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CN103189496A - 改进的真菌菌株 - Google Patents

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CN103189496A CN2011800527635A CN201180052763A CN103189496A CN 103189496 A CN103189496 A CN 103189496A CN 2011800527635 A CN2011800527635 A CN 2011800527635A CN 201180052763 A CN201180052763 A CN 201180052763A CN 103189496 A CN103189496 A CN 103189496A
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Abstract

本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中，所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。本发明还提供了已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量的真菌细胞，其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae)，其中所述细胞包含纤维二糖脱氢酶1(cdh1)基因的缺失。

Description

改进的真菌菌株
本申请要求都在2010年11月2日递交的美国临时专利申请序列号61/409,186、61/409,217、61/409,472和61/409,480以及2011年6月16日递交的美国临时专利申请序列号61/497,661的优先权，在此通过引用将其全文并入本文。
发明领域
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中，所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料(cellulosic material)水解成葡萄糖。
发明背景
纤维素是由β-1，4糖苷键连接的简单糖(simple sugar)葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开以被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端连续地释放纤维二糖分子。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶水解纤维二糖为葡萄糖。
转化木质纤维素原料为乙醇具有以下优点：大量原料的容易获得性、避免燃烧或陆地装填材料的需要、和降低的总的温室气体产生。木头、农业残余物、草本作物、和市政固体废料已经被考虑作为乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。在纤维素被转化为葡萄糖后，葡萄糖容易被酵母发酵为乙醇。
发明概述
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中，所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。
本发明提供了真菌细胞，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量，其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae)，其中所述细胞包含纤维二糖脱氢酶1(cdh1)基因的缺失。在一些实施方案中，所述真菌细胞是毁丝霉属(Myceliophthora)的物种。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)。在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏纤维二糖脱氢酶的分泌信号肽。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中的翻译起始序列。又在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以将移码突变引入到编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的启动子。在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少内源性纤维二糖脱氢酶的催化效力。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞中的纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基已被遗传修饰。又在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞中的纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基已被遗传修饰。
在一些实施方案中，本发明提供了包含纤维二糖脱氢酶的真菌细胞。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶包含与SEQ ID NO：2至少约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，真菌细胞已被修饰成使得所述细胞与该修饰之前或不含该修饰的真菌细胞相比分泌减少的量的内源性纤维二糖脱氢酶1(cdh1)。
本发明还提供了包含两种或更多种纤维素水解性酶(cellulosehydrolyzing enzyme)的酶混合物，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶中的至少一种由所述真菌细胞表达。在一些实施方案中，所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中，预处理的木质纤维素构成该酶混合物的至少一种基质。在一些另外的实施方案中，预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破(steam explosion)和/或有机溶剂萃取的至少一种处理方法处理的木质纤维素。
本发明还提供了用于产生葡萄糖的方法，包括使至少一种纤维素基质与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶中的至少一种由本文提供的真菌细胞表达。本发明还提供了用于产生葡萄糖的方法，包括使至少一种纤维素基质与本文提供的至少一种酶混合物接触。在一些另外的实施方案中，所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中，所述纤维素基质是预处理的木质纤维素。又在一些另外的实施方案中，预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂萃取的至少一种处理方法处理的木质纤维素。在一些另外的实施方案中，本发明的方法还包括将葡萄糖发酵成终产物。在一些另外的实施方案中，终产物是燃料醇或前体工业化学品。在一些另外的实施方案中，所述燃料醇是乙醇或丁醇。又在一些另外的实施方案中，本发明的方法、酶混合物和/或真菌细胞提供对于该真菌细胞为同源或异源的至少一种纤维素降解酶。
本发明还提供了包含如本文提供的至少一种真菌细胞和/或至少一种酶混合物的发酵培养基。
附图简述
图1提供了嗜热毁丝霉(M.thermophila)CDH1的核苷酸序列和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：1和2)。
图2提供了示出了以从100g/kg葡聚糖(预处理的玉米秸秆)产生的葡萄糖测量的CF-200和CF-400的相对糖化效力的图。在pH5、55℃下，反应以110μL体积中24.6％固体，以及128mM NaOAc、3％酶进行。使用GOPOD测定测量葡萄糖。误差棒表示±1SD，n＝4。
发明描述
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中，所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。如本文指出的，本发明提供了用于将纤维素转化成葡萄糖的改进的真菌菌株。特别地，本文提供的改进的真菌菌株被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在本发明之前，通常认为纤维二糖脱氢酶通过降低纤维二糖的浓度增强了纤维素水解的速度，纤维二糖是一些纤维素酶组分的强力抑制剂(参见例如Mansfield等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：3804-3809[1997]；和Igarishi等人，Eur.J.Biochem.，253：101-106[1998])。此外，纤维二糖脱氢酶已被报告为在纤维素降解期间通过阻止水解产物抑制而在促进协同增强方面起关键作用(参见，例如Hai等人，J.Appl.Glycosci.，49：9-17[2002])。通常还认为纤维二糖脱氢酶在对木质纤维素脱木质(delignifying)方面是有用的，从而增强纤维素降解。近来，已经报道纤维二糖脱氢酶可增强来自糖基水解酶家族61的纤维素裂解增强蛋白(cellulolyticenhancing protein)的活性(参见例如，WO2010/080532A1)并可用于为了氧化还原平衡目的的反应中。
与本领域中的常规理解不同地，本发明提供了对产生纤维素酶的真菌细胞中的编码纤维二糖脱氢酶的基因的遗传修饰(例如，缺失)。该修饰导致来自由遗传修饰的细胞分泌的酶混合物的可发酵糖的产量改进。因此，由产生纤维素酶的生物体分泌的纤维二糖脱氢酶的减少提供了可在包含纤维素的基质的酶水解期间改进可发酵糖的产量的纤维素酶混合物。另外，cdh基因的缺失为在真菌细胞基因组中引入其他序列(例如，编码目的蛋白的异源序列)提供了额外的空间。
因此，本文提供了真菌细胞，该真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量，其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科，且其中所述真菌细胞能够分泌包含纤维素的酶混合物。在一些实施方案中，所述真菌细胞能够分泌包含两种或更多种纤维素酶的酶混合物。在一些实施方案中，所述真菌细胞是下列属的毛壳菌科的成员：无毛毛壳属(Achaetomium)、无孔梭孢壳属(Aporothielavia)、毛喙壳属(Chaetomidium)、毛壳属(Chaetomium)、Corylomyces、棒囊壳属(Corynascus)、法氏壳属(Farrowia)、梭孢壳属(Thielavia)、柄孢壳属(Zopfiella)或毁丝霉属的成员。在一些实施方案中，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是选自下列属的毛壳菌科的成员：毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属或毛壳属。
真菌分类学不断经历整理是公认的。因此，预期本发明的所有方面包括已被重新分类的属和物种，包括但不限于诸如嗜热毁丝霉的生物体，其已被给予多种其他名称(例如，嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophilum)、异梭孢壳菌(Thielaviaheterothallica)、异棒囊壳菌(Corynascus heterothallica)、嗜热金孢子菌(Chrysosporium thermophilum)和印度毁丝霉(Myceliophthora indica))。实际上，预期本发明包括所有有性型、无性型及其同物异名、基本异名或分类学等价物。
在一些实施方案中，真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在一些实施方案中，所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属(Sporotrichum)、棒囊壳属、支顶孢属(Acremonium)、毛壳属、栉霉属(Ctenomyces)、柱霉属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)或嗜热子囊菌属(Thermoascus)的物种。在一些实施方案中，所述真菌细胞是嗜纤维素侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、太瑞斯梭孢壳菌(Thielavia terrestris)、异棒囊壳菌、异梭孢壳菌、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)或嗜热毁丝霉。在一些实施方案中，所述真菌细胞是分离的真菌细胞。
在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶的量。在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏纤维二糖脱氢酶的分泌信号肽。在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。例如，在一些实施方案中，所述真菌细胞被遗传修饰以破坏翻译起始序列，而在一些其他实施方案中，所述真菌细胞被遗传修饰以将移码突变引入到编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。在一些其他实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。例如，在一些实施方案中，所述真菌细胞被遗传修饰以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的启动子。例如，在一些实施方案中，通过使用终止密码子、终止子去除、转座子等遗传修饰所述真菌细胞以破坏编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。在一些另外的实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰为至少部分地缺失编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。在一些其他实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少内源性纤维二糖脱氢酶的催化效力。在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰为使得纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基已被突变。在一些实施方案中，所述真菌细胞的纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基已被遗传修饰。实际上，预期用于修饰真菌细胞以减少由所述细胞表达和/或分泌的纤维二糖脱氢酶的量的任何合适的手段将可用在本发明中。
在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶被包括在EC1.1.99.18内。在一些实施方案中，所述纤维二糖脱氢酶包含与SEQ ID NO：2至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，真菌细胞还包含编码对于该真菌细胞为异源的至少一种纤维素降解酶的至少一种基因。例如，在一些实施方案中，所述真菌细胞过表达编码纤维素降解酶例如β-葡糖苷酶的同源或异源基因。在一些实施方案中，所述真菌细胞过表达β-葡糖苷酶并已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。
本发明还提供了包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由如本文提供的真菌细胞表达。例如，在一些实施方案中，所述真菌细胞是已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量的细胞，其中所述真菌细胞是下列属的成员：毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、柱霉属、踝节菌属或嗜热子囊菌属。在一些实施方案中，所述酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中，酶混合物的基质包含预处理的木质纤维素。在一些实施方案中，预处理的木质纤维素包含通过酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂萃取处理的木质纤维素。在一些实施方案中，酶混合物还包含对于所述真菌细胞为异源的至少一种纤维素降解酶。在一些实施方案中，所述两种或更多种纤维素水解性酶中的至少一种由分离的真菌细胞表达。
本发明还提供了用于产生葡萄糖的方法，该方法包括使纤维素与至少两种酶的混合物接触。例如，在一些实施方案中，该方法包括使纤维素与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由如本文所述的真菌细胞表达。在一些实施方案中，该方法包括使纤维素与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量的细胞表达，其中所述真菌细胞是毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、棒囊壳属、支顶孢属、毛壳属、栉霉属、柱霉属、踝节菌属或嗜热子囊菌属。在一些实施方案中，这些方法导致来自水解的纤维素的葡萄糖和/或纤维二糖的产量增加和来自水解的纤维素的纤维二糖向氧化的糖产物的氧化减少，所述氧化的糖产物例如葡糖酸内酯、葡糖酸盐(gluconate)、葡糖酸(gluconicacid)、纤维二糖内酯和/或纤维二糖酸。
在一些实施方案中，酶混合物是无细胞混合物。在一些另外的实施方案中，纤维素基质包含预处理的木质纤维素。在一些另外的实施方案中，预处理的木质纤维素包含通过例如酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和/或有机溶剂萃取的至少一种处理方法处理的木质纤维素。
在一些实施方案中，这些方法还包括将葡萄糖发酵成终产物例如燃料醇或前体工业化学品。在一些实施方案中，燃料醇是乙醇或丁醇。在一些实施方案中，这些方法包括使纤维素与还包含对所述真菌细胞为异源的纤维素降解酶的酶混合物接触。
本文还提供了包含任何一种上述实施方案的真菌细胞和/或包含来源于任何一种上述实施方案的真菌细胞的酶混合物的发酵培养基。
定义
除非另外指明，否则本发明的实践包括分子生物学、蛋白质工程和微生物学中通常使用的本领域技术范围内的常规技术。这些技术是众所周知的并被描述在本领域技术人员所熟知的许多教科书和参考文献作品中。本文在上文和下文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物在此明确地被通过引用并入本文。
除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所涉及的领域的普通技术人员通常理解的相同含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。虽然类似或等价于本文描述的方法和材料的任何合适的方法和材料可用在本发明的实践中，但是本文描述了一些优选的方法和材料。应理解，本发明不限于所描述的特定方法、操作说明和试剂，因为，这些方法、操作说明和试剂可根据本领域技术人员使用它们的情形而变化。因此，通过整体地参考本申请更充分地描述了下文紧接着定义的术语。
另外，除非上下文明确地另外指明，否则如本文所用的单数“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数的指代对象。数值范围包括定义该范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意在包括落在该较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，如同这些较窄的数值范围都被明确地写在本文中一样。还预期本文公开的每个最大值(或最小值)的数字限值包括每个更低(或更高的)的数字限值，如同这些更低(或更高的)的数字限值都被明确地写在本文中一样。此外，本文提供的标题不是对可通过整体地参考本申请而获得的本发明的各个方面或实施方案的限制。因此，下文紧接着定义的术语通过整体地参考本申请更充分地定义。但是，为了有助于理解本发明，下文定义了一些术语。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′方向从左向右书写；氨基酸序列是以氨基至羧基方向从左向右书写。
如本文所用的，术语“包含”及其同义词以其包括性含义(即，等价于术语“包括(including)”及其相应的同义词)使用。
如本文所用，“底物(substrate)”是指通过酶的作用被转化或打算被转化为另一种化合物的物质或化合物。该术语不仅包括单种化合物还包括化合物的组合，诸如包含至少一种底物的溶液、混合物和其他材料。
如本文所用，“转化”是指底物被酶促转化为对应的产物。“转化百分比”是指在指定条件下在一段时间内被转化为产物的底物的百分比。因此，例如，纤维二糖脱氢酶(“CDH”或“cdh”)多肽的“酶活性”或“活性”可以表示为底物到产物的“转化百分比”。
如本文所用，“分泌活性”是指细胞外环境(extracellular environment)中存在的由真菌细胞产生的纤维二糖氧化性酶(cellobiose oxidizingenzyme)的酶活性。细胞外环境可以是，例如，细胞外环境(extracellularmilieu)诸如培养基。分泌活性受分泌的纤维二糖氧化性酶的总量影响，还受分泌的纤维二糖氧化性酶的催化效力影响。
如本文所用，“催化效力的减少”是指如由本文提供的或本领域另外已知的标准技术测量的，纤维二糖氧化性酶相对于未修饰的纤维二糖氧化性酶的活性的减少。
如本文所用，术语“酶混合物”是指至少两种酶的组合。在一些实施方案中，至少两种酶在组合物中存在。在一些另外的实施方案中，酶混合物在细胞(例如，真菌细胞)中存在。在一些实施方案中，酶混合物中存在的酶的每一种或一些由不同真菌细胞和/或不同真菌培养物产生。在一些进一步的实施方案中，酶混合物中存在的所有酶由同一细胞产生。在一些实施方案中，酶混合物包含纤维素酶，而在一些另外的实施方案中，酶混合物包含纤维素酶以外的酶。在一些实施方案中，酶混合物包含至少一种纤维素酶和至少一种纤维素酶以外的酶。在一些实施方案中，酶混合物包含包括但不限于以下的酶：内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、α-葡糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、乙酰基木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)、阿魏酰酯酶(EC3.1.1.73)、香豆酰酯酶(EC3.1.1.73)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、内切-聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)、内切-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、果胶乙酰基酯酶(EC3.1.1.6)、内切-果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)、α鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、外切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.82)、外切-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.9)、鼠李聚糖半乳糖醛酸内切裂解酶(rhamnogalacturonan endolyase)EC(4.2.2.B3)、鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰酯酶(EC3.2.1.B11)、鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.B11)、内切-阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)、虫漆酶(EC1.10.3.2)、锰依赖性过氧化物酶(EC1.10.3.2)、淀粉酶(EC3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、脂酶、木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、和/或蛋白酶。
在一些另外的实施方案中，本发明还提供包括至少一种扩展蛋白(expansin)和/或扩展蛋白样蛋白，诸如纤维膨胀因子(swollenin)(参见例如，Salheimo等，Eur.J.Biochem.，269：4202-4211[2002])和/或纤维膨胀因子样蛋白的酶混合物。扩展蛋白与植物细胞生长过程中细胞壁结构的松弛有关。已提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键而没有水解活性。以这种方法，认为它们允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩展。纤维膨胀因子是一种扩展蛋白样蛋白，包括N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。在一些实施方案中，扩展蛋白样蛋白和/或纤维膨胀因子样蛋白包括此类结构域中的一个或两个和/或破坏细胞壁的结构(例如破坏纤维素结构)，任选地不产生可检测的量的还原糖。在一些另外的实施方案中，酶混合物包括纤维素整合蛋白(cellulose integrating protein)、支架蛋白和/或支架蛋白样蛋白的至少一种多肽产物(例如分别来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)或解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)的CipA或CipC)。在一些另外的实施方案中，酶混合物包括至少一种纤维素诱导蛋白和/或纤维素调节蛋白(cellulose induced protein and/or modulating protein)(例如，由来自里氏木霉的cip1或cip2基因和/或类似基因所编码的蛋白；参见例如，Foreman等，J.Biol.Chem.，278：31988-31997[2003])。在一些另外的实施方案中，酶混合物包括至少一种GH61和上述多肽类别中的每一种的至少一个成员、一个多肽类别中的若干成员、或这些多肽类别的任何组合，以提供适于多种用途的酶混合物。至少一种、两种、三种、四种、五种或多于五种酶和/或多肽的任何组合可用在本文提供的多种酶混合物中。事实上，不预期本发明的酶混合物限于任何特定的酶、多肽、组合，因为任何适合的酶混合物可用于本发明。
如本文所用，术语“糖”是指任何碳水化合物，包括单糖(例如，葡萄糖、核糖、果糖、半乳糖等)、二糖(例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、蜜二糖等)、寡糖(例如，棉子糖、水苏糖、直链淀粉等)、和多糖(例如，淀粉、糖原、纤维素、壳多糖、木聚糖、阿糖基木聚糖、甘露聚糖、墨角藻聚糖、半乳甘露聚糖、愈创葡聚糖、昆布多糖、金藻昆布多糖、支链淀粉、葡聚糖、糊精、麦芽糖糊精、菊粉、低聚果糖、聚葡萄糖等)。该术语涵盖简单的碳水化合物、以及复合的碳水化合物。事实上，不预期本发明限于任何特定的糖，因为多种糖和糖的形式可用于本发明。
如本文所用，术语“糖水解性酶(saccharide hydrolyzing enzyme)”是水解至少一种糖的任何酶。
如本文所用的，术语“纤维二糖氧化性酶”指氧化纤维二糖的酶。在一些实施方案中，纤维二糖氧化性酶包括纤维二糖脱氢酶(EC1.1.99.18)。
如本文所用的，术语“纤维二糖脱氢酶”、“CDH”和“cdh”指纤维二糖：接受体(acceptor)1-氧化还原酶，该酶在接受体的存在下催化纤维二糖转化为纤维二糖-1，5-内酯和还原的接受体。纤维二糖脱氢酶的实例落在酶分类(E.C.1.1.99.18)中。通常2，6-二氯靛酚可充当接受体，铁尤其是Fe(SCN)3、分子氧、泛醌或细胞色素C和其他多酚类(polyphenolic)例如木质素也可充当接受体。该酶的底物包括纤维二糖、纤维-低聚糖、乳糖和D-葡糖基-1，4-β-D-甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露二糖、硫代纤维二糖、半乳糖基-甘露糖、木二糖、木糖。虽然电子供体包括葡萄糖或甘露糖位于还原末端的β-1，4-二己糖类，但是α-1，4-己糖苷、己糖、戊糖和β-1，4戊糖聚合物(pentomer)可充当这些酶中至少一些酶的底物(参见，例如Henriksson等人，Biochim.Biophys.Acta-Prot.Struct.Mol.Enzymol.，1383：48-54[1998]；和Schou等人，Biochem.J.，330：565-571[1998])。在一些实施方案中，本发明中的目的纤维二糖脱氢酶是由cdh1基因编码的CDH1。
如本文所用的，术语“氧化”、“氧化(的)”及本文所用的类似术语指一种或多种纤维二糖氧化产物的酶促形成。当提及氧化的纤维二糖的百分比使用时，这些百分比反映相对于基质的初始量的重量百分比(w/w)。例如，当酶混合物与纤维二糖接触时，氧化的纤维二糖的百分比反映相对于溶液中存在的纤维二糖的初始量的重量百分比(w/w)。当酶混合物与纤维素基质接触时，氧化的纤维二糖的百分比反映基于能够从总的水解的纤维素产生的葡萄糖的最大量(即，Gmax)的重量百分比(w/w)(wt％)。
如本文所用的，“纤维素”指通过β-1，4糖苷键连接的单糖葡萄糖的聚合物。
如本文所用的，“纤维二糖”指水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。
