HPPD D0193494的高ON速率比和HPPD D0206042的高OFF速率比组合的变体，主要基于活性位点邻近位点，使用玉米-硝磺草酮结构模型来预测HPPD D0206042中6处突变的哪一处最有可能造成高OFF速率比。选择3处并通过定点诱变单独以及联合地将其引入HPPDD0193494基因，并评价酶。明显发现，R341C突变(HPPD D0223903)主要造成提高的不敏感性。进一步探索第341位处的具有不同化学性质的侧链发现，谷氨酸(表9；HPPD D0223945，相比于HPPD D0223938)和异亮氨酸(表9；HPPD D0223935，相比于HPPD D0223903)也是有效的。另一随机突变G414D仅造成不敏感性参数增加6.5倍(表9；HPPDD0205976，相比于野生型)。

筛选尾部文库后又发现了两个与野生型主链的有益效果有关的位置。当引入HPPD D0223903后，L360M突变导致增加的OFF速率比(表9；HPPD D0223938，相比于HPPD D0223903)。在具有提高的不敏感性的变体中，S417A突变将k_cat恢复为野生型中观察到的值(表9；HPPDD0223944，相比于HPPD D0223903；HPPD D0223946，相比于HPPDD0223945)。

实施例5.文库筛选；重排的HPPD变体的表征

按照实施例1，将编码HPPD的重排变体的基因克隆到大肠杆菌表达载体中并引入大肠杆菌。将文库接种到富集琼脂培养基上，然后挑取单个菌落，并使其生长在96孔板中的富集培养基中。具有活性HPPD酶的菌落由于将尿黑酸转化为褐黄色素而使培养基变为棕色(Zannoni VG et al.(1969)Biochim Biophys Acta.177:94-105)。将能在100uM硝磺草酮的存在下使培养基变为棕色的蛋白进行实施例1所述的详细分析。通过IPTG诱导大肠杆菌培养物中蛋白产生，并通过Ni NTA层析纯化HPPD酶。按照之前关于玉米和大豆的酶所述那样，测定ON速率、OFF速率、k_cat和K_m的特征。表9提供所有改进的HPPD蛋白变体的动力学和不敏感性特征。

在至少一个不敏感性参数上改进的变体

容易获得酶和硝磺草酮的改进的(较慢的)缔合速率，其在测定中表现为ON速率比的值较高(参见，实施例1)。数值范围从野生型的0.2至0.9，这接近1.0的理论最大值。较少观察到改进的(较快的)解离速率，但是观察到OFF速率比高达0.76的变体。在ON速率、OFF速率或两者上显著改进从而得到改进的不敏感性参数(ON速率比×OFF速率比)的变体包括值为0.06至0.1的很多抗体和值高至0.38的数种抗体，这代表与玉米野生型HPPD相比不敏感性提高8倍。未尝试改进k_cat，而是寻找到在很少损失或不损失酶周转速率(k_cat)或催化效率(k_cat/K_m)的情况下能够获得提高的不敏感性的序列背景。数种变体实现了这点，例如对应于HPPDD0223944、D0223945、D0223946以及D0223947的变体。

表9.玉米野生型HPPD和改进的变体的动力学参数

改进的变体中HPPD多样性的总结

用以下参数定量HPPD变体的抑制剂敏感性：ON速率比(如实施例1所规定)，OFF速率比(如实施例1所规定)，ON和OFF速率比的乘积(称为“不敏感性参数ON×OFF”)，OFF速率比测定中用硝磺草酮获得的最大反应速率(称为“V_最大MT”)和ON速率比、OFF速率比和k_cat的三重乘积(称为“ON×OFF×k_cat”)。表9中的变体是按照它们与野生型相比有改进的参数分类的。每个组中它们的氨基酸序列是比对的，并且存在多样性的位置列在表10中。序列位置的编号是按照野生型玉米氨基酸序列SEQ ID 1。某些取代在多个情况下都有效，下文部分讨论。

表10A与提高的ON速率比有关的多样性

HPPD命中的分

解性多样性总结

表10B与提高的OFF速率比有关的多样性

HPPD命中的分

解性多样性总结

表10C与提高的ON×OFF有关的多样性

HPPD命中的分

解性多样性总结

表10D与提高的V_最大MT有关的多样性

HPPD命中的分

解性多样性总结

表10E与提高的ON×OFF×k_cat有关的多样性

HPPD命中的分

解性多样性总结

多背景下具有统计学显著性的HPPD命中多样性

各个氨基酸取代(统称为“多样性”)对HPPD的抑制剂不敏感性的贡献取决于多样性被引入的主链序列。如果所述位置是某性质的强决定位，取代可以在多序列背景下具有作用。检测这样取代的统计学方法难以获得。重排的HPPD基因产物具有437-446个氨基酸残基。对于仅具有10个氨基酸取代位点的变体序列(97.7%序列同一性)，利用所有20种氨基酸得到的可能的序列多样性为20¹⁰或1.024×10¹³。缺少统计学学习工具(例如ProSAR(Fox R et al(2003)Protein Engineering16,589-597))的情况下，测量引入如此大量的主链序列中的各个取代的贡献是困难的。

