CN103215208A - 副猪嗜血杆菌培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种副猪嗜血杆菌培养基，其制备方法包括基础培养液制备、辅酶A处理和培养基的完善；基础培养液包括蛋白胨、胰蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、酵母浸出液、甘油和蒸馏水，基础培养液与辅酶A及小牛血清混合均匀即得副猪嗜血杆菌培养基。本发明提供的副猪嗜血杆菌培养基能够保存副猪嗜血杆菌，方便运输副猪嗜血杆菌可疑样品，运输过程中不会造成副猪嗜血杆菌死亡，提高该菌的分离几率。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌培养基。
背景技术
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）能引起猪的多发性浆膜炎和关节炎。该菌十分娇嫩，对培养基要求相对苛刻，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD 或V 因子) , 不需要X因子（血红素和其它卟啉类物质），生长速度极其缓慢，体外培养保存易死亡，在鲜血琼脂平板上培养72h以上，才能长出针尖大小菌落，HPS极容易被忽略或被其他菌掩盖。
副猪嗜血杆菌对冰冻、热都敏感，分离细菌的样品，如关节液、胸腔积液等采集时需立即接种培养基，否则分离培养往往不能成功，但在实际工作中到现场采集立即接种培养基的是很少一部分，畜主或基层兽医人员采集样品往往需要冷藏或冰冻一段时间后送到实验室或通过运输的方式投送，样品到达后分离培养出菌率较低。因此, 分离培养该菌时遇到了很大的困难。
目前报道使用进口的TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）和TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）作为分离副猪嗜血杆菌的基础培养基，这些培养基营养极其丰富，HPS在这些培养基上生长速度较快。如果把其作为运输副猪嗜血杆菌可疑样品的培养基，由于可疑样品可能还存在大肠杆菌、链球菌等菌，这些菌种在TSA或TSB上生长速度远比副猪嗜血杆菌生长快得多，短时间内就能把培养基的养分消耗完，且其生长产生的废物能把副猪嗜血杆菌杀死。因此，TSA和TSB并不适合作为运输可疑样品的培养基，也不适合作为保存副猪嗜血杆菌的培养基。临床上迫切需要一种适合运输副猪嗜血杆菌可疑样品的培养基。
发明内容
本发明提供一种副猪嗜血杆菌培养基，由以下制备方法制备而成，其制备方法包括基础培养液制备、辅酶A处理和培养基的完善，具体步骤如下：
1）所述的基础培养液制备
A、将基础培养液的组分14~16g/L（重量/体积计，下同）蛋白胨、4~6g/L胰蛋白胨、4~5g/L氯化钠、2~3g/L葡萄糖、4~6g/L酵母浸出液和13~18‰（按体积比计，下同）甘油，余量蒸馏水混合；
B、将A步骤获得的混合液加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解；
C、将B步骤中获得的溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2；
D、将C步骤获得的溶液分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；
2）所述的辅酶A处理
取0.14~0.16g/L辅酶A，用8~12‰无菌水稀释过滤除菌；
3）培养基的完善
每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存备用。
以上所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为5g/L、葡萄糖为2g/L、酵母浸出液为5g/L和甘油为15‰。
以上所述的基础培养液的组分是蛋白胨为14g/L、胰蛋白胨为6g/L、氯化钠为5g/L、葡萄糖为2g/L、酵母浸出液为5g/L和甘油为15‰。
以上所述的基础培养液是的组分蛋白胨为16g/L、胰蛋白胨为4g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为4g/L和甘油为13‰。
以上所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为6g/L和甘油为18‰。
以上所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为5g/L、葡萄糖为2g/L、酵母浸出液为6g/L和甘油为16‰。
以上所述的基础培养液的组分是蛋白胨为14g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为6g/L和甘油为14‰。
以上所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为5g/L和甘油为17‰。
本发明的特点：本发明培养基中的蛋白胨等营养物质正好满足副猪嗜血杆菌存活的最低需要，其生长速度较慢；且本发明的基础培养液添加甘油，一方面甘油可以补充细菌生长所需的碳源；另一方面甘油是一种亲水性物质，起维持渗透压的作用，保持细菌细胞壁的完整性作用，保证副猪嗜血杆菌存活时间较长，使运输副猪嗜血杆菌样品过程中维持细菌的活性，达到提高分离出菌率的目的。本发明的进步：1）便于运输 以无菌操作方式，将副猪嗜血杆菌可疑样品菌株放入本发明培养基，装于试管中，在室温情况下，通过班车货运的方式即可运输，保存运输时间为12~72h。2）提高出菌几率 本发明培养基作为运输副猪嗜血杆菌可疑样品的培养基，在室温下保存运输，到达实验室后再进行分离培养，可明显提高初次分离的副猪嗜血杆菌菌株的成功率。
具体实施方式
发明人近年来对副猪嗜血杆菌病的研究中，反复改进培养该细菌的流程，总结出运输副猪嗜血杆菌可疑样品的培养基，并把培养基送到畜主和基层兽医人员的手上，指导他们以无菌操作的方式，将样品放入培养基中，在室温的情况下通过班车货运的方式运送到发明人手上，到达实验室再进行接种分离副猪嗜血杆菌，该方法提高了分离副猪嗜血杆菌的出菌率。
实施例1
取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出液和15‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.15g/L辅酶A，用10‰无菌水溶解稀释过滤除菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例2
取14g/L蛋白胨、6g/L胰蛋白胨、5g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出液和15‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.14g/L辅酶A，用8‰无菌水溶解稀释过滤除菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例3