如本文所用的，术语“纤维糊精”指不同长度的葡萄糖聚合物(即，包含至少两个葡萄糖单体)。每个葡萄糖单体通过β-1，4糖苷键连接。纤维糊精通过其聚合度(DP)分类，聚合度表示该纤维糊精包含的葡萄糖单体的数目。最常见的纤维糊精是：纤维二糖(DP＝2)；纤维三糖(DP＝3)；纤维四糖(DP＝4)；纤维五糖(DP＝5)；以及纤维六糖(DP＝6)。在一些实施方案中，纤维糊精具有2-6的DP(即，纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和/或纤维六糖)。在一些实施方案中，纤维糊精具有大于6的DP。可测量纤维糊精分子的聚合度(例如通过质谱，包括但不限于基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱和电喷雾电离离子阱(ESI-IT)质谱)。测量纤维糊精分子的聚合度的方法是本领域已知的(参见，例如，Melander等人，Biomacromol.，7：1410-1421[2006])。
如本文所用，术语“纤维素酶”是指能够降解纤维素的任何酶。因此，该术语涵盖能够水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或β-D-葡糖苷键)为较短的纤维素链、寡糖、纤维二糖和/或葡萄糖的酶。“纤维素酶”被分为三个亚类的酶：1，4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1，4-β-D-glucan glucanohydrolase)(“内切葡聚糖酶”或“EG”)；1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(“外切葡聚糖酶”、“纤维二糖水解酶”或“CBH”)；和β-D-葡糖苷-葡糖苷水解酶(“β-葡糖苷酶”、“纤维二糖酶”、“BG”或“BGL”)。这些酶共同作用以催化含纤维素的基质的水解。内切葡聚糖酶断裂内部键并破坏纤维素的晶体结构，暴露个别的纤维素多糖链(“葡聚糖”)。纤维二糖水解酶逐步缩短葡聚糖分子，主要释放纤维二糖单元(葡萄糖的水溶性β-1，4-连接的二聚体)以及葡萄糖、纤维三糖和纤维四糖。β-葡糖苷酶将纤维二糖分裂为单体。纤维素酶通常包括协同作用以破坏纤维素为可溶的二糖或寡糖诸如纤维二糖的不同类型的纤维素分解性酶(cellulolytic enzyme)(内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶)的混合物，所述二糖或寡糖随后被β-葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖。纤维素酶由多种微生物产生。来自丝状真菌和一些细菌的纤维素酶(和半纤维素酶)被广泛地用于许多工业应用，包括加工天然纤维为糖类。
如本文所用，“产纤维素酶的真菌细胞”是产生至少一种纤维素酶(即，“纤维素水解性酶”)的真菌细胞。在一些实施方案中，本文提供的产纤维素酶的真菌细胞表达和分泌纤维素水解性酶的混合物。
如本文所用，术语“纤维素水解性酶”、“纤维素分解性酶”和类似术语是指在破坏纤维素为可溶的二糖或寡糖诸如纤维二糖的过程中起作用的酶，所述二糖或寡糖随后被β-葡糖苷酶进一步水解为葡萄糖。纤维素水解性酶的混合物在本文还称为“纤维素酶”、“含纤维素酶的混合物”和/或“纤维素酶混合物”。
如本文所用，术语“内切葡聚糖酶”和“EG”是指一类催化纤维素的内部β-1，4糖苷键水解的纤维素酶(EC3.2.1.4)。术语“内切葡聚糖酶”在本文进一步定义为内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(诸如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷键，混合的β-1，3葡聚糖诸如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖、和包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1，4键的内切水解。内切葡聚糖酶活性可基于基质粘度的减少或由还原糖检验确定的还原性末端的增加来确定(参见例如，Zhang等人，Biotechnol.Adv.，24：452-481[2006])。为了本发明的目的，内切葡聚糖酶活性使用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定(参见例如，Ghose，Pur.Appl.Chem.，59：257-268[1987])。
如本文所用，“EG1”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族7催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，EG1功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语“EG2”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族5催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，EG2功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语“EG3”是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族12催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，EG3功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语“EG4”是指从分类在EC3.2.1.4下的编码糖基水解酶(GH)家族61催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，EG4功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语″EG5″是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族45催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，EG5功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语″EG6″是指分类在EC3.2.1.4下的从编码糖基水解酶(GH)家族6催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，EG6功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语″纤维二糖水解酶″和″CBH″是指水解纤维素中的糖苷键的一类纤维素酶(EC3.2.1.91)。术语″纤维二糖水解酶″在本文进一步定义为1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或包含任何β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-葡糖苷键水解，从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(参见例如，Teeri，Tr.Biotechnol.，15：160-167[1997]；和Teeri等人，Biochem.Soc.Trans.，26：173-178[1998])。在一些实施方案中，纤维二糖水解酶活性使用荧光二糖衍生物4-甲基伞形酮基-.β.-D-乳糖苷来确定(参见例如，van Tilbeurgh等人，FEBS Lett.，149：152-156[1982]；和van Tilbeurgh and Claeyssens，FEBSLett.，187：283-288[1985])。
如本文所用，术语″CBH1″和“1型纤维二糖水解酶”是指分类在EC3.2.1.91下的从编码糖基水解酶(GH)家族7催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。在一些实施方案中，CBH1功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语″CBH2″和“2型纤维二糖水解酶”是分类在EC3.2.1.91下的指从编码糖基水解酶(GH)家族6催化结构域的核酸序列表达的碳水化合物活性酶，或其任何蛋白、多肽或催化活性片段。2型纤维二糖水解酶还常常称为“Cel6家族”。在一些实施方案中，CBH2功能地连接于碳水化合物结合模块(CBM)，诸如家族1纤维素结合结构域。
如本文所用，术语″β-葡糖苷酶″、″纤维二糖酶″和″BGL″是指催化纤维二糖水解为葡萄糖的一类纤维素酶(EC3.2.1.21)。术语″β-葡糖苷酶″在本文进一步定义为β-D-葡糖苷酶葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，伴随β-D-葡萄糖的释放。β-葡糖苷酶活性可使用任何适当的方法确定(参见例如，J.Basic Microbiol.，42：55-66[2002])。1单位的β-葡糖苷酶活性定义为在40℃，pH5，在含0.01％
Figure BDA00003133653100151
20的100mM柠檬酸钠中，从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0pmol对硝基苯酚。
如本文所用，术语″糖苷水解酶61″和″GH61″是指与一种或多种另外的纤维素酶联合使用时增强纤维素水解的一类纤维素酶。纤维素酶的GH61家族描述在例如，碳水化合物活性酶(CAZY)数据库中(参见例如，Harris等人，Biochem.，49(15)：3305-16[2010])。
如本文所用的“半纤维素酶”是指能够催化将半纤维素水解成小的多糖诸如寡糖或单体糖的多肽。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。半纤维素酶包括例如，以下：内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、阿魏酰酯酶、香豆酰酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶。
如本文所用，术语″木聚糖降解活性″和″分解木聚糖的活性(xylanolyticactivity)″在本文定义为水解含木聚糖的材料的生物活性。测量分解木聚糖的活性的两种基本方法包括：(1)测量总的分解木聚糖的活性，和(2)测量单独的分解木聚糖的活性(内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶和α-葡糖醛酸基酯酶)(参见例如，Biely和Puchard，J.Sci.Food Agr.86：1636-1647[2006]；Spanikova和Biely，FEBS Lett.，580：4597-4601[2006]；和Herrmann等人，Biochem.J.，321：375-381[1997])。
总的木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖，包括燕麦、二粒小麦、山毛榉木和落叶松木聚糖形成的还原糖或通过光度确定从多种共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。常见的总的分解木聚糖的活性检验是基于从聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖(参见例如，Bailey等人，J.Biotechnol.，23：257-270[1992])。在一些实施方案中，木聚糖降解活性通过在以下典型条件下测量山毛榉木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St.Louis，Mo.，USA)被木聚糖-降解酶水解的增加来确定：1mL反应、5mg/mL基质(总固体)、5mg分解木聚糖的蛋白/g基质、50mM乙酸钠pH5、50℃、24小时、使用对羟基苯甲酰肼(PHBAH)检验的糖分析(参见例如，Lever，Anal.Biochem.，47：273-279[1972])。
如本文所用，术语″木聚糖酶活性″是指催化木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷键的内切水解的1，4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(E.C.3.2.1.8)。在一些实施方案中，木聚糖酶活性使用山毛榉木木聚糖作为底物来确定。1单位的木聚糖酶活性定义为在50℃，pH5，在含0.01％
Figure BDA00003133653100161
20的50mM乙酸钠中，从作为底物的2g/升山毛榉木木聚糖在水解的最初阶段中每分钟产生1.0μmol还原糖(以葡萄糖当量测量；参见例如，Lever，Anal.Biochem.，47：273-279[1972])。
如本文所用，术语″β-木糖苷酶活性″是指催化短的β(1→4)-低聚木糖的外切-水解以从非还原性末端除去逐个的D-木糖残基的β-D-木糖苷木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。在本发明的一些实施方案中，1单位的β-木糖苷酶活性定义为在40℃，pH5，在含0.01％
Figure BDA00003133653100171
20的100mM柠檬酸钠中，从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚。
如本文所用，术语″乙酰基木聚糖酯酶活性″是指催化乙酰基从聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、α-萘基乙酸酯和对硝基苯基乙酸酯水解的羧酸酯酶活性(EC3.1.1.72)。在本发明的一些实施方案中，乙酰基木聚糖酯酶活性在包含0.01％
Figure BDA00003133653100172
20的50mM乙酸钠pH5.0中使用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物来确定。1单位的乙酰基木聚糖酯酶活性定义为在pH5，25℃，能够每分钟释放1pmol对硝基苯酚阴离子的酶的量。
如本文所用，术语″阿魏酰酯酶活性″是指催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基从酯化的糖，通常是“自然”基质中的阿拉伯糖，水解以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶活性(EC3.1.1.73)。阿魏酰酯酶还被称为阿魏酸酯酶、羟基肉桂酰酯酶、FAE-III、肉桂酰酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。在本发明的一些实施方案中，阿魏酰酯酶活性在50mM乙酸钠pH5.0中使用0.5mM对硝基苯基阿魏酸酯作为底物来确定。1单位的阿魏酰酯酶活性等于在pH5，25℃，能够每分钟释放1μmol对硝基苯酚阴离子的酶的量。
如本文所用，术语″α-葡糖醛酸酶活性″是指催化α-D-葡糖醛酸苷水解为D-葡糖醛酸和醇的α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶活性(EC3.2.1.139)。1单位的α-葡糖醛酸酶活性等于在pH5，40℃，能够每分钟释放1pmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶的量(参见例如，de Vries，J.Bacteriol.，180：243-249[1998])。
如本文所用，术语″α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性″是指催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解的α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(alpha-L-arabinofuranosidearabinofuranohydrolase)活性(EC3.2.1.55)。该酶活性作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1，3)-键和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖(alpha-L-arabinan)、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶和α-L-阿拉伯聚糖酶。为了本发明的目的，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性如下确定：使用每mL100mM乙酸钠pH5的5mg中等粘度的小麦阿糖基木聚糖(Megazyme International Ireland，Ltd.，Bray，Co.Wicklow，Ireland)在40℃以总体积200μL持续30分钟，随后通过
Figure BDA00003133653100181
HPX-87H柱色谱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，Calif.，USA)的阿拉伯糖分析。
酶促木质素解聚可由通常协同起作用的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和纤维二糖脱氢酶(CDH)完成。木质素降解必需的这些胞外酶常常被称为“木质素改性酶(lignin-modifying enzyme)”或“LME”。这些酶中的三种包括两种糖基化的含血红素的过氧化物酶：木质素过氧化物酶(LIP)；Mn依赖性过氧化物酶(MNP)；和含铜的酚氧化酶：虫漆酶(LCC)。尽管木质素生物降解的反应式的细节迄今没有完全理解，不受理论束缚，暗示这些酶利用自由基用于解聚反应。
如本文所用，术语“虫漆酶”是指在许多植物、真菌和微生物中发现的含铜的氧化酶。虫漆酶对酚类和类似分子具有酶活性并且进行一个电子的氧化。虫漆酶可以是聚合的并且酶活性形式可以是二聚体或三聚体。
如本文所用，术语“Mn依赖性过氧化物酶”是指需要Mn的过氧化物酶。Mn依赖性过氧化物酶(MnP)的酶活性依赖于Mn2+。不受理论束缚，已表明这种酶的主要作用是将Mn2+氧化成Mn3+(参见例如，Glenn等，Arch.Biochem.Biophys.，251：688-696[1986])。随后，酚类底物被产生的Mn3+氧化。
如本文所用，术语“木质素过氧化物酶”是指体外催化聚合木质素的稀溶液的氧化解聚作用的胞外血红素。一些LiP的底物，最值得注意的是3，4-二甲氧基苄醇(藜芦醇，VA)，是显示充当氧化还原介质(mediator)的活性氧化还原化合物。VA是与LiP同时被黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)的木质素分解培养物产生的次生代谢产物，且不受理论限制，已提出VA作为木质素的体内LiP催化氧化中的生理学氧化还原介质起作用(参见例如，Harvey，等，FEBS Lett.195：242-246[1986])。
如本文所用，术语“葡糖淀粉酶”(EC3.2.1.3)是指催化从寡糖和多糖分子的非还原性末端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶通常也被认为是一种类型的淀粉酶，称为淀粉-葡糖苷酶。
如本文所用，术语“淀粉酶”(EC3.2.1.1)是指通过以内切或外切作用方式水解α-1，4和/或α-1，6葡糖苷键来降解淀粉和相关化合物的淀粉裂解酶。淀粉酶包括α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；β-淀粉酶(3.2.1.2)、淀粉-淀粉酶(EC3.2.1.3)、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20)、支链淀粉酶(EC3.2.1.41)和异淀粉酶(EC3.2.1.68)。在一些实施方案中，淀粉酶是α-淀粉酶。
如本文所用，术语“果胶酶”是指催化果胶水解成较小的单元，诸如寡糖或单体糖的酶。在一些实施方案中，酶混合物包括任何果胶酶，例如内切-聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、内切-半乳聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、内切-果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、α鼠李糖苷酶、外切-半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan)水解酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶和/或木半乳糖醛酸酶(xylogalacturonase)。
如本文所用，术语“内切-聚半乳糖醛酸酶”(EC3.2.1.15)是指催化果胶酸和其他半乳糖醛酸聚糖(galacturonan)中的1，4-α-D-半乳糖苷醛酸键(1，4-α-D-galactosiduronic linkage)的随机水解的酶。这种酶还可以被称为“聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶”、“果胶酶(pectinase)”、“内切聚半乳糖醛酸酶”、“果胶酶(pectolase)”、“果胶水解酶”、“果胶聚半乳糖醛酸酶”、“聚-α-1，4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶”、“内切半乳糖醛酸酶”、“内切-D-半乳糖醛酸酶”或“聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶”。
如本文所用，术语“果胶甲基酯酶”(EC3.1.1.11)是指催化如下反应的酶：果胶+n H2O＝n甲醇+果胶酸。该酶还可以称为“果胶酯酶”、“果胶脱甲氧基酶(pectin demethoxylase)”、“果胶甲氧基酶”、“果胶甲基酯酶”、“果胶酶”、“果胶酯酶(pectinoesterase)”或“果胶甲酯水解酶(pectinpectylhydrolase)”。
如本文所用，术语“内切-半乳聚糖酶”(EC3.2.1.89)是指催化阿拉伯半乳聚糖中的1，4-β-D-半乳糖苷键的内切水解(endohydrolysis)的酶。该酶还可以称为“阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶”、“内切-1，4-β-半乳聚糖酶”、“半乳聚糖酶”、“阿拉伯半乳聚糖酶”或“阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶”。
如本文所用，术语“果胶乙酰基酯酶”是指催化果胶GaIUA残基的羟基处的乙酰基的脱乙酰基作用的酶。
如本文所用，术语“内切-果胶裂解酶”(EC4.2.2.10)是指催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的消除性切割以产生在其非还原性末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-烯醛酸糖基(4-deoxy-6-O-methyl-α-D-galact-4-enuronosyl)基团的寡糖的酶。该酶还可以称为“果胶裂解酶”、“果胶反式-消除酶(pectin trans-eliminase)”、“内切-果胶裂解酶”、“聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶”、“果胶甲基反式消除酶”、“果胶裂解酶(pectolyase)”、“PL”、“PNL”、“PMGL”或“(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶”。
如本文所用，术语“果胶酸裂解酶”(EC4.2.2.2)是指催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割以产生在非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-烯醛酸糖基(4-deoxy-α-D-galact-4-enuronosyl)基团的寡糖的酶。该酶还可以称为“聚半乳糖醛酸反式消除酶(polygalacturonic transeliminase)”、“果胶酸反式消除酶”、“聚半乳糖醛酸裂解酶”、“内切果胶甲基反式消除酶”、“果胶酸反式消除酶”、“内切半乳糖醛酸反式消除酶”、“果胶酸裂解酶”、“果胶裂解酶”、“α-1，4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶”、“PGA裂解酶”、“PPase-N”、“内切-α-1，4-聚半乳糖醛酸裂解酶”、“聚半乳糖醛酸裂解酶”、“果胶反式消除酶”、“聚半乳糖醛酸反式消除酶”或“(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶”。
如本文所用，术语“α-鼠李糖苷酶”(EC3.2.1.40)是指催化α-L-鼠李糖苷或可选的鼠李聚糖半乳糖醛酸中的末端非还原性α-L-鼠李糖残基的水解的酶。这种酶还可以称为“α-L-鼠李糖苷酶T”、“α-L-鼠李糖苷酶N”或“α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶”。
如本文所用，术语“外切-半乳糖醛酸酶”(EC3.2.1.82)是指从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸(digalacturonate)的酶。该酶还可以称为“外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶”、“外切聚半乳糖苷酶”或“外切聚半乳糖醛酸苷酶”。
如本文所用，术语“外切-半乳糖醛酸聚糖1，4-α半乳糖醛酸苷酶”(EC3.2.1.67)是指催化以下类型反应的酶：(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷酶)n+H2O＝(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-i+D-半乳糖醛酸。该酶还可以称为“聚[1-＞4)α-D-半乳糖醛酸苷]半乳糖醛酸水解酶”、“外切聚半乳糖醛酸酶”、“聚(半乳糖醛酸)水解酶”、“外切-D-半乳糖醛酸酶”、“外切-D-半乳糖醛酸酶”、“外切聚-D-半乳糖醛酸酶”或“聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶”。
如本文所用，术语“外切聚半乳糖醛酸裂解酶”(EC4.2.2.9)是指催化4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-烯醛酸糖基)-D-半乳糖醛酸从果胶酸(即去酯化的果胶)的还原性末端的消除性切割的酶。这种酶还可称为“果胶酸二糖裂解酶”、“果胶酸外切裂解酶”、“外切果胶酸反式消除酶”、“外切果胶酸裂解酶”、“外切聚半乳糖醛酸-反式-消除酶”、“PATE”、“外切-PATE”、“外切-PGL”或“(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原性末端二糖裂解酶”。
如本文所用，术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸酶”是指在由二糖[(1，2-α-L-鼠李糖酰-(1，4)-α-半乳糖基醛酸]组成的严格交替的鼠李聚糖半乳糖醛酸结构中以内切方式水解半乳糖基醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的酶。
如本文所用，术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶”是指在鼠李聚糖半乳糖醛酸中借助β-消除以内切方式切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的酶。
如本文所用，术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶”是指催化鼠李聚糖半乳糖醛酸中鼠李糖和半乳糖醛酸残基的交替主链的脱乙酰基作用的酶。
如本文所用，术语“鼠李聚糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶”是指以外切方式水解来自严格交替的鼠李聚糖半乳糖醛酸结构的非还原性末端的半乳糖醛酸的酶。这种酶还可以称为“木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)水解酶”。
如本文所用，术语“内切-阿拉伯聚糖酶”(EC3.2.1.99)是指催化1，5-阿拉伯聚糖中的1，5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的酶。该酶还可以称为“内切-阿拉伯酶”、“阿拉伯聚糖内切1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶”、“内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶(endo-1，5-α-L-arabinanase)”、“内切-α-1，5-L-阿拉伯聚糖酶(endo-α-1，5-L-arabinase)”、“内切-阿拉伯聚糖酶”或“1，5-α-L-阿拉伯聚糖1，5-α-L-阿拉伯糖水解酶”。
如本文所用，“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)以及水解肽与其他部分诸如糖之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶被表征在EC3.4之下并且适于在本发明中使用。一些特定类型的蛋白酶包括但不限于，半胱氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，和丝氨酸蛋白酶包括糜蛋白酶、羧肽酶，和金属内切肽酶。
如本文所用，″脂酶″包括水解脂质、脂肪酸、和酰基甘油酯，包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等的酶。在植物中，脂质被用作限制水分损失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括从脂肪酸衍生的蜡以及角质和木栓质。
