CN103205391A

CN103205391A - 一种基因工程菌及其应用

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Publication number: CN103205391A
Application number: CN2013101313969A
Authority: CN
Inventors: 吴绵斌; 焦静雨; 林建平; 杨立荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其应用。所述基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞中的目的基因，所述目的基因为木糖还原酶基因和NADPH再生酶基因。所述应用为该基因工程菌在制备木糖醇中的应用，包括：将所述工程菌接种至培养液中培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入诱导剂进行诱导表达，完成后从培养液中分离纯化获得木糖醇。与现有技术相比，本发明的基因工程菌中木糖还原酶的酶活力大大提高，是粗糙脉胞菌的5倍；本发明的基因工程菌中还含有NADPH再生体系，使得该基因工程菌的木糖转化率高达80.32%。

Description

一种基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，尤其涉及一种基因工程菌及其应用。

背景技术

木糖醇是一种五碳糖醇，其化学名称为1，2，3，4，5-五醇，分子式为C₅H₁₂O₅，是一种白色结晶或结晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系数等理化性质与蔗糖基本相同，可以作为蔗糖的替代品。美国FAD自1963年就将木糖醇视为“公认安全物质”，允许在食品、饮料、医药和化妆品中使用。

木糖醇已引起人们越来越多的关注，如在药学领域，作为药剂的辅料，木糖醇类表面活性剂；在医学领域，作为优质的输液载体，并能与抗菌药、心脑血管用药、消化系统用药、抗肿瘤药等一起制成输液，还可用于肠道外营养用药、糖尿病的治疗、肝病治疗、防龋齿、预防呼吸道感染、抑制巨噬细胞的粘附、治疗慢性鼻窦炎等。

近年来，木糖醇的市场需求不断扩大，国内木糖醇的年产值已超过13亿元，今后3年，国际市场上木糖醇总需求量将达10万吨以上，依照当前各国木糖醇总产量仅6万吨来算，市场缺口高达40%。虽然木糖醇广泛存在于许多蔬菜和水果中，但是含量都很低，直接提取困难并且费用昂贵。化学催化加氢法是目前工业生产木糖醇的主要方法，但工艺要求高温高压、昂贵的催化剂和繁杂的分离净化工序且成本高。

针对这些问题，国际上从20世纪70年代开始研究用微生物发酵法来生产木糖醇。微生物发酵反应在常温常压下进行，具有能耗低、设备简单、操作安全等优点。微生物发酵法的原理是利用细胞内的木糖还原酶，将木糖还原为木糖醇。

尽管微生物法有这些优势，但现有的基因工程菌中，木糖还原酶的专一性比较差，在催化木糖还原为木糖醇的同时将阿拉伯糖还原为阿拉伯糖醇，而木糖醇与阿拉伯糖醇互为差向异构体，其物理化学性质极为相似，并且半纤维素水解液含有大量的阿拉伯糖，生成的阿拉伯糖醇给分离纯化带来困难。

近几年不断有研究者通过筛选、优化、基因工程等手段来提高微生物中木糖还原酶对木糖的专一性，以提高木糖醇的产率和降低生产成本，但所获甚少。

发明内容

本发明提供了一种木糖还原酶基因工程菌，利用该工程菌转化木糖生产木糖醇时，木糖醇的转化率大大提高。

一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞中的目的基因，所述目的基因为木糖还原酶基因和NADPH再生酶基因。

所述宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。木糖还原酶基因（xr）在宿主细胞中进行表达，使基因工程菌分泌木糖还原酶，因此具有将木糖转化为木糖醇的能力，木糖还原酶转化木糖的反应如下：

反应向右进行时需要消耗NADPH，为能连续生成木糖醇，本发明的基因工程菌中还重组有再生NADPH酶的基因，用以表达分泌NADPH再生酶，从而产生大量NADPH，使反应（1）持续向右进行。

本发明中，所述基因工程菌的菌体内含有表达载体pET30a(+)、表达载体pCDFDuet-1，所述木糖还原酶基因、NADPH再生酶基因分别连接在表达载体pET30a(+)、表达载体pCDFDuet-1的启动子下游。

并且，表达载体pET30a(+)、表达载体pCDFDuet-1的启动子均为T7启动子。在T7启动子的作用下，木糖还原酶、NADPH再生酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。将每个目的基因分别置于一个T7启动子下游，使每个目的基因能够独立进行表达，不相互干涉。

所述NADPH再生酶基因优选为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（gnd）和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因（zwf）中的至少一种；更优选为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因的组合。其中，

