CN103130884B - 与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物穗形相关的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗形相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明通过克隆SPED基因,深入了解水稻穗形态建成特别是末端枝梗的发育问题,探索生物物质由源到库输送的决定因素,最终解决“理想株形”的深层理论问题,将有望为作物高产育种指引新方向。
Description
技术领域
本发明涉及与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
在禾本科中,花序的主轴叫作穗轴(rachis)(Bell,AD(1991)Plant Form:AnIllustrated Guide to Flowering Plant Morphology,Oxford University Press,New York.p.184-191.),着生于穗轴上的侧向分枝枝梗叫作一级枝梗,顺此方式类推,着生于一级枝梗上的更下一级分枝叫作二级枝梗。“枝梗”这个专业名字仅仅用于花序分枝具有足够长度支撑超过一个小穗的结构,当枝梗短到仅包含一个小穗(至少一朵花及其连接的花柄)时,只能被叫作花序梗(peduncle)(Ikeda,K,Sunohara H and Nagato Y(2004)Development Course of Inflorescence and Spikelet in Rice.Breed.Sci.54:147-156),而更加短到只包含一朵小花时,就叫作花梗(pedicel)。
水稻花序特别是枝梗的发肓是一个整体全局的过程,是由初级到高级按照分生组织的类型一层层地整体调节的,也就是说,只有主穗轴完成了分化,才会启动一级枝梗分化;所有一级枝梗分化完成后才启动伸长程序并同时进入下一级枝梗的分化;所有次级枝梗完成分化后才同时启动小穗的分化。在这个过程中,枝梗的伸长受到了严格的时间限制,总是迟后于各种原基的分化,这与一般生命组织先出现分裂生长的现象完全不同(Ikeda,K,Sunohara H and Nagato Y(2004)Development Course ofInflorescence and Spikelet in Rice.Breed.Sci.54:147-156)。
水稻花序发育中,先决性的,也是最为关键性的事件就是枝梗的发育。这一发育问题在育种实践上也显得极为重要。多年来在传统育种实践中形成的一些先进育种理论,例如直立穗形具有增产潜力(Chen Wenfu,Xu Zhenjin,Zhang Longbu,et al.(2000)Theories and practices of rice breeding for super high yield.Proceedings of InternationalConference on Engineering and Technological Science[C].378-382),稀重穗具有解决源库不匹配矛盾而充分利用能量的特点(周开达,马玉清,刘太清,等(1995)杂交水稻亚种间重穗型组合选育。四川农业大学学报13(4):403-407),密直穗能大幅增产(HuangX,Qian Q,Liu Z,Sun H,He S,Luo D,Xia G,Chu C,Li J,Fu X(2009)Natural variaion atthe DEP1 locus enhances grain yield in rice.Nature Genetics 41:494-497)等,部是以枝梗为基础的穗形改良才能达到的目标。因此,只有弄清楚枝梗的发育过程与分子机理,并借助分子生物学的工具,才能够通过分子肓种的方法,有的放矢地达到更高产的育种目标。
从发育过程与结构来看,水稻的枝梗发育涉及到四个层面:穗轴(rachis),一级枝梗(primary branches),二级枝梗(secondary branches),花梗(pedicels)。水稻花序发育需要形成三类分生组织:穗轴枝梗分生组织,侧生穗分生组织与顶生穗分生组织。穗轴、一级枝梗和二级枝梗均来自同一类分生组织,而花梗分别来自两种穗分生组织。顶生穗的花梗可以直接由枝梗分化出来,而侧生穗花梗必须直接来源于枝梗侧生分生组织的形成。到目前为止,已经发现了超过17种类型的水稻穗型突变体。