如本文所用的，术语“分离的”和“纯化的”用来指被从其天然缔合的至少一种其他组分取出的分子(例如，分离的核酸、多肽[包括但不限于酶]，等)或其他组分。因此，这些术语指被从其原始环境(例如，天然环境，如果其为天然存在的话)中取出的物质。预期该术语包括用于去除该分子天然缔合的至少一种组分的任何合适的方法。在一些实施方案中，这些术语还包括从其他细胞和/或培养基组分中分离的细胞。预期任何合适的分离方法可用在本发明中。在一些实施方案中，当物质以比天然存在的生物体或野生型生物体中存在的更高或更低的浓度存在于特定组合物中时，或其与由天然存在的生物体或野生型生物体表达后通常不存在的组分组合时，该物质被表述为“纯化的”。例如，存活的动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但是从自然系统中的一些或全部的共存材料中分离到的同样的多核苷酸或多肽是分离的。在一些实施方案中，这些多肽是载体的一部分，和/或这些多核苷酸或多肽是组合物的一部分，并仍被认为是分离的，因为所述载体或组合物不是其天然环境的一部分。在一些实施方案中，核酸或蛋白质被表述为纯化的，例如，如果其在电泳凝胶或印迹中产生基本上一条带的话。
当用于表示DNA序列时，术语“分离的”指已被从其天然遗传环境中取出并因此不含其他无关或不想要的编码序列，并因此为适合用在遗传改造的蛋白质产生系统中的形式的DNA序列。这些分离的分子是被从其天然环境中分离的分子且包括cDNA和基因组克隆。虽然本发明的分离的DNA分子不含其通常缔合的其他基因，但是可包括天然存在的5′和3′非翻译区(例如，启动子和终止子)。缔合区域的鉴定对于本领域普通技术人员将是明显的(参见例如，Dynan和Tijan，Nature316：774-78[1985])。可选择地，术语“分离的DNA序列”被称为“克隆的DNA序列”。
当用于表示蛋白质时，术语“分离的”指在除了其天然环境以外的条件中发现的蛋白质。在一些实施方案中，分离的蛋白质基本不含其他蛋白质，特别是其他同源蛋白质。如通过SDS-PAGE确定的，分离的蛋白质大于约10％纯，优选地大于约20％纯，且甚至更优选地大于约30％纯。如通过SDS-PAGE确定的，本发明另外的方面包括非常纯的形式(即，大于约40％纯、大于约60％纯、大于约70％纯、大于约80％纯、大于约90％纯、大于约95％纯、大于约97％纯、大于约98％纯或甚至大于约99％纯)的蛋白质。
当用于表示纤维二糖脱氢酶时，“纯化”或“分离”指借助于从其本来缔合的一些或全部天然存在的成分中分离纤维二糖脱氢酶而使纤维二糖脱氢酶从其天然状态改变。这可通过任何合适的方法，包括本领域公认的分离技术，包括但不限于离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白盐析沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微滤、凝胶电泳、梯度分离或任何其他合适的方法完成，以去除最终组合物中不期望的完整细胞、细胞碎片、杂质、无关蛋白质或酶。然后将提供另外的益处的成分，例如活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物、其他酶等加入包含纤维二糖脱氢酶的组合物中也是可能的。
如本文所用的，词组“基本纯的多肽”指其中该多肽物质为所存在的主要物质(即，以摩尔或重量计，其比组合物中任何其他单独的大分子物质更丰富)的组合物，并且当目的物质以摩尔或％重量计构成所存在的大分子物质的至少约百分之50时，其通常是基本纯的组合物。通常，基本纯的酶组合物以摩尔或％重量计将构成该组合物中存在的所有大分子物质的约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多、或约98％或更多。溶剂物质、小分子(＜500道尔顿)和元素的离子物质不被认为是大分子物质。
如本文所用，术语提及酶混合物使用的“纯化工艺”涵盖物理地除去酶混合物的不期望组分的任何工艺。因此，在一些实施方案中，本文提供的纯化工艺包括从酶混合物物理地除去纤维二糖氧化性活性或反之亦然的纯化方法。预期本领域已知的任何适当的纯化工艺可用于本发明。事实上，不预期本发明限于任何特定的纯化工艺。
如本文所用，术语“无细胞的酶混合物”包括已经从任何细胞，包括分泌该酶的细胞分离的酶。无细胞的酶混合物可通过本领域已知的多种方法的任一种制备，诸如过滤或离心方法。在一些实施方案中，酶混合物可以是，例如，部分无细胞的、基本上无细胞的或完全无细胞的。
如本文所用，″多核苷酸″是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物、和其互补物(complement)。
如果多核苷酸以其天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，其可被转录并且/或者翻译以产生RNA、多肽或其片段，则所述多核苷酸被表述为“编码”RNA或多肽。该核酸的反义链也被表述为编码这些序列。如本领域已知的，RNA聚合酶可转录DNA以产生RNA，而且逆转录酶可逆转录RNA以产生DNA。因此，DNA分子可有效地编码RNA分子且反之亦然。
术语″蛋白″和″多肽″在本文可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。此外，术语″氨基酸″、“多肽”和“肽”涵盖天然存在的和合成的氨基酸、以及氨基酸类似物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些、以及后来被修饰的那些氨基酸(例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。
如本文所用的，“目的蛋白”和“目的多肽”指期望的和/或被评价的蛋白/多肽。在一些实施方案中，目的蛋白被胞内表达，而在其他实施方案中，其为分泌的多肽。在一些实施方案中，“目的蛋白”或“目的多肽”包括本发明的酶。在一些实施方案中，目的蛋白为被融合到信号肽(即，待分泌的蛋白上的氨基端延伸部分)的分泌的多肽。几乎所有分泌的蛋白质使用在靶向到前体蛋白和前体蛋白穿过膜的转移中起关键作用的氨基端蛋白质延伸部分。该延伸部分在膜转移期间或膜转移之后立即被信号肽酶通过蛋白酶水解去除。
如本文所用，术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物(即，α-碳原子结合于氢原子、羧基、氨基和R基，包括但不限于高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍)。在一些实施方案中，这些类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)和/或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
氨基酸在本文由其公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的单字母符号来提到。类似地，核苷酸可由其通常被接受的单字母代码来提到。
氨基酸或核苷酸碱基的“位置”由根据其相对于N末端(或5’末端)的位置顺序地辨别每个氨基酸(或核苷酸碱基)的编号表示。由于在确定最佳比对时必须被考虑的缺失、插入、截短、融合等，通过简单地从N末端计数而确定的测试序列中的氨基酸残基编号不一定与其在参考序列中的对应位置的编号相同。例如，在测试序列具有相对于比对的参考序列的缺失的情况下，变体中在缺失位点将不存在对应于参考序列中的位置的氨基酸。在比对的测试序列中存在插入的情况下，该插入将不会对应于参考序列中的编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可存在不对应于对应序列中的任何氨基酸的氨基酸串(stretchesof amino acids)。
本文互换地使用术语“野生型序列”和“天然存在的序列”表示宿主细胞中固有的或天然存在的多肽或多核苷酸序列。在一些实施方案中，野生型序列表示为蛋白质工程项目的起点的目的序列。野生型序列可编码同源或异源蛋白。同源蛋白是无干预时宿主细胞产生的蛋白质。异源蛋白是除非干预否则宿主细胞将不会产生的蛋白质。
如本文所用的，“天然存在的酶”表示具有与自然界中发现的氨基酸序列(即，“野生型”)相同的未被修饰的氨基酸序列的酶。天然存在的酶包括固有酶(即，特定微生物中天然表达或发现的那些酶)。
如本文所用，术语″参考酶″是指本发明的另一种酶(例如，“试验”酶)与其比较以确定被评价的其他酶中的改进的特征的存在的酶。在一些实施方案中，参考酶是野生型酶。在一些实施方案中，参考酶是指本发明的试验酶与其比较以确定被评价的试验酶中的改进的特征的存在的酶，所述改进的性质包括但不限于改进的热活性、改进的热稳定性、和/或改进的稳定性。在一些实施方案中，参考酶是野生型酶。
如本文所用，术语″生物活性片段″是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部的缺失的多肽，但其中其余的氨基酸序列与与其比较的序列中相应位置相同，且该多肽保留全长多肽的基本上所有活性。
如本文所用，术语“重组”是指宿主细胞中非自然存在的多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，重组分子包含以非自然存在的方式连接在一起的两个或多个自然存在的序列。在一些实施方案中，由于故意的人工干预，“重组细胞”表达在细胞的天然(即，非重组)形式中未发现相同形式的基因和/或表达本来异常地过表达、低表达和/或完全不表达的天然基因。重组细胞包含至少一种重组的多核苷酸或多肽。核酸构建体、核酸(例如多核苷酸)、多肽或宿主细胞当是非自然存在的、人工的或工程改造的时，在本文称为“重组的”。“重组(Recombination)”、“重组(recombining)”和产生“重组的”核酸通常涵盖至少两种核酸片段的组装。本发明还提供重组的核酸构建体，包含在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的至少一种CDH多核苷酸序列。
当核酸缔合，通常在溶液中缔合时，它们“杂交”。核酸杂交是由于各种被很好表征的物理-化学力，诸如氢键键合、溶剂排斥(solventexclusion)、碱基堆积等。如本文所用，在核酸杂交实验诸如Southern杂交或Northern杂交的背景下术语“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见Tijssen，1993，″Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，″第I部分，第2章(Elsevier，New York)，其通过引用并入本文。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸而言，对低严格条件到极高严格条件限定如下：在标准的DNA印迹程序后，在42℃在5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA，以及对于低严格性的25％甲酰胺，对于中等和中-高严格性的35％甲酰胺，或对于高严格性和极高严格性的50％甲酰胺中预杂交和杂交。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸，使用2×SSC，0.2％SDS50℃(低严格性)、在55℃(中等严格性)、在60℃(中-高严格性)、在65℃(高严格性)或在70℃(极高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
中等严格条件涵盖本领域已知和在多种标准教科书中描述的那些，并包括洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)的使用。中等严格条件的一个例子包括：在37℃在包含以下的溶液中培养过夜：20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切的鲑精DNA，随后在约37-50℃在1x SSC中洗涤滤器。本领域技术人员知晓如何如所需地调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度和类似因素的因素。
如在本文的一些实施方案中使用的，严格条件或高严格度条件使用：(1)低离子强度和高温用于洗涤，例如在50℃0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间，变性剂诸如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液、在pH6.5、750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠、在42℃；或(3)50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖、在42℃，在42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和在55℃在50％甲酰胺中洗涤，随后在55℃以含EDTA的0.1x SSC组成的高严格度洗涤。
如本文所用的，用于表示细胞的术语“突变体文库”和“变体文库”指它们的基因组大部分是相同的但是包括一个或多个基因的不同的同源物的细胞群体。这些文库可用来，例如鉴定具有改善的性状的基因或操纵子。当用于表示多肽或核酸时，“文库”指一组(即，多种)异源多肽或核酸。文库由“成员”构成。文库的成员之间的序列差异造成了文库中存在的多样性。文库可采取多肽或核酸的简单混合物的形式，或可以是用核酸文库转化的生物体或细胞，例如细菌、病毒、动物或植物细胞的形式及类似形式。
如本文所用的，术语“起始基因”指编码目的蛋白的待使用本发明改进、缺失、突变和/或以其他方式改变的目的基因。
如本文在核酸背景下所用的术语“性质”及其语法等价物指可被选择或检测的核酸的任何特征或属性。这些性质包括但不限于影响结合多肽的性质、赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(例如，启动子强度、启动子识别、启动子调控和/或增强子功能)、影响RNA加工的性质(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和/或转录后修饰)、影响翻译的性质(例如，水平、调控、mRNA与核糖体蛋白质的结合和/或翻译后修饰)。例如，可改变核酸对转录因子、聚合酶、调控因子等的结合位点以产生期望的特征或鉴定出不期望的特征。
如本文在多肽(包括蛋白质)背景下所用的术语“性质”及其语法等价物指可被选择或检测的多肽的任何特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性曲线、对蛋白酶降解的抗性、km、kcat、kcat/km比、蛋白质折叠、诱导免疫反应、不诱导免疫反应、结合配体的能力、结合受体的能力、被分泌的能力、被展示在细胞表面上的能力、低聚化的能力、信号转导的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、被通过磷酸化或糖基化修饰的能力和/或治疗疾病的能力等。实际上，预期本发明不限于任何特定的性质。
如本文所用，“相似性”是指相同或其保守氨基酸取代，如以下定义的。因此，为了相似性的目的，改变为相同或保守性取代不视为包括改变。氨基酸的缺失或非保守氨基酸取代在本文视为包括改变。相似性百分比的计算以对同一性百分比进行的相同方式进行。
如本文所用的，关于表示氨基酸所用的“保守取代”指用化学上相似的氨基酸取代一种氨基酸。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域熟知的并被描述在许多教科书中。最通常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及这些交换的逆向交换。如本文所用的，对于一种残基的保守取代物是同一组中的另一种残基。
在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是诸如表A中所示的保守性取代的取代。显示的取代是基于氨基酸的物理化学性质，如此，是独立于生物体的。在一些实施方案中，保守氨基酸取代是示例性取代标题下所列的取代。
Figure BDA00003133653100291
Figure BDA00003133653100301
如本文所用的，当在对给定氨基酸或多肽序列编号的上下文中使用术语“参考...编号”或“对应于...”时指当将该给定氨基酸或多肽序列与参考序列比较时对具体参考序列的残基的编号。
以下命名可用来相对于参考序列或变体多肽或核酸序列描述参考序列中的取代：“R-#-V”，其中#指在参考序列中的位置，R指参考序列中该位置处的氨基酸(或碱基)，并且V指变体序列中该位置处的氨基酸(或碱基)。
术语“氨基酸取代集合”和“取代集合”指一组氨基酸取代。一个取代集合可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种氨基酸取代。
如本文所用，两个或多个多肽序列上下文中“同一性”或“同一性百分比”指如利用序列对比算法或通过人工比对和直观检查所测量的，当跨比较窗口或跨指定区域进行最大一致的对比和比对时，两个或多个序列或子序列与参考序列在跨指定区域是相同的或具有指定的相同氨基酸残基百分比(例如，共有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性)。在一些实施方案中，术语“同一性百分比(percent identity)”、“％同一性”、“同一百分比(percent identical)”和“％相同(％identical)”在本文可互换使用，是指通过ClustalW分析(可从European Bioinformatics Institute，Cambridge，UK获得的W1.8版)获得的氨基酸或多核苷酸序列同一性百分比：计算比对中相同匹配的数目并用此相同匹配的数目除以参考序列的长度，并且使用以下ClustalW参数以达到缓慢的/更准确的逐对最佳比对-DNA/蛋白空位开放罚分(Gap OpenPenalty)：15/10；DNA/蛋白空位延伸罚分(Gap Extension Penalty)：6.66/0.1；蛋白权重矩阵(Protein weight matrix)：Gonnet系列；DNA权重矩阵：Identity。
两条序列当以下时候是“比对的”：为相似性评分使用限定的氨基酸取代矩阵(例如，BLOSUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分对这两条序列进行比对以达到该序列对可能的最高分数。氨基酸取代矩阵及其在定量两条序列之间的相似性中的应用是本领域熟知的(参见例如，Dayhoff等人，于Dayhoff[编著]，Atlas of Protein Sequence and Structure，″第5卷，增刊3，Natl.Biomed.Res.Round.，Washington D.C.[1978]；pp.345-352中；和Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919[1992]，二者均通过引用并入本文)。BLOSUM62矩阵在序列比对方案诸如Gapped BLAST2.0中通常用作缺省评分取代矩阵(default scoringsubstitution matrix)。空位存在罚分用于在比对序列之一引入单个氨基酸空位，而空位延伸罚分用于被插入到已开放的空位中的每个另外的氨基酸空位置。通过比对开始和结束所在的每条序列的氨基酸位置以及任选地通过在一条或两条序列中插入一个空位或多个空位以达到最高可能评分，来限定比对。尽管最佳比对和评分可手动完成，但通过使用计算机执行的比对算法促进该过程(例如，gapped BLAST2.0；参见，Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402[1997]，通过引用并入本文)，并且该算法在美国国立生物技术中心(National Center for BiotechnologyInformation)网站为公众可用。可使用容易获得的程序诸如PSI-BLAST(参见例如，Altschul等人，上文)，准备最佳比对，包括多重比对。
本发明还提供重组的核酸构建体，该构建体包含在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的CDH多核苷酸序列。具有100％序列同一性的两条核酸或多肽序列被称为″相同″。当如使用本文所述方法，诸如使用标准参数的BLAST确定的，核酸或多肽序列与参考序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或更大序列同一性时，核酸或多肽序列被称为与参考序列具有″基本上序列同一性″。
如本文所用，“分泌信号肽”可以是原肽(propeptide)、前肽(prepeptide)或二者。例如，术语“原肽”是指被裂解产生“成熟蛋白”的蛋白前体。在分泌之前，信号肽被信号肽酶从前蛋白裂解，产生″成熟″或″分泌的″蛋白。术语“前肽”和“前蛋白”是指被合成为带有靶向其用于分泌的N末端信号肽的多肽。因此，“前-原-肽”是包含靶向多肽用于分泌并被裂解下以产生成熟多肽的信号肽的多肽。信号肽见于蛋白的N末端，通常由6至136个碱性和疏水的氨基酸构成。
如本文所用，“转录”和类似术语是指转化基因中编码信息为RNA转录子。相应地，减少纤维二糖氧化性酶的转录水平是编码纤维二糖氧化性酶的RNA的RNA转录子的量的减少。
如本文所用的，术语“DNA构建体”和“转化性DNA”被互换地使用以表示用来将序列引入到宿主细胞或生物体中的DNA。DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适的技术体外制备。在一些实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如，作为“引入的序列”)。在一些实施方案中，所述序列被可操作连接到另外的元件例如控制元件(例如，启动子等)。在一些实施方案中，DNA构建体还包括至少一个可选择标志。在一些另外的实施方案中，DNA构建体包含侧翼为同源框的引入序列。在一些另外的实施方案中，转化性DNA包含被加至两个末端的其他非同源序列(例如，填充序列或侧翼)。在一些实施方案中，引入序列的末端是闭合的，使得转化性DNA形成闭合的环。转化性序列可以是野生型、突变的或修饰的。在一些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞的染色体同源的序列。在一些其他实施方案中，DNA构建体包含非同源序列。一旦DNA构建体被体外组装，则其可用来：1)将异源序列插入到宿主细胞的期望靶序列中；2)对宿主细胞染色体的一个区域诱变(即，用异源序列取代内源序列)；3)去除靶基因；和/或4)将复制性质粒引入到宿主中。在一些实施方案中，引入序列包含至少一个可选择标志。该序列可编码一种或多种目的蛋白。其可具有其他生物功能。在许多情况下，引入序列包含至少一个可选择标志，例如提供抗微生物抗性的基因。
如本文所用，″载体″是用于向细胞中引入多核苷酸序列的多核苷酸构建体。在一些实施方案中，载体包含可操作地连接于多核苷酸序列并能够实现在适当的宿主中表达多核苷酸序列编码的多肽的适当的控制序列。″表达载体″具有可操作地连接于多核苷酸序列(例如，转基因)以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列，和在一些实施方案中，转录终止子序列。在一些实施方案中，载体是缺失载体。在一些实施方案中，载体包含产生干扰靶多核苷酸序列的翻译的小干扰RNA或反义RNA转录子的多核苷酸序列。
如本文所用，“缺失载体”包含与待从宿主基因组缺失的靶序列5’和3’的多核苷酸序列同源的多核苷酸序列，从而指导用5’和3’靶向序列之间的多核苷酸重组和代替靶序列。
如本文所用，术语“表达”包括多肽的产生所涉及的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还涵盖从细胞分泌多肽。通常，该术语“表达”是指转化基因编码的信息为由该基因编码的蛋白。因此，“表达的纤维二糖氧化性酶的量的减少”是由该细胞最终翻译的纤维二糖氧化性酶的量的减少。
如本文所用，术语“过表达”旨在包括将蛋白的表达提高到大于细胞正常产生的水平。意欲使该术语包括内源蛋白以及异源蛋白的过表达。在一些实施方案中，过表达包括与基因的内源转录率(transcription rate)和/或水平相比，该基因的升高的转录率和/或水平。例如，在一些实施方案中，异源基因被引入真菌细胞以表达编码异源酶诸如来自另一种生物体的β-葡糖苷酶的基因。在一些其他实施方案中，异源基因被引入真菌细胞以过表达编码同源酶诸如β-葡糖苷酶的基因。
在一些实施方案中，异源基因是已被修饰以过表达基因产物的基因。在一些实施方案中，“过表达”是指其中与基因的内源表达率(expressionrate)和/或水平相比，该基因被导致以升高的率和/或水平表达的任何状态。在一些实施方案中，过表达包括与基因的内源翻译率(translation rate)和/或水平相比，该基因的升高的翻译率和/或水平。
如本文所用，术语“产生”是指由细胞产生蛋白和/或其他化合物。预期该术语涵盖多肽的产生中牵涉的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还涵盖从细胞分泌多肽。
如本文所用的，“由细胞分泌的纤维二糖脱氢酶”是由所述细胞以使得所述纤维二糖脱氢酶穿过细胞膜输出并然后接着释放到胞外环境，例如释放到培养基中的方式产生的纤维二糖脱氢酶。
如本文所用，“已经适于表达的多核苷酸序列”是已经被插入表达载体中或以其他方式被修饰以包含在宿主细胞中表达多核苷酸必需的调节元件的多核苷酸序列，所述调节元件被放置的方式使得允许在宿主细胞中表达多核苷酸。此类表达所需的调节元件包括启动子序列、转录起始序列和任选地增强子序列。例如，在一些实施方案中，多核苷酸序列被插入适于在真菌宿主细胞中表达的质粒中。
如本文所用的，术语“质粒”指用作克隆载体的环形双链(ds)DNA构建体。在一些实施方案中，质粒在一些真核细胞和/或原核细胞中形成染色体外的自身复制的遗传元件，而在一些其他实施方案中，质粒整合到宿主细胞的染色体中。
如本文所用的，“控制序列”包括对于表达本公开内容的多核苷酸所必需或有利的所有部件。每个控制序列对于目的多核苷酸可以是固有的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导物、多腺苷酸序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。
如本文所用的，“可操作连接”指如下配置：其中控制序列被合适地布置(即，处于功能联系中)在相对于目的多核苷酸的一个位置处，使得所述控制序列指导或调控目的多核苷酸和/或多肽的表达。
如本文所用的，当核酸被布置成与另一种核酸序列功能上相关时，其是“可操作连接”的。例如，如果编码分泌性前导物(即，信号肽)的DNA被表达为参与一种多肽的分泌的前体蛋白质，则该DNA被可操作连接到所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其被可操作连接到该序列；或如果核糖体结合位点被放置为促进翻译，则其被可操作连接到编码序列。通常，“可操作连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且，在分泌性前导物的情况下，是连续的并且处于读码相(readingphase)。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接完成。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用的，术语“基因”指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域以及各个编码区段(外显子)之间的居间序列(内含子)的多核苷酸(例如，DNA区段)。
如本文所用的，“内源”或“同源”基因指在宿主细胞(例如，真菌或细菌细胞)的亲本菌株中发现的基因(包括但不限于野生型)。如本文所用的，在核酸序列之间进行比较时，“同源基因”(或“同源物”基因)指来自不同的、但通常相关的物种的彼此对应且彼此相同或非常相似的基因。该术语包括通过物种形成(即，新物种的发展)而分离的基因(例如，直向同源基因)以及已通过遗传复制而分离的基因(例如，共生同源基因)。
如本文所用，氨基酸或核苷酸序列(例如，启动子序列、信号肽、终止子序列等)当可操作地连接于在自然界与其不相关的另一序列时，这两条序列是“异源的”。
如本文所用，“异源酶”是指由“异源基因”编码的酶。然而，还预期，异源基因编码内源或同源酶，如本文所述的。通常，术语“异源基因”是指以未见于宿主真菌细胞的亲本菌株(包括但不限于野生型)中的形式存在的基因。因此，在一些实施方案中，异源基因是衍生自不同于表达该基因的真菌细胞的物种和表达该基因的真菌细胞的公认的无性型、或有性型或分类学等价物的物种的基因。在一些实施方案中，异源基因是宿主真菌细胞内源的基因的修饰形式，该内源基因已被进行操作，随后被引入或转化进入宿主细胞。例如，在一些实施方案中，异源基因具有内源编码序列，但具有对启动子序列的修饰。类似地，在一些实施方案中，异源基因与内源基因编码相同的氨基酸序列，但具有对密码子利用或对非编码区域诸如内含子或其组合的修饰。例如，在一些实施方案中，异源基因包含对编码序列的修饰以编码非野生型多肽。在一些其他实施方案中，异源基因具有与亲本菌株相同的启动子序列、5’和3’非翻译区和编码区，但与宿主细胞的亲本菌株相比，位于同一染色体的另一区域中或在完全不同的染色体上。
如本文所用，在插入核酸序列到细胞中的背景中使用的术语“引入”是指转化、转导、接合、转染、和/或本领域已知用于插入核酸序列到宿主细胞中的任何其他适当的方法。用于引入核酸到宿主细胞中的任何适当的手段可用于本发明。
如本文所用，提及细胞使用的术语″转化的″和″转化″是指具有被整合到其基因组中的非天然核酸序列或具有经多代保持的附加体质粒的细胞。在一些实施方案中，术语“转化的”和“稳定地转化的”指具有被整合到其基因组中的非天然(即，异源的)多核苷酸序列或具有被维持至少两次传代的游离质粒的细胞。
如本文所用，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”是指用于表达包含本文提供的多核苷酸序列(例如，DNA)的表达载体的适当的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞是已经被转化或转染使用本领域已知的重组技术构建的载体的原核或真核细胞。转化的宿主能够复制编码至少一种目标蛋白的载体和/或表达期望的目标蛋白。此外，提及特定菌株的细胞是指菌株的亲本细胞以及后代和遗传修饰的衍生物。亲本细胞的遗传修饰的衍生物包括包含修饰的基因组或附加体质粒的后代细胞，所述修饰的基因组或附加体质粒赋予例如，抗生素抗性、改进的发酵等。在一些实施方案中，宿主细胞被遗传修饰以具有改进蛋白分泌、蛋白稳定性或蛋白的表达和/或分泌期望的其他性能的特征。例如，Alp1功能的敲除获得缺乏蛋白酶的细胞。pyr5功能的敲除获得具有嘧啶缺陷型表型的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞被修饰以缺失内源纤维素酶蛋白-编码序列或以其他方式消除一种或多种内源纤维素酶的表达。在一些实施方案中，一种或多种内源纤维素酶的表达被抑制以增加目标纤维素酶的产生。遗传修饰可通过任何适当的遗传工程技术和/或经典微生物学技术(例如，化学或UV诱变和随后的筛选)来实现。使用重组技术，可以导致生物体或培养物中酶的产量增加的方式引入、缺失、抑制或修饰核酸分子。例如，Alp1功能的敲除获得缺乏蛋白酶的细胞。pyr5功能的敲除获得具有嘧啶缺陷型表型的细胞。在一些遗传工程方法中，使用同源重组通过在体内特异性靶向基因来引起靶基因修饰以阻遏编码的蛋白的表达。在一种替代性方法中，siRNA、反义和/或核酶技术可用于抑制基因表达。
