CN103130817A - 一种新的银杏内酯b化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的银杏内酯B化合物，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中银杏内酯B的含量大于99%，所述银杏内酯B化合物中含有银杏内酯A，所述银杏内酯A的含量低于0.4%。本发明还涉及该银杏内酯B化合物的制备方法，包括：在搅拌条件下加入硅藻土、银杏叶提取物，于78-85℃加热回流0.5-1.5h，过滤，浓缩；再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60～70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。

Description

一种新的银杏内酯B化合物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新的银杏内酯B化合物及其制备方法。

背景技术

银杏内酯B，英文名Ginkgolide B；分子式：C₂₀H₂₄O₁₀；分子量：424.40。

银杏内酯B是一种活性强的血小板活化因子（PAF）拮抗剂，能竞争性地与PAF受体结合，抑制PAF的作用；因此，凡涉及与PAF相关的病症，如：血栓形成、脑组织损伤、器官移植排斥、急性炎症、心脏过敏、细胞内毒素及IgG导致的休克等，银杏内酯B均有一定疗效。

但迄今为止，国内外均未有银杏内酯B单一成分为原料的制剂上市。根据我国《药品注册管理办法》中化学药品注册分类该药品属于化学药品中“未在国内外上市销售的药品”下的“天然物质中提取或者通过发酵提取的新的有效单体及其制剂”，属于化学药品1.2类。

CN101182325A涉及一种静脉给药银杏内酯B及提取方法，其中银杏内酯B含量≥97%,银杏酸≤2PPM,白果内酯未检出,可以直接作为静脉注射或静脉滴注原料药;提取采用叶干重8～25倍量、浓度为5%-30%乙醇水溶液回流提取若干次,过滤分离;将滤液浓缩至原体积的0.05～0.2倍量,加入吸附剂在搅拌状态下充分吸附,过滤,滤饼用3～10倍量乙醇回流提取若干次,合并提取液,浓缩至原体积的0.01～0.2倍量,静置析晶,过滤得银杏内酯;银杏内酯用10～50倍量的甲醇进行重结晶若干次,析晶温度-10℃～-25℃,过滤结晶、干燥,得银杏内酯B。

CN101412725A公开一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法,其步骤如下:1)取银杏叶,用由高到低不同浓度的乙醇进行提取,合并提取液,回收乙醇,得到浓缩后的提取液;2)向浓缩后的提取液中加入乙酸乙酯萃取,回收有机相后浓缩至浸膏;3)将步骤2)所得浸膏稀释后上选择性极性无孔吸附树脂柱,用乙醇洗脱,所得洗脱液回收乙醇后,再用乙醇结晶得到银杏内酯类化合物;4)将银杏内酯类化合物结晶上硅胶柱,用正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱,收集洗脱液,得到富集银杏内酯B的洗脱液;5)回收步骤4)中收集的洗脱液中的溶剂,再用乙醇结晶,得到银杏内酯B单体。

CN1680392A涉及采用高速逆流色谱法(HSCCC)从银杏叶中分离一种高纯度银杏内酯的制备方法。用三个溶剂体系,分别经过两次HSCCC分离后,可得到银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯,纯度均达到99%以上。

目前，药用的银杏内酯B主要从银杏叶中提取，但由于银杏内酯B在银杏叶中的含量极低，且银杏内酯B与银杏内酯A以及银杏酸、白果内酯共同存在，银杏内酯B与银杏内酯A的结构又极为相似，极性差异很小，从银杏叶中提取高纯度的银杏内酯B单体较为困难，特别是将银杏内酯B与银杏内酯A的分离较为困难。上述专利以及现有技术中提取的银杏内酯B的纯度不够高，且银杏内酯B溶解性差，因此只能作为口服用药原料而不能作为注射剂的原料药，而口服给药的生物利用度较低，不能充分发挥银杏内酯B的药效，采用注射剂可极大提高其生物利用度，且临床适用人群——缺血性脑病病人，包括急性缺血性中风脑梗塞的病人治疗时间窗窄，且需快速起效，一般口服制剂相对于注射剂起效慢，而制成注射剂后给药起效迅速，另外，缺血性脑病病人可能会存在口服药物吞咽困难，制成注射剂则不存在吞咽困难的问题。但注射剂对银杏内酯B的纯度要求非常高，因此，提供一种高纯度的银杏内酯B化合物具有非常重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的不足，提供一种高纯度的银杏内酯B化合物，该化合物中仅含有微量的银杏内酯A。