参与这些花序形态控制的主要基因早在多年前就已经报道了20多种(Kinoshita T,Takahashi M(1991)The one hundredth report of genetical studies on the rice plant.Linkage studies andfuture prospects.J.Fac.Agric.Hokkaido Univ.65:1-61),这些基因的克隆,已经为理解穗部形态的建成提供了越来越清晰的分子机理,使作物高产育种沿着分子设计理想株形的目标大大靠近了一步。特别是对于控制水稻穗轴、一、二级枝梗发生与发育的分子生物学机理已经比较明确;对花梗的发育,LAX1只能解释侧生穗的花梗来源(OikawaT and Kyozuka J(2009)Two-Step Regulation of LAX PANICLE 1Protein Accumulation inAxillary Meristem Formation in Rice.PLANT CELL 21(4):1095-1108),FZP基因控制的穗分生组织的分化信息中包含所有花梗发育信息(Komatsu M,Maekawa M,Shimamoto K,and Kyozuka J(2001)The LAX1 and FRIZZY PANICLE 2 GenesDetermine the Inflorescence Architecture of Rice by Controlling Rachis-Branch andSpikelet Development.Developmental Biology 23:364-373),但是这些基因都不能解释花梗因为长度缩短而形成的一种水稻突变体——簇生穗突变体。
1957年,Jodon(Jodon NE(1957)Inheritance of some of the more striking charactersin rice.J.Hered.48(4):181-192)最早报导发现簇生穗突变体Cl。该突变体的整体观上表现为小花失去正常的在枝梗上分级排列的特性,而呈2到5个小穗并生在一起的簇生状态。发现者根据其外观形状将之描述为“簇生穗”。除了这一命名外,还有人将之命名为“复粒稻”(田翠,张涛,蒋开锋,杨莉,杨乾华,万先齐,郑家奎(1010)水稻小穗簇生突变体的遗传分析及其基因的初步定位。分子植物育种8:29-34),也有研究者特别地把只在一级枝梗上有两粒穗簇生,其他部位正常的簇生型突变体命名为“麦颖稻”(陈红旗,刘刚,朱旭东,等(2002).水稻簇生穗突变体的鉴定及遗传.南京农业大学学报25(3):116-118)。从以上发表文献中不同名字的突变体的初步遗传定位结果来看(郑雷英,朱旭东,钱前,赵忠,张建军,胡筱荷,林鸿宣,罗达(2003)水稻穗部突变体CL的形态和定位分析。科学通报48:264-267),除了定位精度的差异以外,都落在相同的染色体比较狭窄的区段内,因此可以推测,国内目前已经定位的几个簇生穗基因都是等位的。
育种学上具有深远影响的源库流理论,一直指引着作物的育种实践。流的物质环节主要在于茎节和枝梗。水稻矮化增产的结果表明,其主要是通过减少营养体源而扩大生殖体库的优化结果,故推测穗枝梗可能是主要的流环节之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物穗形相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物穗形相关的蛋白,名称为SPED,来源于水稻(Oryza sativaL.),是如下(a)或(b)的蛋白质:
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗形相关的由(a)衍生的蛋白质。
序列表中的序列1由530个氨基酸残基组成。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(a)中的SPED蛋白可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的SPED衍生蛋白可人工合成,也可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因,再进行生物表达得到。
所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因:
1)序列表中序列2所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因;
3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
序列表中的序列2由1593个核苷酸组成,编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的SPED蛋白。