本文互换地使用术语“被修饰的序列”和“被修饰的基因”以表示包括对天然存在的核酸序列的缺失、插入、取代或任何其他中断的序列。在一些实施方案中，被修饰的序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果该修饰是序列的缺失或中断的话)。在一些实施方案中，截短的蛋白质保留了生物活性。在一些替代实施方案中，被修饰的序列的表达产物是增长的蛋白质(例如，修饰包含对核酸序列的插入)。在一些另外的实施方案中，插入导致截短的蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可导致截短的蛋白质或增长的蛋白质作为表达产物。
如本文所用的，术语“突变的核酸序列”、“突变的核苷酸序列”和“突变的基因”被互换地用来表示具有发生在宿主细胞的野生型核苷酸序列中的至少一个密码子改变的核苷酸序列。突变的序列的表达产物是相对于野生型具有改变的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，表达产物具有改变的功能能力(例如，增强的酶活性)。
如本文所用的，术语“靶向随机化”指产生其中一个或多个位置已被随机化的多种序列的过程。在一些实施方案中，随机化是完全的(即，所有四种核苷酸，A、T、G和C可发生在随机位置)。在一些替代实施方案中，核苷酸的随机化局限于四种核苷酸的子集。靶向随机化可应用于编码一种或多种目的蛋白的序列的一种或多种密码子。如通过随机化密码子的随机化方案确定的，当表达时，所得的文库产生其中一个或多个氨基酸位置可包含所有20种氨基酸的混合物或氨基酸子集的蛋白质群。在一些实施方案中，由靶向随机化产生的群体的单个成员由于密码子的靶向或随机插入或缺失而在氨基酸数目方面不同。在一些另外的实施方案中，合成的氨基酸被包括在所产生的蛋白质群中。在一些另外的实施方案中，由靶向随机化产生的群体的大多数成员表现出比起始基因大的与共有序列的序列同源性。在一些实施方案中，该序列编码一种或多种目的蛋白。在一些替代实施方案中，这些蛋白质具有不同的生物功能。
如本文所用的，“缺失”是指通过去除参考多肽中的一个或多个氨基酸修饰多肽。缺失可包括去除1或更多个氨基酸、2或更多个氨基酸、3或更多个氨基酸、4或更多个氨基酸、5或更多个氨基酸、6或更多个氨基酸、7或更多个氨基酸、8或更多个氨基酸、9或更多个氨基酸、10或更多个氨基酸、15或更多个氨基酸或20或更多个氨基酸，最多构成该多肽的氨基酸总数的10％、或最多构成该多肽的氨基酸总数的20％，同时保持酶活性和/或保持所工程化的纤维二糖脱氢酶的改进的性质。缺失可存在于多肽的内部部分和/或末端部分。在一些实施方案中，缺失包括连续的片段，而在其他实施方案中，其是不连续的。
如本文所用的，“基因缺失”或“缺失突变”是其中构成基因的DNA的至少一部分序列丢失的突变。因此，述及核酸的“缺失”是导致构成基因的DNA序列的完全或部分破坏的遗传材料的丢失或取代。在一些实施方案中，设想了基因序列的完全或几乎完全的缺失。然而，为了减少由真菌细胞分泌的内源性纤维二糖氧化性酶的活性，缺失突变不必完全去除纤维二糖氧化性酶的完整基因序列。例如，去除了编码纤维二糖氧化性酶的活性位点中的氨基酸、编码分泌信号、或编码在由真菌细胞分泌的内源性纤维二糖氧化性酶的活性方面起作用的纤维二糖氧化性酶的另一部分的一个或多个核苷酸的部分缺失。可缺失任意数量的核苷酸，从一个碱基至一整片染色体。因此，在一些实施方案中，术语“缺失”指去除编码特定蛋白质所需要的基因(例如，cdh1)。在这种情况下，具有该缺失的菌株可称为“缺失菌株”。
如本文所用的，“片段”指与参考多肽相比具有氨基端和/或羧基端和/或内部缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列与参考序列中的对应位置相同。片段通常可具有全长纤维二糖脱氢酶的多肽，例如多肽SEQ IDNO：2的约80％、约90％、约95％、约98％或约99％。在一些实例中，本文公开的非天然存在的和野生型纤维二糖脱氢酶的多肽序列可包括起始甲硫氨酸(M)残基(即，位置1处的M)。然而，本领域技术人员将认识到，例如在宿主细胞或体外翻译系统中，该起始甲硫氨酸残基可在酶的生物加工过程中被去除，以产生缺乏起始甲硫氨酸残基，但在其他方面保留了该酶的性质的成熟的酶。因此，对于具有包含起始甲硫氨酸的氨基酸序列的本文公开的每一种纤维二糖脱氢酶的多肽，本公开内容还包括具有缺失了起始甲硫氨酸残基的多肽(即，缺少位置1处的甲硫氨酸的纤维二糖脱氢酶多肽的片段)。
如本文所用的，“条件突变”是在一些环境条件下具有野生型表型而在一些其他条件下具有突变表型的突变。
如本文所用的，术语“筛选”具有其在本领域的一般含义，通常为多步骤过程。第一步，提供突变的核酸或来自其的变体多肽。第二步，确定该突变的核酸或变体多肽的性质。第三步，将所确定的性质与相应前体核酸的性质、相应的天然存在的多肽的性质或起始材料(例如，初始序列)的性质比较以产生突变的核酸。对于本领域技术人员将明显的是，用于获得具有改变的性质的核酸或蛋白质的筛选程序取决于起始材料的性质、和预期突变核酸的产生所有助于的修饰。因此本领域技术人员将理解，本发明不限于待被筛选的任何特定的性质且下文对性质的描述仅列出了示例性的实例。用于筛选任何特定性质的方法通常是本领域所描述的。例如，人们可在突变之前和之后测量结合、最适pH、特异性等，其中变化表示改变。在一些实施方案中，筛选以高通量方式进行，包括待同时筛选的多个样品，包括但不限利用芯片、噬菌体展示、多底物和/或指示剂的测定和/或本领域已知的任何其他合适的方法。
如在一些实施方案中使用的，筛选包括从变体群中富集目的变体的选择步骤。这些实施方案的实例包括选择为宿主生物体赋予生长优势的变体、以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中可基于其结合或催化性质从变体群中捕获变体。在一些实施方案中，变体文库被暴露于应激条件(例如，暴露于热、蛋白酶或变性条件)。接下来，鉴定筛选中仍然完整的变体或通过选择富集。预期该术语包括任何合适的选择手段。实际上，预期本发明不限于任何特定的筛选方法。
如本文所用的，“遗传修饰的”和/或“遗传改造的细胞”(例如，“遗传改造的真菌细胞”和/或“遗传修饰的真菌细胞”)是其遗传物质已使用遗传工程技术改变的细胞。遗传修饰的细胞还指其遗传物质已使用遗传工程技术改变的细胞的衍生物或后代。由遗传工程技术引起的遗传修饰的实例包括对基因组DNA的修饰；由遗传工程技术引起的遗传修饰的另一实例包括将稳定的异源核酸引入到细胞内。例如，如本文提供的，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是其遗传物质已被改变的真菌细胞，其改变方式是为了减少所分泌的纤维二糖氧化性酶活性的量或减少所分泌的酶氧化纤维二糖的活性。
在一些实施方案中，突变的DNA序列使用至少一个密码子的位点饱和诱变产生。在一些其他实施方案中，对两个或更多个密码子进行位点饱和诱变。在一些另外的实施方案中，突变的DNA序列与野生型序列具有大于约50％、大于约55％、大于约60％、大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约95％或大于约98％的同源性。在一些替代实施方案中，突变的DNA使用任何合适的已知诱变程序包括但不限于使用辐射、亚硝基胍等体外产生。然后分离期望的DNA序列并用于本文提供的方法中。
如本文所用，术语″扩增″和″基因扩增″是指藉以不成比例地复制特定DNA序列的方法，使得被扩增的基因变得以比基因组中最初存在的更高拷贝数存在。在一些实施方案中，通过在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的存在下生长来筛选细胞导致编码在药物的存在下生长所需的基因产物的内源基因扩增，或通过扩增编码该基因产物的外源(即，输入物)序列或二者。“扩增″是包括模板特异性的核酸复制的特殊情形。其与非特异性模板复制(即，是模板依赖性的但不依赖于特定模板的复制)不同。模板特异性在本文区别于复制保真性(即，合成正确的多核苷酸序列)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性通常以″靶″特异性的方式描述。靶序列是″靶″的含义在于，它们是被寻求从其他核酸分选出的核酸。扩增技术主要是为了这样的分选出而设计的。
如本文所用，术语″引物″是指，无论是天然存在的，如纯化的限制性消化物中的或合成产生的，当被放置在诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下(即，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶存在下并在适当的温度和pH)时能够作为合成起始点起作用的寡核苷酸。为了扩增的最大效率，引物优选地是单链的，但可选地双链的。如果是双链的，首先处理引物以在被用于制备延伸产物之前分离其链。在一些实施方案中，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。如本领域已知的，引物的确切长度将依赖于多种因素，包括温度、引物的来源和方法的使用。
术语“诱变引物”和“诱变寡核苷酸”(本文互换地使用的)指对应模板序列的一部分并能够与其杂交的寡核苷酸组合物。关于诱变引物，该引物不会与模板核酸精确地匹配，引物中的一个或多个错配被用来将期望的突变引入到核酸文库中。
如本文所用的，术语“非诱变引物”和“非诱变寡核苷酸”(本文互换地使用的)预期指将与模板核酸准确地匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一些实施方案中，只使用了诱变引物。在一些其他实施方案中，引物被设计成以致于对于已包括诱变引物的至少一个区域，寡核苷酸混合物中也包括非诱变引物。通过添加诱变引物和对应于至少一条诱变引物的非诱变引物的混合物，可能产生呈现出各种组合的突变形式的所得到的核酸文库。例如，如果期望突变核酸文库的一些成员在一些位置保留其前体序列而其他成员在这些位点是突变的，则非诱变引物提供了在核酸文库内获得针对给定残基的未突变成员的特定水平的能力。本发明的方法采用了通常为约10-50个碱基之间的长度，或更优选地，约15-45个碱基的长度的诱变和非诱变寡核苷酸。然而，使用短于约10个碱基或长于约50个碱基的引物可能是必要的以获得所期望的诱变结果。关于对应的诱变和未诱变引物，对应寡核苷酸具有相同的长度是不必的，但前提是在对应于待添加突变的区域中存在重叠。可以以根据本发明的预定比例添加引物。例如，如果期望所得的文库具有显著水平的一些特定突变和较少量的相同或不同位点处的不同突变，则通过调整所添加的引物的量产生期望的偏向性文库是可能的。可选择地，通过添加较少或更大量的非诱变引物，调整突变的核酸文库中产生对应突变的频率是可能的。
如本文所用的，词组“连续突变”指呈现在同一寡核苷酸引物中的突变。例如，连续突变可相邻或互相邻近，但是，连续突变将通过同一引物被引入到所得的突变模板核酸中。
如本文所用的，词组“不连续突变”指呈现在不同的寡核苷酸引物中的突变。例如，不连续突变将通过分别地制备的寡核苷酸引物被引入到所得的突变模板核酸中。
如本文所用的，术语“简并密码子”指用来表示一组不同的密码子的密码子(也称为“多义密码子”)。例如，简并密码子“NNT”代表具有三碱基序列的16个密码子(A、C、T或G)/(A、C、T或G)/T的组。
如本文所用的，“编码序列”指编码蛋白质的氨基酸序列的那部分多核苷酸(例如，基因)。
如本文所用，术语″探针″是指，无论是天然存在的，如纯化的限制性消化物中的或合成、重组或由PCR扩增产生的，能够与另一目标寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即，一系列的核苷酸)。探针可以是单链或双链的。探针可用在特定基因序列的检测、鉴定和分离中。预期本发明中使用的任何探针将以任何″报告分子″标记，从而其在任何检测系统中可检测，所述检测系统包括但不限于酶(例如，ELISA、以及基于酶的组织化学检验)、荧光、放射性、和发光系统。不预期本发明限于任何特定的检测系统或标记。
如本文所用，术语″靶″当提及聚合酶链式反应使用时，是指被用于聚合酶链式反应的引物结合的核酸区域。因此，″靶″是被寻求从其他核酸序列分选出的。″区段″定义为靶序列内的核酸区域。
如本文所用，术语″聚合酶链式反应″(PCR)是指美国专利号4,683，195、4,683,202和4,965,188的方法，通过引用在此并入，其包括用于增加基因组DNA的混合物中靶序列的区段的浓度而无克隆或纯化的方法。用于扩增靶序列的这一方法是本领域公知的。
如本文所用，术语″扩增试剂(amplification reagent)″是指除了引物、核酸模板和扩增酶以外，扩增所需的那些试剂(三磷酸脱氧核糖核苷酸、缓冲液等)。通常，扩增试剂与其他反应组分被放置和包含在反应容器(试管、微孔等)中。
如本文所用，术语″限制内切核酸酶″和″限制酶″是指细菌酶，其各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。
″限制性位点″是指被指定限制内切核酸酶识别和裂解的核苷酸序列，通常是用于插入DNA片段的位点。在本发明的一些实施方案中，限制性位点被工程改造到DNA构建体的选择性标记和5′和3′末端中。
如本文所用，″同源重组″是指两个DNA分子或成对的染色体之间在相同或几乎相同的核苷酸序列的位点处交换DNA片段。在一些实施方案中，染色体整合是同源重组。
如本文所用，术语“C1”是指嗜热毁丝霉，包括由Garg描述的真菌菌株(参见，Garg，Mycopathol.，30：3-4[1966])。
如本文所用，“Chrysosporium lucknowense”包括描述于美国专利号6,015,707、5,811，381和6,573,086；美国专利公布号2007/0238155、US2008/0194005、US2009/0099079；国际专利公布号WO2008/073914和WO98/15633的菌株，其全部通过引用并入本文，并且包括但不限于Chrysosporium lucknowense Garg27K、VKM-F3500D(登记号VKMF-3500-D)、C1菌株UV13-6(登记号VKM F-3632D)、C1菌株NG7C-19(登记号VKM F-3633D)、和C1菌株UV18-25(VKM F-3631D)，其全部被保藏在俄罗斯科学院全俄微生物菌种保藏中心(VKM)，Bakhurhina St.8，Moscow，Russia，113184，以及其任何衍生菌株(derivative)。尽管最初被描述为Chrysosporium lucknowense，目前可认为C1是嗜热毁丝霉的菌株。其他C1菌株包括以登记号ATCC44006、CBS(Centraalbureau voorSchimmelcultures)122188、CBS 251.72、CBS 143.77、CBS 272.77、CBS122190、CBS122189和VKM F-3500D保藏的细胞。示例性C1衍生菌株包括其中一个或多个内源基因或序列被缺失或修饰和/或一个或多个外源基因或序列被引入的修饰的生物体。衍生菌株包括但不限于UV18#100f Δalp1、UV18#100f Δpyr5 Δalp1、UV18#100.f Δalp1 Δpep4Δalp2、UV18#100.fΔpyr5 Δalp1Δpep4 Δalp2和UV18#100.fΔpyr4 Δpyr5ΔaIp1 Δpep4 Δalp2，如在WO 2008073914和WO 2010107303所描述的，其每一篇通过引用并入本文。
如本文所用，术语″培养″是指在适当的条件下在液体或固体培养基中生长微生物细胞的群体。预期培养以任何适当的形式、设备(例如，摇动烧瓶、发酵罐、生物反应器等)进行。还预期，培养使用任何适当的工艺方法进行，包括但不限于分批、分批补料、和/或连续培养。事实上，预期适当的方法的任何组合可使用。
在“分批工艺”中，在操作开始时，除了用于需氧工艺的氧气以外，将所有必需材料放置在反应器中并允许发酵进行直到完成，此时收获产物。在一些实施方案中，用于产生本发明的真菌细胞、酶和/或酶混合物的分批工艺在摇动烧瓶或生物反应器中进行。
在“分批补料工艺”中，对培养物连续或序贯地供应一种或多种培养基组分，而不除去培养流体。
在“连续工艺”中，以体积相等的比率连续地供应新鲜培养基和除去培养流体，以保持培养物在稳定生长速率。提及连续工艺时，“稳态”是指其中反应物的浓度不明显改变的状态，“准-稳态”是指其中在反应开始后，反应物的浓度在与连续水解工艺的正常操作一致的范围中波动的状态。
如本文所用，术语″糖化″是指其中基质(例如，纤维素生物质)由纤维素酶的作用被破裂以产生可发酵糖类(例如，单糖，诸如但不限于葡萄糖)的过程。
如本文所用，术语″可发酵糖类″是指简单的糖类(例如，单糖、二糖和小的寡糖)，包括但不限于葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。事实上，可发酵糖类是微生物能够利用或发酵的任何糖。
如本文所用，术语“可溶性糖类”是指水溶性戊糖和己糖单体和最多约6个单体单元的寡聚体。预期该术语涵盖任何水溶性单糖和/或寡糖。
如本文所用，术语″发酵″宽泛地使用，是指从有机化合物(例如，碳水化合物)的氧化来获得能量的过程。事实上，“发酵”宽泛地是指经由使用发酵生物体来化学转化糖源为终产物。在一些实施方案中，该术语涵盖利用糖类诸如可发酵糖类作为能源来获得期望产物的微生物或微生物培养物的培养。
如本文所用，术语“发酵生物体”是指适于产生期望的终产物的任何生物体，包括原核以及真核生物体(例如，细菌生物体、以及真菌生物体诸如酵母和丝状真菌)。尤其适当的发酵生物体能够直接或间接地发酵(即，转化)糖类，包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖为至少一种期望的终产物。在一些实施方案中，可用于本发明的酵母包括但不限于属酵母属(Saccharomyces)的菌株(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株)、属毕赤酵母属(Pichia)的菌株(例如，树干毕赤酵母(Pichia stipitis)诸如树干毕赤酵母CBS 5773和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、和属假丝酵母属(Candida)的菌株(例如，产朊假丝酵母(Candida utilis)、Candida arabinofermentans、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、Candidasonorensis、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))。其他发酵生物体包括但不限于发酵单胞菌属(Zymomonas)、汉逊酵母属(Hansenula)(例如，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和异常汉逊酵母(Hansenulaanomala))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis))和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))的菌株。
如本文所用，术语“浆(slurry)”是指在其中分散有一种或多种固体组分，诸如纤维素基质的水溶液。因此，术语“浆”是指固体在液体中的悬液。在一些实施方案中，纤维素基质在液体中以稠的但仍然能被泵送的浓度浆化。例如，在一些实施方案中，液体是水、回收工艺流、和/或处理的流出液。然而，不预期本发明限于任何特定液体和/或固体。
术语″生物质″和″生物质基质″涵盖用于糖化反应中的任何适当的材料。该术语涵盖但不限于，包括纤维素(即，″纤维素生物质″、″纤维素原料″和″纤维素基质″)、以及木质纤维素生物质的材料。事实上，术语“生物质”包括包含多糖基质的任何活的或死亡的生物材料，包括但不限于纤维素、淀粉、其他形式的长链碳水化合物聚合物、和这些来源的混合物。在一些实施方案中，其完全或主要地从葡萄糖或木糖组装，并且在一些实施方案中，任选地还包含多种其他的戊糖和/或己糖单体。生物质可获取自植物、动物或微生物，并包括但不限于获取自植物、动物或微生物，并包括但不限于农业、工业、和林业残余物、工业和市政废弃物、以及为了能源目的而种植的陆地和水生作物。生物质基质的实例包括但不限于，木头、木浆、纸浆、玉米纤维、玉米粒、玉米芯、谷物残渣诸如玉米皮、玉米秸秆、草、小麦、麦秆、大麦、大麦秆、干草、稻、稻秸、柳枝稷、废纸、纸和纸浆加工废料、木质或草本植物、果浆或蔬菜浆、酒糟、草、稻壳、棉花、大麻、亚麻、剑麻、甘蔗渣、高粱、大豆、柳枝稷、碾磨谷物获得的组分、树、树枝、根、叶、木片、锯末、灌木丛、蔬菜、果实、和花、和其任何适当的混合物。在一些实施方案中，生物质包括但不限于栽培作物(例如，草、包括C4草，诸如柳枝稷、大米草、黑麦草、芒草、草芦、或其任何组合)、糖加工残渣，例如但不限于，蔗渣(例如，甘蔗渣、甜菜浆[例如糖用甜菜]、或其组合)、农业残渣(例如，大豆秸秆、玉米秸秆、玉米纤维、稻秸、甘蔗秆、稻、稻壳、大麦秆、玉米芯、麦秆、油菜秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维、大麻、亚麻、剑麻、棉花、或其任何组合)、果浆、蔬菜浆、酒糟、林业生物质(例如，木头、木浆、纸浆、回收的木浆纤维、锯末、硬木诸如白杨木、软木材、或其组合)。而且，在一些实施方案中，生物质包括纤维素废料和/或林业废料，包括但不限于，纸和纸浆加工废料、城市纸废料、新闻纸、纸板和类似物。在一些实施方案中，生物质包括一种类型的纤维，而在一些替代性实施方案中，生物质包括来源于不同生物质的纤维的混合物。在一些实施方案中，生物质还包括表达木质素酶和/或纤维素酶的转基因植物(参见例如，US2008/0104724A1)。
如本文所用，“木质纤维素”是指纤维素、半纤维素和木质素的基质(matrix)。从木质纤维素生物质经济地生产生物燃料通常包括转化纤维素和半纤维素组分为可发酵糖类，通常是单糖诸如葡萄糖(从纤维素)和木糖和阿拉伯糖(从半纤维素)。几乎完全的转化可通过化学预处理木质纤维素，随后以纤维素酶酶促水解来实现。化学预处理步骤使得纤维素对酶促水解更敏感，而且在一些情形中，还水解了半纤维素组分。多种化学预处理工艺是本领域已知的，包括但不限于，在高温的弱酸(mild acid)预处理和稀酸、铵预处理或有机溶剂提取。
木质素是比纤维素或半纤维素更复杂和非均质的生物聚合物，包括多种酚醛亚单位(phenolic subunit)。酶促木质素解聚可由通常协同起作用的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和纤维二糖脱氢酶(CDH)完成。然而，如名称表示的，CDH酶还氧化纤维二糖为纤维二糖酸内酯。许多报告表示，由于减少纤维二糖的浓度，由CDH氧化纤维二糖增强纤维素酶水解纤维素的比率，纤维二糖是一些纤维素酶组分的强力抑制剂(Mansfield等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：3804-3809[1997]；和Igarishi等人，Eur.J.Biochem.，253：101-106[1998])。最近已经报告，CDH可增强来自糖基水解酶家族61的纤维素分解增强蛋白(cellulolytic enhancingprotein)的活性(参见例如，WO2010/080532A1)。
如本文所用，术语“木质纤维素生物质”是指包括与木质素结合的纤维素和半纤维素的任何植物生物质。
在一些实施方案中，任选地通过化学、物理和生物预处理(诸如蒸汽爆破、制浆、碾磨、酸水解、溶剂暴露等等、以及其组合)预处理生物质以增加纤维素对水解的敏感性。多种木质纤维素原料可使用，包括包含新鲜木质纤维素原料、部分干燥的木质纤维素原料、完全干燥的木质纤维素原料、和/或其任何组合的那些。在一些实施方案中，木质纤维素原料包括多于约20％、更优选地多于约30％、更优选地多于约40％(w/w)的量的纤维素。例如，在一些实施方案中，木质纤维素材料包括从约20％至约90％(w/w)的纤维素、或其间的任何量，而在一些实施方案中，木质纤维素材料包括少于约19％、少于约18％、少于约17％、少于约16％、少于约15％、少于约14％、少于约13％、少于约12％、少于约11％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、或少于约5％的纤维素(w/w)。而且，在一些实施方案中，木质纤维素原料包括多于约10％的量、更通常地多于约15％(w/w)的量的木质素。在一些实施方案中，木质纤维素原料包括少量的蔗糖、果糖和/或淀粉。木质纤维素原料通常首先通过包括但不限于以下的方法经受尺寸减少：碾磨、研磨、振荡、撕碎、压制/膨胀、或其他类型的机械作用。通过机械作用的尺寸减少可通过适应该目的的任何类型的设备进行，例如但不限于，锤式粉碎机、筒式粉碎机、辊式压制机、精磨机和水力碎浆机。在一些实施方案中，从尺寸减少产生的颗粒的按重量计至少90％具有少于约1/16至约4英寸(in)的长度(测量值可以是体积或重量平均长度)。在一些实施方案中，用于减少粒径的设备是锤式粉碎机或撕碎机。在尺寸减少后，通常将原料在水中浆化，因为这促进原料的泵送。在一些实施方案中，粒径少于约6英寸的木质纤维素原料不需要尺寸减少。
如本文所用，术语“木质纤维素原料”是指适于用作糖化反应中的原料的任何类型的木质纤维素生物质。
如本文所用，术语“预处理的木质纤维素原料”是指如上所述，已经受物理和/或化学工艺以使纤维更可及和/或更易接受纤维素分解性酶作用的木质纤维素原料。
如本文所用，术语“木质纤维素-感受态(lignocellulose-competent)”、“木质纤维素-利用(lignocellulose-utilizing)”和类似术语是指分泌参与木质素破坏和水解的酶的生物体。例如，在一些实施方案中，木质纤维素-感受态真菌细胞分泌一种或多种木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和/或纤维二糖脱氢酶(CDH)。木质素降解必需的这些胞外酶常常被称为“木质素改性酶(lignin-modifying enzyme)”或“LME”。
当生物质基质已经由一些物理和/或化学手段加工来便于糖化时，该生物质基质被称为“预处理的”。如本文进一步描述的，在一些实施方案中，使用本领域已知的方法“预处理”或处理生物质基质，诸如化学预处理(例如，氨预处理、稀酸预处理、稀碱预处理、或溶剂暴露)、物理预处理(例如，蒸汽爆破或辐照)、机械预处理(例如，研磨或碾磨)和生物预处理(例如，施加增溶木质素的微生物)和其组合，以增加纤维素对水解的敏感性。
在一些实施方案中，在预处理之前将基质浆化。在一些实施方案中，浆料的一致性是约2％至约30％，更通常地约4％至约15％。在一些实施方案中，在预处理之前对浆料进行水和/或酸浸泡操作。在一些实施方案中，在预处理之前使用任何适合的方法将浆料脱水以减少蒸气和化学品的使用。脱水装置的实例包括但不限于加压螺旋压制机(pressurized screw press)(参见例如，WO2010/022511，通过引用并入本文)加压过滤器和挤压机。
在一些实施方案中，进行预处理以将半纤维素、和/或木质纤维素中存在的半纤维素部分水解为单体戊糖和己糖糖类(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或其任何组合)。在一些实施方案中，进行预处理从而发生半纤维素的几乎完全水解和纤维素向葡萄糖的少量转化。在一些实施方案中，含水浆料中从约0.02％(w/w)至约2％(w/w)、或其间的任何量的酸浓度通常用于处理纤维素基质。任何适合的酸可用于这些方法，包括但不限于，盐酸、硝酸、和/或硫酸。在一些实施方案中，预处理期间使用的酸是硫酸。蒸汽爆破是进行生物质基质的酸预处理的一种方法(参见例如，美国专利号4,461,648)。预处理浆料的另一种方法包括连续预处理(即，将纤维素生物质连续地泵入反应器)。这种方法是本领域技术人员公知的(参见例如，美国专利号7,754,457)。
在一些实施方案中，预处理中使用碱。不同于酸预处理，碱预处理可以不水解生物质的半纤维素组分。而是，碱与半纤维素上存在的酸性基团反应来打开基质的表面。在一些实施方案中，碱的加入改变纤维素的晶体结构，从而使纤维素更顺从于水解。可用于预处理的碱的实例包括但不限于，氨、氢氧化铵、氢氧化钾、和氢氧化钠。碱预处理的一种方法是氨冷冻爆破法、氨纤维爆破法或氨纤维膨胀法(“AFEX”工艺；参见例如，美国专利号5,171,592；5,037,663；4,600,590；6,106,888；4,356,196；5,939,544；6,176,176；5,037,663和5,171,592)。在这一工艺期间，在加压容器中将纤维素基质与氨或氢氧化铵接触足够的时间以使氨或氢氧化铵能够改变纤维素纤维的晶体结构。然后快速地减少压力，这允许氨闪蒸或沸腾并爆破纤维素纤维结构。在一些实施方案中，然后使用本领域已知的方法回收闪蒸的氨。在一些替代方法中，使用稀氨预处理。稀氨预处理方法利用比AFEX更稀的氨或氢氧化铵溶液(参见例如，WO2009/045651和US2007/0031953)。这一预处理工艺可产生或不产生任何单糖。
用在本发明中的另外的预处理工艺包括用有机溶剂化学处理纤维素基质，诸如在预处理系统中利用有机液体的那些方法(参见例如，美国专利号4,556,430)。这些方法具有以下益处：低沸点液体可以容易地回收和再利用。其他预处理，诸如OrganosolvTM工艺，也使用有机液体(参见例如，美国专利号7,465,791)。使基质经受加压水也可以是适合的预处理方法(参见例如，Weil等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，68：21-40[1997])。在一些实施方案中，在预处理之后，通过多个步骤的任一个加工预处理的纤维素生物质，所述步骤诸如水稀释、水洗、缓冲、过滤、或离心、或这些工艺的任何组合，随后酶促水解，如本领域技术人员熟悉的。