本发明的第二目的在于提供一种上述银杏内酯B化合物的制备方法。

为了实现本发明的目的，特采用如下技术方案：

一种银杏内酯B化合物，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中银杏内酯B的含量大于99%，所述银杏内酯B化合物中含有银杏内酯A，所述银杏内酯A的含量低于0.4%，所述的银杏内酯B化合物的结构式为：

银杏内酯A与银杏内酯B的结构极为相似，二者极性差异很小，从银杏叶中提取的银杏内酯B单体中银杏内酯A的含量较高，要获得高纯度的银杏内酯B较为困难。本发明提供的银杏内酯B化合物是从天然药物银杏叶中提取、分离、精制而成的单体成分，有效地将银杏内酯A从银杏内酯B中分离了出来，银杏内酯B的含量大于99%，银杏内酯A的含量低于0.4%，银杏内酯B化合物的含量非常高，银杏内酯A的含量极低，可作为注射制剂的原料药，极大地提高了银杏内酯B的生物利用度，且本品的质量研究和稳定性试验结果表明本品质量可控、稳定，为本品临床应用提供良好的有效性和安全性和质量可控性的基础，大大地提高了患者的用药安全。

优选的，所述银杏内酯B的含量大于99.6%，所述银杏内酯A的含量低于0.3%。

优选的，所述银杏内酯B化合物中不含白果内酯。

优选的，所述银杏内酯B化合物中总银杏酸的含量小于0.12ppm。

本发明参考《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物项下总银杏酸限度测定方法，对原料测定的结果表明，本品含总银杏酸的量小于0.12ppm，远低于银杏叶提取物总银杏酸不得过百万分之十的限度规定，本发明提供的银杏内酯B是安全而有效的。

银杏内酯B化合物中杂质的种类和含量对银杏内酯B化合物的稳定性也有较大影响，本发明提供的银杏内酯B化合物中的杂质种类少、含量低，相对于现有技术具有更好的稳定性，并且本品质量可控，是一种性能优良的注射制剂的原料药，极大地提高了患者的用药安全。

本发明中，所述银杏内酯B化合物的甲醇溶液在20℃时的比旋度为-57°～-61°。

银杏内酯B在无水乙醇下的溶解度较甲醇低，配制成10mg/ml的浓度较困难，而5mg/ml的旋光度数值较低，误差增大，因而选用甲醇为溶剂，配制成10mg/ml的溶液，在20℃时测定的比旋度为-57°～-61°。本发明的银杏内酯B的比旋度比《中国药典》中规定的银杏内酯B的比旋度为-48°至-63°的范围窄了很多，说明本发明提供的银杏内酯B具有非常高的纯度。

本发明还提供了一种所述的银杏内酯B化合物的制备方法，包括：

（1）在搅拌条件下向乙酸乙酯中先加入硅藻土，再加入银杏叶提取物，于78-85℃加热回流0.5-1.5小时，过滤，浓缩；加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.8-1.2倍，乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为15-20ml/g；

（2）再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；

（3）洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60～70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；

（4）粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。

本发明采用乙酸乙酯从银杏叶提取物中提取银杏内酯B，将银杏叶提取物加至乙酸乙酯中，会形成大量粘度大的物质，不利用后续工艺及清场的工艺，因此加入硅藻土有助于银杏叶提取物在乙酸乙酯中的分散；当进行大量提取时，直接将硅藻土与银杏叶提取物进行混合，不利于银杏叶提取物的分散与混匀，因此在提取罐中加入乙酸乙酯后，在搅拌条件下先加入硅藻土，再加入银杏叶提取物，银杏叶提取物能较快地在乙酸乙酯中分散均匀，有利于银杏内酯B在乙酸乙酯中的溶出，提高粗品中银杏内酯B的含量。

上述制备方法的步骤（1）中，所述的银杏叶提取物为从银杏叶中提取获得，提取方法可参考现有技术中的任何一种方法，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动。

步骤（1）获得的浓缩液有析出物，析出物影响柱层析，因此步骤（2）中在进行柱层析之前先于浓缩液中加水萃取，可使析出物溶于水，分去水层，有利于去除浓缩液中的大量杂质，以及在去掉析出物的同时降低浓缩液的粘度，更有利于后续的柱层析工艺。

