CN103146789A - 一种胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种胶原蛋白的制备方法，其通过创造性的使用了蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为酶法制备胶原蛋白的酶原，其水解效率显著提高，本发明中还通过在制备环节中添加使用超滤技术，使酶解产物分离彻底，胶原蛋白分子量均匀分布，分子量小，活性高，更易于人体吸收；本发明一种胶原蛋白的制备方法的整个工艺过程条件温和，对环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性物质的制备发明，特别是指一种胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是人体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的三分之一，约占人体重量的6％．它是结缔组织的主要组成部分，主要以胶原纤维的形式存在，主要存在于皮肤、肌肉、骨骼、牙齿、内脏(如胃、肠、心脑、血管与食道)与眼睛等部位．胶原蛋白具有美容(抗皱、保湿、塑身)、保障运动系统(骨骼、肌肉和关节)和心脑血管系统健康、调控内分泌、养护脏器、提高人体免疫力等多重功效．另外，因为胶原蛋白还具有良好的生物相容性、营养性、修复性、保湿性、配伍性和亲和性，所以可被广泛应用于生物医学材料、化妆品、食品及保健品等功能性产品中胶原蛋白与肌体的生长、衰老和疾病有着极其密切的联系，是可以护佑人一生的重要营养物质．
蛋白质水解产物的生产方式通常有两种：化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质的方法。酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应，反应强烈，设备腐蚀严重，水解彻底，得到的多肽分子质量分布不均匀，色氨酸完全被破坏，该法目前已逐渐被淘汰；碱法水解会因为不对称碳原子经过中间状态的过度阶段，发生消旋现象，即产生D型和L型的等摩尔混合物，使氨基酸大多消旋，其中，D-型氨基酸不能作为有效的氨基酸源，有些还具有毒性甚至有致癌、致畸和致突变作用。20世纪80年代，随着酶制剂工业和食品工业的迅猛发展，人们发现酶法水解反应条件温和，反应时间短，无环境污染，产品营养价值高，产物以多肽和L型游离氨基酸为主，易于人体消化吸收，因而利用酶水解胶原蛋白逐渐受到了人们的重视。
能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1398、放线菌166等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，除此之外，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决定能否得到目标产物的一个关键因素，目前已知的关于制备胶原蛋白的酶种类也挺多，但是其水解效率普遍不是很高，因此，在水解效率上，还需要发现一种新的酶以进一步提高。
蚯蚓丝氨酸蛋白酶是从蚯蚓体内提取得到的一种酸性蛋白酶，属于胰蛋白酶，它能水解蛋白质底物（如酪蛋白），碱性氨基酸的酯及酰胺。PI3-4；20-50℃范围稳定；是一种糖蛋白酶类。
蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为一组蛋白水解酶，对其酶学性质的研究还不够深入。多数蚯蚓丝氨酸蛋白酶组分受3种丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮、N-对甲苯磺酰赖氨酰氯甲基酮的抑制，但不同组分对不同种类的蛋白酶抑制剂的敏感性存在差异；蚯蚓丝氨酸蛋白酶直接切割纤溶酶原及降解纤维蛋白原是其同时具有激酶和纤溶酶活性的分子基础；对不同合成底物具有专一性说明其具有不同活性中心；蚯蚓丝氨酸蛋白酶能对组织纤溶酶原激活剂(t-P A)的专一性底物S-2288有水解作用，说明其对纤溶酶原的激活方式与t-P A相似。
发明内容
本发明提出一种胶原蛋白的制备方法，提高了水解的效率，产物得率更高，同时得到的肽的含量更高，并且产物分离更加彻底，活性高。
本发明的技术方案是这样实现的：一种胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：将制备胶原蛋白的原料清洗干净，然后使用3‰-10‰的碱性溶液进行浸泡10-20min，再把原料清洗至中性，晾干待用；
（2）称取一定量的预处理后的原料，按照物料比1:3(w/v)-1:4(w/v)加入纯化水，80-85℃灭菌30-40min，冷却至40℃；
（3）按称取预处理后的原料重量的0.5-2‰加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶；
（4）酶解工艺控制：通过缓冲溶液使得PH控制在6.0-7.8的范围内，37-42℃保温水解6-7h，80-85℃灭活30min，然后离心过滤，取过滤清液；
（5）使用截留分子量为6000的超滤设备进行超滤，并补加纯化水使超滤更加完全，取透出液；
（6）将透出液进行干燥，得到胶原蛋白。
优选的，步骤（1）中，所述碱性溶液为5‰的NaOH溶液。
优选的，步骤（2）中，灭菌温度为80℃30min，温度过高容易导致蛋白质变性，降低成品的价值。
优选的，步骤（3）中，加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶的量为称取预处理后的原料重量的1‰。
