CN103207151A

CN103207151A - 用于生物反应器的在线细胞显微观察仪

Info

Publication number: CN103207151A
Application number: CN2013101350544A
Authority: CN
Inventors: 缪寿洪; 王泽建; 张敏; 虞万安; 郭美锦; 王振煜; 贺莉清; 张大伟; 袁旭军
Original assignee: KEYUAN ELECTRONIC TECH Co Ltd SHANGHAI; University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: KEYUAN ELECTRONIC TECH Co Ltd SHANGHAI; Shanghai Cohere Electronics Tech Co Ltd; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明公开了一种用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，特点是，它包括观察仪主体、可变倍光学系统、取样装置、清洗机构、内部光源结构和控制器，观察仪主体通过固定螺母与生物反应器连接，观察仪主体上开有的三个孔分别与可变倍光学系统、取样装置和清洗机构连接；内部光源结构与观察仪主体之间通过伸缩杆连接；清洁机构与观察仪主体通过活动轴连接。本发明采用一种结合可变焦物镜和前组物镜耦合的方式，仅单一的摄像头便可达到同时观测微生物细胞和动物细胞的动态观测要求。此外，达到了在线细胞显微观察仪的一些基本技术要求：高分辨率的光学系统，高速图像传输能力和高效的细胞数量统计，耐高温高压能力，镜头的自动清洁，样品的自动采集。

Description

用于生物反应器的在线细胞显微观察仪

技术领域

本发明涉及一种在线细胞显微观察仪，特别是一种应用于生物反应器的在线细胞形态观察仪。

背景技术

微生物细胞、动物细胞在生物反应器中培养时，为了实时了解其生长与形态变化情况，最直接有效的方法就是对其进行取样分析。传统方法采用离线间隔取样，这种方法难以避免杂菌污染问题，且观察动态性差，过程分析较困难。针对这些问题，科研人员研制了多种在线显微观察仪(In-situ microscope)。

德国专利（专利号DE 4032002）介绍了在一种线细胞观察仪设计，其特点为生物反应器侧壁开有透明孔，外部打入光源，在被观测细胞溶液反射后经过半透半反透镜，再聚焦于摄像机上，然后送入图像处理单元。该装置的缺点是透明玻璃反应器内侧壁上有附着物后无法清洗。2004年德国专利(DE10350243)也介绍了一种利用SLD(Super Light Diode)照明，Multimode Fiber(多模光纤)传输、同步高速摄像的在线细胞观察仪。它由反应器外产生激光，通过多模光纤深入细胞溶液，再照射到样品细胞，显微物镜汇聚细胞散射的光再成像于摄像机上，然后通过传输单元送入计算机处理。由于观测样品一直处于运动中且采用明视场照明方式，对于样品的对比度和分辨率要求难以满足量化分析要求，且机械结构复杂，成本较高。

国内发明专利(200710042189.0)和实用新型(200720071207.3)提出一种采用暗视场照明以提高对于细胞所成图像的对比度以及分辨率的在线细胞显微观察仪；提供一种可更换波长的外部光源系统；结构简单的机械取样装置，操作简便和制造成本低。该观察仪由于是采用外部光源的暗视场照明方式，光学系统复杂，成本较高。且在观察仪使用过程中清洗机构和取样机构长期使用后易相互卡位，需要维护校正，结构的可靠性有待提高。

发明内容

为了克服现有技术缺点提供一种具备可变倍物镜组的光学系统，固定观察腔的取样装置，内部明视场照明方式和清洁机构的在线细胞显微观察仪。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特点是，该观察仪包括观察仪主体、可变倍光学系统、取样装置、清洗机构、内部光源结构和控制器，所述观察仪主体通过固定螺母与生物反应器相连接,固定螺母拧紧后主体上的密封圈受挤压变形使得观察仪主体和生物反应器之间相互密封，所述观察仪主体上开有三个孔，分别与可变倍光学系统、取样装置和清洗机构相连接；所述内部光源结构与观察仪主体之间通过一根可直线移动的伸缩杆连接；所述的清洁机构通过在观察仪主体孔中穿有的活动轴相连接，清洁机构采用硅橡胶刮扫叶，清洁电机带动其在取样结束后刮扫。

所述可变倍光学系统由可变倍物镜组和CCD摄像机组成，调整可变倍物镜组的位置，使观测对象能清晰成像，然后通过锁紧螺母固定可变倍物镜组在观察仪主体上，当观察对象形体尺寸变化时，调整可变倍物镜组放大倍数，获取清晰成像效果。