ProSAR(蛋白序列活性关系(Protein Sequence Activity Relationship))的核心算法是偏最小二乘回归(PLSR)，其属于机器学习技术的一个大家族。PLSR利用基于主成分的方法，从而对最大的成分组减少变量数并构建具有足够稳健性的模型。在ProSAR中，多样性被编码入随机变量，PLSR被用于将它们投射到适合性参数(在本文情况下为除草剂不敏感性)。从PLSR获得的关键统计学数值与从典型最小二乘回归获得的回归系数相似。计算序列活性数据中每个氨基酸突变的PLSR系数，从而表明具体的突变对适合性参数的贡献。不同于回归，当随机变量具有独立提前假设时，PLSR发现多背景下的回归系数。具有较高绝对回归系数值和更高统计学显著性(以P值衡量)的取代被ProSAR预测为对不敏感性贡献较大，即使被引入多背景。

在命中序列上训练5个ProSAR模型，它们与5个适合性参数的对应显示在表4中。表中列出的多样性按照以下标准：

1.标准化的回归系数大于10.

2.P值<0.1

3.命中序列中突变的总计数≥3.

显示在表11中的ProSAR选择的多样性是表11中的总累计多样性的子集，并代表预测为在多序列背景下具有统计学显著性的取代的集中列表。对于该列表中未示出的多样性，ProSAR统计学未否定它们对除草剂不敏感性的贡献。

表11.ProSAR预测的能在多序列背景下改进适合性参数的多样性

ProSAR分析的总结

ON速率比

OFF速率比

不敏感性参数(ON×OFF)

V_最大MT

On×Off×k_cat

实施例6.来自理性设计的特定取代

获得研究中的酶-抑制剂复合物的结构模型导致发现数种与提高的不敏感性或催化效率相关的取代，如表12所示。实施例3中所述的两种设计策略β-折回和甲磺酰基接触提供了较高的除草剂耐受性，而由S417G取代代表的第三种策略尾部柔性在序列背景下将k_cat恢复为野生型，较高不敏感性的目标与部分降低的k_cat有关。

表12.理性设计的与提高的适合性有关的取代

实施例7.通过等温滴定量热法测量K_D来验证不敏感性参数

为了验证不敏感性参数反应为K_D的提高(升高)，利用等温滴定量热法直接测量K_D。按照上文所述纯化玉米野生型和D223903HPPD。通过凝胶过滤层析将酶转移到含25mM Hepes(pH7)、2mM抗坏血酸盐和10uM FeSO₄的基质中。将硝磺草酮或环磺酮在相同缓冲液中稀释。细胞中的酶浓度为100至300uM。注射器中的抑制剂浓度一直为细胞浓度的8倍。结果总结于表13中。

表13硝磺草酮和环磺酮与野生型玉米HPPD和选定重排变体组合的K_D值

	造模的位点	K_D，nM	野生型的倍数
				硝磺草酮
玉米野生型	1	104
				D0223903	1	379	3.6
玉米野生型	2	33.3
				D0223903	2	165	4.9
环磺酮
				玉米野生型	2	16.8
D0223903	2	123	7.3

变体相比于野生型的K_D倍数升高与不敏感性参数中的倍数增加相似。

实施例8.对硝磺草酮的不敏感性赋予对其他除草活性HPPD抑制剂的不敏感性

测定对硝磺草酮的不敏感性参数的相同方法(参见，实施例1)被用于监测对其它除草活性HPPD抑制剂的进步的不敏感性。异噁唑草酮的二酮腈形式不可商购，由DuPont化学工作者合成。在每种情况，当利用硝磺草酮的不敏感性参数(ON速率比×OFF速率比)升高时，利用其它抑制剂观察到相似的或更好的不敏感性，如表14A所示。

表14A相对于玉米野生型HPPD，对多种除草活性HPPD抑制剂的不敏感性参数(ON速率比×OFF速率比)

不敏感性参数的高值通常与降低的催化周转速率(k_cat)有关。当将k_cat值与不敏感性参数相乘来解释k_cat时，对于硝磺草酮而言，值大于野生型HPPD的变体数量大大减少，但对于其他抑制剂，大部分变体中k_cat的降低大于提高的不敏感性所补偿的。

表14B相对于玉米野生型HPPD，对于多种除草活性HPPD抑制剂的三乘积(ON速率比×OFF速率比×k_cat)

