CN103131684A - 一种具有C端多余序列的木聚糖酶XynA及其基因和用途、提高木聚糖酶催化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有C端多余序列的木聚糖酶XynA及其基因和用途、提高木聚糖酶催化率的方法。具有C端多余序列的木聚糖酶XynA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首先所要解决的技术问题是题是克服现有技术的不足，提供一种高效的可应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为6.0，最适温度50℃。本发明发现了其C端多余序列可以提高降解底物的能力，产生更多的单糖，来提高木聚糖酶的催化效率。通过融合表达，发现这种提高降解能力的作用同样适用于其它的木聚糖酶。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有C端多余序列的木聚糖酶XynA及其基因和用途、提高木聚糖酶催化率的方法。
背景技术
自然界中，木聚糖是许多生物材料半纤维素的主要组成成分，是半纤维素中最丰富的一种，其主链由吡喃木糖以β-1,4糖苷键连接而成，聚合度150–200，侧链上具有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、乙醚、香豆酸、肉桂酸等(Collins et al.FEMS MicrobiologyReviews.2005,29:3-23.)。木聚糖的完全降解需要多种酶的协同作用，但是在木聚糖的降解过程中，木聚糖酶发挥的作用是最主要和最重要的。木聚糖酶的主要作用是从木聚糖的主链内部随机切割吡喃木糖残基之间的β-1,4-连接键，而生成不同长度的寡聚木糖。木聚糖酶来源比较广泛，在细菌、海洋藻类、原生动物、真菌、陆地植物组织，以及蜗牛、甲壳动物等中都存在。对木聚糖酶的研究已有半个世纪，主要研究集中在适合于饲料工业、食品工业、制浆造纸工业、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶，并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。
高效木聚糖酶的产生、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。获得具有高效降解能力的木聚糖酶将会大大减少产业成本，提高生产效率，仍具有重大意义。
本发明中，我们发现了一种具有C端多余序列的木聚糖酶XynA，其C端多余的序列具有提高底物降解能力的作用，为提高木聚糖酶的催化效率提供了一种思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有C端多余序列的木聚糖酶。
本发明的另一目的是提供编码上述具有C端多余序列的木聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供提一种高木聚糖酶的催化效率的方法。
本发明的另一目的提供上述具有C端多余序列的木聚糖酶的应用。
本发明从绵羊瘤胃中分离得到一种新的具有C端多余序列的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
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其中，该酶基因编码407个氨基酸和一个终止密码子，前24个氨基酸是信号肽，因此，成熟的木聚糖酶XynA的理论分子量为44kDa。
本发明筛选到的木聚糖酶XynA，其最适pH值为6.0，最适温度为50℃。
本发明提供了编码上述具有C端多余序列的木聚糖酶的核苷酸序列。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2
ATGAAACATTCTTTTTACAGCCTTATGACTGCCATGGCCCTGTTGGCCATGAGCCCGTCCAGTTCGATGGCTCAAGGCCTGAAAGACATCTACAAGGACTACTTCCTTATCGGTGTGGCCGTGAACCAGCGCAACGTCTCCAATGCTGAGCAGGCCGCTCTCGTGAAGCAAGAGTTCAACAGCATCACTTGCGAGAACGACATGAAGCCCGAGCCCACTGAACCCCAGGAAGGAAAATTCAACTGGGAAGCTGCCGACCGCATCGCCAACTTCTGCCGCACCAATGGCATCAAGCTCCGTGGCCACTGCCTGATGTGGCACAGCCAGATCGGACGCTGGATGTACAGCGACAACCCCACGAAGGAAGTGTTCTTCCAGCGCATGAAAAACCACATCCAGGCTGTCGTCAGCCGCTACAAGGACGTGGTCTACGCTTGGGACGTGGTGAACGAGGCCATGACCGATGACCCGAAGGCCGAGGATCCCTTCCGCCAGTCGCCTCTCTACAAGATTGCCGGCGACGAGTTCATCGCCAAGGCTTTCCAGTATGCCCGCGAGGCCGACCCCAACGCCCTCTTGTTCTACAACGACTACAATGAGTGCGACCCCGTGAAGAGCCAGCGCATCTACGAGATGGTGAAGCGCATGAAGGAGAACGGTGTGCCCATCGACGGTATCGGCATGCAGGGTCACTACAACATCTACGGACCGACAGAGGCCGAGATCGATGCTGC CATCACCAAATACAAGAGCATCGTGAAGCACATCCATGTGACCGAGCTCGACATCCGTGTCAACGCCGAGATGGGTGGACAGCTGCAGTTCAGCCGCGAGGGTGTGGCAGTGAGCGACAGTGTGAAGCAGCACCTCGCCGACCAGTATGCCCGTGTGTTCAACGTGCTGCGCAAGCACCGCGATGTCATCGACTGTGTGACCTTCTGGAACCTCTCCGACCGCGACTCCTGGCTCGGGCAGAACAACTACCCGCTGCCTTTCGACGCCAACTACAAACCCAAGATGGCCTACGACTATATCAAGCAGATGAAAGCGGCGGCATGGCCCATCCCCGAGAAACCGAAACCCAACCCCAACCAGCAGCGTCAGCGCCGTCGTGGCGGATTTGGCGGTCCACAGCGTCCTCCTTTCAATCCCGCACTGGCTTTCGCCGAGCAACCTGGCGTGAAAGAGGATTTCGTGCCCTCTGAGCTCAACCAGCCTGGATAG
本发明提供了一种C端多余序列的木聚糖酶，由60个氨基酸组成，其C端多余序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：