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶再生NADPH的反应为：

葡萄糖6-磷酸脱氢酶再生NADPH的反应为：

可见，葡萄糖6-磷酸脱氢酶催化反应（3）生成的6-磷酸葡萄糖酸正好作为反应（2）的底物；如此葡萄糖6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶协同，可产生大量的NADPH供给反应（1），使反应（1）向右进行。除葡萄糖6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶外，也可采用其他能够催化生成NADPH的酶类。

具体可按如下方法进行本发明基因工程菌的构建，包括：

（1）利用xr基因构建E.coli BL21（pET30a-xr）；

以粗糙脉胞菌（Neurosporacrassa）总DNA为模板，利用上游引物P1、下游引物P2进行PCR扩增，获得xr基因（核苷酸序列如SEQ ID No.1所示）；引物序列如下：

P1：5’-GAAGATCTGATGGTACCAGGTCTAAGGCTCAACTC-3’；（下划线处为BglⅡ酶切位点）；

P2：5’-CGGAATTCCTATGCGAAAAACCAGAGGTTCTC-3’；（下划线处为EcoRⅠ酶切位点）；

将xr基因重组至大肠杆菌pET30a(+)的T7启动子下游，构建重组质粒pET30a-xr；将pET30a-xr转入E.coli BL21(DE3)中，获得E.coli BL21（pET30a-xr）；

经检测，E.coli BL21（pET30a-xr）的木糖还原酶的酶活力达到10.5U/mg，是粗糙脉胞菌的5倍；

（2）利用gnd基因构建E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）；

以大肠杆菌K-12总DNA为模板，利用上游引物P3、下游引物P4进行PCR扩增，获得gnd基因（核苷酸序列如SEQ ID No.2所示）；引物序列为：

P3：5’-TCCGAATTCGATGTCAAAGCAACAGATCGG-3’（下划线处为EcoRⅠ酶切位点）；

P4：5’-GCTTGTCGACTTAATCCAGCCATTCGGTATG-3’（下划线处为Sal Ⅰ酶切位点）；

先将gnd基因重组至双启动子原核表达载体pCDFDuet-1中T7启动子-1的下游构建重组质粒pCDFDuet-1-gnd，再将该重组质粒转入E.coliBL21（pET30a-xr）中获得E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）；

（3）利用zwf基因构建E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）；

以大肠杆菌K-12总DNA为模板，利用上游引物P5、下游引物P6进行PCR扩增，获得zwf基因（核苷酸序列如SEQ ID No.3所示）；引物序列为：

P5：5’-TGGCAGATCTCATGGCGGTAACGCAAACA-3’（下划线处为Bgl Ⅱ酶切位点）；

P6：5’-CAGACTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGG-3’（下划线处为Xho Ⅰ酶切位点）；

先将zwf基因重组至pCDFDuet-1-gnd中T7启动子-2的下游，构建重组质粒pCDFDuet-1-gnd-zwf，再将该重组质粒转入E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）中获得E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）。

本发明中，为使该基因工程菌具有较高的木糖还原酶活力，优选将xr基因置于pET30a(+)载体中，以实现xr基因的高水平表达。但对gnd基因和zwf基因在pCDFDuet-1中的相对位置并不限制，这两个目的基因可任意排列，只要位于各自的T7启动子下游即可。

本发明还提供了所述基因工程菌在制备木糖醇中的应用。具体可以包括：

将所述工程菌接种至培养液中培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入诱导剂进行诱导表达，完成后从培养液中分离纯化获得木糖醇；

以1L计，所述培养液的组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母膏1-10g/L，胰蛋白胨2-20g/L，氯化钠2-20g/L，木糖30-50g/L，阿拉伯糖20-40g/L；

培养液中，木糖作为反应（1）的底物，葡萄糖作为反应（3）的底物；阿拉伯糖为半纤维素的组成成分，用它来模拟半纤维素水解液中糖比例，相当于碳源。

所述的诱导剂优选为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度优选为0.5～1.2mmol/L；诱导表达时，先于30～37℃诱导表达8～12h，再于24～26℃下诱导表达48～80h。

在诱导表达72h后，大肠杆菌BL21-xr-gnd-zwf将木糖转化为木糖醇的转化率高达80.32%。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明的基因工程菌中木糖还原酶的酶活力大大提高，是粗糙脉胞菌的5倍；

（2）本发明的基因工程菌中还含有NADPH再生体系，使得该基因工程菌的木糖转化率高达80.32%。

附图说明

图1为重组质粒pET30a(+)-xr图谱；

图2为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）中目的基因的表达情况；其中，M：Marker，1：IPTG诱导，2：非IPTG诱导，3：空质粒；