实施例9.用玉米野生型和变体HPPD基因转化大豆

利用粒子枪轰击法(Klein et al.(1987)Nature327:70-73,美国专利4,945,050)，利用DuPont Biolistic PDS1000/He仪器，制备表达HPPD变体转基因的大豆植物。用于便于大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell et al.(1985)Nature313:810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz et al.(1983)Gene25:179-188)和来自根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3'区组成的嵌合基因。用于便于大豆转化的另一选择标记是由来自大豆的S-腺苷蛋氨酸合酶(SAMS)启动子(US7,741,537)、ALS的高度抗性等位基因(美国专利5,605,011，5,378,824，5,141,870以及5,013,659)，以及天然大豆ALS终止子区组成的嵌合基因。转化过程中使用的选择剂为潮霉素或氯磺隆，取决于存在的标记基因。利用合成的组成型启动子(例如美国专利6,072,050和6,555,673)、HPPD变体以及拟南芥泛素3基因终止子(Callis,J.,et al.(1995)Genetics139(2),921-939;Genbank L05363)表达HPPD基因。在某些的构建体中，使用US6072050的SCP1启动子。纯化后不含任何细菌载体DNA的线性DNA片段进行轰击。选择标记基因盒位于与HPPD盒相同的DNA片段中。在缺少选择剂的情况下，培养轰击的大豆胚胎发生悬浮组织一周，然后，将其置于液体选择培养基6周。从假定的转基因悬浮组织采样进行PCR分析，以确定是否存在HPPD基因。在选择培养基中将假定的转基因悬浮培养组织保持3周，以获得足够的用于植物再生的组织。利用标准方法，使悬浮组织生长4周；使生长好的体细胞胚胎干燥4-7天，然后置于发芽诱导培养基2-4周。将发芽的植物苗转移到细胞盘的土壤中3周来适应环境。将植物苗栽到温室的10英寸罐中，用于评价除草剂抗性。

实施例10.利用硝磺草酮对转基因T0HPPD大豆植物进行除草剂喷雾测试

使具有HPPD转基因的T0植物生长至V2至V8生长阶段，然后用商业硝磺草酮制剂以210g ai/ha的速率进行喷雾。以374L/ha的喷雾量，用0.25%非离子表面活性剂和1%硫酸铵进行所有硝磺草酮处理。个体植物与具有相似的遗传背景的未处理的植物比较，在处理后8天评价除草剂反应，并指定0至100%损伤的可视反应评分(0=无反应至100=死亡植物)。由于HPPD基因在各T0植物中的基因组位置，HPPD基因的表达不同。某些不表达HPPD基因的植物被硝磺草酮重度损伤。用相同DNA片段产生的其它T0植物由于表达HPPD基因而表现出对硝磺草酮除草剂的耐受性。发现玉米HPPD蛋白对硝磺草酮的不敏感性高于天然大豆HPPD酶约25倍。因此，玉米HPPD SEQ ID NO:1在T0大豆植物中提供了对硝磺草酮的中等耐受性是不意外的。在T0代，根据低损伤评分而与对照相比具有提高的耐受性的植物进一步到T1代，用于更全面的除草剂测试。某些T0植物不用除草剂喷雾，并全部到下一代进行测试。

表15.表达HPPD基因变体的大豆T0植物。用HPPD抑制剂除草剂硝磺草酮对植物喷雾，并与相似处理的对照植物比较(nd：未从植物收集到数据)

实施例11.用多种HPPD抑制剂除草剂对转基因HPPD大豆植物进行除草剂喷雾测试

评价T1植物的接合性。鉴定纯合单基因位点转基因植物及其对应的空白分离子，从每个获得T2真实遗传种子。使植物生长至V1至V2生长阶段，然后用硝磺草酮、环磺酮、苯吡唑草酮以及异噁唑草酮的商业制剂进行喷雾。以374L/ha的喷雾量，用非离子表面活性剂和硫酸铵进行所有处理。每个除草剂以多个级别施加，这样反应范围可用于比较不同除草剂的相对耐受性以及对于每一事件纯合空白和阳性的相对耐受性。通过与具有相似遗传背景的未处理的植物比较来评价处理的个体植物的除草剂反应。处理后8天进行除草剂反应评级。将可视损伤评为0至100%损伤(0=无反应至100=死亡植物)。

实施例12.表达重排玉米HPPD和玉米NSF1的大豆植物的耐受性

按照与实施例9相同的方式产生的转基因大豆植物可以还含有P450基因，其通过代谢除草剂提供对HPPD抑制剂的耐受性。将NSF1基因(US2007/0214515，US2008/0052797)包含在含有HPPD变体和标记基因的DNA片段中，并轰击到大豆胚胎发生组织中，如实施例9所述。NSF1表达盒包含H2B启动子(Hagemann,K.et al.,(2003)Plant Cell Rep.21:569-576,US6,177,611))和拟南芥泛素14终止区(Genbank NM_178961和NC_003075)。如实施例10所述，测试T0植物的除草剂耐受性。

NSF1基因自身的表达不赋予对HPPD抑制剂硝磺草酮的高水平耐受性。在包括112株T0植物的一个测试实施例中，最低损伤评分为25%，但很多为85%。参见图11。

尽管单独的NSF1不赋予对硝磺草酮的高水平耐受性，但是其与不敏感的HPPD联合表达时，在某些情况下可以增强耐受性。在一个测试实施例中，重排HPPD基因表达盒单独赋予相对高水平的耐受性对抑制剂，使得当用2X硝磺草酮对某些T0事件喷雾时，未表现出可见损伤。含有相同HPPD表达盒和H2B启动子-NSF1盒的另一载体也产生了T0事件，用2X硝磺草酮进行喷雾时，未损伤。参见图12。由于在对2X硝磺草酮反应为零损伤的总独立事件的百分比方面，HPPD+NSF1载体大于单独HPPD载体，所以看起来NSF1表达能提供超过单独表达不敏感的HPPD的硝磺草酮耐受性。