预处理产生包含包括半纤维素水解产生的糖类、任选地乙酸和其他抑制剂的可溶组分、和包括未水解的原料和木质素的固体的预处理的原料组合物(例如，“预处理的原料浆料”)。在一些实施方案中，从固体分离预处理原料组合物的可溶组分以产生可溶级分。在一些实施方案中，然后将包括预处理期间释放的糖类、和其他可溶组分(例如，抑制剂)的可溶级分送去发酵。然而，在其中半纤维素没有在预处理期间被有效水解的一些实施方案中，包括一个或多个另外的步骤(例如，进一步的水解步骤和/或酶促处理步骤和/或进一步的碱和/或酸处理)以产生可发酵糖类。在一些实施方案中，通过以水溶液洗涤预处理的原料组合物来进行分离，以产生洗液流和包含未水解的、预处理的原料的固体流。可选地，通过使用任何适合的方法(例如，离心、微量过滤、板框压滤、交叉流过滤、加压过滤、真空过滤等)对预处理的原料组合物进行固液分离，从固体分离可溶组分。任选地，在一些实施方案中，在固液分离中掺入洗涤步骤。在一些实施方案中，然后对包含纤维素的分离的固体以纤维素酶进行酶促水解以将纤维素转化为葡萄糖。在一些实施方案中，将预处理的原料组合物供料进入发酵工艺而不分离其中包含的固体。在一些实施方案中，在发酵工艺后对未水解的固体以纤维素酶进行酶促水解以将纤维素转化为葡萄糖。在一些实施方案中，对预处理的纤维素原料以纤维素酶进行酶促水解。
如本文所用，术语″化学处理″是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。
如本文所用，术语″物理预处理″是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料的分离和/或释放的任何预处理。
如本文所用，术语″机械预处理″是指用于处理生物质的任何机械手段，包括但不限于多种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
如本文所用，术语″生物预处理″是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料的分离和/或释放的任何生物预处理。
如本文所用，术语“回收”是指从细胞和/或培养基收获、分离、收集或回收蛋白。在糖化的背景中，使用回收是指从培养基和/或细胞收获在糖化反应期间产生的可发酵糖类。在发酵的背景中，使用回收是指从培养基和/或细胞收获发酵产物。因此，一个过程如果包括在至少一些反应产物在反应中被产生后，从反应混合物的其他组分分离反应产物，则该过程被称为包括“回收”反应产物(诸如从糖化回收的可溶性糖)。
如本文所用，当反应中存在目标特定组分(例如，酶)时与在相同条件下以相同基质和其他代替物进行，但不存在目标组分(例如，不存在酶)的反应相比，导致产生更多产物时，发生“增加”来自反应的产物(诸如可发酵糖类)的产量。
如本文所用，如果与参与催化反应的其他酶相比，特定酶的量小于约2％、约1％或约0.1％(wt/wt)，则反应被称为“基本上不含”特定的酶。
如本文所用，“分级”液体(例如，培养肉汤)是指施加分离工艺(例如，盐沉淀、柱色谱、尺寸排阻和过滤)或此类工艺的组合以提供一种溶液，其中期望蛋白(例如，纤维素酶、和/或其组合)比在最初液体产物中构成总蛋白的更大百分比。
如本文所用，术语“酶促水解”是指由酶水解基质。在一些实施方案中，水解包括其中将至少一种酶与至少一种基质接触以产生终产物的方法。在一些实施方案中，酶促水解方法包括至少一种纤维素酶和作用于多糖(例如，纤维素)的至少一种糖苷酶和/或混合物糖苷酶，以将其全部或部分转化为可发酵糖类。当基质中存在的两个单糖之间的糖苷键的至少一些被水解，从而将此前连接的两个单体彼此分离时，发生纤维素或其他多糖的“水解(hydrolyzing)”和/或“水解(hydrolysis)”。
预期酶促水解以能够水解至少一种基质为至少一种终产物的任何适当的类型的酶进行。在一些实施方案中，基质是纤维素，而在一些其他实施方案中，基质是木质纤维素，在又进一步的实施方案中，基质是另一种组合物(例如，淀粉)。在一些实施方案中，终产物包括至少一种可发酵糖类。还预期，酶促水解涵盖以能够水解纤维素为葡萄糖的任何适当的类型的纤维素酶进行的过程，而不论纤维素酶的来源。预期任何适当的来源的酶可用于本发明，包括但不限于来自真菌，诸如木霉属(Trichoderma spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、肉座菌属(Hypocrea spp.)、腐质霉属(Humicolaspp.)、链孢霉属(Neurospora spp.)、Orpinomyces spp.、赤霉菌属(Gibberellaspp.)、裸孢壳属(Emericella spp.)、毛壳属(Chaetomium spp.)、金孢属(Chrysosporium spp.)、镰孢菌属(Fusarium spp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、大角间座壳属(Magnaporthe spp.)、原毛平革菌属(Phanerochaetespp.)、栓菌属(Trametes spp.)、香菇(Lentinula edodes)、Gleophyllumtrabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、Cryptococcus laurentii、Aureobasidium pullulans、Amorphotheca resinae、Leucosporidium scotti、Cunninghamelia elegans、Thermomyces lanuginosus、Myceliopthora thermophila和嗜热侧孢霉的酶，以及从属芽孢杆菌属(Bacillus)、Thermomyces、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)和Thermobifida的细菌获得的那些。
在一些实施方案中，酶促水解在为或接近使用纤维素酶的最佳值的pH和温度进行。例如，在一些实施方案中，酶促水解在约30℃至约75℃或其间的任何适当的温度，例如约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃的温度或其间的任何温度、和约3.5至约7.5的pH或其间的任何pH(例如，约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或其间的任何适当的pH)进行。在一些实施方案中，酶促水解开始前纤维素的最初浓度优选地是约0.1％(w/w)至约20％(w/w)或其间的任何适当的量(例如，约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约4％、约6％、约8％、约10％、约12％、约14％、约15％、约18％、约20％或其间的任何适当的量)。在一些实施方案中，所有纤维素酶的组合剂量是每克纤维素约0.001至约100mg蛋白或其间的任何适当的量(例如，每克纤维素约0.001、约0.01、约0.1、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100mg蛋白或其间的任何量)。酶促水解进行任何适当的时间段。在一些实施方案中，酶促水解进行约0.5小时至约200小时的时间段或其间的任何时间(例如，约2小时至约100小时或其间的任何适合时间)。例如，在一些实施方案中，其进行约0.5、约1、约2、约5、约7、约10、约12、约14、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约120、约140、约160、约180、约200或其间的任何适合时间。
在一些实施方案中，酶促水解是分批水解、连续水解、和/或其组合。在一些实施方案中，水解是被搅动的、未混合的、或其组合。酶促水解通常在水解反应器中进行。在加入预处理的木质纤维素基质到水解反应器之前、期间或之后，将纤维素酶组合物加入预处理的木质纤维素基质。事实上，不预期反应条件限于本文提供的那些，因为修改充分地在本领域技术人员知识范围内。在一些实施方案中，在纤维素水解后，在任何进一步加工之前，使用常规固体-液体分离技术除去所得的木质纤维素水解产物中存在的任何不溶性固体，包括但不限于木质素。在一些实施方案中，燃烧这些固体以为整个工艺提供能量。
如本文所用，“可得的总纤维素”是酶促水解可及的纤维素的量(wt％)。可得的总纤维素通常等于或非常接近等于水解反应中存在的最初的纤维素的量。
如本文所用，“剩余纤维素”是水解混合物中可得的总纤维素保持未水解的比例(wt％)。剩余纤维素可使用本领域已知的任何适当的方法测量。例如，可使用IR光谱学直接测量或可通过确定剩余固体的浓酸水解产生的葡萄糖的量来测量。
如本文所用，“水解的总纤维素”是水解混合物中水解的可得的总纤维素的比例。例如，水解的总纤维素可计算为“可得的总纤维素”与“剩余纤维素”的差。
如本文所用，“理论最大葡萄糖产量”是在指定条件下能够从可得的总纤维素产生的葡萄糖的最大量(wt％)。
如本文所用，“Gmax”是指能够从水解的总纤维素产生的葡萄糖的最大量(wt％)。Gmax可如下计算：例如，通过直接测量在指定反应条件下在反应结束时剩余的剩余纤维素的量，从可得的总纤维素减去剩余纤维素的量以确定水解的总纤维素，然后计算能够从水解的总纤维素产生的葡萄糖的量。
本领域技术人员将理解的是，当计算理论值诸如Gmax和理论最大葡萄糖产量时，把在水解反应过程中加入到葡萄糖分子的两个氢原子和一个氧原子的质量考虑进去。例如，当“n”葡萄糖单位的聚合物被水解时，(n-1)单位的水被加至水解中形成的葡萄糖分子，所以产生的葡萄糖的重量比水解中消耗的纤维素的重量大约10％(例如，水解1g纤维素将产生约1.1g葡萄糖)。
因此，作为一个实例，当水解反应开始时存在5g可得的总纤维素，且反应后剩余2g剩余纤维素时，水解的总纤维素是3g纤维素。在反应条件下的100％(w/w)的理论最大葡萄糖产量是约5.5g葡萄糖。Gmax是基于反应中被水解释放或转化的3g纤维素计算。因此，在这一实例中，100％(w/w)的Gmax是约3.3g葡萄糖。纤维素水平，无论是基质中存在的可得的总量或未水解的或剩余纤维素的量，可通过本领域已知的多种方法的任一种来定量，诸如通过IR光谱学或通过测量纤维素的浓酸水解产生的葡萄糖的量(参见例如，美国专利号6,090,595和7,419,809)。
如本文所用，术语“不溶固体”是指液体中被悬浮但不溶的固体材料。如本领域公知的，悬浮或不溶固体的浓度可通过任何适当的方法确定(例如，通过使用玻璃微纤维滤纸过滤浆料的样品，用水洗涤滤饼，并在约105℃干燥滤饼过夜)。
如本文所用，术语“未水解的固体”、“未转化的固体”和类似术语是指未被纤维素酶消化的纤维素、以及原料中存在的、对纤维素酶惰性的非纤维素材料或其他材料。
如本文所用，术语″副产物″是指是特定工艺(例如，糖化)不期望的产物的有机分子。
如本文所用的，术语“抗体”指免疫球蛋白。抗体包括但不限于从期望从其获得抗体的任何物种直接获得的免疫球蛋白。另外，本发明包括修饰的抗体。该术语还指保留了结合完整抗体结合的表位的能力的抗体片段，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗独特型(抗-ID)抗体。抗体片段包括但不限于互补决定区(CDR)、单链片段可变区(scFv)、重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)片段。
如本文所用的，术语“热学上稳定的”和“热稳定的”指当暴露于改变的温度时，在使用酶期间主要的条件下暴露于确定的温度给定的时间段之后保留了特定量的酶活性的本发明的酶。“改变的温度”包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，这些酶在暴露于改变的温度特定的时间段，例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等之后保留了至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的酶活性。
如本文所用的，术语“嗜热真菌”指在至少约37℃，且通常低于约100℃，例如诸如在约37℃至约80℃之间，约37℃至约75℃之间，在40℃至约65℃之间，或约40℃至约60℃之间的温度下显示出最佳生长的任何真菌。通常，最佳生长显示在至少约40℃至约60℃的温度下。
如本文所用的，“溶剂稳定性的”指与参考多肽相比，暴露于不同浓度(例如，约5％至约99％)的非水溶剂(例如，异丙醇、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚等)一段时间(例如，约0.5至约24小时)之后保持相似活性(例如，大于约60％至约80％)的多肽。
如本文所用的，术语“氧化稳定的”指例如暴露于氧化剂或接触氧化剂时，在使用本发明期间主要的条件下经给定的时间段保留特定量的酶活性的本发明的酶。在一些实施方案中，这些酶在与氧化剂接触特定的时间段，例如，至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等之后保留了至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的酶活性。
如本文所用的，“pH稳定的”指与参考多肽相比，暴露于低或高的pH(例如，约4.5至约6或约8至约12)一段时间(例如，0.5-24小时)之后保持相似活性(例如，大于约60％至约80％)的多肽。
如本文所用的，氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的酶背景下的术语“增强的稳定性”指与其他酶和/或野生型酶相比随时间推移更高的保留的酶活性。
如本文所用的，氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的酶背景下的术语“减少的稳定性”指与其他酶和/或野生型酶相比，随时间推移更低的保留的酶活性。
发明详述
本发明提供了改进的真菌菌株。在一些实施方案中，所述改进的真菌菌株可用于将纤维素材料水解成葡萄糖。如本文指出的，本发明提供了具有减少的内源性纤维二糖脱氢酶的分泌活性的真菌菌株。在一些实施方案中，真菌菌株分泌提高来自纤维素的可发酵糖产量的酶混合物。之前的报道已经表明纤维二糖脱氢酶对纤维二糖的氧化增强了纤维素酶水解纤维素的速度。与本领域中的传统看法不同，本发明令人惊奇地提供了减少纤维二糖脱氢酶的活性并导致来自纤维素的可发酵糖的产量提高的基因组修饰。有利地，本文提供的遗传修饰的产生纤维素酶的真菌细胞分泌导致提高的来自纤维素的可发酵糖例如葡萄糖的产量的酶混合物。
木质纤维素(也称为“木质纤维素生物质”)包含纤维素、半纤维素和木质素的基质。从木质纤维素生物质经济地生产生物燃料通常包括将纤维素和半纤维素组分转化成可发酵的糖，通常是单糖例如葡萄糖(来自纤维素)和木糖以及阿拉伯糖(来自半纤维素)。几乎完全的转化可通过化学预处理木质纤维素，接下来用纤维素酶酶促水解实现。化学预处理步骤使得纤维素对酶促水解更易感，并且在一些情况下，还水解半纤维素组分。本领域已知的许多化学预处理工艺可用在本发明中，且包括但不限于高温下的弱酸预处理和稀酸、铵预处理和/或有机溶剂萃取。
纤维素酶通常是协同地起到将纤维素分解成可溶性二糖或低聚糖例如纤维二糖的作用的不同类型的纤维素分解性酶(例如，内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，后者也称为“外切葡聚糖酶”)的混合物，然后纤维二糖被β-葡糖苷酶进一步水解成葡萄糖。纤维素酶由各种各样的微生物产生。来自丝状真菌和一些细菌的纤维素酶以及半纤维素酶被广泛地利用于涉及将天然纤维加工成糖的许多工业应用中。
木质素是比纤维素或半纤维素更复杂且异质性的生物聚合物且包括多种酚亚单位。酶促木质素解聚可通过通常协同地作用的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和/或纤维二糖脱氢酶(CDH)实现。然而，如名称所暗示的，CDH酶还将纤维二糖氧化成纤维二糖内酯。多种报道表明，CDH对纤维二糖的氧化由于减少了纤维二糖的浓度而增强了纤维素酶水解纤维素的速度，纤维二糖是一些纤维素酶组分的强力抑制剂(参见例如Mansfield等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：3804-3809[1997]；和Igarishi等人，Eur.J.Biochem.，253：101-106[1998])。近来，已报道CDH可增强来自糖基水解酶家族61的纤维素裂解增强蛋白的活性(参见例如，WO2010/080532A1)。
在产纤维素酶的丝状真菌之中，存在还产生参与木质素降解的多种酶的那些。例如，诸如属毁丝霉属、金孢属、侧孢霉属、梭孢壳属、原毛平革菌属和栓菌属的生物体产生和分泌纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的混合物。这些类型的生物体由于其消化木质素的能力而通常被称为“白腐真菌”，区别于通常不能消化木质素的“棕腐”真菌(诸如木霉属)。
遗传修饰的真菌细胞
本文提供的遗传修饰的真菌细胞允许减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在本文提供的一些遗传修饰的真菌细胞中，由所述细胞分离的纤维二糖脱氢酶的活性相对于由在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的亲本真菌细胞分泌的纤维二糖脱氢酶的活性水平减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。在一些实施方案中，遗传修饰的真菌细胞提供了相对于由在基本相同的条件下生长或培养的未修饰的亲本真菌细胞分泌的纤维二糖脱氢酶的活性水平的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
将易于理解，本领域已知的任何合适的遗传修饰可被用来减少内源性纤维二糖脱氢酶的分泌活性。例如，如本文以下描述的，本文设想的修饰包括减少由所述细胞分泌的纤维二糖脱氢酶的量的修饰。还设想了减少由所述细胞表达的纤维二糖脱氢酶的量的修饰。另外的实施方案包括减少纤维二糖脱氢酶的转录水平的修饰。更进一步的实施方案包括编码纤维二糖脱氢酶的基因的完全或部分缺失。其他实施方案包括减少纤维二糖脱氢酶的催化效力的修饰。
分泌的酶.在一些实施方案中，本发明的真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶的量。分泌的纤维二糖脱氢酶的量的减少可以是分泌到胞外环境中的纤维二糖脱氢酶的完全或部分减少。分泌的纤维二糖脱氢酶的量的减少可通过减少由所述细胞产生的纤维二糖脱氢酶的量和/或通过减少细胞分泌由所述细胞产生的纤维二糖脱氢酶的能力来实现。用于减少细胞分泌多肽的能力的方法可根据本领域已知的多种合适的方法中的任何一种进行(参见，例如Fass和Engels J.Biol.Chem.，271：15244-15252[1996]，其被通过引用全文并入本文)。例如，编码分泌性多肽的基因可被修饰以缺失分泌信号肽或使其失活。在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏纤维二糖脱氢酶的N端分泌信号肽。在一些实施方案中，由所述细胞分泌的纤维二糖脱氢酶的量相对于在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的生物体中纤维二糖脱氢酶的分泌减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
此外，在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶活性的总量相对于在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的生物体中分泌的纤维二糖脱氢酶的总量减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
减少的纤维二糖脱氢酶的分泌可通过本领域已知的用于检测蛋白质或酶水平的多种合适的方法中的任何一种方法确定。例如，真菌培养物的上清液中纤维二糖脱氢酶的水平可使用蛋白质印迹技术或利用纤维二糖脱氢酶特异性抗体的任何其他合适的蛋白质检测技术检测。相似地，真菌培养物的上清液中的纤维二糖脱氢酶的分泌活性可使用如本文更详细地描述的用于纤维二糖脱氢酶活性的测定测量。
表达水平.在一些实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。如本文所用的，表达指将基因中所编码的信息转化成由该基因编码的蛋白质。因此，表达的纤维二糖脱氢酶的量的减少表示由细胞最终翻译的纤维二糖脱氢酶的量的减少。在一些这类实施方案中，表达的减少通过减少由编码纤维二糖脱氢酶的基因转录的mRNA的量实现。在一些其他实施方案中，表达的减少通过减少由编码纤维二糖脱氢酶的mRNA翻译的蛋白质的量实现。
由所述细胞表达的纤维二糖脱氢酶的量相对于未被修饰的真菌细胞中纤维二糖脱氢酶的表达可被减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。在一些这类实施方案中，表达的减少通过在基本上相同的培养条件下生长或培养的未修饰的生物体中，减少由编码纤维二糖脱氢酶的基因转录的mRNA的量实现。
此外，在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶表达水平的减少导致所述真菌细胞的纤维二糖脱氢酶的总的表达水平相对于在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的真菌细胞减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。
减少的纤维二糖脱氢酶的表达可通过本领域已知的用于检测蛋白质或酶水平的多种方法中的任何一种方法确定。例如，真菌培养物的上清液中纤维二糖脱氢酶的水平可使用蛋白质印迹技术或利用纤维二糖脱氢酶特异性抗体的任何其他合适的蛋白质检测技术检测。
用于减少多肽表达的方法是本领域熟知的且可使用本领域已知的多种合适的方法中的任何一种方法进行。例如，编码分泌性多肽的基因可被修饰以破坏翻译起始序列例如Shine-Delgarno序列或Kozak共有序列。此外，编码分泌性多肽的基因可被修饰以将移码突变引入到编码内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。还将认识到，不常用密码子的使用可导致减少的多肽表达。将理解在一些实施方案中，编码纤维二糖脱氢酶的基因具有至少一个导致翻译截短的蛋白质的无义突变。
减少所表达的多肽的量的其他方法包括转录后RNA沉默方法，例如反义RNA和RNA干扰。反义技术是充分建立的，且包括使用与该基因的核酸序列互补的核苷酸序列。更具体地，真菌细胞对基因的表达可通过引入与所述核酸序列互补的可在所述细胞中被转录并能够与细胞中所产生的mRNA杂交的核苷酸序列来减少或消除。在允许互补的反义核苷酸序列与所述mRNA杂交的条件下，所翻译的蛋白的量因此减少或消除。用于表达反义RNA的方法是本领域已知的(参见例如，Ngiam等人，ApplEnviron Microbiol.，66(2)：775-82[2000]；和Zrenner等人，Planta.，190(2)：247-52[1993])，在此其都被通过引用全文并入本文)。
此外，基因的修饰、下调或失活可经过RNA干扰(RNAi)技术获得(参见例如，Kadotani等人Mol.Plant Microbe Interact.，16：769-76[2003]，其被通过引用全文并入本文)。RNA干扰方法包括双链RNA(dsRNA)、短的发夹RNA(shRNAs)和小干扰RNA(siRNAs)。使用dsRNA的强效沉默可使用任何合适的技术获得(参见例如，Fire等人，Nature391：806-11[1998])。使用shRNA的沉默也是已被充分确立的(参见例如，Paddison等人，GenesDev.，16：948-958[2002])。使用siRNA技术的沉默也是已知的(参见例如，Miyagishi等人，Nat.Biotechnol.，20：497-500[2002])。每一个上述参考文献的内容被通过引用全文并入本文。
转录水平.在一些实施方案中，本发明的真菌细胞已被遗传修饰以减少编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。如本文所用的，转录及类似的术语指将基因中所编码的信息转化为RNA转录子。因此，纤维二糖脱氢酶的转录水平的减少是编码纤维二糖脱氢酶的RNA的RNA转录子的量的减少。在一些实施方案中，转录水平相对于在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的生物体中的纤维二糖脱氢酶的转录水平减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
此外，在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶转录水平的减少导致由所述真菌细胞分泌的总的纤维二糖脱氢酶相对于由在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的生物体减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。减少的转录可通过本领域已知的用于检测转录水平的多种方法的任一种来确定。例如，真菌细胞中特定mRNA的转录水平可使用定量RT-PCR技术或特异性检测特定mRNA的其他RNA检测技术来检测。用于减少基因的转录水平的方法可根据本领域已知的任何合适的方法进行，且包括基因的部分或完全缺失，和对基因启动子的破坏或取代，使得该基因的转录被极大地降低或甚至被抑制。例如，基因的启动子可被弱启动子取代(参见例如，美国专利第6,933,133号，其被通过引用全文并入本文)。因此，如果该弱启动子与内源性多肽的编码序列可操作连接，则该基因的转录被极大地降低或抑制。
基因缺失.在一些实施方案中，本发明的真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码内源性纤维二糖脱氢酶的基因。通常，该缺失减少或消除了由所述真菌细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶的总量。在一些实施方案中，设想了基因序列的完全缺失或几乎完全的缺失。然而，为了减少由真菌细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶的量，缺失突变不必完全去除编码纤维二糖脱氢酶的完整基因序列。例如，在一些实施方案中，存在去除了编码纤维二糖脱氢酶活性位点中的氨基酸、编码分泌信号或编码在由所述真菌细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性中起作用的纤维二糖脱氢酶的另一部分的一个或多个核苷酸的部分缺失。
根据本文提供的实施方案，编码纤维二糖脱氢酶的基因中的缺失包括编码所述纤维二糖脱氢酶的基因中的一个或多个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，存在编码纤维二糖脱氢酶的基因的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的缺失，其中由细胞分泌的纤维二糖脱氢酶的量减少。
因此，在一些实施方案中，缺失导致由所述真菌细胞分泌的纤维二糖脱氢酶的活性相对于由在基本相同的培养条件下生长或培养的未修饰的生物体分泌的纤维二糖脱氢酶的活性减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。
此外，在一些实施方案中，缺失导致由所述真菌细胞分泌的总纤维二糖脱氢酶相对于在基本相同的培养条件下生长或培养的未被修饰的真菌细胞减少至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。
纤维二糖脱氢酶基因的缺失可通过本领域已知的用于检测基因缺失的多种方法的任一种检测和证实，包括本文提供的和实施例中的方法。例如，如在本文示例的，基因缺失可使用PCR扩增修饰的基因组区域来证实。将理解的是，用于证实缺失的另外的适当的技术可以使用并且是公知的，包括DNA印迹技术、修饰的基因组区域的DNA测序、和筛选在重组事件中掺入的阳性或阴性标志物。
用于完全和/或部分缺失基因的方法是公知的，本文所述的遗传修饰的真菌细胞可使用本领域已知的导致减少由该细胞分泌的内源纤维二糖脱氢酶的量的多种缺失方法的任一种产生。此类方法可有利地包括使用同源侧翼标志物的标准基因破坏(参见例如，Rothstein，Meth.Enzymol.，101：202-211[1983]，通过引用全文并入本文)。用于基因缺失的另外的技术包括用于标准缺失的基于PCR的方法(参见例如，Davidson等人，Microbiol.，148：2607-2615[2002]，通过引用全文并入本文)。
另外的基因缺失技术包括“阳性-阴性”盒；基于cre/lox的缺失、增加同源重组的基因枪转化、和农杆菌介导的基因破坏。“阳性-阴性”方法采用由用于阳性筛选的一种标志物基因和用于阴性筛选的另一标志物基因组成的盒(参见例如，Chang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：4959-4963[1987])。基于Cre/lox的方法采用使用Cre重组酶的表达消除标志物基因(参见例如，Florea等人，Fung.Genet.Biol.，46：721-730[2009])。
向真菌细胞中引入DNA或RNA的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于PEG介导的原生质体转化、电穿孔、基因枪转化和农杆菌介导的转化。基因枪转化采用一种工艺，其中DNA或RNA在微米大小的颗粒上被引入细胞，从而增加缺失构建体向真菌细胞的递送(参见例如，Davidson等人，Fung.Genet.Biol.，29：38-48[2000])。类似地，农杆菌介导的转化联合线性或割裂标志物(split-marker)缺失盒可帮助缺失构建体向靶细胞的递送(参见例如，Wang等人，Curr.Genet.，56：297-307[2010])。
用于完全或部分基因缺失的另外的方法包括，基因的破坏。此类基因破坏技术是本领域技术人员已知的，包括但不限于，插入性诱变、转座子的使用和标志的整合(marked integration)。然而，应理解的是，提供编码序列或基因的任何其他功能方面的破坏的任何适当的技术可用来产生本文提供的遗传修饰的真菌细胞。插入性诱变的方法可根据本领域已知的任何适当的方法进行(参见例如，Combier等人，FEMS Microbiol.Lett.，220：141-8[2003]，其通过引用全文并入本文)。此外，可使用农杆菌介导的插入性诱变以插入破坏编码基因的功能诸如破坏编码序列或基因的任何其他功能方面的序列。
转座子诱变方法提供了用于破坏基因的另一方式。转座子诱变是本领域公知的，并可使用体内技术(参见例如，Firon等人，Eukaryot.Cell2：247-55[2003])；或通过使用体外技术(参见例如，Adachi等人，Curr Genet.，42：123-7[2002])进行；这些参考文献的每一篇通过引用全文并入。因此，可使用使用转座子诱变的靶向的基因破坏以插入破坏编码基因的功能的序列，诸如破坏编码序列或基因的任何其他功能方面。