图3为重组质粒pCDFDuet-1-gnd图谱；

图4为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）和E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）中目的基因的表达情况；其中，M：Marker，1：pET30a(+)阴性对照；2：pCDFDuet-1阴性对照；3：E.coli BL21（pET30a-xr）表达xr蛋白；4：E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）表达xr蛋白和gnd蛋白；5：E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）表达xr蛋白、gnd蛋白和zwf蛋白；

图5为重组质粒pCDFDuet-1-gnd-zwf图谱；

图6(a)为阴性对照菌株E.coli BL21(DE3)的木糖转化情况；

图6(b)为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）的木糖转化情况；

图6(c)为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）的木糖转化情况；

图6(d)为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）的木糖转化情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。本具体实施方式中涉及的E.coli BL21(DE3)、E.coli K-12、Neurosporacrassa均为浙江大学保藏。

实施例一构建基因工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）

1获取木糖还原酶基因

（1）根据NCBI上发表的木糖还原酶基因（xr）序列（GeneID:2593996254，SEQ ID No.1）和表达载体pET30a(+)上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成简并引物，上下游引物分别为：

P1：5’-GAAGATCTGATGGTACCAGGTCTAAGGCTCAACTC-3’（下划线处为BglⅡ酶切位点）（SEQ ID No.4）；

P2：5’-CGGAATTCCTATGCGAAAAACCAGAGGTTCTC-3’；（含EcoR Ⅰ酶切位点）（SEQ ID No.5）；

（2）培养粗糙脉胞菌（Neurosporacrassa），提取其总DNA；

（3）以总DNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增；

PCR反应体系为：25μL DNA PrimerStarMix，21μL H₂O，1.5μL P1，1.5μL P2，1μL DNA模板。

PCR反应条件为：95℃预变性2min；98℃变性10s；55℃复性9s；72℃延伸5s；循环30次；72℃延伸5min；最后4℃保温。

PCR产物通过1%琼脂糖电泳检测，DNA Gel Extraction Kit试剂盒纯化、回收片段大小约为0.9-1.1kb的目标片段，用于克隆表达。

2构建重组质粒

用BglⅡ和EcoRⅠ对获得的目标片段进行酶切，并重组至经相同酶切的pET30a(+)，重组质粒命名为pET30a(+)-xr，并转化到E.coli DH5a，测序，重组质粒pET30a(+)-xr的图谱如图1所示。

3构建工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）

从-80℃冰箱中取100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液，冰浴中融化10分钟；加入2-10μL重组质粒pET30a(+)-xr，混匀后冰中放置30分钟；42℃水浴中热击45秒后迅速置于冰上冷却1-2分钟；向管中加入890μL液体LB培养基，混匀后37℃震荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Kana（终浓度为50μg/mL）的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

提取质粒进行酶切验证，用Bgl Ⅱ单酶切鉴定时应出现一条带，用Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定时应出现两条带。验证正确的重组大肠杆菌即为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）。

4表达木糖还原酶

（1）将工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）接种于3mL LB-Kana培养基中，37℃振荡培养过夜，获取种子液；次日以2%的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kana培养基中，37℃培养至菌体OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达10h左右；

LB-Kana培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，Kana50μg/mL（终浓度）；

（2）采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳观察目的蛋白的表达；结果表明：外源蛋白获得高效表达（图2）；

（3）取适量步骤（1）诱导表达后的菌液，于4℃下8000r/min离心10min，收集菌泥，用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液（pH6.5）洗涤两次，离心后用适量的磷酸钾缓冲液（pH6.5）重悬菌体，冰浴中超生破碎（每次超声持续3s，两次超声之间间隔7s，全程时间5min），于4℃下10000r/min离心10min，上清即为粗酶液；

（4）测定粗酶液中木糖还原酶的酶活力，测定方法为：

木糖还原酶（xr蛋白）是一种氧化还原酶，它的催化活性是可逆的，木糖转化为木糖醇为其还原反应，需要辅酶NADPH，木糖醇转化为木糖为其氧化反应，需要辅酶NADP⁺。反应如下：

通过测量单位时间内酶催化反应体系在340nm处吸光度的增量从而计算出木糖还原酶的活性；酶催化反应体系中包括：100mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH=6.5），0.2mol/L D-木糖溶液，0.15mmol/L NADPH溶液，加入适量的粗酶液启动反应。