所述可变倍物镜组采用可变焦物镜和前组物镜耦合的方式，前组物镜为前组物镜为NA=0.3高分辨率短共轭距长工作距物镜，放大倍数M₁=8x；可变焦物镜为Zoom物镜组，放大倍数M₂=1.33～3.5x，以期实现细胞生长过程中动态观察和观察范围的变化，该两组物镜通过一中间透镜有效匹配。

所述取样装置由驱动电机、由从动齿轮和主动齿轮组成的齿轮组、套筒、限位块、伸缩杆、密封环、密封环盖板、固定套筒、紧固螺母、固定套筒防水玻璃和主体防水玻璃组成，固定套筒防水玻璃的一端置有一个凹槽，当固定套筒防水玻璃与主体防水玻璃紧密接触时，该凹槽形成一个隔离的取样腔，LED光正好从该取样腔中透过并使样品在可变倍光学系统中成像。

所述清洗机构包括硅胶刮扫叶、刮扫叶轴、活动轴、清洁电机、支撑板、圆棍、档块，清洁电机带动活动轴使圆棍碰到挡块时，清洁电机堵转，电流升高，控制器根据电流升高改变清洁电机转向，实现硅胶刮扫叶往复刮扫。

所述内部光源结构主要包括LED灯，密封环(、密封环盖板、固定套筒、紧固螺母和防水玻璃，LED灯装在固定套筒的底部，电源线从密封环内部走，再经过伸缩杆中间的通孔伸到观察仪外部，固定套筒的右端粘好防水玻璃，LED灯发出的光从固定套筒透过防水玻璃照到样品中,使样品在CCD摄像机中成像。

所述控制器采用基于ARM的嵌入式系统，它包括具有ARM核的CPU、3G无线网络接口、TCP/IP网络接口、RS48和摄像头接口，主要实现视频图像的显示及存储；视频图像的远程传输。

本发明出了一种结合可变焦物镜和前组物镜耦合的方式，仅单一的摄像头便可达到同时观测微生物细胞和动物细胞的动态观测要求。此外，从结构优化和提高易操作性的角度出发，提出了在线细胞显微观察仪的一些基本技术要求，包括：1)在线观测能力的高效性，包括高分辨率的光学系统，高速图像传输能力和高效的细胞数量统计软件2) 耐高温高压能力。耐高温和高压的光机结构有助于减少该仪器的频繁拆卸,提高工作效率。3)镜头的自动清洁装置。4)样品的自动采集装置。为推广应用在线细胞显微观察仪创造了条件。

附图说明

图1为在线细胞显微观察仪安装在生物反应器上的示意图；

图2为在线细胞显微观察仪主视图；

图3为在线细胞显微观察仪右视图；

图4为图3的A-A剖视图；

图5为图3的B向视图；

图6为在线细胞显微观察仪主体主视图；

图7为在线细胞显微观察仪主体左视图；

图8为在线细胞显微观察仪的取样腔示意图；

图9为在线细胞显微观察仪的可变倍光学系统原理图1；

图10为在线细胞显微观察仪的可变倍光学系统原理图2。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。

如图1-7所示，一种用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特点是，该观察仪包括观察仪主体、可变倍光学系统、取样装置、清洗机构、内部光源结构和控制器，所述观察仪主体29通过固定螺母7与生物反应器1相连接,观察仪与生物反应器的密封和固定采用如下方式实现，观察仪主体一侧开有一个半圆形密封圈凹槽35，如图7所示，固定螺母7拧紧后观察仪主体29上的密封圈30受挤压变形使得观察仪主体29和生物反应器1之间相互密封，所述观察仪主体29上开有三个孔，记为C、D、E孔，分别与可变倍光学系统、取样装置和清洗机构相连接；所述内部光源结构与观察仪主体29之间通过一根可直线移动的伸缩杆26连接；所述的清洁机构通过在观察仪主体29孔中穿有的活动轴32相连接，清洁机构采用硅橡胶刮扫叶8，清洁电机20带动其在取样结束后刮扫。

由图2、图5所示，所述可变倍光学系统由可变倍物镜组4和CCD摄像机3组成，调整可变倍物镜组4的位置，使观测对象能清晰成像，然后通过锁紧螺母5固定可变倍物镜组4在观察仪主体29上，当观察对象形体尺寸变化时，调整可变倍物镜组4放大倍数，获取清晰成像效果。