在另一个测试实施例中，另一HPPD盒单独地提供对用2X硝磺草酮喷雾的T0事件的差耐受性，最低损伤评分为55%。当与H2B启动子-NSF1盒配对时，相同HPPD盒产生的事件中的损伤低至5%。参见图13。

实施例13.制备表达引入叶绿体基因组的HPPD转基因的除草剂耐受性大豆

利用粒子枪轰击法(参见，Klein et al.(1987)Nature327:70-73)，利用DuPont Biolistic PDS1000/He仪器和特异性地设计为能通过同源重组整合入叶绿体基因组的载体，制备具有引入叶绿体基因组的HPPD转基因的大豆植物。HPPD变体D0223946和D0223961中移除了0、20或23个N末端密码子，并被蛋氨酸(ATG)密码子替换用于起始翻译。

为了实现用HPPD基因对大豆进行叶绿体转化，构建了携带叶绿体基因组的区域的载体(图4)。这些叶绿体序列(也称为同源区)位于希望引入叶绿体基因组的基因的侧翼，并通过同源重组指导转基因准确插入叶绿体基因组。载体中所用的同源序列介导叶绿体基因组内的Gm-trnV和Gm-rps12/7基因之间的转基因整合。载体在左同源区和右同源区之间含有两个嵌合基因。aadA基因编码氨基糖苷3"-腺苷转移酶。该蛋白可以为抗生素大观霉素解毒。该基因被置于烟草16S核糖体RNA启动子Prrn以及位于5’端的来自rbcL基因的核糖体结合位点和位于3’端的来自psbA基因的终止子的控制下(Svab et al.(1993)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America90(3):913-17)。HPPD基因被置于位于5’端的烟草psbA启动子和位于3’端的来自rps16的终止子的控制下。

按照大豆核转化产生大豆胚胎发生悬浮培养物(US7,763,778)，并用通过粒子枪轰击法用大豆表达质粒进行转化。含有目的基因和选择标记基因的DNA质粒片段被用于轰击。通过凝胶分离消化的质粒获得来自大豆表达质粒的片段。在每种情况下，在0.5mL特异性限制性酶混合物中使用100μg质粒DNA。通过凝胶电泳使得到的DNA片段分开，并利用GELase消化酶，按照生产商的说明，从琼脂糖纯化DNA。将纯化的DNA包被在金颗粒上，并轰击入大豆胚胎发生组织，所述大豆胚胎发生组织置于空的无菌60×15mm皮氏培养皿并用塑料网盖住。

轰击后，将组织保持在固化琼脂糖培养基2天。然后，将组织破碎，并转移到含大观霉素(300mg/L)的新鲜的固化琼脂糖培养基。6至10周后，叶绿体转基因组织被识别为球形期体胚胎的小的绿色簇。然后，将绿色组织转移到含有大观霉素(300mg/L)的液体培养基。然后，可以通过PCR分析组织是否存在转基因。PCR分析还可以用于确定转基因组织是否还含有叶绿体基因组的野生型拷贝或组织是否是同质的。

允许阳性胚胎成长和再生而形成大豆植物苗。使植物苗生根并转移到土壤中。用HPPD抑制剂除草剂对叶绿体转基因植物喷雾并评价耐受性。

实施例14.玉米HPPD具有叶绿体靶向序列

玉米HPPD的生物信息学分析：

玉米HPPD蛋白未预期具有叶绿体靶向肽N末端序列。通过ProtComp6.1(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)对玉米HPPD序列的分析指示出玉米HPPD的细胞内位置，ProtComp6.1是广泛用于检测细胞器靶向序列的程序。搜索得到的结果如下：

位置的显著相似性：细胞质

细胞质核心=14470

叶绿体评分1.4

玉米HPPD的截短形式的活性：

在肽进入细胞器之后，细胞器靶向序列通常被切割。之前的研究人员(Fritze I et al.(2004)Plant Physiology134:1388-1400;Yang C et al.(2004)Biochemistry43:10414-10423)已证实，天然成熟玉米HPPD起始于ala17或ala23。通过移除不同长度的氨基端，、在大肠杆菌中表达基因以及测试其活性和稳定性，产生编码蛋白的野生型玉米HPPD基因的变体。在每种情况下，将蛋氨酸起始密码子加到截短序列。蛋白是通过其N末端氨基酸(所有丙氨酸s)在SEQ ID NO:1中的位置来指定。所有N末端截短的蛋白保留HPPD活性。测得k_cat的差异可能无显著差异，因为该实验仅进行了单次测量。

表16a玉米野生型HPPD的N末端截短变体的活性

截短	k_cat，min^-1
		玉米野生型	166
Ala12	230
		Ala15	177
Ala17	180
		Ala20	128
Ala23	184

为了测试稳定性，将变体在20C至54C中的不同温度下加热30分钟。通过之前实施例所述的偶联测定检测剩余活性。所有变体在20C下是稳定的，但活性在孵育温度超过30C时降低，54C下几乎没有活性。稳定性在野生型和所有截短变体之间没有差异。