上述严格条件可为:在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1%SDS的溶液中,65℃下进行DNA或RNA杂交实验并洗膜。
含有所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在载体pCAMBIA1301的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体。
扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围,所述引物对中,一条引物序列如序列表中序列3所示,另一条引物序列如序列表中序列4所示。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法,是将所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因导入目的植物中,得到与所述目的植物相比,穗形改变的转基因植物。
所述穗形改变体现为:与所述目的植物相比,所述转基因植物穗轴上部花梗以及顶端花序梗缩短。
所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物;所述单子叶植物为水稻。
本发明所提供的与植物穗形相关的蛋白的编码基因SPED是一个主要调控花梗以及远末端1到3节花序梗伸长发育的基因,但是并不影响花梗与远末端花序梗的分化。花梗缩短是穗簇生突变体具有的稳定、遗传上完全显性的性状,而穗簇生是受到多种因素影响的不完全显性性状。因此将我们这个穗簇生突变体命名为短花梗突变体(SPED,shortened pedicel and peduncle)。本发明的研究结论表明,SPED基因是特异控制花梗伸长发育的基因,并暗示花梗是来自于不同于二级枝梗分生组织的新型枝梗分生组织——花梗分生组织(pedicel meristem,PEDM);是对水稻穗轴枝梗分生组织的发育具有调节功能的基因。通过生物信息学分析,发现SPED蛋白是一个具有9-12个PPR(pentatricopeptide repeat)结构的典型的Alpha-helix蛋白,三级结构预测表明在功能区具有镍(nickel)离子配基结合位点,并且氨基酸序列与苜蓿中的一个含DNA甲基转移酶结构域的蛋白具有40%的一致性,这些特征表明,SPED蛋白可能参与DNA甲基化途径来影响生命活动的。通过克隆SPED基因,深入了解水稻穗形态建成特别是末端枝梗的发育问题,探索生物物质由源到库输送的决定因素,最终解决“理想株形”的深层理论问题,将有望为作物高产育种指引新方向。
附图说明
图1为SPED突变体的穗部形态遗传以及发育示意图。
图2为STS标记创制与SPED基因的精细定位。
图3为SPED基因序列以及互补验证和过表达验证区段。
图4为SPED基因的特异STS标记-CSPJ320B的PCR分析。
图5为重组表达载体p1301::SPED示意图。
图6为转SPED基因水稻T0代植株的花梗形态以及采用潮霉素基因标记和SPED基因STS标签检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、与水稻穗形相关的SPED基因的获得
一、SPED突变体性状
在夏季自然条件下,SPED突变体营养生长状态无异常,但是穗部形态发生改变,主要有两方面:一是从小穗着生状态来看,原本呈梯级分布于一二级枝梗上的谷粒(颖花),在顶部的部分簇生成一团,一般有3到5粒簇生,而一二级枝梗上从顶部往下数3到5粒以下部位的小穗仍然按一定剃度距离着生在枝梗上;二是从末端枝梗性状来看,所有直接连接小穗的花梗都极度缩短到1.0毫米左右,另外每级花序梗从上往下数有1到3节缩短,其中缩短1节花序梗表现为小穗呈3粒簇生,缩短2节有4粒簇生,最多可以有3节花序梗缩短致5粒簇生,并且所有的次级枝梗都表现为缩短(图1中A)。图1中B为野生型植株的穗型。
以SPED与9311杂交产生的F1代材料自交繁殖后,统计F2中突变体植株的各穗花梗长度进行分析,发现突变体植株仅在第1穗与第6穗有1到2毫米的超突变体亲本变化,其他各级花梗都在1毫米左右(图1中C和D)。并且除了花梗缩短以外,其他花序梗并不缩短。由此可以归纳得到SPED突变体花序枝梗的发育模式:花梗和上部花序梗的伸长发育强烈抑制,子粒呈现3粒以上严重簇生,如SPED突变体亲本;或只有花梗严重缩短,上部花序梗伸长发育不受抑制,从而使花序子粒形态呈现2粒簇生,如在9311遗传背景中的表型(图1C中上部分)。
二、与植物穗形相关的基因SPED的遗传分析与初步定位
在北京实验场,以突变体SPED为父本,分别与9311、R498、R549、R527、Balila、K1/Pita、抗恢527等7个品种杂交,获得F1后播种于海南陵水自交繁殖,获得F2代种子,取部分F2种子在北京种植,并调查突变性状分离,统计数据。杂交组合以及遗传分析结果如表1。