由图2、图4、图5所示，所述取样装置由驱动电机19、由从动齿轮15和主动齿轮16组成的齿轮组、套筒27、限位块28、伸缩杆26、密封环12、密封环盖板13、固定套筒10、紧固螺母11、固定套筒防水玻璃22和主体防水玻璃21组成，固定套筒防水玻璃22的一端置有一个凹槽，当固定套筒防水玻璃22与主体防水玻璃21紧密接触时，该凹槽形成一个隔离的取样腔36，如图8所示，LED光正好从该取样腔中透过并使样品在可变倍光学系统中成像。由图2所示，驱动电机19安装在支撑板18右端，驱动电机轴19从支撑板18中间穿过，并嵌进主动齿轮16中。从动齿轮15套在伸缩杆26的外面。同时从动齿轮又被支撑板18压紧，使从动齿轮15不能再伸缩杆26上左右移动，仅作旋转运动。伸缩杆26与观察仪器主体29之间装有套筒27。伸缩杆26外部装有一个硅橡胶波纹管14，可拉伸和压缩。硅橡胶波纹管14的一端压在观察仪主体29和套筒27之间，这个压紧力由压紧螺母一31产生，压紧螺母一31和观察仪主体29之间有固定块6；另一端压在密封环12和伸缩杆26之间，这个压紧力由压紧螺母二25产生。密封环12与密封环盖板13之间垫有密封环密封圈24。固定块6和支撑板18之间由四个支撑圆柱17支撑。套筒27和伸缩杆26之间装有一个限位块28，该限位块28起限制伸缩杆26作左右平移作用。取样装置的动作方式为：驱动电机19通过齿轮组带动伸缩杆26转动，由于限位块28的限制，使得伸缩杆26仅在套筒27左右移动，从而带动密封环12也作移动，也即固定套筒10相应左右移动。当固定套筒10移至与主体防水玻璃21接触时，一个隔离的取样腔36形成了,然后内部光源结构之LED灯23发出的光就能使采样腔里的样品在CCD摄像机3上成像，达到观察生物反应器1内部培养对象的目的。

由图4、图5所示，所述清洗机构包括硅胶刮扫叶8、刮扫叶轴9、活动轴32、清洁电机20、支撑板18、圆棍34、档块33，当观察仪需要清洗时，控制器会根据实现设定的程序控制清洁电机20带动活动轴32转动，通过与活动轴32相连的刮扫叶轴9的旋转使得硅橡胶刮扫叶8也做转动。因为需要清洁的面积较小，硅橡胶刮扫叶8仅需要做往复运动即可达到清洁效果。为此，在往复运动的两个极限位置放置了各一个挡块33,当活动轴32上的圆棍34碰到挡块33时清洁电机20会堵转，清洁电机20的电流会大幅上升，控制器检测到该电流的变化后发出改变清洁电机20转向的指令，直至圆棍34碰到下一个挡块33，清洁电机20又改变转向，如此往复达到了来回刮扫的目的。

由图2、图4所示，所述内部光源结构主要包括LED灯23，密封环12、密封环盖板13、固定套筒10、紧固螺母11和固定套筒防水玻璃22，LED灯23装在固定套筒10的底部，电源线从密封环12内部走，再经过伸缩杆26中间的通孔伸到观察仪2外部，固定套筒10的右端粘好防水玻璃，LED灯23发出的光从固定套筒10固定套筒透过防水玻璃22照到样品中,使样品在CCD摄像机3中成像。

本发明所用控制器采用基于ARM的嵌入式系统，它包括具有ARM核的CPU、3G无线网络接口、TCP/IP网络接口、RS48和摄像头接口，主要实现视频图像的显示及存储；视频图像的远程传输。

在微生物细胞、动物细胞在生物反应器培养全过程中，针对能清晰分辨1μm大小的细节要求，并能用显示屏显示出来。为实现该目标看，本发明从三方面着手：1)光学结构；2）电子放大；3)光学效果（人眼观测）。

1) 光学结构

根据分辨率的计算公式，当用普通的中央照明法（即明视场透射照明）时，显微物镜的分辨距离为(Reyleigh公式)

σ=0.61λ/NA (1)

式中σ—物镜的可分辨距，单位μm

NA—物镜数值孔径

λ——照明光线波长，单位 μm(可见光时λ可选为550nm)。

因此，要求σ=1μm时则物镜的数值孔径NA≥0.3

本观察仪采用两组物镜耦合的光学结构，可变焦物镜和前组物镜耦合的方式。其中，前组物镜为NA=0.3高分辨率短共轭距长工作距物镜，放大倍数M₁=8x；可变焦物镜为Zoom物镜组，放大倍数M₂=1.33～3.5x，以期实现细胞生长过程中动态观察和观察范围的变化。该两组物镜通过一中间透镜有效匹配，如图9和图10所示。