将两个其他变体截短，使得它们的第二氨基酸(N末端蛋氨酸之后)是ala20，并进行底物饱和动力学分析。未发现显著差异。

表16b.截短至ala20的变体的动力学参数

	Km，mM	k_cat，min^-1	k_cat/Km
				D0223946	6.61±0.84	247±47.1	37.2±2.39
D0223946-ala20	6.86±0.37	206±20.5	30.2±4.64
				D0223961	11.80±0.99	106±12.4	9.00±0.29
D0223961-ala20	11.38±0.96	93.3±5.41	8.22±0.36

在玉米叶中瞬时表达时，与DsRed融合的玉米HPPDN末端被靶向到叶绿体

构建了这样的载体，其中玉米HPPD基因中编码N末端50个氨基酸的部分与编码珊瑚红色荧光蛋白2(DsRed2)的基因融合，并插入二元表达载体，所述载体位于玉米二磷酸核酮糖羧化酶活化酶启动子(Liu et al.(1996)Plant Physiol.112(1):43–51)的控制下并且终止于马铃薯蛋白酶抑制剂II(pinII)终止子区(An et al.(1989)Plant Cell1:115–122)并具有潮霉素选择盒。两个基因位于农杆菌的左侧和右侧边界序列之间。

阳性对照载体是相同的，但插入物是与拟南芥二磷酸核酮糖羧化酶活化酶的叶绿体靶向肽融合的DsRed2，而阴性对照是无靶向序列的DsRed2。将质粒转化入根癌农杆菌AGL-1。用农杆菌感染3周的玉米幼苗的叶，并在两天后用荧光显微镜检查(Nikon Eclipse80i,DsRed滤光片组)。对于DsRed2与二磷酸核酮糖羧化酶活化酶CTP融合的载体，与预期一致，观察到类似于核周叶绿体模式的红色荧光的离散束。当DsRed2与玉米HPPD的N末端50个氨基酸融合时，观察到相似的模式。没有靶向，荧光是弥散的，部分聚集在核中。参见图7。

实施例15.重排玉米酶中单个位置的饱和诱变

一个随机突变G414D(D0205976)仅引起不敏感性参数(ON×OFF)增加6.5倍，但是对于底物HPP的Km增加100倍。为了探索该位置的其他取代是否能提供相似的不敏感性增加以及更好的动力参数，进行饱和诱变，并测量纯化的蛋白的动力学参数和不敏感性参数。评价了19个可能取代中的12个。构建了该位点处取代的小文库。产生取代的主链序列为HPPD D0223944。

表17.位置414处取代的动力学和不敏感性参数

位置414处的取代得到大范围的K_M值。因此，总体性能的参数ON速率比×OFF速率比×k_cat不足，所以将其代替为ON×OFF×k_cat/K_M。一些一般的观察结果是，对于D0223944序列，1)不敏感性未增加与野生型背景中观察到的相同的增量，2)负电荷(D)提高Km，而正电荷(R、K)保持接近正常的Km，3)A、Q和H支持最高的k_cat，以及4)疏水侧链(V、Y、F)和S不利于不敏感性，特别是对于ON速率。K、R、H和A取代代表不敏感性和催化活性的最佳组合。

表23.实施例15中所述变体的总结

克隆名称	SEQ ID NO	与本文其它HPPD变体的关系的简要描述
			D0223957(全长)	383	8_D0223946G414A
D0223959(全长)	384	3_D0223903C341I L360M S417G G414A
			D0223960(全长)	385	3_D0223903C341I L360M S417G G414K
D0223961(全长)	386	6_D0223944G414K
			D0223962(全长)	387	6_D0223944G414A
D0223963(全长)	388	6_D0223944G414H
			D0223964(全长)	389	6_D0223944G414R
D0223957(N末端截短)	397	8_D0223946G414A
			D0223959(N末端截短)	398	3_D0223903C341I L360M S417G G414A
D0223960(N末端截短)	399	3_D0223903C341I L360M S417G G414K
			D0223961(N末端截短)	400	6_D0223944G414K
D0223962(N末端截短)	401	6_D0223944G414A
			D0223963(N末端截短)	402	6_D0223944G414H
D0223964(N末端截短)	403	6_D0223944G414R

实施例16.新的HPPD基序的鉴定

表18提供了在具有对HPPD抑制剂的提高的不敏感性的HPPD多肽中发现的一系列基序(SEQ ID NO:372-382和460-463)。表18还展示了SEQ ID NO:3-164，383-389和404-430所示的那些HPPD序列具有鉴定出的基序。

SEQ ID NO:372-382和460-463中鉴定出的HPPD基序被确定为对具有提高的除草剂耐受性的HPPD变体是重要的。基序是基于多背景下统计学显著性的多样性列表(表11)产生的。如此限定的基序包括至少一个统计学显著的多样性，以及基序所限定的特定氨基酸组合特有地仅存在于具有提高的不敏感性的HPPD重排变体。

也可以用重排玉米HPPD变体的特有多样性限定非连续基序。与其他已知植物、细菌、真菌或动物HPPD蛋白相比，当与玉米HPPD蛋白最佳比对时，以下单、双以及三最小氨基酸取代的列表对于实施例中所述的改进的变体的特有的。正如在本文其他部分所详细讨论的，这样的非连续HPPD基序包括但不限于：