表1遗传分析所采用杂交组合以及分析结果
结果表明,SPED突变体性状是由单基因显性控制遗传的。从簇生程度进行表型评价,SPED在不同的遗传背景中呈现情况有不同;从花梗缩短的表型来评价,则SPED在所有的遗传背景中均呈现完全显性。进而以突变体SPED为父本与9311杂交,其F1种子于海南陵水自交繁殖,获得F2代种子在北京种植,建立一个总单株数为5298株F2代群体,其中1318株表型为野生型的单株被用来进行作图分析。
初步定位步骤:采集F2代群体中野生型表型的单株叶片,分别抽取DNA。各取6株野生型和突变表型F2代单株DNA,分别等量混合构成野生型DNA池和突变体DNA池。在http://www.gramene.org/microsat/ssr.html以及http://ricelab.plbr.cornell.edu/publications/2005/IRGSP/supplementaltable18.xls网站上均匀选取水稻12条染色体上的110个SSR标记对亲本以及野生型DNA池和突变体DNA池进行SSR标记连锁分析。对在亲本与野生型DNA池和突变体DNA池中均能扩增到多态性一致的SSR引物,再扩大群体进行验证。进行初步验证以确定初步定位区间。经98个野生型单株的小群体连锁分析,SPED基因被限定在水稻第6号染色体下臂两个SSR分子标记RM5957和RM3827之间,定位区间约为2.5Mbp(图2中A)。这两个标记分别检测到6株和4株交换单株。
三、STS标记的创制以及SPED基因的精细定位
在上述水稻SSR标记数据库中选取RM5957和RM3827标记(见表2)之间的SSR标记,对98株初步定位群体中筛选到的交换单株进行筛选。所用多态引物分别为RM275,RM20384,RM20297,RM20303,RM20311,RM20315,RM1340(见表2)。其中RM275和RM1340分别从RM5957和RM3827标记为交换的单株中检测到3株和1株交换株。采用这两个标记分别从1318株野生型定位群体中筛选出交换株。通过位置检索,在gramene网站数据库中(http://www.gramene.org/Oryza_sativa/Location/)从上述标记区间挑选更多的SSR引物,对筛选出来的交换株进行染色体步移。在标记染色体步移到区间距离约为300K时,通过NCBI网站比对这一区间内indica与japonica的序列,对相互之间具有10bp以上的缺失的序列设计STS(sequence taggedsites)引物,共获得6对多态性好的STS标记(CSP1、CSP4、CSP7、CSP8、CSP25和CSP30)(见表2),它们的扩增片段为100bp到500bp不等,最终将目标区间聚焦到CSP30和CSP25标记之间的19.2Kb范围内(图2中B和C)。
表2本发明过程中所创制的标记和引物
四、SPED基因预测及其STS标签CSPJ320B的创制
用Genescan软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)对定位区间19.2kb的序列进行基因预测,发现1个明显的开放阅读框(ORF),是SPED的候选基因(图2中C;C:候选基因的结构,粗线代表外显子)。该基因无内含子,编码530个氨基酸,在其终止密码子下游具有567bp的非翻译区(图3中Pro775bp-SPED为来自突变体的SPED含内源启动子启动SPED基因的结构图)。根据该基因在数据库中的序列设计引物,以SPED突变体和9311亲本DNA为模板高保真PCR扩增后克隆测序,序列比对发现ATG上游775bp的启动子区有一个69bp的缺失,表达序列存在3处点突变,分别在+209位由A变为C、+1240位由A变为C、+1341位由C变为A(图3)。克隆测序结果表明,SPED基因的全长cDNA序列的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由1593个碱基组成,编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质,序列表中序列1由530个氨基酸残基组成,将该蛋白质命名为SPED。
根据SPED基因内部的两个突变位点,设计了能特异区分SPED基因的STS标记CSPJ320B(该标记的引物序列见表2),经过PCR条件摸索,在94℃2min;94℃45s,64℃45s,72℃20s,35cycle;72℃5min的热循环条件下,使用华美Taq polymerase buffer配方配制反应体系,分别以SPED突变体、野生型9311和野生型TP309基因组DNA为模板,进行PCR扩增。扩增结果见图4,从图4可见,在SPED突变体中可得到140bp的特异扩增条带,而在野生型9311和野生型TP309中无该特异扩增条带。