MKAAAWPIPEKPKPNPNQQRQRRRGGFGGPQRPPFNPALAFAEQPGVKEDFVPSELNQPG
本发明的木聚糖酶XynA的C端多余序列可以提高木聚糖酶的底物降解能力。
本发明提供了编码上述木聚糖酶的C端多余序列的核苷酸序列。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.4
ATGAAAGCGGCGGCATGGCCCATCCCCGAGAAACCGAAACCCAACCCCAACCAGCAGCGTCAGCGCCGTCGTGGCGGATTTGGCGGTCCACAGCGTCCTCCTTTCAATCCCGCACTGGCTTTCGCCGAGCAACCTGGCGTGAAAGAGGATTTCGTGCCCTCTGAGCTCAACCAGCCTGGA
本发明的C端去除60个氨基酸序列的XynA-Tr的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5
MKHSFYSLMTAMALLAMSPSSSMAQGLKDIYKDYFLIGVAVNQRNVSNAEQAALVKQEFNSITCENDMKPEPTEPQEGKFNWEAADRIANFCRTNGIKLRGHCLMWHSQIGRWMYSDNPTKEVFFQRMKNHIQAVVSRYKDVVYAWDVVNEAMTDDPKAEDPFRQSPLYKIAGDEFIAKAFQYAREADPNALLFYNDYNECDPVKSQRIYEMVKRMKENGVPIDGIGMQGHYNIYGPTEAEIDAAITKYKSIVKHIHVTELDIRVNAEMGGQLQFSREGVAVSDSVKQHLADQYARVFNVLRKHRDVIDCVTFWNLSDRDSWLGQN NYPLPFDANYKPKMAYDYIKQ
本发明涉及到的木聚糖酶XynB的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
SEQ ID NO.6
MKKGILKTTACAMMLFMGATSCWAQSAAKGLKDVYKDYFMIGVAVNQRNVTNPEQIALIKKEFNSITAENDMKPEPTEPREGEFNWENADRIADFARANGIKLRGHTLMWHSQIGRWMTAEGTTKEQFYARMKNHIQAIVTRYKDVVYCWDVVNEAMSDDPNATDPYRQSAMYRLCGDEFIEKAFQYAHEADPKALLFYNDYSTVDPHKRDRIYNMVKKMKAKGIPIDGIGMQAHYNIYYPSEARLDSAITLFKTIVKHIHITEFDIRVNEEMGGGLQFSREGANVTDSVXQHLADQYARCFKIFRKHKDVIDCVTFWNLGDRGIALGVRNYPLPWDENYQPKLAYEYIRD
本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶xynA，DNA全序列分析结果表明，该基因全长1224bp。将xynA的氨基酸序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对后确定XynA是一种新的木聚糖酶。
本发明还提供了包含上述木聚糖酶xynA的重组载体，命名为pET22b(+)-xynA。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET22b(+)上的EcoR I和Xho I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET22b(+)-xynA。
本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因xynA的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种制备木聚糖酶XynA的方法，包括以下步骤：
1)用上述的载体转化宿主细胞，得到活性菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XynA。
本发明还提供了上述木聚糖酶XynA的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是题是克服现有技术的不足，提供一种高效的可应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为6.0，最适温度50℃。本发明发现了其C端多余序列可以提高降解底物的能力，产生更多的单糖，来提高木聚糖酶的催化效率。通过融合表达，发现这种提高降解能力的作用同样适用于其它的木聚糖酶。
附图说明
图1重组木聚糖的表达和纯化图，其中，1 XynA-Tr 2 XynA 3 XynB 4Xyn-Fu。
图2重组木聚糖XynA和XynA-Tr的最适pH。
图3重组木聚糖XynA和XynA-Tr的pH稳定性。
图4重组木聚糖XynA和XynA-Tr的最适温度。
图5重组木聚糖XynA和XynA-Tr的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1绵羊瘤胃来源的木聚糖酶XynA基因的克隆
采用液氮研磨法结合SDS-CTAB化学裂解法来提取绵羊瘤胃环境的宏基因组。根据木聚糖酶基因的保守区序列设计合成了简并引物GH10-F和GH10-R：X10-F：5′-CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA-3′和X10-R：5′-GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT-3′。以瘤胃总DNA为模板进行PCR扩增。得到一约260bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。
表1.木聚糖酶XynA的TAIL-PCR特异性引物
通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德公司测序。拼接后xynA基因全长1224bp，编码407个氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为44kDa。将xynA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，XynA与来源于Bacteroides intestinalis DSM17393的假定木聚糖酶的具有最高一致性(61%),说明XynA是一种新的木聚糖酶。经比对和结构分析，该木聚糖酶的C端具有一段60个氨基酸的多余序列，富含脯氨酸(21.2%)。
实施例2重组木聚糖酶的制备
XynA的重组与纯化：