限制性酶介导的整合(REMI)是用于基因破坏的另一种方法，并是本领域公知的(参见例如，Thon等人，Mol.Plant Microbe Interact.，13：1356-65[2000]，其通过引用全文并入本文)。REMI以表面上随机的方式向基因组限制性位点中产生插入，其中一些导致突变。因此，可如本文提供地筛选和利用展示编码内源纤维二糖脱氢酶的基因中的破坏的插入性突变体。
催化破坏.在一些其他实施方案中，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少纤维二糖脱氢酶的催化效力。催化效力的减少指如使用本文提供的或本领域本来已知的标准技术测量的，相对于未修饰的纤维二糖脱氢酶，纤维二糖脱氢酶活性的减少。因此，减少催化效力的遗传修饰可导致例如，所翻译的具有酶活性减少的蛋白质产物。
催化效力的减少是如使用标准技术测量的，纤维二糖脱氢酶活性相对于未修饰的纤维二糖脱氢酶减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。在一些另外的实施方案中，如使用标准技术测量的，遗传修饰导致在由所述真菌细胞分泌的总的纤维二糖脱氢酶活性方面，纤维二糖脱氢酶活性与未修饰的纤维二糖脱氢酶相比减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。
用于减少脱氢酶的催化效力的方法是公知的，如此，本领域已知的用于减少催化效力的多种适当的方法的任一种可用于遗传修饰本文提供的真菌细胞。因此，例如，可遗传修饰真菌细胞以灭活纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基(参见，例如Frederik等人.，Biochem.，42：4049-4056[2003]，本文通过引用将其全文并入)。例如，可修饰一个或多个残基以减少底物结合，和/或可修饰一个或多个残基以减少纤维二糖脱氢酶的催化活性。因此，可对纤维二糖脱氢酶的电子接受体(例如，黄素)结合结构域、或任何其他底物结合结构域中的一个或多个残基进行修饰以减少或灭活纤维二糖脱氢酶的催化效力。类似地，活性位点以外的残基突变可导致纤维二糖脱氢酶的形状或活性的变构改变，从而减少酶的催化效力将是明显的。
在一些实施方案中，其他结构域被靶向用于至少一种突变，其导致减少内源纤维二糖脱氢酶的催化效力。例如，在一些实施方案中，对纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基的突变可导致减少的催化效力(例如，Rotsaert等人，Arch.Biochem.Biophys.，390：206-14[2001]，其被通过引用全文并入本文)。
真菌细胞
如本文所表明的，本发明提供了来自科毛壳菌科的真菌细胞，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量，其中所述真菌细胞能够分泌包含纤维素酶的酶混合物。毛壳菌科是子囊菌亚门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)中的真菌的科。科毛壳菌科包括无毛毛壳属、无孔梭孢壳属、毛喙壳属、毛壳属、Corylomyces、棒囊壳属、法氏壳属、梭孢壳属、柄孢壳属和毁丝霉属。在一些实施方案中，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是选自毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属和毛壳属的毛壳菌科的成员。
在一些实施方案中，遗传修饰的真菌细胞是选自毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属和毛壳属的毛壳菌科成员的无性型或有性型。在一些实施方案中，遗传修饰的真菌细胞选自侧孢霉属、金孢子菌属、拟青霉属(Paecilomyces)、踝节菌属和支顶孢属。还设想了遗传修饰的真菌细胞还可选自属栉霉属、嗜热子囊菌属和柱霉属，包括这些属的真菌细胞的无性型和有性型。在一些实施方案中，遗传修饰的真菌细胞选自嗜纤维素侧孢霉、异梭孢壳菌、异棒囊壳菌、太瑞斯梭孢壳菌的菌株，包括其无性型和有性型。预期本发明不限于毛壳菌科中的任何特定的属。在一些另外的实施方案中，遗传修饰的真菌细胞是支顶孢属、节皮菌属(Arthroderma)、棒囊壳属、梭孢壳属、毁丝霉属、嗜热子囊菌属、Chromocleista、丝衣霉属(Byssochlamys)、侧孢霉属、毛壳属、金孢子菌属、柱霉属、栉霉属、拟青霉属或踝节菌属的嗜热型物种。应理解对于所有前述物种，不管其所称作的种名，本文展示的遗传修饰的真菌细胞包括完全和不完全阶段，和其他分类学等价物(例如，无性型)(参见，例如，Cannon，Mycopathol.，111：75-83[1990]；Moustafa等人，Persoonia14：173-175[1990]；Upadhyay等人，Mycopathol.，87：71-80[1984]；Guarro等人，Mycotaxon23：419-427[1985]；Awao等人，Mycotaxon16：436-440[1983]；和von Klopotek，Arch.Microbiol.，98：365-369[1974])。本领域技术人员将容易地认识到合适等价物的身份。因此，将应理解，除非另外指明，否则本公开内容中特定物种命名的使用也指通过无性型或有性型关系相关的物种。例如，下列物种是无性型或有性型且因此可被认为是同义的：嗜热毁丝霉、嗜热侧孢霉、嗜热侧孢霉、嗜纤维素侧孢霉、嗜纤维素金孢子菌、异棒囊壳菌和异梭孢壳菌。
在一些实施方案中，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是产生纤维素酶的真菌细胞。在一些实施方案中，产生纤维素酶的真菌细胞表达并分泌纤维素水解性酶的混合物。在一些实施方案中，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是来自科毛壳菌科的真菌细胞，其分泌两种或更多种纤维素水解性酶(例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶)。在一些另外的实施方案中，产生纤维素酶的真菌细胞以任意组合产生这些酶中的两种或多种。
另外，在一些实施方案中，遗传修饰的真菌细胞来源于木质纤维素感受态的亲本真菌细胞。在一些实施方案中，木质纤维素感受态的真菌细胞分泌一种或多种木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和/或纤维二糖脱氢酶(CDH)。
本发明还提供了处于包含如上文描述的遗传修饰的真菌细胞的容器中的真菌培养物。在一些实施方案中，该容器包含液体培养基，例如发酵培养基。例如，该容器可以是烧瓶、生物处理反应器或任何合适的容器。在一些实施方案中，该容器包含固体生长培养基。例如，固体培养基可以是琼脂培养基，例如马铃薯葡萄糖琼脂、羧甲基纤维素、玉米粉琼脂和任何其他合适的培养基。在一些实施方案中，上文描述的真菌细胞是分离的真菌细胞。
纤维二糖脱氢酶
如本文所指出的，术语“纤维二糖脱氢酶”和“CDH”指纤维二糖：接受体1-氧化还原酶，该酶在接受体的存在下催化将纤维二糖转化为纤维二糖-1，5-内酯和还原的接受体。纤维二糖脱氢酶的实例落在酶分类(E.C.1.1.99.18)中。通常，如铁，尤其是Fe(SCN)3、分子氧、泛醌或细胞色素C和其他多酚类例如木质素可充当接受体一样，2，6-二氯靛酚可充当接受体。该酶的底物包括纤维二糖、纤维-低聚糖、乳糖和D-葡糖基-1，4-β-D-甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露二糖、硫代纤维二糖、半乳糖基-甘露糖、木二糖、木糖。电子供体包括在还原末端带有葡萄糖或甘露糖的β-1，4-二己糖，但是α-1，4-己糖苷、己糖、戊糖和β-1，4戊糖聚合物可充当这些酶的至少一些酶的底物(参见，例如Henriksson等人，Biochim.Biophys.Acta Prot.Struct.Mol.Enzymol.，1383：48-54[1998]；和Schou等人，Biochem.J.，330：565-571[1998])。
在一些实施方案中，CDH酶包含保守的葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶的N结构域和GMC氧化还原酶的C结构域二者。在一些其他实施方案中，CDH包含仅GMC氧化还原酶的N结构域。GMC氧化还原酶是FAD黄素蛋白氧化还原酶(参见例如，Cavener，J.Mol.Biol.，223：811-814[1992]；以及Vrielink和Blow，Biochem.，32：11507-15[1993])。GMC氧化还原酶包括多种蛋白质，例如胆碱脱氢酶、甲醇氧化酶、和纤维二糖脱氢酶(CDH)，其共有具有序列相似性的几个区域。如通过Pfam数据库根据条目GMC_oxred_N(PF00732)定义的，这些区域中的位于N端部分中的一个区域对应于FAD ADP-结合结构域。相似地，按照Pfam数据库中根据条目GMC_oxred_C(PF05199)中列出的定义了C端保守结构域(GMC氧化还原酶C结构域)。
纤维二糖脱氢酶可分为两个家族。第一家族包含催化部分且第二家族包含催化部分和纤维素结合基序(CBM)。示例性纤维二糖脱氢酶的3维结构以两个球状结构域为特征，每一个包含两个辅因子中的一个，即血红素或黄素。活性位点位于两个结构域之间的缝隙内。纤维二糖的氧化通常经过从纤维二糖到黄素的2-电子转移发生，产生纤维二糖-1，5-内酯和还原的黄素。活性FAD通过向血红素基团的电子转移而再生，留下被还原的血红素。天然状态的血红素通过在第二活性位点处与氧化型底物的反应再生。在一些实施方案中，接受体优先为氰铁化铁、细胞色素C或氧化的酚化合物例如二氯靛酚(DCIP)，一种通常用于比色测定的接受体。金属离子和O2也是接受体，但是对于大部分纤维二糖脱氢酶，纤维二糖氧化酶针对这些接受体的反应速度比对于铁或有机氧化剂所观察到的反应速度低几个数量级。纤维二糖内酯释放后，产物可经历自发开环以产生纤维二糖酸(参见，例如Hallberg等人，J.Biol.Chem.，278：7160-7166[2003])。本领域技术人员将理解，纤维二糖脱氢酶活性通常利用氧或等价氧化还原接受体的存在，所述等价氧化还原接受体可以是例如木质素、分子氧、细胞色素C、氧化还原染料、苯醌和/或Fe2+络合物。
纤维二糖脱氢酶活性可使用本领域已知的多种合适的方法中的任何一种方法测量(参见，例如Combier等人，Biochem J.，220：565-71[1998]，其被通过引用全文并入)。例如，可通过在530nm下的吸光度监测在纤维二糖存在下CDH活性对DCPIP(2，6-二氯苯酚吲哚苯酚)的还原。
如本文提供的，已被遗传修饰以减少纤维二糖脱氢酶的分泌活性的真菌细胞通常具有减少的内源性纤维二糖脱氢酶的分泌活性。因此，来自本文描述的每一种真菌物种的一种或多种纤维二糖脱氢酶可被遗传修饰所靶向。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶来自科毛壳菌科的真菌物种。下表1中列出了从毛壳菌科成员鉴定到的纤维二糖脱氢酶的一些实例。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶来自选自下列的真菌物种：嗜纤维素侧孢霉、异梭孢壳菌、异囊壳菌、太瑞斯梭孢壳菌、球毛壳菌和嗜热毁丝霉。下表中列出了从这些物种鉴定到的一些纤维二糖脱氢酶。下表中列出的蛋白质是本领域已知的或本文鉴定为纤维二糖脱氢酶的纤维二糖脱氢酶的实例。
Figure BDA00003133653100691
*对于太瑞斯梭孢无菌的登记号表示美国能源部(DOE)联合基因组研究院(JGI)的基因组序列。
本文提供了编码纤维二糖脱氢酶的一些氨基酸序列。例如，编码嗜热毁丝霉CDH1的核苷酸序列在本文以SEQ ID NO：1列出，并且嗜热毁丝霉CDH1的编码的氨基酸序列以SEQ ID NO：2列出。
在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶是纤维二糖脱氢酶EC1.1.99.18。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶是具有如SEQ ID NO：2列出的嗜热毁丝霉CDH1的氨基酸序列的纤维二糖脱氢酶。在一些其他实施方案中，纤维二糖脱氢酶包含表1中列出的任何一个登记号的GenBank条目中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶由与SEQ ID NO：1至少约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的核酸序列所编码。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶由与编码如SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列、或在表1列出的任何一个登记号的Genbank条目中提供的氨基酸序列的核酸序列至少约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的核酸序列所编码。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶由可与SEQ ID NO：1在如上文描述的中等严格或严格条件下选择性地杂交的核酸序列编码。在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶由可与编码SEQID NO：2或表1列出的任何一个登记号的Genbank条目中提供的氨基酸序列的核酸序列在中等严格或严格条件下选择性地杂交的核酸序列编码。
在一些实施方案中，纤维二糖脱氢酶包含与如SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列，或在表1列出的任何一个登记号的Genbank条目中提供的氨基酸序列具有至少约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的相似性的氨基酸序列。纤维二糖脱氢酶序列可通过本领域已知的多种方法中的任何一种方法确定。例如，可针对数据库，例如NCBI数据库进行序列比对，并可选择具有最低HMME-值的序列。
在一些实施方案中，本发明的真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的两种或更多种内源性纤维二糖脱氢酶的纤维二糖脱氢酶活性的量。在一些实施方案中，所述两种或更多种纤维二糖脱氢酶中的第一种包含与SEQ ID NO：2至少约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列，且所述两种或更多种纤维二糖脱氢酶中的第二种包含与SEQ ID NO：2至少约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。
酶混合物
本文还提供了包含由真菌细胞表达的至少一种或多种纤维素水解性酶的酶混合物，如本文所述的，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。纤维素酶由各种各样的微生物产生。来自丝状真菌和一些细菌的纤维素酶(以及半纤维素酶)被广泛地利用于涉及将天然纤维加工成糖的许多工业应用中。设想了本文列出的任何酶的混合物将可用在本发明中。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含由真菌细胞表达的至少一种或多种纤维素水解性酶，如本文所述的，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在一些实施方案中，所述真菌细胞是来自科毛壳菌科的利用木质纤维素的细胞。在一些实施方案中，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是选自毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属或毛壳属的毛壳菌科的成员。在一些其他实施方案中，遗传修饰的真菌细胞还可以是选自毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属或毛壳属的毛壳菌科成员的无性型或有性型。另外，遗传修饰的真菌细胞还可选自侧孢霉属或支顶孢属或踝节菌属。还设想了遗传修饰的真菌细胞选自栉霉属、嗜热子囊菌属和柱霉属，包括来自这些属的真菌细胞的无性型和有性型。在一些实施方案中，真菌细胞是选自嗜纤维素侧孢霉、异梭孢壳菌、异棒囊壳菌、太瑞斯梭孢壳菌、球毛壳菌、柄篮状菌和嗜热毁丝霉的物种，包括其无性型和有性型。
除了上述酶之外，其他酶例如虫漆酶可用在本发明的混合物中。虫漆酶是在许多植物、真菌和微生物中发现的含铜氧化酶。虫漆酶酶促地作用于酚和类似分子并进行一电子氧化。虫漆酶可以是聚合态的且酶活形式可以是二聚体或三聚体。
Mn依赖性过氧化物酶也可用在本发明的混合物中。Mn依赖性过氧化物酶(MnP)的酶促活性依赖于Mn2+。不被理论束缚地，已表明该酶的主要作用是将Mn2+氧化成Mn3+(参见例如，Glenn等人Arch.Biochem.Biophys.，251：688-696[1986])。随后，酚底物被所产生的Mn3+氧化。
木质素过氧化物酶也可用在本发明的混合物中。木质素过氧化物酶是体外催化聚合态木质素的稀溶液的氧化性解聚的胞外血红素。LiP的一些底物，最著名地3，4-二甲氧基苄醇(藜芦醇，VA)是已被表明充当氧化还原介质的有活性的氧化还原化合物。VA是在黄孢原毛平革菌的木质素裂解培养物产生LiP的同时产生的次级代谢产物且不被理论束缚地，已指出其在体内LiP-催化的木质素氧化中充当生理氧化还原介质(参见例如，Harvey等人，FEBS Lett.195：242-246[1986])。
在一些实施方案中，利用无细胞的酶混合物会是有利的。无细胞的酶混合物通常包含已从任何细胞，包括分泌酶的细胞分离的酶。无细胞的酶混合物可使用本领域已知的多种合适的方法(例如过滤或离心)中的任何一种方法制备。在一些实施方案中，酶混合物是部分地无细胞的、基本上无细胞的或完全无细胞的。
在一些实施方案中，纤维素酶混合物中存在的两种或更多种纤维素酶和任何另外的酶由单一的遗传修饰的真菌细胞或由组合或单独的发酵中的不同微生物分泌。相似地，纤维素酶混合物中存在的两种或更多种纤维素酶和任何另外的酶可由不同生物体的不同菌株单独地表达或成小组地表达，并且这些酶被体外合并以制备纤维素酶混合物。还设想了酶混合物中的纤维素酶和任何另外的酶由单一生物体的不同菌株单独地表达或成小组地表达，并且这些酶被合并以制备纤维素酶混合物。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含由真菌细胞表达的至少一种或多种纤维素水解性酶，如本文所述，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量。在一些实施方案中，所述真菌细胞是来自科毛壳菌科的利用木质纤维素的细胞。在一些实施方案中，本文提供的遗传修饰的真菌细胞是选自毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属和毛壳属的毛壳菌科的成员。遗传修饰的真菌细胞还可以是选自毁丝霉属、梭孢壳属、棒囊壳属和毛壳属的毛壳菌科成员的无性型或有性型。另外，遗传修饰的真菌细胞还可选自侧孢霉属、支顶孢属、栉霉属、柱霉属和嗜热子囊菌属，包括来自这些属的真菌细胞的无性型和有性型。在一些实施方案中，真菌细胞是选自嗜纤维素侧孢霉、异梭孢壳菌、异棒囊壳菌、太瑞斯梭孢壳菌、球毛壳菌、柄篮状菌和嗜热毁丝霉的物种，包括其无性型和有性型。
在一些实施方案中，本发明的纤维素酶混合物在发酵工艺中产生，其中本文所述的真菌细胞被培养在深层液体培养发酵物中。在一些实施方案中，使用分批、补料分批或连续处理孵育真菌细胞的深层液体发酵物。在分批工艺中，除了用于需氧工艺的氧以外，所有必需的材料在操作开始时被放置在反应器中并允许发酵进行直到结束，在结束的时间点收集产物。在一些实施方案中，用于产生本发明的酶混合物的分批工艺在摇瓶或生物反应器中进行。在使用补料分批工艺的一些实施方案中，给培养物连续地或顺序地供应一种或多种培养基组分而不去除培养液。在连续工艺中，以体积上相等的速度供应新鲜培养基并连续去除培养液以将培养物保持在稳定的生长速度下。本领域技术人员将理解，发酵培养基通常为液体，且包含可被添加至发酵培养基以改进真菌细胞的生长和酶产生的碳源、氮源以及其他营养成分、维生素和矿物质。这些其他的培养基组分可在用真菌细胞接种培养物之前、与之同时或之后添加。
在用于产生本发明的酶混合物的工艺的一些实施方案中，碳源包含将诱导真菌细胞表达纤维素酶的碳水化合物。例如，在一些实施方案中，所述碳源包含纤维素、纤维二糖、槐糖、木聚糖、木糖、木二糖和/或已知诱导纤维素酶和β-葡糖苷酶在这些真菌细胞中表达的有关的低聚糖或多糖的一种或多种。在利用分批发酵的一些实施方案中，碳源在接种之前或与之同时加入到发酵培养基。在利用补料分批发酵或连续操作的一些实施方案中，在发酵工艺期间连续地或间歇地供应碳源。例如，在一些实施方案中，以约0.2g碳/L培养物/h和约2.5g碳/L培养物/h之间或其间的任何合适的量的碳补料速度供应碳源。
用于产生本发明的酶混合物的方法可在任何合适的温度下进行，通常从约20℃至约100℃、或其间任何合适的温度，例如从约20℃至约80℃、25℃至约65℃、或其间任何合适的温度，或从约20℃、约22℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约32℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃和/或其间任何合适的温度。
用于产生本发明的酶混合物的方法可在任何合适的pH下进行，通常从约3.0至8.0、或其间任何合适的pH，例如从约pH3.5至pH6.8、或其间任何合适的pH，例如从约pH3.0、约3.2、约3.4、约3.5、约3.7、约3.8、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.2、约5.4、约5.5、约5.7、约5.8、约6.0、约6.2、约6.5、约6.8、约7.0、约7.2、约7.5、约8.0或其间任何合适的pH。
在一些实施方案中，酶混合物被包含在含有如本文所述的遗传修饰的真菌细胞的容器中。在一些实施方案中，该容器包含液体培养基。在一些实施方案中，该容器是烧瓶、生物处理反应器或任何其他合适的容器。在一些实施方案中，所述酶混合物以液体体积计。在一些实施方案中，液体体积可大于约0.01mL、约0.1mL、约1mL、约10mL、约100mL、约1000mL或大于约10L、约50L、约100L、约200L、约300L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1000L、约10,000L、约50,000L、约100,000L、约250,000L、约500,000L或大于约1,000,000L。
在一些实施方案中，发酵后，使用包含真菌细胞的发酵培养基，或使用包含真菌细胞和酶混合物的发酵培养基，或例如通过过滤或离心使酶混合物与真菌细胞分离，并且使用发酵培养基中的酶混合物。在一些实施方案中，低分子溶质例如发酵培养基未被消耗的组分通过超滤去除。在一些实施方案中，酶混合物通过蒸发、沉淀、沉降、过滤或任何合适的手段浓缩。在一些实施方案中，添加化学物质例如甘油、蔗糖、山梨醇等以稳定酶混合物。在一些实施方案中，向酶混合物中添加其他化学品例如苯甲酸钠或山梨酸钾以防止微生物污染物的生长。
用于产生葡萄糖的方法
本发明还提供了用于产生葡萄糖的工艺，包括使纤维素与本文描述的酶混合物接触。例如，在一些实施方案中，该工艺包含使纤维素与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由如本文所述的真菌细胞表达。在一些实施方案中，使用酶混合物从纤维素产生葡萄糖的方法是分批水解、连续水解或其组合。在一些实施方案中，水解是被搅拌的、未混合的或其组合。
用于从纤维素产生葡萄糖的方法可在任何合适的温度，包括约30℃和约80℃之间，或其间任何合适的温度，例如约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃的温度或其间任何合适的温度和约3.0至约8.0的pH，或其间任何合适的pH，例如在约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0的pH，或其间任何合适的pH下进行。水解开始之前水解反应器中纤维素的最初浓度优选地为约0.1％(w/w)至约15％(w/w)或其间的任何合适的量，例如，约2％、约4％、约6％、约8％、约10％、约12％、约14％、约15％或其间的任何合适的量。
纤维素酶混合物的剂量可以为每克纤维素约0.1至约100mg蛋白质，或其间任何合适的量，例如每克纤维素约0.1、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100mg蛋白质或其间任何合适的量。水解可进行约0.5小时至约200小时的时间段，或其间任何合适的时间。例如，在一些实施方案中，水解进行约15小时至约100小时的时间段，或其间任何合适的时间，或其可进行约0.5小时、约1小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约15小时、约20小时、约25小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时、约50小时、约55小时、约60小时、约65小时、约70小时、约75小时、约80小时、约85小时、约90小时、约95小时、约100小时、约120小时、约140小时、约160小时、约180小时、约200小时或其间任何合适的时间。应理解，反应条件不意味着以任何方式限制本发明并可由本领域技术人员如所期望地调整。
在一些实施方案中，酶促水解通常在水解反应器中进行。酶混合物在将预处理的木质纤维素原料(也称为“基质”)加至水解反应器之前、期间或之后被加至基质。
在使纤维素材料与酶混合物接触的方法中，可根据本领域已知的多种方法的任一种调整多种环境条件以将水解产物例如葡萄糖的形成最大化。例如，温度、pH、％溶解氧和搅拌速度各自可被独立地调整。在一些实施方案中，酶混合物是如本文所述的无细胞混合物。
如本文所述的，使用具有减少的纤维二糖脱氢酶活性的酶混合物产生葡萄糖的方法导致比使用具有充分补充的纤维二糖脱氢酶活性的酶混合物的对应工艺更高的来自酶促水解的纤维素的葡萄糖产量。另外，这些方法导致酶水解产物中的减少的纤维二糖产物被转化成氧化产物。
在使用本文提供的遗传修饰的细胞和/或酶混合物的方法的一些实施方案中，可测量提高的葡萄糖产量并定量。如本文所述，葡萄糖产量可根据每理论最大葡萄糖产量所产生的葡萄糖的量或根据Gmax描述。本领域技术人员将理解，当计算理论值例如Gmax和理论最大葡萄糖产量时，计入了水解反应过程中添加到葡萄糖分子上的两个氢原子和一个氧原子的质量。例如，当“n”个葡萄糖单元的聚合物被水解时，(n-1)单位的水被添加至水解中形成的葡萄糖分子上，所以所产生的葡萄糖的重量比水解中消耗的纤维素的重量多约10％(例如，水解1g纤维素将产生约1.1g葡萄糖)。因此，作为举例，如果水解反应开始时存在5g总的可用纤维素，并且反应后剩余2g残余纤维素，则总的被水解的纤维素是3g纤维素。该反应条件下100％(w/w)的理论最大葡萄糖产量为约5.5g葡萄糖。Gmax基于反应中通过水解被释放或转化的3g纤维素计算。因此，在该实例中，100％(w/w)的Gmax为约3.3g葡萄糖。纤维素水平，基质中存在的总的可用量或未水解的或残余纤维素的量可通过本领域已知的多种合适的方法中的任何一种定量，例如通过IR光谱学或通过测量浓酸水解纤维素产生的葡萄糖的量(参见，例如美国专利第6,090,595和7,419,809号，其都被通过引用全文并入本文)。
例如，在一些实施方案中，纤维素含量通过酸水解纤维素，接下来是葡萄糖浓度的确定，计入水解纤维素所必需的水来确定(参见例如，美国专利第6,090,595和7,419,809号)。在一个实例中，离心原料的浆料，用水洗涤，并悬浮于净的硫酸浓度为70％的硫酸中。在40℃下孵育浆料30分钟，接下来在去离子水中稀释至2％硫酸。在该时间点，在121℃下对样品蒸汽高压灭菌1小时，以将低聚物转化成单体葡萄糖。葡萄糖浓度通过HPLC或任何合适的酶学测定测量。在一些替代实施方案中，纤维素含量通过如实施例1中描述的红外光谱学分析。例如，可洗涤固体并将其置于红外分光仪的检测晶体上并测量在500-4000cm-1之间的吸光度。
葡萄糖水平可通过本领域已知的多种合适的方法中的任何一种方法定量(参见例如，美国专利第6,090,595和7,419,809号)。例如，可使用基于葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的酶偶联测定确定葡萄糖浓度(参见例如，Trinder，Ann.Clin.Biochem.，6：24-27[1969]，其被通过引用全文并入本文)。另外的葡萄糖定量的方法包括色谱法(参见例如，美国专利第6,090,595和7,419,809号)。纤维二糖水平可通过本领域技术人员已知的多种合适的HPLC方法的任一种测量(参见，例如Kotiranta等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，81：81-90[1999])，其被通过引用全文并入本文)。
相似地，纤维二糖和葡萄糖产物向氧化产物例如纤维二糖内酯和葡萄糖内酯的转化的减少可通过本领域已知的多种合适的方法中的任何一种方法定量。例如，葡萄糖或纤维二糖氧化的产物可使用红外光谱学或通过色谱方法例如HPLC检测和定量(参见，例如Rakotomanga等人，J.Chromatog.B.，4：277-284[1991]；和Mansfield等人，Appl.Environ.Microbiol.，64：3804-3809[1997]，其都被通过引用全文并入本文)。因此，可将葡萄糖或纤维二糖的总的氧化，确定为例如每理论最大葡萄糖产量的总氧化产物的函数或Gmax的函数。
纤维素材料
包含纤维素的任何材料可用于本发明。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，第三是果胶。在细胞已经终止生长后产生的次生细胞壁还包含多糖并由与半纤维素共价交联的聚合木质素强化。纤维素是脱水纤维二糖的同聚物，因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括处于具有一系列取代基的复杂分支结构的多种化合物，诸如木聚糖、木糖葡聚糖、阿糖基木聚糖和甘露聚糖。尽管通常是多形的，纤维素在植物组织中主要作为平行的葡聚糖链的不溶性晶体基质出现。半纤维素通常以氢键键合于纤维素以及其他半纤维素，这帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于，例如，植物的茎、叶、壳(hull)、外壳(husk)和穗轴(cob)或树的叶、枝和木料中。纤维素材料可以是但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废料、废纸、和纸浆和造纸厂残余物(参见，例如Wiselogel等人，在Charles E.Wyman，(编辑)，Handbook on Bioethanol，Taylor & Francis，Washington D.C.[1995]，在第105-118页中；Wyman，Biores.Technol.，50：3-16[1994]；Lynd，Appl.Biochem.Biotechnol.，24/25：695-719[1990]；以及Mosier等人，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，65：23-40[1999])。应理解，在一些实施方案中，纤维素是木质纤维素形式，木质纤维素是在混合的基质中包含木质素、纤维素和/或半纤维素的植物细胞壁材料。在一些实施方案中，纤维素材料是木质纤维素。