五、SPED编码蛋白的结构分析
对基因SPED所编码的全长氨基酸序列分析,发现它由最多达12个PPR简并氨基酸motif重复序列构成,这些简并PPR序列每个单元为31或者35个氨基酸组成。
实施例2、转SPED基因水稻植株的穗形分析
根据上述实施例1扩增得到的SPED基因设计引物,加入EcoRI和HindIII酶切位点,引物序列如下:
SPED-F:GCGAATTCGGCTGACCTCAGCTTGAGTT(下划线为EcoRI位点)(序列表中序列3),
SPED-R:GCAAGCTTGTTGGTCCAGTCAAACTAATG(下划线为HindIII位点)(序列表中序列4),
以人工合成的序列表中序列2所示的SPED基因为模板,进行PCR扩增,扩增获得1176bp的SPED基因的全长双链cDNA产物,在该基因序列两端各添加EcoRI和HindIII酶切位点。将产物经EcoRI和HindIII双酶切后,连接到表达载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)的EcoRI和HindIII酶切位点间,得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中,抗性筛选,挑取阳性克隆,将阳性克隆进行液体培养,提取阳性克隆质粒进行测序验证,测序结果表明在载体pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位点间插入了序列表中序列2所示的SPED基因片段,证明重组表达载体构建正确,将该重组表达载体命名为p1301::SPED,构建过程如图5所示。将重组的表达载体p1301::SPED通过农杆菌介导的方法转入水稻TP309(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得,记载过该材料的非专利文献是:A receptor kinase-like protein encoded by the rice diseaseresistance gene,Xa21.Song WY et al.Science.1995,270(5243):1804-6),得到3个转SPED基因的水稻T0代株系。转基因具体方法见Plant Molecular Biology,2003,52:957-966。
以水稻TP309植株为野生型对照。将空载体pCAMBIA1301转化TP309水稻植株,得到5个转空载体的T0代株系。获得的3个转SPED基因水稻T0代植株(T0-1)与野生型对照植株(TP309)相比,穗轴上部部分花梗以及顶端花序梗缩短,形成两粒并齐(图6中A)。转空载体的T0代植株的表型与野生型对照TP309没有明显的差别。
分别以转SPED基因水稻T0代植株和野生型对照植株的基因组DNA为模板,以潮霉素基因标记引物(HYG-F和HYG-R)以及特异STS标记CSPJ320B(CSPJ320B-F和CSPJ320B-R)进行PCR扩增检测,引物序列如下:
HYG-F:5’-ttctacacagccatcggtcc-3’,
HYG-R:5’-caaactgtgatggacgacacc-3’;
CSPJ320B-F:5’-caatgagggaggtttatcagc-3’,
CSPJ320B-R:5’-ccaaacagtggcatagcatccttt-3’。
PCR扩增检测结果如图6中B所示,在3个转SPED基因水稻T0代植株(图6中TP309-T0-1、TP309-T0-2和TP309-T0-3)中都能检测到500bp的潮霉素基因片段,而在野生型对照植株(图6中TP309)中检测不到该条带;同时,特异STS标记CSPJ320B在SPED突变体和3个转SPED基因水稻T0代植株中都可检测到140bp的条带,而在野生型TP309中检测不到该条带。
Claims (3)
1.一种培育转基因水稻的方法,是将序列表中序列2所示DNA分子导入目的水稻中,得到与所述目的水稻相比,穗形改变的转基因水稻。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述穗形改变体现为:与所述目的水稻相比,所述转基因水稻穗轴上部花梗以及顶端花序梗缩短。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:序列表中序列2所示DNA分子通过重组表达载体导入目的水稻中;
所述重组表达载体是在载体pCAMBIA1301的多克隆位点间插入序列表中序列2所示DNA分子得到的。
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