将表达载体pET22（+）进行双酶切(EcoRI+XhoI)，同时将编码木聚糖酶的基因xynA双酶切(EcoRI+XhoI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET22（+）连接，获得含有木聚糖酶基因xynA的重组质粒pET22(+)-xynA并转化BL21(DE3)。
取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于300mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养约2h后，加入1mM IPTG和1mM CaCl2，置于30℃220rpm进行诱导，约8h后测定胞内和胞外的木聚糖酶活力。在胞外检测到木聚糖酶的活性经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶得到了表达并达到电泳纯(图1)。
XynA-Tr的重组与纯化：
将XynA截短C端60个氨基酸序列后的基因命名为XynA-Tr,将表达载体pET22（+）和编码木聚糖酶的基因xynA-Tr进行双酶切(EcoRI+XhoI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET22（+）连接，获得含有木聚糖酶基因xynA-Tr的重 组质粒pET22(+)-xynA-Tr并转化BL21(DE3)。
取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于300mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养约2h后，加入1mM IPTG，置于30℃220rpm进行诱导，约8h后测定胞内和胞外的木聚糖酶活力。在胞外检测到木聚糖酶的活性经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶得到了表达并达到电泳纯(图1)。
实施例3重组木聚糖酶的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH6.0和37下℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
实施例4重组木聚糖酶XynA和XynA-Tr的性质测定
1、重组木聚糖酶最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例2纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行木聚糖酶活力测定。结果表明，重组酶XynA和XynA-Tr的最适pH均为6.0，在pH5.0~7.5范围内，XynA的相对酶活性高于XynA-Tr（图2）。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH6.0缓冲液体系中37℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明木聚糖酶XynA和XynA-Tr在pH5.0-9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70%以上，而这说明此酶在中性偏碱的范围内具有较好的pH稳定性。
2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在50,55,60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其XynA的最适温度为50℃，而XynA-Tr为45℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，XynA和XynA-T有良好的热稳定性，在55℃下温育1h，能保持80%以上的酶活。
3、木聚糖酶的Km值测定方法如下：
用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系中，各自最适稳定下测定酶活性，计算出其在最适反应条件下的Km值。经测定，XynA和XynA-Tr以榉木木聚糖为底物时的Km值分别为11和19mg/mL，最大反应速度Vmax 分别为2000和222μmol/min·mg。
表2、XynA和XynA-Tr及融合表达蛋白的动力学参数
4、重组木聚糖酶的产物分析
以pH6.0的0.5%榉木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖为底物，加入10U的纯化酶XynA或XynA-Tr，37°C反应12h。用3kDa的超滤管除去酶蛋白和未降解的大分子，然后将滤液用HPLC分析其产物，以葡萄糖、纤维二糖、三糖和四糖作为标准。结果表明，XynA比XynA-Tr产生更多的单糖，具有更好的降解能力。
表3XynA和XynA-Tr及融合表达蛋白的产物分析
5、融合蛋白的构建及C端多余序列的广泛应用
我们将C端多余序列与另一个木聚糖酶XynB进行融合表达（图1），并且测定融合蛋白的动力学参数和产物分析。结果发现，该C端多余序列同样可以提高底物降解能力（表2），从而提高木聚糖酶的降解效率（表3），从而验证该C端多余序列具有提高催化效率的普遍性意义，进一步的研究打下一定的基础。
Claims (9)
1.具有C端多余序列的木聚糖酶XynA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.木聚糖酶基因xynA，其特征在于，编码权利要求1所述的木聚糖酶XynA。
3.根据权利要求2所述的木聚糖酶基因xynA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种提高木聚糖的催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括在木聚糖酶的C端连接SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的步骤，或者在木聚糖基因的5’端连接SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
6.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xynA的重组载体。
7.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xynA的重组菌株。
8.权利要求1所述具有C端多余序列的木聚糖酶XynA的应用。
9.氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽用于提高木聚糖的催化效率的应用。
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