酶活单位定义为：25℃时，每分钟氧化1μmol的NADPH所需的酶量。

测定结果表明，基因工程菌E.coli BL21（pET30a-xr）的木糖还原酶活力为10.5U/mg，是粗糙脉胞菌的5倍。

实施例二构建基因工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）1获取gnd基因

（1）根据NCBI上发表6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（gnd）序列（GeneID：388478084，SEQ ID No.2）和表达载体pCDFDuet-1上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成简并引物，上下游引物分别为：

P3：5’-TCCGAATTCGATGTCAAAGCAACAGATCGG-3’(含EcoR Ⅰ酶切位点)（SEQ ID No.6）；

P4：5’-GCTTGTCGACTTAATCCAGCCATTCGGTATG-3’(含Sal Ⅰ酶切位点)（SEQ ID No.7）。

（2）以E.coli K-12基因组DNA为模板，利用引物P3、P4，进行PCR扩增；

PCR反应体系为：25μL DNA PrimerStarMix，21μL H₂O，1.5μL P3，1.5μL P4，1μL DNA模板。

PCR反应条件为：95℃预变性2min；98℃变性10s；55℃复性15s；72℃延伸9s；循环30次；72℃延伸5min；最后4℃保温。

PCR产物通过1%琼脂糖电泳检测，DNA Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收片段大小约为1.4-1.6kb的目标片段，用于克隆表达。

2构建重组质粒pCDFDuet-1-gnd

以Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ对上述目标片段进行酶切，并重组至经相同酶切的pCDFDuet-1，获得重组质粒，命名为pCDFDuet-1-gnd，并转化到E.coliDH5a，测序，重组质粒pCDFDuet-1-gnd的图谱如图3所示。

3构建工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）

从-80℃冰箱中取100μL E.coli BL21（pET30a-xr）感受态细胞悬液，冰浴中融化10分钟；加入2-10μL pCDFDuet-1-gnd重组质粒，混匀后冰中放置30分钟；42℃水浴中热击45秒后迅速置于冰上冷却1-2分钟；向管中加入890μL液体LB培养基，混匀后37℃震荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Kana（终浓度为50μg/mL）和链霉素（终浓度为50μg/mL）的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

提取质粒进行酶切验证，用EcoR Ⅰ单酶切鉴定时应出现一条带，用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定时应出现两条带。验证正确的重组大肠杆菌即为工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）。

4测定工程菌酶活力

（1）将E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）接种于3mLLB-Kana-Sm培养基中，37℃振荡培养过夜，获得种子液；次日以2%的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kana-Sm培养基中，37℃培养至菌体OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达10h左右；

LB-Kana-Sm培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，Kana50μg/mL（终浓度），Sm10μg/mL（终浓度）；

（2）采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳观察目的蛋白的表达；结果表明：外源蛋白获得高效表达（图4）；

（4）测定粗酶液中6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的酶活力，测定方法为：

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（gnd蛋白）也是一种氧化还原酶，它的催化活性是可逆的，将6-磷酸葡萄糖酸转化为核酮糖-5-磷酸为其氧化反应，需要辅酶NADP⁺；反应如下：

通过测量单位时间内酶催化反应体系在340nm处吸光度的增量从而计算出6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的活性。反应体系中包括：100mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH=6.5），0.2mol/L6-磷酸葡萄糖酸，0.15mmol/L NADPH溶液，加入适量的粗酶液启动反应。

酶活单位定义为25℃时，每分钟氧化1μmol的NADPH所需的酶量。

测定结果表明，E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-gnd）中6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的酶活力为2.26U/mg，该基因工程菌已具备再生NADPH的能力。

实施例三构建工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）

1获取zwf基因

（1）根据NCBI上发表葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因（zwf）序列（GeneID:388477926，SEQ ID No.3）和表达载体pCDFDuet-1上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成简并引物，上下游引物分别为：

P5：5’-TGGCAGATCTCATGGCGGTAACGCAAACA-3’（含Bgl Ⅱ酶切位点）（SEQ ID No.8）；

P6：5’-CAGACTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGG-3’(含Xho Ⅰ酶切位点)（SEQ ID No.9）；

（2）以E.coli K-12基因组DNA为模板，利用引物P5、P6进行PCR扩增；

PCR反应体系为：25μL DNA Primer StarMix，21μL H₂O，1.5μL P5，1.5μL P6，1μL DNA模板。

2构建重组质粒pCDFDuet-1-gnd-zwf

以BglⅡ和Xho Ⅰ对获得的目标片段进行酶切，重组至经相同酶切的pCDFDuet-1-gnd，获得重组质粒，命名为pCDFDuet-1-gnd-zwf，并转化到E.coli DH5a，测序，重组质粒pCDFDuet-1-gnd-zwf的图谱如图5所示。