本光学系统的放大倍数：最大 M_max=8*3.5=28x，可分辨σ=1μm

细节，适于观察微生物细胞；M_min=8*1.33=10.6x，分辨能力下降，但观察范围增大，适于观察动物细胞。因此兼顾到了形态尺寸差异较大的不同观察对象。

2) 电子放大

本观察仪选用500万像素，1/3”CCD摄像头。CCD靶面规格应与屏幕规格相匹配。电子放大倍数M_E=（屏幕幅值）/CCD幅值，M_E数值约为100倍左右。经过物镜组放大和电子放大后总的放大倍数

M_总=M_E*M₀(M₀=M₁*M₂) (2)

最终放大倍数还与选用的显示屏有关，为获取更清晰的观察效果，应选用像素数更多的显示屏。

3) 光学效果(人眼观测)

在线细胞显微观察仪最终获取的图片要在显示屏上显示，清晰与否还与人眼的观测有关(即观察距离和人眼的分辨角，一般舒适的分辨角可取4～8分)。假设人眼处在显示屏0.5m处，

人眼清晰观察屏幕细节的粒度=0.5m处观察*人眼的分辨角≈0.5mm～1mm。

Claims

1.一种用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，该观察仪包括观察仪主体、可变倍光学系统、取样装置、清洗机构、内部光源结构和控制器，所述观察仪主体通过固定螺母与生物反应器相连接,固定螺母拧紧后主体上的密封圈受挤压变形使得观察仪主体和生物反应器之间相互密封，所述观察仪主体上开有三个孔，分别与可变倍光学系统、取样装置和清洗机构相连接；所述内部光源结构与观察仪主体之间通过一根可直线移动的伸缩杆连接；所述的清洁机构通过在观察仪主体孔中穿有的活动轴相连接，清洁机构采用硅橡胶刮扫叶，清洁电机带动其在取样结束后刮扫。

2.根据权利要求1所述的用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述可变倍光学系统由可变焦物镜组和CCD摄像机组成，调整可变倍物镜组的位置，使观测对象能清晰成像，然后通过锁紧螺母固定可变倍物镜组在观察仪主体上，当观察对象形体尺寸变化时，调整可变倍物镜组放大倍数，获取清晰成像效果。

3.根据权利要求2所述的用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述可变倍物镜组采用可变焦物镜和前组物镜耦合的方式，前组物镜为前组物镜为NA=0.3高分辨率短共轭距长工作距物镜，放大倍数M₁=8x；可变焦物镜为Zoom物镜组，放大倍数M₂=1.33～3.5x，以期实现细胞生长过程中动态观察和观察范围的变化，该两组物镜通过一中间透镜有效匹配。

4.根据权利要求1所述的用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述取样装置由驱动电机、由从动齿轮和主动齿轮组成的齿轮组、套筒、限位块、伸缩杆、密封环、密封环盖板、固定套筒、紧固螺母、固定套筒防水玻璃和主体防水玻璃组成，固定套筒防水玻璃的一端置有一个凹槽，当固定套筒防水玻璃与主体防水玻璃紧密接触时，该凹槽形成一个隔离的取样腔，LED光正好从该取样腔中透过并使样品在可变倍光学系统中成像。

5.根据权利要求1所述的用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述清洗机构包括硅胶刮扫叶、刮扫叶轴、活动轴、清洁电机、支撑板、圆棍、档块，清洁电机带动活动轴使圆棍碰到挡块时，清洁电机堵转，电流升高，控制器根据电流大小改变清洁电机转向，实现硅胶刮扫叶往复刮扫。

6.根据权利要求1所述的用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述内部光源结构主要包括LED灯，密封环(、密封环盖板、固定套筒、紧固螺母和防水玻璃，LED灯装在固定套筒的底部，电源线从密封环内部走，再经过伸缩杆中间的通孔伸到观察仪外部，固定套筒的右端粘好防水玻璃，LED灯发出的光从固定套筒透过防水玻璃照到样品中,使样品在CCD摄像机中成像。

7.根据权利要求1所述的用于生物反应器的在线细胞显微观察仪，其特征在于，所述控制器采用基于ARM的嵌入式系统，它包括具有ARM核的CPU、3G无线网络接口、TCP/IP网络接口、RS48和摄像头接口，主要实现视频图像的显示及存储；视频图像的远程传输。