(a)具有玉米位置341C的等同方案的HPPD。

(b)具有玉米位置261A、301I、327L、328P、360M或417G中的一个或多个和341C的等同方案的HPPD。

(c)具有玉米位置328P、360M或417G中的一个或多个和341E的等同方案的HPPD。

(d)具有玉米位置327L、331P或360M中的一个或多个和417G的等同方案的HPPD。

(e)具有玉米位置360M或417G中的一个或多个和(261A和/或301L)和328P的等同方案的HPPD。

(f)具有玉米位置(261A和/或327L)和331P和341E的等同方案的HPPD。

(g)具有玉米位置301I和327L中的一个或多个以及209V和233L的等同方案的HPPD。

(h)具有玉米位置233L和360M中的一个或多个以及327L和328P的等同方案的HPPD。

其他非连续HPPD基序描述于实施例20。

实施例17.通过引入改进的HPPD蛋白的连续和非连续基序来改进HPPD蛋白

玉米HPPD基因的重排和诱变中鉴定出的氨基酸取代可以在其他HPPD蛋白中类似的位置进行，以提高对HPPD抑制剂除草剂的不敏感性。序列可以经过最佳比对，并对新HPPD序列进行基序取代。通过产生合成的对应基因序列或通过编码新模板基因的核苷酸序列的定点诱变可以制备设计的蛋白。例如，可以利用实施例16的基序改变高粱HPPD基因，使其编码改进的HPPD变体。相似的，可以利用实施例16的基序制备改进的大豆(Glycine max)HPPD蛋白，如图9或图14所示。使蛋白在大肠杆菌中表达，并按实施例1表征，按照实施例9或12将其转化入植物，以及按照实施例10和11来表征植物中的除草剂耐受性。

表18.具有提高的不敏感性的HPPD变体中存在的特有序列基序

加括号的氨基酸([])表示可以在该位置存在的任何氨基酸残基。

实施例18.通过引入改进的玉米HPPD蛋白的连续和非连续基序改进HPPD蛋白

玉米HPPD基因的重排和诱变中鉴定出的氨基酸取代可以在其他HPPD蛋白中类似的位置进行，以提高它们对HPPD抑制性除草剂的不敏感性。将天然玉米HPPD和改进的玉米HPPD的序列与高粱(Genbank登录号XP002453359)和大豆(Genbank登录号ABQ96868)的序列比对，并且相应地设计基序取代，如图14所示。商业合成为改进设计的基因，将其插入载体pVER7062并进行表达、纯化和评价，如实施例1所述。

表21.玉米HPPD中赋予对抑制剂的降低的敏感性的氨基酸取代也赋予降低的来自大豆和高粱的HPPD降低的敏感性。

表21的数据表明，限定为连续或非连续基序的氨基酸取代当被插入其他植物种类的HPPD蛋白时具有相似的效果。大豆HPPD蛋白对硝磺草酮提高2.41倍，对环磺酮提高5.10倍。高粱HPPD蛋白对硝磺草酮提高6.13倍，对环磺酮提高7.71倍。GE010883如SEQ ID NO:459所示，GE010082如SEQ ID NO:458所示。

实施例19.改进的HPPD变体赋予多种HPPD抑制剂除草剂的耐受性

利用qPCR评价表达由合成启动子(描述于US6,072,050)驱动的D0223903(SEQ ID NO:3)的T1大豆植物中转基因的存在，选择空白和阳性分离子。在V1生长阶段，用硝磺草酮、环磺酮、苯吡唑草酮以及异噁唑草酮的商业制剂对植物喷雾。以374L/ha的喷雾量，利用非离子表面活性剂和硫酸铵，每种除草剂以两个级别叶面施用。通过与具有相似遗传背景的未处理的植物比较来确定个体植物的除草剂反应。可视损伤评为0至100%损伤(0=无反应至100=死亡植物)。表22中的结果是两个重复实验的平均值，并表明，转基因增加大豆对不同HPPD-抑制剂除草剂的耐受性。

表22.用HPPD转基因转化的植物表现出对多种除草剂的耐受性。

实施例20.重排玉米HPPD中单个位置的饱和诱变

对实施例5、表9和实施例21、表26所示的赋予任何动力学参数或不敏感性参数有益效果的多样性的ProSAR分析解释了在多序列背景下有益的那些取代(表11)，反映出它们较高的作用级别。为了确定那些位点被完全利用，我们在选定位点对D0226660主链进行了饱和诱变。如实施例1所述测定动力学和不敏感性参数。如表24所示，6个位置处的多个取代得到了动力学或不敏感性参数几乎与主链序列同样好或优于主链序列的变体。

表24.通过在D0226660中选定位置进行饱和诱变制备的变体的动力学和不敏感性参数。

野生型玉米HPPD(SEQ ID NO:1)中选定位置的氨基酸：H44，F233，Q316，T331，R341和L360。

因此，还提供了HPPD多肽，其在编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸，SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸，以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括赖氨酸。