预处理的木质纤维素原料是植物来源的材料，在预处理之前包含至少10％的纤维素(干重)，更优选地大于约30％的纤维素，甚至更优选地大于40％的纤维素，例如约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％，或其间任何合适的百分比，和至少约10％(干重)或至少约12％(干重)的木质素，并已被进行物理和/或化学处理以使纤维更易被纤维素酶所接近和/或更易接受纤维素酶的作用。在一些实施方案中，在预处理后木质纤维素原料可包含更高水平的纤维素。例如，如果采用酸预处理，则半纤维素组分被水解，这增加了纤维素的相对水平。在这种情况下，预处理的原料可包含大于约20％的纤维素和大于约12％的木质素。
可用于本发明的木质纤维素原料包括但不限于，农业残余物，诸如玉米秸秆、麦秆、大麦秆、稻草、燕麦秆、油菜秆、甘蔗秆和大豆秸秆；纤维工艺残余物，诸如谷物纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和废渣或甘蔗渣；林业残余物，诸如白杨木、其他硬木材、软木材和锯末；或草诸如柳枝稷、芒草、大米草和草芦。在一些实施方案中，木质纤维素原料首先通过包括但不限于以下的多种方法的任一种经受尺寸减少：碾磨、研磨、振荡、撕碎、压制/膨胀、和/或其他类型的机械作用。通过机械作用的尺寸减少可通过适应该目的的任何类型的设备进行，例如但不限于，锤式粉碎机。
预处理
在一些实施方案中，酶混合物的基质包括预处理的纤维素材料。因此，例如，在本文描述的一些方法中，本领域已知的任何预处理工艺可用于破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(参见例如，Chandra等人，Adv.Biochem.Engin.Biotechnol.，108：67-93[2007]；Galbe和Zacchi，Adv.Biochem.Engin.Biotechnol.，108：41-65[2007]；Hendriks和Zeeman，Biores.Technol.，100：10-18[2009]；Mosier等人，Biores.Technol.，96：673-686[2005]；Taherzadeh和Karimi，Int.J.Mol.Sci.，9：1621-1651[2008]；以及Yang和Wyman，Biofuels Bioprod.Bioref.Biofpr.2：26-40[2008]；其都被通过引用全文并入本文)。
在一些实施方案中，在预处理之前，使用本领域已知的多种适当方法的任一种对纤维素材料进行颗粒尺寸减少、预浸泡、湿化、洗涤、或调理。常规预处理包括但不限于，蒸汽预处理(带有或不带有爆破)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆破、氨纤维膨胀、稀氨预处理、有机溶剂预处理、和生物预处理。另外的预处理包括氨渗透、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧和γ辐射预处理。在一些实施方案中，纤维素材料在水解和/或发酵之前被预处理。在一些实施方案中，预处理优选地在水解之前进行。在一些替代性实施方案中，预处理与酶水解同时进行以释放可发酵糖类，诸如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在一些实施方案中，预处理步骤本身导致生物质向可发酵糖类的一些转化，即使不存在酶。
蒸汽预处理.在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁的组分，包括木质素、半纤维素、和纤维素以使纤维素和其他级分(例如，半纤维素)更易被酶接近。纤维素材料被传递到反应容器或穿过反应容器，在反应容器中注入蒸汽以将温度升高到所需的温度和压力并保持蒸汽于反应容器中，持续期望的反应时间。在一些实施方案中，蒸汽预处理优选地在约140℃至约230℃下进行，而在其他实施方案中，其在约160℃至约200℃下进行，而在另外的实施方案中，其在约170℃至约190℃下进行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任何添加。在一些实施方案中，蒸汽预处理的停留时间是约1至约15分钟，而在其他实施方案中，其为约3至约12分钟，且又在其他实施方案中，其为约4至约10分钟，其中最佳的停留时间取决于温度范围和化学催化剂的任何添加。蒸汽预处理允许相对高的固体负载，以致于在预处理过程中纤维素材料通常仅仅湿润。蒸汽预处理往往与预处理后对材料的爆破释放组合，其被称为蒸汽爆破，也就是，快速闪蒸至大气压和材料紊流以增加发酵可接触到的表面积(参见例如美国专利第4,451,648号；Duff和Murray，Biores.Biophys.，855：1-33[1996]；Galbe和Zacchi，Appl.Microbiol.Biotechnol.，59：618-628[2002]；以及美国专利申请公布第2002/0164730号，其都被通过引用全文并入本文)。蒸汽预处理期间，半纤维素的乙酰基被裂解并且所得的酸自动催化半纤维素部分水解成单糖和低聚糖。仅在有限程度上去除木质素。催化剂例如H2SO4或SO2(通常为约0.3至约3％的w/w)通常在蒸汽预处理前添加，这减少了时间和温度，增加了回收，并提高了酶促水解(参见例如，Ballesteros等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，129/-132：496-508[2006]；Varga等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，113-116：509-523[2004]；以及Sassner等人，Enz.Microb.Technol.，39：756-762[2006])
化学预处理：术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理工艺的实例包括，但不限于，稀酸预处理、稀碱预处理(参见例如，美国专利申请公布第2007/0031918和2007/0037259号)、石灰预处理、湿式氧化、氨纤维/冷冻爆破或膨胀(AFEX)、氨浸透(APR)、稀氨预处理以及有机溶剂预处理(参见例如，WO2006/110891、WO2006/11899、WO2006/11900和WO2006/110901)。
在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸，通常是H2SO4和水混合以形成浆料，蒸汽加热至期望温度，在停留时间后迅速变成大气压。稀酸预处理可用许多反应器设计进行(例如，活塞流动反应器、对流反应器或连续对流收缩床反应器)(参见例如，Duff和Murray，上文；Schell等人，Biores.Technol.，91：179-188[2004]；以及Lee等人，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，65：93-115[1999])。
在一些实施方案中，用碳酸钙、氢氧化钠或氨在约85℃至约150℃的低温以及约1小时至数天的停留时间进行石灰预处理(Wyman等人，Biores.Technol.，96：1959-1966[2005]；和Mosier等人，Biores.Technol.96：673-686[2005])。
湿法氧化是在添加氧化剂例如过氧化氢或超压的氧下，通常在约180℃至约200℃下进行约5至约15分钟的热预处理(参见例如，Schmidt和Thomsen，Biores.Technol.，64：139-151[1998]；Palonen等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，117：1-17[2004]；Varga等人，Biotechnol.Bioeng.，88：567-574[2004]；Martin等人，J.Chem.Technol.Biotechnol.，81：1669-1677[2006])。该预处理优选地在约1％至约40％的干物质、约2至约30％的干物质，或约5至约20％的干物质下进行，且通常初始pH值因加入碱例如碳酸钠而升高。在一些实施方案中，可使用称为湿法爆破(湿式氧化和蒸汽爆破的组合)的对湿法氧化预处理法的一种修改方案。这种方法可以处理最多至约30％的干物质。在湿法爆破中，预处理期间在特定停留时间后引入氧化剂。然后通过闪蒸至大气压结束预处理(参见例如，WO2006/032282)。
在一些实施方案中，可使用氨纤维膨胀(AFEX)。该方法包括在中等温度例如约90至约100℃和高压例如约17至约20巴下用液态或气态氨处理纤维素材料，持续约5至约10分钟，其中干物质含量可高达约60％(参见例如，Gollapalli等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，98：23-35[2002]；Chundawat等人，Biotechnol.Bioeng.，96：219-231[2007]；Alizadeh等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，121：1133-1141[2005]；和Teymouri等人，Biores.Technol.，96：2014-2018[2005])。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物被裂解。稀氨预处理利用了比AFEX更稀的氨溶液，并且可以在约100℃至约150℃的温度或其间任何合适的温度下进行(参见例如，美国专利申请公布第2007/0031918和2007/0037259号，本文通过引用将其全文并入)。在一些实施方案中，稀氨预处理的持续时间是约1至约20分钟，或其间任何合适的持续时间。
在一些实施方案中，可使用有机溶剂预处理。这种方法通过在约160℃至约200℃下，用乙醇水溶液(约40％至约60％的乙醇)萃取约30至约60分钟对纤维素材料脱木质(参见，例如Pan等人，Biotechnol.Bioeng.，90：473-481[2005]；Pan等人，Biotechnol.Bioeng.，94：851-861[2006]；以及Kurabi等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，121：219-230[2005])。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素被去除。
其他合适的预处理方法的实例是本领域已知的(参见例如，Schell等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，105：69-85[2003]；Mosier等人，Biores.Technol.，96：673-686[2005]；以及美国专利申请公布第2002/0164730号)。
在一些实施方案中，化学预处理优选地以酸处理进行，且更优选地以连续的稀酸处理和/或弱酸处理。酸通常是硫酸，但也可使用其它的酸，例如硝酸、磷酸、盐酸或其混合物。弱酸处理在约1至约5、或约1至约4、或约1至约3的pH值范围内进行。在一些实施方案中，酸浓度在从约0.01至约20wt％的酸的范围内，而在其他实施方案中，其在从约0.05至约10wt％的酸的范围内，在其他实施方案中，其在从约0.1至约5wt％的酸的范围内，且又在其他实施方案中，其在从约0.2至约2.0wt％的酸的范围内。使所述酸与纤维素材料接触并保持处于优选地约160℃至约220℃，且更优选地约165℃至约195℃范围内的温度下，持续从几秒到几分钟的时间(例如，约1秒至约60分钟)。
在一些实施方案中，预处理在含水浆料中进行。在一些实施方案中，预处理期间存在优选地约10至约80wt％、或约20至约70wt％、或约30至约60wt％之间、或约50wt％的量的纤维素材料。可不洗涤预处理的纤维素材料或使用本领域已知的任何合适的方法洗涤(例如，用水洗涤)。
物理预处理.物理预处理可包括高压和/或高温(蒸汽爆破)。在一些实施方案中，高压物理预处理包括约300至约600psi、或约350至约550psi、或约400至约500psi的范围内的压力、或约450psi的压力。在一些其他实施方案中，高温预处理包括使用约100℃至约300℃、或约140℃至约235℃的范围内的处理温度。在一些实施方案中，机械预处理以分批工艺在使用如上述定义的高压和高温的蒸汽枪水解器系统中进行(例如，Sunds水解器；Sunds Defibrator AB，Sweden)。
联合的物理和化学预处理.在一些实施方案中，可使用联合的物理和化学预处理。事实上，可物理地和化学地预处理纤维素材料。例如，在一些实施方案中，预处理步骤包括稀酸或弱酸处理和高温和/或高压处理。如期望的话，物理和化学预处理可以依次或同时进行。在一些另外的实施方案中，机械预处理也可以与物理和化学预处理联合使用。因此，在一些实施方案中，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理.在一些实施方案中，可使用生物预处理技术。在一些实施方案中，这些方法包括施加增溶木质素的微生物(参见例如，Hsu，inWyman(编辑)，Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Taylor& Francis，Washington，D.C.，在第179-212页[1996]；Ghosh和Singh，Adv.Appl.Microbiol.，39：295-333[1993]；McMillan，在Baker和Overend(编辑)，Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，ACS SymposiumSeries566，American Chemical Society，Washington，D.C.，第15章[1994]中；Gong等人，Adv.Biochem.Engineer.Biotechnol.，65：207-241[1999]；Olsson和Hahn-Hagerdal，Enz.Microb.Tech.，18：312-331[1996]；以及Vallander和Eriksson，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.42：63-95[1990])。
在一些实施方案中，随后从固体中分离从预处理工艺获得的可溶性化合物。例如，在一些实施方案中，分离步骤包括一种或多种标准的机械手段(例如，筛选、筛滤、离心或过滤)以实现分离。在一些其他实施方案中，预处理后未从固体中分离可溶性化合物。本领域技术人员理解，预处理可以作为分批、补料分批或连续工艺进行。还将应理解，如期望的话，预处理可在低、中或高固体稠度下进行(参见例如，WO2010/022511，其被通过引用全文并入本文)。
发酵
在一些实施方案中，本文所述的用于产生糖的方法还包括将所得到的糖发酵成终产物。发酵包括通过使用发酵生物体将糖源转化成终产物。任何合适的生物体可用在本发明中，包括适合用于产生所期望的终产物的细菌和真菌生物体(例如，酵母和丝状真菌)。尤其合适的发酵生物体能够将糖，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖直接或间接地发酵(即，转化)成期望的终产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体例如酵母。在一些实施方案中，可使用酵母菌株，包括但不限于下列属：属酵母属(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)和葡萄汁酵母(S.uvarum))；毕赤酵母属(例如，树干毕赤酵母(P.stipitis)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))；假丝酵母属(例如，产朊假丝酵母(C.utilis)、C.arabinofermentans、迪丹斯假丝酵母(C.diddensii)、C.sonorensis、休哈塔假丝酵母(C.shehatae)、热带假丝酵母(C.tropicalis)和博伊丁假丝酵母(C.boidinii))。其他发酵生物体包括但不限于发酵单胞菌属、汉森酵母属(例如，多形汉森酵母(H.polymorpha)和异常汉森酵母(H.anomala)、克鲁维酵母属(例如，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis))和裂殖酵母属(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株。
在一些实施方案中，发酵生物体是埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、发酵单胞菌属(例如，运动发酵单胞菌(Z.mobilis))、发酵杆菌属(Zymobacter)(例如，Z.palmae)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如，产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))、明串珠菌属(Leuconostoc)(例如，肠膜明串珠菌(L.mesenteroides))、梭菌属(例如，氨基丁酸梭菌(C.butyricum))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如，产气肠杆菌(E.aerogenes))和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)(例如，热厌氧杆菌属BG1L1[参见例如，GeorgievaheAhring，Appl.Microbiol，Biotech.，77：61-86]、产乙醇热厌氧杆菌(T.ethanolicus)、热解糖热厌氧杆菌(T.thermosaccharolyticum)或麦氏热厌氧杆菌(T.mathranii))、乳杆菌属(Lactobacillus)、谷氨酸棒杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidaisius)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。预期发酵生物体不限于这些特定的菌株，因为任何合适的生物体可用在本发明中。
发酵条件取决于期望的发酵产物并可由本领域普通技术人员容易地确定。在涉及通过酵母发酵乙醇的一些实施方案中，发酵通常持续约1小时至约120小时、或约12至约96小时之间。在一些实施方案中，发酵在约20℃至约40℃之间、或约26℃至约34℃之间、或约32℃的温度下进行。在一些实施方案中，发酵的pH是约pH3至约pH7，而在一些其他实施方案中，pH是约4至约6。
在一些实施方案中，酶水解和发酵在分开的容器中进行，以致于每个生物反应可在其各自的最佳条件下(例如温度)进行。在一些其他实施方案中，以同步糖化发酵(即“SSF”)反应，从纤维素产生葡萄糖的方法与发酵同时进行。在一些实施方案中，SSF通常在约28℃至约50℃、或约30℃至约40℃、或约35℃至约38℃的温度下进行，这是对大多数纤维素酶混合物为最佳的约50℃和对大多数酵母为最佳的约28℃至约30℃之间的折衷。但是，预期本发明不限于任何特定的温度，因为任何合适的温度可用在本发明中。
在一些实施方案中，用于产生葡萄糖的方法还包括将葡萄糖发酵成期望的终产物。预期本文提供的方法不限于任何特定的终产物的产生。在一些实施方案中，终产物包括燃料醇或前体工业化学品。例如，在一些实施方案中，发酵产物包括前体工业化学品，例如醇(例如，乙醇，甲醇和/或丁醇)、有机酸(例如，丁酸、柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸和/或葡糖酸)、酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如，H2和/或CO2)；抗微生物剂(例如青霉素和/或四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、和/或β-胡萝卜素)和/或激素。在一些实施方案中，终产物是燃料醇。合适的燃料醇是本领域中已知的且包括，但不限于低级醇如甲醇、乙醇、丁醇和丙醇。
糖水解性酶表达增加
在本文提供的一些实施方案中，真菌细胞还被遗传修饰以增加其对一种或多种糖水解性酶的生产。例如，在一些实施方案中，真菌细胞过表达编码糖水解酶例如β-葡糖苷酶的同源或异源基因。在一些实施方案中，所述一种或多种糖水解酶是本文所述的纤维素酶。例如，在一些实施方案中，所述酶是以下多种酶中的任何一种：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖内切酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖苷酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶和α-葡糖醛酸基酯酶和/或任何其他参与糖水解的酶。在一些实施方案中，真菌细胞被遗传修饰以增加β-葡糖苷酶的表达。因此，在一些实施方案中，真菌细胞包含用于增加编码β-葡糖苷酶的多核苷酸的表达的多核苷酸序列。在一些实施方案中，真菌细胞还被遗传修饰以缺失编码一种或多种内源性纤维二糖脱氢酶的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述糖水解性酶对于所述真菌细胞是内源性的，而在其他实施方案中，所述糖水解性酶对于真菌细胞是外源性的。在一些另外的实施方案中，酶混合物还包含对所述真菌细胞为异源性的糖水解性酶。更进一步地，在一些实施方案中，用于产生葡萄糖的方法包括使纤维素与包含对所述真菌细胞为异源性的糖水解性酶的酶混合物接触。
在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的多种合适的方法中的任何一种方法将真菌细胞遗传修饰以增加糖水解酶的表达。在一些实施方案中，编码水解性酶的多核苷酸序列适合在宿主真菌细胞中用于增加表达。如本文所用的，已适合用于表达的多核苷酸序列是已被插入到表达载体或以其他方式被修饰为包含宿主细胞中的多核苷酸表达所必需的调控元件，以允许该多核苷酸在该宿主细胞中表达的方式放置的多核苷酸序列。表达所需要的这些调控元件包括启动子序列、转录起始序列以及任选地，增强子序列。例如，在一些实施方案中，多核苷酸序列被插入到适合用于在真菌宿主细胞中表达的质粒载体中。
实验
以下实施例进一步详细地描述了本发明，所述实施例意在不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
在以下的实验公开内容中，应用了以下缩写：ppm(百万分之)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)、uM和μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um和μm(微米)；sec.(秒)；min(分钟)；h(小时)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(每分钟的转数)；℃(摄氏度)；wt％(重量百分比)；w.r.t.(关于)；DNA(脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；HPLC(高压液相色谱)；MS(质谱)；LC(液相色谱)；LC/MS(液相色谱/质谱)；LC/MS/MS(液相色谱/多级质谱)；HMF(羟甲基糠醛)；YPD(酵母提取物10g/L；蛋白胨20g/L；葡萄糖20g/L)；DCPIP(2，6-二氯苯酚吲哚苯酚)；CV(柱体积)；NREL(美国国家可再生能源实验室，Golden，CO)；ARS(ARS培养物保藏中心或NRRL培养物保藏中心，Peoria，IL)；Lallemand(Lallemand Ethanol Technology，Milwaukee，WI)；Cayla(Cayla-InvivoGen，Toulouse，France)；Agilent New Brunswick(New Brunswick Scientific Co.，Edison，NJ)；Sigma(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)；Eppendorf(EppendorfAG，Hamburg，Germany)；GE Healthcare(GE Healthcare，Waukesha，WI)；Bruker Optics(Bruker Optics，Inc.，Billerica，MA)；Specac(Specac，Inc.，Cranston，RI)；Invitrogen(Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)；Alphalyse(Alphalyse，Inc.，Palo Alto，CA)；Promega(Promega，Corp.，Madison，WI)；Sartorius(Sartorius-Stedim Biotech，SA，Aubagne，France)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，FI[Thermo Fisher Scientific的部分])，CalBiochem(CalBiochem，EMD Chemicals，Inc.，Gibbstown，NJ)；和Bio-Rad(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)。
来自嗜热毁丝霉(C1)的以下CDH序列可用在本发明中。SEQ ID NO：1和2分别提供CDH1的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3是CDH2的氨基酸序列，而SEQ ID NO：4是CDH3的氨基酸序列，SEQ ID NO：5是CDH4的氨基酸序列，SEQ ID NO：6是CDH5的氨基酸序列，SEQ ID NO：7是CDH6的氨基酸序列，且SEQ ID NO：8是CDH7的氨基酸序列。
CDH1：
atgaggacctcctctcgtttaatcggtgcccttgcggcggcactcttgccgtctgcccttgcgcagaacaacgcgccggtaaccttcaccgacccggactcgggcattaccttcaacacgtggggtctcgccgaggattctccccagactaagggcggtttcacttttggtgttgctctgccctctgatgccctcacgacagacgccaaggagttcatcggttacttgaaatgcgcgaggaacgatgagagcggttggtgcggtgtctccctgggcggccccatgaccaactcgctcctcatcgcggcctggccccacgaggacaccgtctacacctctctccgcttcgccaccggctatgccatgccggatgtctaccagggggacgccgagatcacccaggtctcctcctctgtcaactcgacgcacttcagcctcatcttcaggtgcgagaactgcctgcaatggagtcaaagcggcgccaccggcggtgcctccacctcgaacggcgtgttggtcctcggctgggtccaggcattcgccgaccccggcaacccgacctgccccgaccagatcaccctcgagcagcacgacaacggcatgggtatctggggtgcccagctcaactccgacgccgccagcccgtcctacaccgagtgggccgcccaggccaccaagaccgtcacgggtgactgcggcggtcccaccgagacctctgtcgtcggtgtccccgttccgacgggcgtctcgttcgattacatcgtcgtgggcggcggtgccggtggcatccccgccgccgacaagctcagcgaggccggcaagagtgtgctgctcatcgagaagggctttgcctcgaccgccaacaccggaggcactctcggccccgagtggctcgagggccacgaccttacccgctttgacgtgccgggtctgtgcaaccagatctgggttgactccaaggggatcgcttgcgaggataccgaccagatggctggctgtgtcctcggcggcggtaccgccgtgaatgccggcctgtggttcaagccctactcgctcgactgggactacctcttccctagtggttggaagtacaaagacgtccagccggccatcaaccgcgccctctcgcgcatcccgggcaccgatgctccctcgaccgacggcaagcgctactaccaacagggcttcgacgtcctctccaagggcctggccggcggcggctggacctcggtcacggccaataacgcgccagacaagaagaaccgcaccttctcccatgcccccttcatgttcgccggcggcgagcgcaacggcccgctgggcacctacttccagaccgccaagaagcgcagcaacttcaagctctggctcaacacgtcggtcaagcgcgtcatccgccagggcggccacatcaccggcgtcgaggtcgagccgttccgcgacggcggttaccaaggcatcgtccccgtcaccaaggttacgggccgcgtcatcctctctgccggtacctttggcagtgcaaagatcctgctgaggagcggtatcggtccgaacgatcagctgcaggttgtcgcggcctcggagaaggatggccctaccatgatcagcaactcgtcctggatcaacctgcctgtcggctacaacctggatgaccacctcaacaccgacactgtcatctcccaccccgacgtcgtgttctacgacttctacgaggcgtgggacaatcccatccagtctgacaaggacagctacctcaactcgcgcacgggcatcctcgcccaagccgctcccaacattgggcctatgttctgggaagagatcaagggtgcggacggcattgttcgccagctccagtggactgcccgtgtcgagggcagcctgggtgcccccaacggcaagaccatgaccatgtcgcagtacctcggtcgtggtgccacctcgcgcggccgcatgaccatcaccccgtccctgacaactgtcgtctcggacgtgccctacctcaaggaccccaacgacaaggaggccgtcatccagggcatcatcaacctgcagaacgccctcaagaacgtcgccaacctgacctggctcttccccaactcgaccatcacgccgcgccaatacgttgacagcatggtcgtctccccgagcaaccggcgctccaaccactggatgggcaccaacaagatcggcaccgacgacgggcgcaagggcggctccgccgtcgtcgacctcaacaccaaggtctacggcaccgacaacctcttcgtcatcgacgcctccatcttccccggcgtgcccaccaccaaccccacctcgtacatcgtgacggcgtcggagcacgcctcggcccgcatcctcgccctgcccgacctcacgcccgtccccaagtacgggcagtgcggcggccgcgaatggagcggcagcttcgtctgcgccgacggctccacgtgccagatgcagaacgagtggtactcgcagtgcttgtga(SEQ ID NO：1)
