CN103163106B - 一种基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，包括以下步骤：1)将第一激光光束投射到待测样品上，待测样品中的粒子由基态激活至激发态；2)用STED光消耗步骤1)中处于激发态的粒子的数量；3)用于第二激光光束激发剩余的粒子发出荧光，并收集荧光得到相应的荧光强度图像；4)第二激光光束和STED光之间设有延迟，改变延迟时间，重复步骤3)，得到不同延迟时间下的荧光强度图像；5)通过计算机对不同延迟时间下的荧光强度图像进行处理，并拟合光点强度衰减规律，反演寿命图像，完成对待测样品一点的扫描6)通过改变光束投射到待测样品上的位置，完成对待测样品的二维扫描。本发明还公开了一种用于实施上述方法的装置。
Description
技术领域
本发明属于荧光寿命成像领域，特别涉及一种基于受激发射损耗的在超分辨下长距离探测荧光寿命成像的方法和装置。
背景技术
荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到激发态后由激发态回到基态时所发生的。而荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间，荧光物质的荧光寿命一般来说是绝对的，不受激发光强度、荧光团强度和光漂白等因素的影响，而仅和细胞自身的结构和其所处的微环境有关。因此，测量样品荧光寿命的荧光寿命成像显微术(FLIM)，可以提供诸多重要的生物信息，比如细胞质基质粘度，pH值，细胞代谢等。
测量荧光寿命的方法主要有时域法，频域法和泵浦探测法。时域法是用超短脉冲光激发样品，测量样品在光脉冲激发后荧光强度的衰减规律，最后根据所测得的样品中各点的荧光强度衰减曲线来拟合分析并计算荧光寿命值。频域法是用强度按正弦规律调制的激光激发样品，荧光强度按正弦调制，且两者调制频率相同，通过测量荧光相对于激发光的相位差及解调系数来计算荧光寿命值。然而无论是时域法还是频域法都是分析样品自发辐射所产生的荧光，由于其方向的不确定性，因此需要较高数值孔径的光学系统以便有效的收集荧光信号。而泵浦探测方法则是在一束激光激发样品的同时用另一束激光照射，收集样品通过受激发射作用所产生的荧光，由于其具有高方向性，因此不会受限于光学系统的数值孔径和工作距离。
然而，受光学衍射极限的限制，传统荧光寿命成像方法的空间分辨率只有200纳米左右，难以满足科学研究的需要。本发明在泵浦探测法的基础上提出了一种基于受激发射损耗的荧光寿命成像方法和装置，实现了在超分辨下长距离探测荧光寿命。
发明内容
本发明提供了一种基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法和装置，装置结构简单，易于操作，荧光寿命成像系统的空间分辨率和信噪比显著改善，实现了超分辨下长距离探测荧光寿命，可用于光学显微领域以及高通量生化分析，组织鉴别，胞内生理学等领域。
一种基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，包括以下几个步骤：
1)将第一激光光束投射到待测样品上，待测样品中的粒子由基态激活至激发态；
2)用STED光投射到待测样品上，消耗步骤1)中处于激发态的粒子的数量；
3)将第二激光光束投射到荧光样品上，激发剩余的处于激发态的粒子发出荧光，并收集所述荧光得到相应的荧光强度图像；
4)第二激光光束和STED光之间设有延迟，改变延迟时间，重复步骤3)，得到不同延迟时间下的荧光强度图像；
5)通过计算机对不同延迟时间下的荧光强度图像进行处理，并拟合光点强度衰减规律，反演寿命图像，完成对待测样品一点的扫描；
6)通过改变第一激光光束、STED光和第二激光光束聚焦到待测样品上的位置，完成对待测样品的二维扫描。
本发明的待测样品可以为荧光样品，也可以为非荧光样品；待测样品为荧光样品时，荧光样品中的荧光染料分子在激光作用下发出荧光，若待测样品为非荧光样品，非荧光样品中的粒子在第一激光光束的作用下由基态跃迁至激发态，处于激发态的粒子在第二激光光束的作用下发出荧光。
第一激光光束、STED光、和第二激光光束并不是同时入射到待测样品上，第一激光光束和STED光以及STED光和第二激光光束之间均设有延迟时间。
通过改变光束投射到待测样品中的位置来完成对待测样品的二维扫描。可以将待测样品放置在纳米平移台上通过计算机控制纳米平移台在垂直光轴面移动，完成对待测样品的二维扫描；还可以在光源和样品之间设置二维扫描振镜，通过改变激光在待测样品上的聚焦位置，来完成对待测样品的二维扫描。
所述第一激光光束和第二激光光束投射在待测样品上形成大小相同的圆形光斑，所述STED光投射到待测样品上形成环形光斑，且圆形光斑和环形光斑的中心重合。STED光用于减少处于激发态的粒子的数量，减小待测样品的发光荧光的衍射面积，提高荧光寿命成像的分辨率。