实施例21.改进的变体中HPPD多样性的其他总结

对表9和表26中所有变体进行了实施例5所述的相同分析。得到的表25A-E总结了存在于具有提高的不敏感性参数的变体中的总体多样性，实施例5中也进行了限定。

表26

表25A与提高的ON速率比有关的多样性

On速率比

表25B与提高的OFF速率比有关的多样性

Off速率比

表25C与提高的不敏感性参数(ON×OFF)有关的多样性

不敏感性参数(On×Off)

表25D与提高的V_最大MT有关的多样性

V_最大MT

表25E与提高的ON×OFF×k_cat有关的多样性

On×Off×k_cat

表19.序列的总结

表20.HPPD变体的序列总结

本文所用的冠词“a”和“an”指一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法对象。例如，“元件(an element)”表示一个或多个元件。

说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。将所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同表明将每个单个出版物或专利申请特别且单独地并入本文一样。

尽管为了清楚理解的目的，通过说明和举例的方式对上述发明进行了详细描述，显而易见的是可以在后附权利要求的范围内进行某些变化和改动。

Claims

a.在SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396中任一个的全长上具有至少60%、70%、80%或90%的序列同一性，并且具有SEQ ID NO:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462、463、467、468、469-488或489所示的氨基酸序列中至少一个的氨基酸序列，其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性；或

(a)与SEQ ID NO:109具有至少1853的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:101具有至少1855的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:50具有至少1862的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:164具有至少1864的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:103具有至少2267的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:160具有至少2268的相似性评分；

(g)与SEQ ID NO:412具有至少1855的相似性评分；

(a)与SEQ ID NO:263具有至少1830的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:212具有至少1839的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:218具有至少1840的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:320具有至少2152的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:275具有至少2176的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:265具有至少2177的相似性评分；或，

(j)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分；

4.分离的或重组的多核苷酸，其包含编码HPPD多肽的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、466-489中任一个具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，其中

c)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1氨基酸位置341的的氨基酸残基包括半胱氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸，对应于SEQID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包含蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

d)编码的多肽中对应于的氨基酸残基SEQ ID NO:1的氨基酸位置341包括谷氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

e)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸，并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQID NO:1的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸，和/或对应于氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸；

f)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

g)编码的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或SEQ ID NO:1的氨基酸位置327包括亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸，以及对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸；

j)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸；或，

k)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。

5.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多肽与SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD多肽相比，具有对HPPD抑制剂提高的不敏感性。

6.如权利要求5所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述对HPPD抑制剂提高的不敏感性包括：

7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述多肽包含叶绿体转运肽序列，所述叶绿体转运肽序列包括：

a.编码SEQ ID NO:490，371或464所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

c.编码异源叶绿体转运肽序列的核苷酸序列。

8.包含权利要求1-7中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸的核酸构建体。

9.如权利要求8所述的核酸构建体，还包含可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。

10.如权利要求9所述的核酸构建体，其中所述启动子相对于所述多核苷酸是异源的，或所述启动子相对于所述多核苷酸是同源的。

11.包含权利要求1-7中任一项所述的至少一个多核苷酸或权利要求8-10中任一项所述的核酸构建体的细胞，其中所述多核苷酸对于所述细胞是异源的。

12.如权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。

13.如权利要求12所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述核酸构建体被稳定并入所述植物细胞的基因组。

14.如权利要求12所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述核酸构建体被稳定并入所述植物细胞的叶绿体基因组。

15.如权利要求9-14中任一项所述的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

16.如权利要求15所述的细胞，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、稻、大麦、甘蔗、高粱或黑麦。

17.如权利要求12-14中任一项所述的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

18.如权利要求17所述的细胞，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。

19.包含权利要求12-18中任一项所述的植物细胞的植物。

20.包含权利要求12-18中任一项所述的植物细胞的植物外植体。

21.如权利要求12-20中任一项所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细胞与相同种类、品种或栽培品种的不包含权利要求1-7中任一项所述的至少一个多核苷酸的植物、外植体或植物细胞相比，表现出对HPPD除草剂的增加的不敏感性。

22.如权利要求12-21中任一项所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细胞还包含至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽。

23.如权利要求22所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽包括：

(a)耐磺酰脲的乙酰乳酸合酶；

(b)耐咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶；

(c)耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶；

(d)耐草甘膦的草甘膦氧化还原酶；

(e)草甘膦-N-乙酰基转移酶；

(f)膦丝菌素乙酰基转移酶；

(g)原卟啉原氧化酶。

(h)生长素酶；

(i)P450多肽；或，

(j)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)。

24.如权利要求22所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述至少一种赋予对其他除草剂的耐受性的多肽包括乙酰乳酸合酶(HRA)和/或草甘膦-N-乙酰基转移酶多肽的高抗性等位基因。

25.如权利要求12-24中任一项所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细胞还包含至少一种赋予对HPPD除草剂的耐受性的其他多肽。

26.如权利要求25所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述至少一种多肽包括P450多肽或NSF1。

27.权利要求19或21-26中任一项所述的植物产生的转基因种子。

28.分离的或重组的多肽，其包含下述氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO:109具有至少1853的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:101具有至少1855的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:50具有至少1862的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:164具有至少1864的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:103具有至少2267的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:160具有至少2268的相似性评分；或，