从银杏叶中提取制备银杏内酯B，制备方法不同，得到的银杏内酯B化合物的纯度以及其中杂质的种类和含量差异巨大，本发明通过大量的实验，对银杏内酯B的提取制备方法不断进行改进和优化，特别包括对溶剂与色谱柱的选用、以及对整个提取路线的设计，最终得到了一个制备高纯度的银杏内酯B化合物的制备方法，且得到的银杏内酯B化合物中杂质的种类少，含量低，经HPLC-ELSD测定，银杏内酯B化合物单体的纯度达到99%以上，且白果内酯未检出，可以作为注射制剂的原料药，极大地提高了患者的用药安全。另外，该方法简单易操作、制备周期短，极大地降低了从银杏叶中制备银杏内酯B化合物单体的成本，进一步降低了含有该银杏内酯B化合物制剂的成本。

上述制备方法的步骤（4）中，粗结晶依次用乙醇重结晶3次以上、乙酸乙酯重结晶1次以上，得到的成品中银杏内酯B的含量大于99.6%，所述银杏内酯A的含量低于0.3%。

所述步骤（1）中，优选的，加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.9-1.1倍；乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为16-18ml/g。硅藻土、银杏叶与乙酸乙酯的用量在该范围内，有利于提高银杏内酯B的收率以及提高粗品中银杏内酯B的含量。

所述步骤（1）中，优选的，滤液浓缩至液固比为3-5ml/g。

所述步骤（2）中，酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：10，酸性氧化铝为200～300目，上样量与氧化铝的重量比为1：7～10，洗脱速度为1/4～1/2BV/h；优选的，所述酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：7，上样量与氧化铝的重量比为1：8。

本发明通过加入蒸馏水除杂、采用酸性氧化铝柱层析等上述优选的技术方案，获得银杏内酯B成品中，白果内酯未检出，总银杏酸的含量小于0.12ppm。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的银杏内酯B化合物的纯度非常高，该银杏内酯B化合物中杂质的种类少、含量低，特别是银杏内酯A的含量非常低，可作为注射剂的原料药，提高了原料药的生物利用度以及患者的用药安全。

另外，本发明提供的制备高纯度银杏内酯B的方法简单易操作，特别是硅藻土的采用，有利于后续的柱层析工艺的进行，提高了制备的效率，降低了制备的成本。

具体实施方式

银杏内酯及白果内酯的色谱测定方法采用HPLC-ELSD色谱方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇/四氢呋喃(2:1)：水=32：68为流动相，蒸发光散射检测器检测（参考条件：Alltech3300：漂移管温度60℃，空气流速1.5L/min，增益为8；Agilent380-LC：雾化温度30℃，漂移管温度50℃，载气流量1.5SLM，PMT增益为8)。积分方法：面积外标法。

总银杏酸的含量测定参考《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物项下总银杏酸限度测定方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-四氢呋喃-水（22：10：68）为流动相；用蒸发光散射检测器检测（参考条件：Alltech3300：漂移管温度60℃，空气流速1.5L/min，增益为8；Agilent380-LC：雾化温度30℃，漂移管温度50℃，载气流量1.5SLM，PMT增益为8)。积分方法：面积外标法。

比旋度的测定方法参考《中国药典》2010年版附录VI E，参考条件：WZZ-3自动旋光仪溶剂：甲醇溶液，浓度：10mg/ml，温度：20℃。

实施例1

银杏内酯B化合物的制备：

在搅拌条件下向750ml乙酸乙酯中先加入硅藻土40g，再加入银杏叶提取物50g，于85℃加热回流0.5小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为5ml：1g；；往浓缩液中加入约1/10体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：4，氧化铝为200目，上样量与氧化铝的重量比为1：7，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/4BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.0%，银杏内酯A的含量小于0.4%。成品的比旋度为-61°。

实施例2

银杏内酯B化合物的制备：

在搅拌条件下向1000ml乙酸乙酯中先加入硅藻土40g，再加入银杏叶提取物50g，于78℃加热回流1.5小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为4ml：1g；往浓缩液中加入约1/9体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：4，氧化铝为200目，上样量与氧化铝的重量比为1：7，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/4BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.6%，银杏内酯A的含量小于0.3%。成品的比旋度为-59.3°。

实施例3

银杏内酯B化合物的制备：

在搅拌条件下向850ml乙酸乙酯中先加入硅藻土60g，再加入银杏叶提取物50g，于80℃加热回流1小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为3ml：1g；往浓缩液中加入约1/11体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：10，氧化铝为300目，上样量与氧化铝的重量比为1：10，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/2BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.7%，白果内酯未检出，银杏内酯A的含量为0.3%，总银杏酸的含量为0.12ppm。成品的比旋度为-57.8°。