MRTSSRLIGALAAALLPSALAQNNAPVTFTDPDSGITFNTWGLAEDSPQTKGGFTFGVALPSDALTTDAKEFIGYLKCARNDESGWCGVSLGGPMTNSLLIAAWPHEDTVYTSLRFATGYAMPDVYQGDAEITQVSSSVNSTHFSLIFRCENCLQWSQSGATGGASTSNGVLVLGWVQAFADPGNPTCPDQITLEQHDNGMGIWGAQLNSDAASPSYTEWAAQATKTVTGDCGGPTETSVVGVPVPTGVSFDYIVVGGGAGGIPAADKLSEAGKSVLLIEKGFASTANTGGTLGPEWLEGHDLTRFDVPGLCNQIWVDSKGIACEDTDQMAGCVLGGGTAVNAGLWFKPYSLDWDYLFPSGWKYKDVQPAINRALSRIPGTDAPSTDGKRYYQQGFDVLSKGLAGGGWTSVTANNAPDKKNRTFSHAPFMFAGGERNGPLGTYFQTAKKRSNFKLWLNTSVKRVIRQGGHITGVEVEPFRDGGYQGIVPVTKVTGRVILSAGTFGSAKILLRSGIGPNDQLQVVAASEKDGPTMISNSSWINLPVGYNLDDHLNTDTVISHPDVVFYDFYEAWDNPIQSDKDSYLNSRTGILAQAAPNIGPMFWEEIKGADGIVRQLQWTARVEGSLGAPNGKTMTMSQYLGRGATSRGRMTITPSLTTVVSDVPYLKDPNDKEAVIQGIINLQNALKNVANLTWLFPNSTITPRQYVDSMVVSPSNRRSNHWMGTNKIGTDDGRKGGSAVVDLNTKVYGTDNLFVIDASIFPGVPTTNPTSYIVTASEHASARILALPDLTPVPKYGQCGGREWSGSFVCADGSTCQMQNEWYSQCL(SEQ ID NO：2)
CDH2：
MKLLSRVGATALAATLSLQQCAAQMTEGTYTDEATGIQFKTWTASEGAPFTFGLTLPADALEKDATEYIGLLRCQITDPASPSWCGISHGQSGQMTQALLLVAWASEDTVYTSFRYATGYTLPGLYTGDAKLTQISSSVSEDSFEVLFRCENCFSWDQDGTKGNVSTSNGNLVLGRAAAKDGVTGPTCPDTAEFGFHDNGFGQWGAVLEGATSDSYEEWAKLATTTPETTCDGTGPGDKECVPAPEDTYDYIVVGAGAGGITVADKLSEAGHKVLLIEKGPPSTGLWNGTMKPEWLESTDLTRFDVPGLCNQIWVDSAGIACTDTDQMAGCVLGGGTAVNAGLWWKPHPADWDENFPEGWKSSDLADATERVFKRIPGTSHPSQDGKLYRQEGFEVISKGLANAGWKEISANEAPSEKNHTYAHTEFMFSGGERGGPLATYLASAAERSNFNLWLNTAVRRAVRSGSKVTGVELECLTDGGFSGTVNLNEGGGVIFSAGAFGSAKLLLRSGIGPEDQLEIVASSKDGETFTPKDEWINLPVGHNLIDHLNTDLIITHPDVVFYDFYAAWDEPITEDKEAYLNSRSGILAQAAPNIGPMMWDQVTPSDGITRQFQWTCRVEGDSSKTNSTHAMTLSQYLGRGVVSRGRMGITSGLSTTVAEHPYLHNNGDLEAVIQGIQNVVDALSQVADLEWVLPPPDGTVADYVNSLIVSPANRRANHWMGTAKLGTDDGRSGGTSVVDLDTKVYGTDNLFVVDASVFPGMSTGNPSAMIVIVAEQAAQRILALRS(SEQ ID NO：3)
CDH3：
MKFLRKSDRGSVLGSTLFSLAFLFYSPPTAAQSPPPDGAVYDYIVIGSGPGGGVVGANLAKAGYSVLLLEAGDDSPGAGFGVYTPTVTWDFYVKHYPEGDPRDNQYSHLTWLTPDGRYWVGQSGAPEGSRLLGVYYPRGATLGGSSMINAMVVWLPNDSDWDYHAEVTGDDSWRAENMHKIFQKIEKNNYLPRGTANHGFDGWFQTQMGTMVQTNRTGPLQGNGVMTTYAQDWNLTIPMSDLLIRDPNEIGPDRDQTSSIYGQVSHQFANGNRYSSRHYVQDAVSSGANLTVSLTSLATRILFDTVTEPDSPRATGVEYLFGKSLYRGDRRRADGAIGVNRTAVARREVIVSGGAFNSPQLLLLSGIGNATELEALGIPVIRDLPGVGRNLMDNQEMPIVGTGSPGGGPGAVAGVAMYKTRHPAHGERDMFLFGGPGFLFRGFWPNEAVHLPDEPAQPVYGVSMVKGSSVNNGGWVKLRSRDPTDTPEINFNHYAVGAEYDLEAVKDTVAWIRSVYRRVGIATVEPPCARGPDENGYCGEEDEAWIHKQTFGHHPTSTNKIGADDDPTAVLDSKFRVRGVRALRVVDASAFARIPGVFPVVSTFMISQKASDDILAELEAESR(SEQ ID NO：4)
CDH4：
MGFLAATLVSCAALASAASIPRPHAKRQVSQLRDDYDFVIVGGGTSGLTVADRLTEAFPAKNVLVIEYGDVHYAPGTFDPPTDWITPQPDAPPSWSFNSLPNPDMANTTAFVLAGQVVGGSSAVNGMFFDRASRHDYDAWTAVGGSGFEQSSHKWDWEGLFPFFQKSVTFTEPPADIVQKYHYTWDLSAYGNGSTPIYSSYPVFQWADQPLLNQAWQEMGINPVTECAGGDKEGVCWVPASQHPVTARRSHAGLGHYADVLPRANYDLLVQHQVVRVVFPNGPSHGPPLVEARSLADNHLFNVTVKGEVIISAGALHTPTVLQRSGIGPASFLDDAGIPVTLDLPGVGANLQDHCGPPVTWNYTEPYTGFFPLPSEMVNNATFKAEAITGFDEVPARGPYTLAGGNNAIFVSLPHLTADYGAITANIRAMVADGTAASYLAADVRTIPGMVAGYEAQLLVLADLLDNPEAPSLETPWATSEAPQTSSVLAFLLHPLSRGSVRLNLSDPLAQPVLDYRSGSNPVDIDLHLAHVRFLRGLLDTPTMQARGALETAPGSAVADSDEALGEYVRSHSTLSFMHPCCTAAMLPEDRGGVVGPDLKVHGAEGLRVVDMSVMPLLPGAHLSATAYAVGEKAADIIIQEWMDKEQ(SEQ ID NO：5)
CDH5：
MELLRVSLAAVALSPLILFGVAAAHPTARSIARSTILDGADGLLPEYDYIIIGGGTSGLTVADRLTENRKRKFSRSPLPTSPARSSPAWCYSVLVLERGIFQNSSSVTTISGGSRGLFDPSLTFNINSVPQAGLDNRSIAVIGGLILGGSSGVNGLQVLRGQREDYDRWGSYFGPNSDWSWKGLLPYFKKAWNFHPPRPELVSQFDIKYDPSYWGNTSDVHASFPTTFWPVLKLEMAAFGDIPGVEYPPDSASGETGAYWHPASVDPATVLRSFARPAHWDNIEAARPNYHTLTGQRVLKVAFDGNRATSVVFVPANATDHSTARSVKAKKEIVLAAGAIHTPQILQASGVGPKQVLKEAGVPLVVDAPGVGSNFQDQPYVVAPTFNFTKFPFHPDFYDMILNQTFIAEAQAQFEKDRTGPHTIASGYCGSWLPLQIIAPNSWKDIARRYESQDPAAYLPAGTDETVIEGYRAQQKALARSMRSKQSAMYNFFLRGGYEEGSVVYLHPTSRGTVRINRSDPFFSPPEVDYRALSNPTDLEVLLEFTPFTRRYFLETRLKSLDPVELSPGANVTAPADIEAWLRSVMIPSSFHPIGTAAMLPRHLGGVVDENLLVYGVEGLSVVDASVMPDLPGSYTQQTVYAIAEKAADLIKSRA(SEQ ID NO：6)
CDH6：
MQVASKLVAVTGGALALWLHPVAAQEGCTNISSTETYDYIVVGSGAGGIPVADRLSEAGHKVLLIEKGPPSTGRWGGIMKPEWLIGTNLTRFDVPGLCNQIWADPTGAICTDVDQMAGCMLGGGTAVNAGLWWKPHPADWDVNFPEGWHSEDMAEATERVFERIPGTITPSMDGKRYLSQGFDMLGGSLEAAGWEYLVPNEHPDRKNRTYGHSTFMYSGGERGGPLATYLVSAVQREGFTLWMNTTVTRIIREGGHATGVEVQCSNSEAGQAGIVPLTPKTGRVIVSAGAFGSAKLLFRSGIGPKDQLNIVKNSTDGPSMISEDQWIELPVGYNLNDHVGTDIEIAHPDVVFYDYYGAWDEPIVEDTERYVANRTGPLAQAAPNIGPIFWETIKGSDGVSRHLQWQARVEGKLNTSMTITQYLGTGSRSRGRMTITRRLNTVVSTPPYLRDEYDREAVIQGIANLRESLKGVANLTWITPPSNVTVEDFVDSIPATPARRCSNHWIGTAKIGLDDGREGGTSVVDLNTKVYGTDNIFVVDASIFPGHITGNPSAAIVIAAEYAAAKILALPAPEDAAS(SEQ ID NO：7)
CDH7：
MASVDLDQPFDYIVVGGGTAGLVVANRLSEDSNVRVLVVEAGADRNADPLVLTPGLVAGLYGKDEYDWNFSSPPQPTLNNRRINQARGKMLGGTSGLNFMMLLYPSKGNIDSWAALGNPSWNYDALAPYLRKFATVHPSPQSARDLLGLTYIDESLAAGDGPIQVSHTDGHNVTNKAWLETFASLGLEVSTDPRDGKALGAFQNHASIDPATHTRSFAGPAYYTPDVAKRPNLVVLTETLVARVLFDTAGGEGDAVATGVEIITKDGQKKQVSACGEVILAAGALQSPQILELSGVGGRELLEKHNIPVVVDNPNVGEHVQDHPIVCQSFEVADGVPSGDVLRDPNVLQAVVGMYQSGGGAGPLGQSVISVAYTPLVDGSGVVSAEAKAELLARHESSFSTAEGKVLRDLVESPSEATFEFLLFPSQVDIPENPTSMAQYITPVLPENYISVMTFIHQPFSRGKVHITSPDIRAAPLWDPRYNSDPLDLELLARGVQFVERIVDSATPFGRVLKQGGKRQPPLRADDLETAREIVRQRQISVFHVSGSCTMRPRDQGGVVDERLRVYGTRGLRVVDASVFPIEPVGNIQSVVYAVAERAADLIKEDRAKA(SEQ IDNO：8)
实施例1
真菌菌株和方法
该实施例描述真菌菌株C1的变体的产生。
菌株命名
菌株CF-200(UV18#100fΔalp1)是衍生的C1菌株。菌株CF-400是C1菌株的衍生物(“UV18#100fΔalp1Δpyr5”)，通过缺失cdh1被进一步修饰，其中cdh1包含多核苷酸序列SEQ ID NO：1。来自这些菌株的纤维素分解性酶通过使用本领域公知的方法和合适的真菌生长培养基通过深层液体培养发酵产生。
GOPOD测定
GOPOD测定试剂盒(Sigma-Aldrich)被用于这些实验中测量所产生的葡萄糖的量。在这些实验中，将10ul的受试样品加至190ul由该试剂盒提供的GOPOD测定混合物中。允许反应物在50℃振荡30分钟。测量溶液在510nm处的吸光度以确定所产生的葡萄糖的量。计算与葡萄糖标准品(0-150克/升)相比这些样品的葡萄糖浓度。
实施例2
C1CDH1的纯化
在该实施例中，先使用旋转蒸发器将使用实施例1的方法制备的400mL C1上清液浓缩至140mL。然后，使用4根在线Hi-Prep26/10脱盐柱(in-line Hi-Prep26/10desalting column，GE Healthcare，17-5087-02)将63mL浓缩液缓冲液交换到20mM MOPS缓冲液pH7.0中。将所得的缓冲液交换的上清液(～150g/L总蛋白)上样到包含以20mM pH7.0MOPS缓冲液预先平衡的500mL DEAE Fast Flow树脂(GE Healthcare，17-0709-01)的柱。用1柱体积(CV)的20mM MOPS(pH7.0)清洗柱，然后运行0-300mM氯化钠梯度经过12柱体积。收集级分并由
Figure BDA00003133653100911
Bis-trisSDS-PAGE凝胶(Invitrogen，NP0322BOX)分析。对应CDH1的表观分子量的SDS-PAGE条带通过MS分析(由Alphalyse进行)。质量图谱分析证实后期洗脱的级分中CDH1的存在。汇集如由SDS-PAGE凝胶证明并由MS证实的包含CDH1的级分，并通过使用Sartorius离心机10kDa滤器(Sartorius-Stedim，VS2002)超滤来浓缩。然后，将10mL500mM哌嗪(pH5.6)和45mL饱和硫酸铵加入到45mL的包含CDH1的汇集物，并将所得的混合物上样到用50mM哌嗪，pH5.6中的1.6M硫酸铵预先平衡的Phenyl FF(high sub)16/10柱(GE Healthcare，28-9365-45)。50mM哌嗪，pH5.6中1.6M至0M硫酸铵的梯度运行经过30CV。收集级分并如上所述地对所选的级分进行SDS-PAGE凝胶分析，揭示在最后清洗步骤中洗脱的CDH1具有大约80-90％纯度。
CDH1活性使用类似由Schou等人(参见，Schou等人，Biochem J.，330：565-71[1998])所述的DCPIP还原检验测量。在透紫外光的平底96孔板中，将50μL包含CDH1的级分加到1.0g/L纤维二糖和100μM DCPIP在100mM乙酸钠，pH5.0中的150μL溶液中。在室温短暂地搅动样品，然后测量在530nm的吸光度(A530)10分钟。包含C1CDH1的级分展示在530nm的吸光度的快速下降。DCPIP检验使用不同量的葡萄糖或纤维二糖和纯化的CDH1进行。在96孔浅孔板中准备纤维二糖(1.0g/L至7.8mg/L)和葡萄糖(10g/L至78mg/L)的系列稀释物。然后，将20μL葡萄糖和纤维二糖标准品加到160μL/孔200mM DCPIP(在100mM pH5.0乙酸钠中)。反应通过加入20μL CDH1溶液来开始。监测在530nm的吸光度30分钟。在530nm的吸光度的减少速率的比较表明，C1CDH1对纤维二糖比对葡萄糖的活性大大约10倍。
实施例3
cdh1割裂标志物缺失构建体的制备
基因组DNA使用标准程序从C1菌株分离。简单地说，将菌丝接种物接种到生长培养基中并允许在35℃生长72小时。离心收集菌丝体块，洗涤，并加入50μL DNA提取缓冲液(200mM TRIS，pH8.0；250mMNaCl；125mM EDTA；0.5％SDS)。将菌丝体用锥形研磨器磨碎，用250μL提取缓冲液再次提取，并离心悬液。将上清液转移到包含300μL异丙醇的新试管中。离心收集DNA，用70％乙醇洗涤两次，并在100μL水中稀释。
cdh1基因侧翼的基因组DNA片段使用引物cf09067和cf09068(cdh1上游同源性)与引物cf09069和cf09070(cdh1下游同源性)克隆。PCR反应通过使用
Figure BDA00003133653100921
聚合酶(Promega)按照制造商的说明并使用0.2μM的每种引物进行。扩增条件是95℃2分钟，随后是95℃持续30秒、55℃持续30秒(对于上游同源性)或53℃持续30秒(对于下游同源性)、72℃持续1分钟的35个循环，和在72℃最终延伸5分钟。使用引物cf09024和cf09025(对于基因的5’部分)与cf09026和cf09027(对于基因的3’部分)从载体PCR扩增pyr5基因作为割裂标志物。PCR反应使用聚合酶(Promega)按照制造商的说明并使用0.2μM的每种引物进行。扩增条件是95℃2分钟，95℃持续30秒、53℃持续30秒、72℃持续1分钟的35个循环，和在72℃最终延伸5分钟。使用的引物显示在表3-1中。在分别的链重叠延伸反应中(参见，Horton等人，Meth.Enzymol.，217：270-279[1993])，将从引物cf09067和cf09068与引物cf09026和cf09027得到的PCR产物融合，对从引物cf09069和cf09070与引物cf09024和cf09025得到的PCR产物也如此。PCR反应通过使用Finnzymes的DNA聚合酶按照制造商的说明进行，包括3％DMSO并使用0.2μM的每种引物。扩增条件是98℃1分钟，98℃持续10秒、62℃持续20秒、72℃持续2分钟的35个循环，和在72℃最终延伸5分钟。链重叠延伸产物用于cdh1缺失。
Figure BDA00003133653100932
实施例4
转化方法
将C1细胞和衍生物菌株以106孢子/ml接种到500ml Erlenmeyer烧瓶中的100ml生长培养基中。在35℃，250rpm培养培养物48小时。为了收获菌丝体，将培养物滤经无菌Myracloth滤器(CalBiochem)并用100mL1700mosmol NaCl/CaCl2溶液(0.6M NaCl，0.27M CaCl2*H2O)洗涤。将洗涤的菌丝体转移到50ml试管中并称重。将Caylase(20mg/克菌丝体；Cayla)溶解于1700mosmol NaCl/CaCl2中并紫外灭菌90sec。然后，将3ml无菌Caylase溶液加入包含洗涤的菌丝体的试管中并混合。然后，将15ml1700mosmol NaCl/CaCl2溶液加入试管中并混合。在30℃，70rpm培养菌丝体/Caylase悬液2小时。通过滤经无菌Myracloth滤器到无菌50ml试管中来收获原生质体。将25mL冷STC(1.2M山梨糖醇，50mM CaCl2*H2O，35mM NaCl，10mM Tris-HCl)加入流通液(flow through)并在4℃以2720rpm离心10min。将小团重悬在50mL STC中并再次离心。在洗涤步骤后，将小团重悬在1mL STC中。
然后，将2μg每一条链重叠延伸产物的DNA移液到15mL无菌试管的底部并加入1μL金精三羧酸和100μl原生质体悬液。混合这些内容物并将原生质体与DNA在室温下孵育25min。然后，加入1.7mL PEG4000溶液(60％PEG4000；聚乙二醇，平均分子量4000道尔顿)、50mMCaCl2·H2O、35mM NaCl、10mM Tris-HCl)并充分混合。将溶液保持在室温下20分钟。用STC填充管，混合，并在4℃下以2500rpm离心10min。倒出STC，并将沉淀重悬于剩余的STC中并铺板到最小选择性培养基平板上。在35℃下孵育平板5天。对菌落再划线并检查cdh1的缺失；具有该缺失的菌落被命名为菌株“CF-400”。
实施例5
CDH1缺失的确认
如实施例3中所描述的制备基因组DNA。通过使用
Figure BDA00003133653100941
聚合酶(Promega)根据制造商的说明使用0.2uM的每种引物(引物cf09112和cf09113)进行PCR反应。扩增条件为95℃持续2分钟，95℃持续30秒、54℃持续30秒、72℃持续30秒的35个循环和最终在72℃下延伸5分钟。还使用引物cf09110和cf09111和
Figure BDA00003133653100942
聚合酶(Promega)根据制造商的说明使用0.2uM的每种引物进行PCR。扩增条件为95℃持续2分钟，95℃持续30秒、55.4℃持续30秒、72℃持续30秒的35个循环和最终在72℃下延伸5分钟。这些引物被用于单独的PCR反应以确认不存在cdh1基因。在PCR中使用引物cf09181和cf09091以确认合适的连接结构和pyr5标志物构建体的靶向(参见，表5-1)。通过使用聚合酶(Promega)根据制造商的说明使用0.2uM的每种引物进行PCR反应。扩增条件为95℃持续2分钟，95℃持续30秒、54.4℃持续30秒、72℃持续3分30秒的35个循环和最终在72℃下延伸5分钟。在琼脂糖凝胶上对PCR产物电泳以确认指示cdh1缺失的条带模式。
Figure BDA00003133653100951
使用二氯苯酚吲哚苯酚(DCPIP)比色测定测试CF-400中cdh1的缺失。通过观察与亲本菌株相比减少的还原DCPIP底物的能力确定cdh1的缺失。培养亲本C1菌株和推定的缺失cdh1的菌株的细胞并测试上清液的DCPIP活性。在这些测试中，在微量滴定板中合并160μL的新鲜制备的DCPIP试剂溶液(溶于100mM乙酸钠，pH5.0的0.2mM DCPIP)、20μL纤维二糖溶液(溶于去离子水的1g/L纤维二糖)和20mL的未稀释的细胞上清液。立即以动力学模式测量随时间推移溶液在530nm下的吸光度30分钟，以追踪由DCPIP还原引起的吸光度的损失。在SDS-PAGE上对来自显示出减少的还原DCPIP底物的能力的菌株的上清液电泳以确认不存在CDH1。使用标准操作方法通过SDS-PAGE分离来自CF-400和未转化的亲本菌株的深层液体培养发酵的培养上清液的蛋白质。按照制造商的说明通过用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen)染色观察蛋白质。在未转化的亲本菌株中观察到Cdh1蛋白为～90kD的条带但是CF-400中不存在。
实施例6
玉米秸秆的水解
在这些实验中，用氢氧化铵水溶液将酸预处理的玉米秸秆(NREL)的pH值调整到5.0。该材料为41.3％的固体，具有58.7％的水分含量。固体中的葡聚糖含量为40.7％。将酸预处理的玉米秸秆加样到96孔板并用乙酸钠缓冲液，用pH5下的128mM乙酸钠稀释至每孔110μL的平均体积。所有实验中的总固体负载为24.7％，并且葡聚糖的浓度为100g葡聚糖/kg反应物。以3g纤维素酶/kg反应物使用CF-200和CF-400的酶上清液。由于基质中游离葡萄糖的存在，还在96孔板中运行一组其中使用水代替酶用作对照的孔。从最终测量的葡萄糖浓度中减去该对照的水平。一旦加入了所有的反应组分就将平板密封，并将其放置在55℃的振荡器中在950rpm下旋转73小时。在反应结束时，允许平板冷却。取出样品，稀释，并随后通过GO测定试剂盒(Sigma)分析以确定葡萄糖的产生。图2中提供了结果。如所表明的，CF-200上清液产生52.1g/L的葡萄糖，而CF-400上清液产生69.4g/L的葡萄糖。CF-400上清液表现出更高的糖化性能，表明cdh1基因的缺失减少了糖化反应期间由葡萄糖形成的葡糖酸。
虽然已例示并描述了本发明的特定实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，可进行多种其他改变和修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，预期本发明将所有这些改变和修改包括在本发明的范围内。
本文已经广泛和概括地描述了本发明。落在该总的公开内容(thegeneric disclosure)中的每一个更窄的个体(species)和下级分类(subgeneric)分组也形成本发明的一部分。可适宜地在没有本文未特别公开的任何一个元件或多个元件、任何一个限值或多个限值存在下实践本文描述的发明。已被采用的术语和表述被用作描述性术语而不是限制性的。意图这些术语和表述的使用不排除所描述和/或展示的特征或其部分的任何等价物，但是应认识到在所要求保护的发明的范围内，多种修改是可能的。因此，应理解，虽然已通过一些优选的实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可利用对本文公开的概念的修改和改变，并且这些修改和改变被认为落在本发明的范围内。

Claims (29)

1.一种真菌细胞，所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞分泌的内源性纤维二糖脱氢酶活性的量，其中所述真菌细胞来自科毛壳菌科(Chaetomiaceae)，其中所述细胞包含纤维二糖脱氢酶1(cdh1)基因的缺失。
2.如权利要求1所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞是毁丝霉属(Myceliophthora)的物种。
3.如权利要求1或2所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏所述纤维二糖脱氢酶的分泌信号肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少由所述细胞表达的内源性纤维二糖脱氢酶的量。
5.如权利要求4所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中的翻译起始序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以将移码突变引入到编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的转录子中。
7.如权利要求1-6中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的基因的转录水平。
8.如权利要求7所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以破坏编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的基因的启动子。
9.如权利要求1-8中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以至少部分地缺失编码所述内源性纤维二糖脱氢酶的基因。
10.如权利要求1-9中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞已被遗传修饰以减少所述内源性纤维二糖脱氢酶的催化效力。
11.如权利要求10所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞的所述纤维二糖脱氢酶的活性位点中的一个或多个残基已被遗传修饰。
12.如权利要求1-11中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞的所述纤维二糖脱氢酶的血红素结合结构域中的一个或多个残基已被遗传修饰。
13.如权利要求1-12中任一项所述的真菌细胞，其中所述纤维二糖脱氢酶包含与SEQ ID NO：2至少约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列。
14.一种酶混合物，包含两种或更多种纤维素水解性酶，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由权利要求1-13中任一项所述的真菌细胞表达。
15.如权利要求14所述的酶混合物，其中所述酶混合物是无细胞混合物。
16.如权利要求14-15中任一项所述的酶混合物，其中所述酶混合物的基质包含预处理的木质纤维素。
17.如权利要求16所述的酶混合物，其中所述预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和有机溶剂萃取的处理方法处理的木质纤维素。
18.一种用于产生葡萄糖的方法，包括使至少一种纤维素基质与包含两种或更多种纤维素水解性酶的酶混合物接触，其中所述两种或更多种纤维素水解性酶的至少一种由权利要求1-13中任一项所述的真菌细胞表达。
19.一种用于产生葡萄糖的方法，包括使至少一种纤维素基质与权利要求14-17中任一项所述的酶混合物接触。
20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，其中所述酶混合物是无细胞混合物。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述纤维素基质是预处理的木质纤维素。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述预处理的木质纤维素包含通过选自酸预处理、氨预处理、蒸汽爆破和有机溶剂萃取的处理方法处理的木质纤维素。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，还包括将所述葡萄糖发酵成终产物。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述终产物是燃料醇或前体工业化学品。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述燃料醇是乙醇或丁醇。
26.如权利要求1-13任一项所述的真菌细胞、权利要求14-17中任一项所述的酶混合物和/或权利要求18-25中任一项所述的方法，还包含对所述真菌细胞为同源或异源的纤维素降解酶。
27.一种发酵培养基，包含权利要求1-13或26中任一项所述的真菌细胞。
28.一种发酵培养基，包含权利要求14-17中任一项所述的酶混合物。
29.一种发酵培养基，包含权利要求1-13或26中任一项所述的真菌细胞和/或权利要求14-17中任一项所述的酶混合物。
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