本发明还提供了一种用于实施上述超分辨荧光寿命成像方法的装置，包括：
分别用于发出第一激光光束、STED光和第一激光光束的第一光源、第二光源和第三光源；
用于放置待测样品的样品台；
用于收集待测样品发出荧光的光强信息图像的探测器；
以及用于对所述光强信息图像进行处理分析的计算机。
设有用于将第一光源、第二光源和第三光源发出的光束聚焦到待测样品上的第一物镜，以及用于收集待测样品发出荧光的第二物镜。
第一光源、第二光源和第三光源通过计算机控制，第一光源、第二光源和第三光源开启时具有一定的时间差，使得三个光源发出的光束之间存在延迟。第一激光光束和STED光之间延迟为1ns，STED光和第二激光光束之间的延迟为1～10ns。
所述第三光源和样品台之间设有电光调制器，用于改变光的相位。
所述探测器为光电倍增管，其可将微弱光信号通过光电效应转变成电信号。
在实际的分析过程中，常需要对待测样品进行扫描，提取待测样品的二维扫描图像，完成对待测样品的分析，可以通过改变光束在待测样品上的聚焦位置完成对待测样品的扫描，也可以通过移动待测样品来完成对待测样品的扫描。
设有用于对待测样品进行扫描的二维扫描振镜，该二维扫描振镜受所述计算机控制，二维扫描振镜用于改变光束在待测样品上的聚焦位置。
所述样品台为纳米平移台，该纳米平移台受所述计算机控制，计算机控制纳米平移台在垂直光轴面上移动，完成光束对待测样品的扫描。
所述样品台和探测器之间设有滤波片，该滤波片用于过滤荧光中的杂散光，过滤片仅允许第二束激光所激发的荧光波段通过，提高成像分辨率。
本发明的原理如下：
本发明将受激发射损耗(STED)技术应用于荧光寿命成像系统中，在第一束激光激活待测样品粒子的同时，用另一激光器发射一束紧挨着入射到待测样品中形成环形光斑，波长较长的STED光照射处于激发态的待测样品的离子，通过受激发射损耗过程消耗所照区域处于激发态的粒子，这样在第三束激光照射处于激发态的粒子发出荧光的时候，就能够有效减少荧光光点的衍射面积，从而显著的提高荧光寿命图像的分辨率。同时由于荧光是通过受激发射作用所产生的，具有高方向性，这样可以有效增加样品与物镜之间的距离，从而实现长距离下的超分辨荧光寿命成像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)空间分辨率显著提高，打破光学衍射极限的限制，实现超分辨荧光寿命成像；
(2)与现有的荧光寿命成像方法相比，能够实现长距离的荧光寿命成像。
附图说明
图1为本发明针对荧光样品的基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像装置。
图2为本发明的第一光源、第二光源和第三光源所发射光束的光斑形状。
图3本发明理想的单指数荧光衰减曲线。
具体实施方式
如图1所示，一种基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像装置，包括：第一激光器1，第二激光器2，第三激光器3，电光调制器4，第一双色镜5，第二双色镜6，第三双色镜7，第一物镜8，纳米平移台9，样品10，第二物镜11，滤波片12，光电倍增管13，计算机14。
本发明所采用的光源为激光器，因此，第一光源、第二光源和第三光源分别对应为第一激光器1、第二激光器2和第三激光器3。
第一激光器1、第二激光器2和第三激光器3通过计算机14控制，使第一激光器1、第二激光器2和第三激光器3开启具有一定的时间差，使得第一激光光束、STED光和第二激光光束入到待测样品上时，具有一定的延迟时间。
电光调制器4用于对第三激光器发出第二激光光束进行相位调制。第一双色镜5，第二双色镜6，第三双色镜7分别用于改变第一激光光束、STED光和第二激光光束的光路，使三束激光的光路同轴。第一双色镜5用于改变第一激光光束的光路，且使STED光和第二激光光束透过；第二双色镜6用于改变STED光的光路，并使第二激光光束透过；第三双色镜7用于改变第二激光光束的光路。
第一激光光束、STED光和第二激光光束同轴入射到第一物镜8，第一物镜8将三束激光聚焦到待测样品上。如图2所示：第一激光光束入射到待测样品上形成圆形光斑，为A图所示；STED光在待测样品上形成环形光斑，为B图所示；第二激光光束在待测样品上形成圆形光斑，为C图所示；三个光斑的中心重合。
待测样品发出的荧光被第二物镜11收集，并由滤波片12滤去杂散光，仅允许第二束激光所激发的荧光波段通过。
光电倍增管13将荧光信号转换为电信号，用于采集由滤波片12出射的荧光强度图像。纳米平移台9由计算机控制，纳米平移台在垂直光轴面移动，该变光束聚焦在待测样品上的位置，完成对待测样品的扫描。
采用图1所示的装置实现针对荧光样品的基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，其过程如下：