实施例4

银杏内酯B化合物的制备：

在搅拌条件下向900ml乙酸乙酯中先加入硅藻土45g，再加入银杏叶提取物50g，于79℃加热回流1小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为3.5ml：1g；往浓缩液中加入约1/10体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：7，氧化铝为300目，上样量与氧化铝的重量比为1：8，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/2BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.6%，白果内酯未检出，银杏内酯A的含量为0.2%，总银杏酸的含量为0.12ppm。成品的比旋度为-58.4°。

实施例5

银杏内酯B化合物的制备：

在搅拌条件下向900ml乙酸乙酯中先加入硅藻土55g，再加入银杏叶提取物50g，于78℃加热回流1小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为3.5ml：1g；往浓缩液中加入约1/10体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：4，氧化铝为300目，上样量与氧化铝的重量比为1：8，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/2BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为65%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.7%，白果内酯未检出，银杏内酯A的含量为0.2%，总银杏酸的含量为0.10ppm。成品的比旋度为-57°～-61°。成品的比旋度为-57°。

实验例1

本实验例参照以下对比文件的方法制备了银杏内酯B，并采用本发明中的测试方法，测定了银杏内酯B成品中银杏内酯B、白果内酯、银杏内酯A、总银杏酸的含量，结果见表1。

样品1为参照专利申请CN101182325A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；

样品2为参照专利申请CN101412725A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；

样品3为参照专利申请CN1680392A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；

样品4为参照专利申请CN101302222A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；

样品5为参照专利申请CN102627656A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；

表1

	银杏内酯B	白果内酯	银杏内酯A	总银杏酸
					样品1	97.8%	未检出	1.1%	2ppm
样品2	98.3%	0.5%	0.5%	8ppm
					样品3	98.7%	0.3%	0.3%	10ppm
样品4	91.5%	1.7%	2.5%	15ppm
					样品5	98.6%	0.5%	0.3%	7ppm

表1的测定结果表明，与上述专利申请的现有技术相比，本发明制备的银杏内酯B化合物纯度高、杂质的含量少，特别是白果内酯、银杏内酯A、总银杏酸的含量非常低，可作为注射剂的原料药，极大地提高了患者的用药安全。

实验例2

本实验例测试了本发明制备的银杏内酯B化合物的稳定性。

样品1为实施例1产品，样品2为实施例2产品；样品3为实施例5产品；

样品4为采用专利CN101182325A实施例1的方法得到的HPLC纯度为97.8%的银杏内酯B；

样品5为采用专利CN1680392A实施例1的方法得到的HPLC纯度为99.0%的银杏内酯B；

样品各取1g，本实验按照中国药典2005版第二部附录XIX C药物稳定性试验指导原则进行，结果如下：

表2、加速试验结果

表3、长期试验结果

银杏内酯B化合物中，作为杂质的银杏内酯A、白果内酯以及总银杏酸对银杏内酯B的稳定性都有一定的影响，本发明提供的杏内酯B化合物中杂质的种类和含量较少，银杏内酯B的纯度较高，杂质对银杏内酯B的稳定性影响较小，通过加速试验及长期稳定试验考察，结果表明本发明的银杏内酯B化合物相对于现有技术具有更好的稳定性，加速、长期试验纯度含量变化小。

Claims (10)

1.一种新的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中银杏内酯B的含量大于99%，所述银杏内酯B化合物中含有银杏内酯A，所述银杏内酯A的含量低于0.4%,所述的银杏内酯B化合物的结构式为：

2.根据权利要求1所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B的含量大于99.6%，所述银杏内酯A的含量低于0.3%。

3.根据权利要求2所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物中不含白果内酯。

4.根据权利要求1所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物中总银杏酸的含量小于0.12ppm。

5.根据权利要求1-4任一项所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物的甲醇溶液在20℃时的比旋度为-57°～-61°。

6.一种权利要求1-5任一项所述的银杏内酯B化合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

（1）在搅拌条件下向乙酸乙酯中先加入硅藻土，再加入银杏叶提取物，于78-85℃加热回流0.5-1.5小时，过滤，浓缩；加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.8-1.2倍，乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为15-20ml/g；

（2）再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；

（3）洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60～70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；

（4）粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.9-1.1倍；乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为16-18ml/g。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，滤液浓缩至液固比为3-5ml/g。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：10，氧化铝为200～300目，上样量与氧化铝的重量比为1：7～10，洗脱速度为1/4～1/2BV/h；优选的，所述酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：7，上样量与氧化铝的重量比为1：8。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，粗结晶依次用乙醇重结晶3次以上、乙酸乙酯重结晶1次以上。