3构建工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）

从-80℃冰箱中取100μL E.coli BL21（pET30a-xr）感受态细胞悬液，冰浴中融化10分钟；加入2-10μL重组质粒pCDFDuet-1-gnd-zwf，混匀后冰中放置30分钟；42℃水浴中热击45秒后迅速置于冰上冷却1-2分钟；向管中加入890μL液体LB培养基，混匀后37℃震荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Kana（终浓度为50μg/mL）和链霉素（终浓度为50μg/mL）的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

提取重组大肠杆菌质粒，进行酶切验证，用BglⅡ单酶切鉴定时应出现一条带，用BglⅡ和Xho Ⅰ双酶切鉴定时应出现两条带。验证正确的重组大肠杆菌即为E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）。

4测定工程菌酶活力

（1）将E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）接种于3mLLB-Kana-Sm培养基中，37℃振荡培养过夜，获得种子液；次日以2%的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kana-Sm培养基中，37℃培养至菌体OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达10h左右；

（4）检测粗酶液中葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶活力，测定方法为：

葡萄糖6-磷酸脱氢酶（zwf蛋白）也是一种氧化还原酶，它的催化活性是可逆的，将葡萄糖6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖酸为其氧化反应，需要辅酶NADPH。反应如下：

通过测量单位时间内酶催化反应体系在340nm处吸光度的增量从而计算出葡萄糖6-磷酸脱氢酶的活性。反应体系中包括：100mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH=6.5），0.2mol/L葡萄糖6-磷酸，0.15mmol/L NADPH溶液，加入适量的粗酶液启动反应。

酶活单位定义为25℃时，每分钟氧化1μmol的NADPH所需的酶量。

测定结果表明，工程菌E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）中葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶活力为1.13U/mg，已具备再生NADPH的能力。

实施例四制备木糖醇

分别利用工程菌E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（pET30a-xr）、E.coliBL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）、E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）转化木糖制备木糖醇，具体步骤为：

（1）挑取工程菌斜面菌落接种于种子培养基，于37℃、200r/min振荡培养8-20h；

种子培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L；

（2）将种子液以体积比10%的接种量接种到扩大培养基，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达48-80h；

扩大培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，木糖40g/L，阿拉伯糖30g/L；

（3）诱导温度调整为26℃，100-260r/min振荡培养48-80h，每4h取样，采用示差折光检测器（RID-10A）检测转化液中木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖醇和乙酸的含量；

检测参数：流动相为V（乙腈）：V（水）=80：20，流速1.0mL/min，柱温25℃；检测结果如图6(a)、6(b)、6(c)、6(d)所示。

由图6(a)可见，阴性对照E.coli BL21（DE3）菌株不能将D-木糖转化为木糖醇，在有葡萄糖和L-阿拉伯糖存在的条件下D-木糖几乎不被利用；

由图6(b)可见，E.coli BL21（pET30a-xr）菌株可以将木糖转化为木糖醇，培养72h后，转化率最高为51.51%；乙酸产率为0.056g/(L.h)；

由图6(c)可见，培养72h后，E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）将木糖转化为木糖醇的转化率为60.9%，比E.coli BL21（pET30a-xr）提高了9.39%，乙酸产率为0.054g/(L.h)；

由图6(d)可见，培养72h后，E.coli BL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd-zwf）将木糖转化为木糖醇的转化率为80.32%，比E.coliBL21（pET30a-xr+pCDFDuet-1-gnd）提高了19.42%，比E.coli BL21（pET30a-xr）提高了29.81%；乙酸产率为0.042g/(L.h)。

Claims

1.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为木糖还原酶基因和NADPH再生酶基因。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，菌体内含有表达载体pET30a(+)、表达载体pCDFDuet-1，所述木糖还原酶基因、NADPH再生酶基因分别连接在表达载体pET30a(+)、表达载体pCDFDuet-1的启动子下游。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，表达载体pET30a(+)、表达载体pCDFDuet-1的启动子均为T7启动子。

5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述NADPH再生酶基因为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因中的至少一种。

6.如权利要求1～5任一所述的基因工程菌在制备木糖醇中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：

将所述基因工程菌接种至培养液中培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入诱导剂进行诱导表达，完成后从培养液中分离纯化获得木糖醇；

以1L计，所述培养液的组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母膏1-10g/L，胰蛋白胨2-20g/L，氯化钠2-20g/L，木糖30-50g/L，阿拉伯糖20-40g/L。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.5～1.2mmol/L。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，诱导表达时，先于30～37℃诱导表达8～12h，再于24～26℃下诱导表达48～80h。