(1)第一激光器1发射出第一激光光束，经第一双色镜5全部反射，再经第一物镜8聚焦到待测样品10的表面，激活待测样品10中的荧光分子；
(2)开启第二激光器2，第二激光器2和第一激光器1之间具有1ns级别的延迟时间，第二激光器2发射出STED光，经第二双色镜6全部反射，再经所述第一双色镜5全部透射，最后经所述第一物镜8聚焦到待测样品10表面，通过受激发射作用消耗所照区域荧光染料分子激发态的粒子；
(3)开启第三激光器3，第三激光器3相对第二激光器2的延迟时间为1～10ns，第三激光器3发射出光束，经电光调制器14调制，得到调制激光；所述调制激光经第三双色镜7全部发射，再经第二双色镜6和第一双色镜5全部透射，最后经所述第一物镜8聚焦到待测样品10表面，激发样品荧光染料分子激发态剩余的粒子发出荧光；
(4)待测样品10发出的荧光被第二物镜11所收集，再经滤波片12过滤非信号光波段，最后被光电倍增管13所接收，得到荧光光强图像；
(5)维持第一激光器1和第二激光器2之间的延迟时间不变，改变第三激光器3与第二激光器2之间的延迟时间，重复步骤(1)至步骤(4)，得到不同延迟时间下的荧光光强图像；
(6)光电倍增管13将数据传给计算机14，计算机14处理数据，拟合光点强度衰减规律，反演寿命图像，完成一点扫描；
(7)待测样品10所在纳米平移台9与计算机14相连，通过计算机14来控制纳米平移台9使样品10在垂直光轴面内移动完成二维扫描成像。
图3为理想的单指数荧光衰减曲线，在激发光E(t)的作用下，荧光团发射荧光，其荧光强度F(t)与时间t的关系可表示为：
F(t)＝F0exp(-t/τ)
公式中F0为最大荧光强度，τ为荧光寿命。第二激光光束与STED光之间有延迟，粒子在高能级上由于驰豫振荡，自发发射等作用的影响，当延迟时间不同时，第二激光光束所激发的荧光光强是不同的，通过改变延迟时间，探测器可接收到不同延迟时间下的荧光强度图像，计算机对不同延迟时间下的荧光强度图像进行处理，拟合光点强度衰减规律，反演得到待测样品的荧光寿命图像。
Claims (10)
1.一种基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
1)将第一激光光束投射到待测样品上，待测样品中的粒子由基态激活至激发态；
2)用STED光投射到待测样品上，消耗步骤1)中处于激发态的粒子的数量；
3)将第二激光光束投射到待测样品上，激发剩余的处于激发态的粒子发出荧光，并收集所述荧光得到相应的荧光强度图像；
4)第二激光光束和STED光之间设有延迟，改变延迟时间，重复步骤3)，得到不同延迟时间下的荧光强度图像；
5)通过计算机对不同延迟时间下的荧光强度图像进行处理，并拟合光点强度衰减规律，反演寿命图像，完成对待测样品一点的扫描；
6)通过改变第一激光光束、STED光和第二激光光束聚焦到待测样品上的位置，完成对待测样品的二维扫描。
2.如权利要求1所述的基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，其特征在于，所述的待测样品放置在纳米平移台上，通过计算机控制纳米平移台在垂直光轴面移动，完成对待测样品的二维扫描。
3.如权利要求2所述的基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，其特征在于，所述第一激光光束和第二激光光束投射在待测样品上形成大小相同的圆形光斑。
4.如权利要求3所述的基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，其特征在于，所述STED光投射到待测样品上形成环形光斑。
5.如权利要求4所述的基于受激发射损耗的超分辨荧光寿命成像方法，其特征在于，所述圆形光斑和环形光斑的中心重合。
6.一种用于实施权利要求1所述超分辨荧光寿命成像方法的装置，其特征在于，包括：
分别用于发出第一激光光束、STED光和第二激光光束的第一光源、第二光源和第三光源；
用于放置待测样品的样品台；
用于收集待测样品发出荧光的光强信息图像的探测器；
以及用于对所述光强信息图像进行处理分析的计算机。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述第三光源和样品台之间设有电光调制器。
8.如权利要求6所述的装置，其特征在于，还设有用于对待测样品进行扫描的二维扫描振镜，该二维扫描振镜受所述计算机控制。
9.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述样品台为纳米平移台，该纳米平移台受所述计算机控制。
10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述样品台和探测器之间设有滤波片。
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