优选的，步骤（4）中，PH控制在6.5，保温水解的温度为40℃，水解时间6.5小时，灭活温度为80℃。
优选的，步骤（5）中，所述超滤设备为中空纤维膜或者卷式膜或者管式膜或者陶瓷膜，当然，可用的超滤设备并不限于此，只要能达到同样效果的超滤设备，均可以使用。
优选的，步骤（6）中，所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥，采用冷冻干燥或喷雾干燥可以防止胶原蛋白发生变性。
优选的，步骤（1）中，所述原料为鱼皮、鱼鳞或者禽类、畜类的皮或蹄，所述原料的选材不限于此，只是不同的选材由于原料本身的不同，产物的得率会稍有不同。
本发明的有益效果为：本发明创造性的利用蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为酶法制备胶原蛋白的酶原，其水解效率显著提高，这些可以从水解后的肽含量（达到80%以上）等其他数据上看出，其明显高于其他已知酶类；本发明中还通过在制备环节中添加使用超滤技术，使酶解产物分离彻底，胶原蛋白分子量均匀分布，3000分子量以下组分达90%以上，分子量小，活性高，更易于人体吸收；本发明一种胶原蛋白的制备方法的整个工艺过程条件温和，对环境友好。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
我们采用本发明公开的方法，进行以下操作：
（1）预处理：把鱼皮用水清洗干净后，使用5‰NaOH溶液浸泡15min，把鱼皮清洗至中性为止，晾干待用；
（2）称取预处理后的鱼皮500g，按物料比1:3（w/v）加入1500ml纯化水，80℃灭菌30min，冷却至40℃；
（3）按称取的预处理的鱼皮重量1‰加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶0.5g（来源：珠海博康药业有限公司）；
（4）PH控制在6.5，40℃保温水解6.5h，80℃灭活30min，离心过滤，得1200ml溶液；
（5）使用截留分子量为6000的中空纤维膜超滤，中间再补加1200ml纯化水，最后得透出液2100ml，
（6）超滤透出液进行冷冻干燥。
结果：对得到的产品进行检测分析，得胶原蛋白36.55g，重量回收率为7.31%。其中，肽含量为80.66%，3000分子量以下组分更是达90%以上；羟基脯氨酸含量为9.5%；用凝胶色谱法检测分子量分布及含量结果如下表所示：
| 峰段 | 数均分子量Mn | 重均分子量Mw | 分布宽D | 相对含量（%） |
| 1# | 1.62×104 | 1.66×104 | 1.03 | 13.2 |
| 2# | 9.16×103 | 9.17×103 | 1.00 | 6.37 |
| 3# | 6.06×103 | 6.11×103 | 1.01 | 31.2 |
| 4# | 3.22×103 | 3.26×103 | 1.01 | 45.6 |
| 5# | 1.01×103 | 1.027×103 | 1.01 | 3.59 |
| 总 | 4.04×103 | 6.26×103 | 1.55 | 100 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理：将制备胶原蛋白的原料清洗干净，然后使用3‰-10‰的碱性溶液进行浸泡10-20min，再把原料清洗至中性，晾干待用；
（2）称取一定量的预处理后的原料，按照物料比1:3(w/v)-1:4(w/v)加入纯化水，80-85℃灭菌30-40min，冷却至40℃；
（3）按称取预处理后的原料重量的0.5-2‰加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶；
（4）酶解工艺条件控制：PH控制在6.0-7.8，37-42℃保温水解6-7h，80-85℃灭活30min，然后离心过滤，取过滤清液；
（5）使用截留分子量为6000的超滤设备进行超滤，并补加纯化水使超滤更加完全，取透出液；
（6）将透出液进行干燥，得到胶原蛋白。
2.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述碱性溶液为5‰的NaOH溶液。
3.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，灭菌温度为80℃，30min。
4.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶的量为称取预处理后的原料重量的1‰。
5.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，PH控制在6.5，保温水解的温度为40℃，水解时间6.5小时，灭活温度为80℃。
6.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述超滤设备为中空纤维膜或者卷式膜或者管式膜或者陶瓷膜。
7.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，所述干燥采用冷冻干燥或喷雾干燥。
8.如权利要求1中所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述原料为鱼皮、鱼鳞或者禽类、畜类的皮或蹄。
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