(j)与SEQ ID NO:412具有至少1855的相似性评分；

29.分离的或重组的多肽，其包含下述氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO:263具有至少1830的相似性评分；

(b)与SEQ ID NO:212具有至少1839的相似性评分；

(c)与SEQ ID NO:218具有至少1840的相似性评分；

(d)与SEQ ID NO:320具有至少2152的相似性评分；

(e)与SEQ ID NO:275具有至少2176的相似性评分；

(f)与SEQ ID NO:265具有至少2177的相似性评分；或，

(j)与SEQ ID NO:433具有至少1825的相似性评分；

30.分离的或重组的多肽，其包含与SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396、466-489中任一个具有至少60%，70%，80%或90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有HPPD活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性，其中

c)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括异亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置327的氨基酸残基包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于的氨基酸残基SEQ ID NO:1的氨基酸位置417包括甘氨酸。

d)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括谷氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

e)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸，并且所述多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ IDNO:1的氨基酸327的氨基酸位置包括亮氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸331的氨基酸位置包括脯氨酸，和/或对应于氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸360的氨基酸位置包括蛋氨酸；

f)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置301的氨基酸残基包括赖氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置328的氨基酸残基包括脯氨酸，并且编码的多肽包含以下氨基酸残基中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置417的氨基酸残基包括甘氨酸；

g)所述多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置261的氨基酸残基包括丙氨酸和/或SEQ ID NO:1的氨基酸位置327包括亮氨酸；以及对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸包括脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸包括谷氨酸；

j)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸或亮氨酸；或，

k)编码的多肽中具有任何以下氨基酸残基中的至少1、2、3、4、5或6个：对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置44的氨基酸残基包括组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸或缬氨酸；SEQ ID NO:1的氨基酸位置233包括苯丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置316的氨基酸残基包括谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置331的氨基酸残基包括苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置341的氨基酸残基包括精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或丙氨酸，或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置360的氨基酸残基包括蛋氨酸、赖氨酸或亮氨酸。

31.分离的或重组的多肽，其包含

(a)在SEQ ID NO:1、2、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、327、391、392、394、396中任一个的全长上具有至少60%、70%、80%或90%序列同一性，并且具有SEQ ID NO:377、372、373、374、375、376、378、379、380、381、382、460、461、462、463、467、468、469-488或489所示的氨基酸序列中至少一个的氨基酸序列，其中所述多肽具有4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)活性并表现出对HPPD抑制剂的不敏感性；或

32.如权利要求28-31中任一项所述的分离的或重组的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1所示的多肽或天然HPPD多肽相比，具有对HPPD除草剂的增加的不敏感性。

33.如权利要求32所述的分离的或重组的多肽，其中所述对HPPD抑制剂的提高的不敏感性包括：

34.如权利要求28-33中任一项所述的分离的或重组的多肽，其中所述多肽包含叶绿体转运肽序列，所述叶绿体转运肽序列包含：

a.SEQ ID NO:490、371或464所示的氨基酸序列；

c.包含异源叶绿体转运肽序列的氨基酸序列。

35.产生能耐受4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂的植物细胞的方法，包括用权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体转化植物细胞。

36.如权利要求35所述的方法，还包括通过使植物细胞在一定浓度的HPPD除草剂的存在下生长来选择对HPPD除草剂具有抗性的植物细胞，所述浓度的HPPD除草剂能白化不包含权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体的植物细胞。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述方法包括

b.将权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8、9、10或11中任一项所述的核酸构建体转化入步骤(a)中的所述植物细胞；

38.如权利要求35、36或37所述的方法，其中所述方法还包括从所述植物细胞再生出转基因植物。

39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述转化植物细胞导致所述多核苷酸被稳定整合入所述植物细胞的基因组。

40.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述转化植物细胞导致所述多核苷酸被稳定整合入所述植物细胞中叶绿体的基因组。

41.控制具有农作物的田地中的杂草的方法，包括：

(a)将权利要求27所述的转基因种子或权利要求19或21-26中任一项所述的植物种植在所述田地中；以及

42.如权利要求36、37或41中任一项所述的方法，其中所述HPPD除草剂包括以下中的至少一个：三酮、异噁唑、吡唑或苯并双环酮或以上的活性衍生物或农业可接受的盐。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述HPPD除草剂包括以下中的至少一个：硝磺草酮、磺草酮、苯吡唑草酮、环磺酮、磺酰草吡唑、异噁唑草酮、吡草酮、苄草唑或吡唑特或以上的活性衍生物或农业可接受的盐。

44.如权利要求41所述的方法，还包括向田地中的农作物和杂草施用足够量的至少一种其他除草剂，包括草甘膦、双丙氨膦、膦丝菌素、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、草硫膦、草铵膦、ALS抑制剂或原卟啉原氧化酶抑制剂。

45.检测HPPD多肽的方法，包括利用免疫测定分析植物组织，所述免疫测定包括一种或多种能特异性地识别权利要求28-34中任一项所述的多肽的抗体，其中所述一种抗体或多种抗体是由作为抗原的权利要求28-34中任一项所述的多肽引发的。

46.检测权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸的存在的方法，包括利用PCR扩增分析植物组织和检测所述多核苷酸。