取16g/L蛋白胨、4g/L胰蛋白胨、4g/L氯化钠、3g/L葡萄糖、4g/L酵母浸出液和13‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.15g/L辅酶A，用10‰无菌水溶解稀释过滤出菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例4
取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、4g/L氯化钠、3g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出液和18‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.16g/L辅酶A，用12‰无菌水溶解稀释过滤出菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例5
取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出液和16‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.15g/L辅酶A，用10‰无菌水溶解稀释过滤除菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例6
取14g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、4g/L氯化钠、3g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出液和14‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.15g/L辅酶A，用10‰无菌水溶解稀释过滤除菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例7
取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、4g/L氯化钠、3g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出液和17‰甘油，余量蒸馏水混合，加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解，将溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2，将调节好pH值的溶液进行分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；取0.15g/L辅酶A，用10‰无菌水溶解稀释过滤除菌；每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存，得副猪嗜血杆菌培养基。
实施例8
将实施例1制备的培养基运输分离副猪嗜血杆菌样品时，将无菌采集的血液、关节液、胸腔积液、肺等组织样品放入培养基中，装于10~15ml试管中，盖好盖封装好，垂直放在合适的泡沫箱中（气温超过40℃时加适量的冰袋，预防温度过高）密封好运输。运输中不可倒立，在室温的情况下通过班车货运的方式运送到发明人手上，到达实验室后，将培养基接种于分离副猪嗜血杆菌的培养基上进行分离。
实施例9
表1：使用本发明培养基保存运输组织样品与冷冻保存运输样品出菌效果比较
结果表明：1、保存时间在12h以下，两种保存方式的样品分离出菌率没有明显差别；保存时间在12~72h之间，本发明培养基分离出副猪嗜血杆菌，冷冻保存无副猪嗜血杆菌出现；保存时间在72h以上，两种方法均无副猪嗜血杆菌出现。2、本发明培养基在室温下保存运输到达实验室，仍可分离出副猪嗜血杆菌，而冷冻保存需降温，且分离出菌情况明显劣于本发明培养基。
Claims (8)
1.一种副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：由以下制备方法制备而成，其制备方法包括基础培养液制备、辅酶A处理和培养基的完善，具体步骤如下：
1）所述的基础培养液制备
A、将基础培养液的组分14~16g/L（重量/体积计，下同）蛋白胨、4~6g/L胰蛋白胨、4~5g/L氯化钠、2~3g/L葡萄糖、4~6g/L酵母浸出液和13~18‰（按体积比计，下同）甘油，余量蒸馏水混合；
B、将A步骤获得的混合液加热至沸腾并不断搅拌直至混合液完全溶解；
C、将B步骤中获得的溶液通过氢氧化钠调节pH值至7.0~7.2；
D、将C步骤获得的溶液分装，在121℃下灭菌15~20min，冷却后即得基础培养液；
2）所述的辅酶A处理
取0.14~0.16g/L辅酶A，用8~12‰无菌水稀释过滤除菌；
3）培养基的完善
每100ml基础培养液以无菌手续加入1ml辅酶A稀释液和5ml无菌的小牛血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10~15ml，4~5℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为5g/L、葡萄糖为2g/L、酵母浸出液为5g/L和甘油为15‰。
3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为14g/L、胰蛋白胨为6g/L、氯化钠为5g/L、葡萄糖为2g/L、酵母浸出液为5g/L和甘油为15‰。
4.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为16g/L、胰蛋白胨为4g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为4g/L和甘油为13‰。
5.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为6g/L和甘油为18‰。
6.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为5g/L、葡萄糖为2g/L、酵母浸出液为6g/L和甘油为16‰。
7.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为14g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为6g/L和甘油为14‰。
8.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：所述的基础培养液的组分是蛋白胨为15g/L、胰蛋白胨为5g/L、氯化钠为4g/L、葡萄糖为3g/L、酵母浸出液为5g/L和甘油为17‰。
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