CN103134852A - 一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学生物学领域，涉及一种利用核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法。首先，将直径13nm的纳米金胶滴在靶板上，晾干并煅烧，在靶板上形成均匀厚实的金膜。该方法能在靶板表面修饰具有疏松孔状结构的金膜，提供了大的比表面积，并且具有优秀的稳定性和生物相容性，可以用于多种功能化修饰。然后，在靶板上固定巯基修饰的核酸适配体。接下来，富集目标蛋白并辅以靶上快速激光酶解，并将样品送入MALDI-TOFMS进行定性和定量分析。整个实验流程简单、快速、准确，可在高通量定性和定量分析重要蛋白中得到广泛的应用。
Description
技术领域
本发明属于化学生物学领域，具体涉及一种利用适配体靶上富集目标蛋白并辅以激光酶解，和MALDI-TOF MS分析，用于简单、快速、准确对目标蛋白质分子进行定性和定量分析的方法。
背景技术
蛋白质分子标记物是一类重要的生物大分子，能够提供疾病发生，发展的信息。对蛋白质分子标记物的检测可以促进疾病的早期诊断，监控疾病的进展，促进后续的治疗等等，因此非常重要。然而目前许多具有临床应用的蛋白质分子标记物在体液中往往处在很低的浓度水平，检测十分困难。传统的方法是利用基于抗体的免疫方法，如ELISA等，因为抗体对底物分子具有高度的亲和力和特异性，能够将目标蛋白从复杂的背景中提取出来。近些年来核酸适配体发展迅速，被广泛应用在检测和诊断中，是一种十分有前景的抗体替代物。核酸适配体是一种寡聚单链核酸（ssDNA或RNA），通过称为“指数富集的配基系统进化技术”（SELEX）的体外筛选方法而获得。与抗体相比，核酸适配体具有以下几个优点：（1）可以用化学的方法批量合成，具有成本低，序列准确的特点；（2）底物范围更广，小到离子、小分子，大到蛋白、细胞都可以成为它结合的目标；（3）适配体更加稳定，更容易被化学修饰。目前已经有许多基于荧光、电化学、比色的适配体检测方法。
MALDI-TOF MS技术被广泛地运用在生物分子的分析中。MALDI-TOF MS具有高通量，操作相对简单，分析速度快，分辨率高，灵敏度高的优点。利用MALDI-TOF MS作为检测单元与其他方法相比具有几个优点：（1）底物的身份可以通过质量信号或者串级质谱信号得到进一步的确认；（2）底物的后修饰情况，或者异构情况可以通过质谱进行分析；（3）MALID-TOF MS具有无与伦比的快速分析能力和质量分辨能力，可以实现对多个底物分子的同时检测，并能进行数百个样品的高通量分析。
因此，提供一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法势在必行。
发明内容
本发明目的在于提供一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法。
本发明内容提供了一种在靶板表面修饰具有疏松多孔结构的金膜的方法，具体步骤如下：
（1）将50-100nmol/L的金胶溶液点在靶板的表面，自然晾干10-12小时后，将靶板在150-200 ℃下煅烧1-3小时，得到表面修饰金膜的靶板；
（2）将一端为巯基修饰的核酸适配体共价修饰在表面修饰金膜的靶板表面；
（3）将需要分析的目标蛋白滴在步骤（2）所得的靶板上，在湿盒（英文名称：Humidity Chamber）中放置1 小时后，用体积比为0.1% 的吐温20 和去离子水依次进行冲洗，晾干；
（4）将步骤（3）所得的靶板表面滴加10-30 ng/μL的胰蛋白酶溶液，用激光照射10-40 秒，晾干；
（5）在步骤（4）所得的靶板表面上滴加基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（即CHCA），送入质谱分析。
本发明中，步骤（1）中所述金胶的尺寸为13 nm，合成步骤为：
(a) 在连有回流冷凝管的三颈烧瓶中加入1mmol/L 氯金酸（HAuCl4）溶液并煮沸；
(b) 加入38.8mmol/L柠檬酸三钠溶液，回流15min；
(c) 冷却。将所得到的红色溶液通过0.22μm滤膜过滤，即得尺寸为13nm的纳米金胶。本发明中，步骤（1）所述的金胶溶液的浓度为 92nmol/L。
本发明中，步骤（4）所述的激光波长为808 nm。
本发明的有益效果在于：所提供的靶板表面修饰金膜的方法简单，所形成的金膜具有疏松的多孔结构，具有较大的比表面积和稳定性，有利于下一步的修饰和应用。同时，适配体靶上富集、激光酶解和MALDI-TOF MS技术能够对目标蛋白进行简单、快速、准确的定性和定量。
附图说明
图1为一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法的流程示意图；
图2为实施例1中表面修饰金膜的靶板电子扫描显微镜的照片；
图3为实施例2中5000 ng/mL 溶菌酶质谱质谱图，信号肽段（m/z=1400.6）为其中最强的峰；
图4为实施例2中利用溶菌酶信号肽段（m/z=1400.6）建立的标准溶液中线性曲线；
图5为实施例2中1000 ng/mL溶菌酶溶液质谱图；
图6为实施例2中100 ng/mL溶菌酶溶液质谱图；
图7为实施例2中14 ng/mL溶菌酶溶液质谱图；
图8为实施例2中适配体靶上富集和激光酶解检测对细胞色素C的选择性示意图；
图9为实施例2中适配体靶上富集和激光酶解检测对人血清白蛋白的选择性示意图；
图10为实施例2中适配体靶上富集和激光酶解检测对转铁蛋白的选择性示意图；
图11为实施例2中适配体靶上富集和激光酶解检测对凝血酶的选择性示意图；
图12为实施例2中适配体靶上富集和激光酶解检测对肌红蛋白的选择性示意图；
图13为实施例2中适配体靶上富集和激光酶解检测对溶菌酶的选择性示意图；
图14为实施例3中人尿样中添加溶菌酶蛋白的标准曲线；
图15 为实施例3中5000 ng/mL 溶菌酶浓度下尿液中溶菌酶的检测结果；
图16为实施例3中500 ng/mL 溶菌酶浓度下尿液中溶菌酶的检测结果；
图17为实施例3中100 ng/mL 溶菌酶浓度下尿液中溶菌酶的检测结果；
图18为实施例3中空白尿液中溶菌酶的检测结果；
图19为实施例3中人尿样中内源性溶菌酶的肽段（m/z=1400.6）串级质谱图及与标准溶菌酶信号肽段的（m/z=1400.6）串级质谱图对比（图a为标准溶菌酶蛋白信号肽段串级质谱图，图b为人尿样中内源性溶菌酶肽段的串级质谱图）。
图中标号，1为金胶，2为靶板，3为表面修饰金膜的靶板，4为适配体，5为蛋白质，6为激光，星号表示胰蛋白酶自降解峰，三角形表示溶菌酶峰，圆形表示内标肽峰。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：
实施例1：
表面修饰金膜的靶板的制备,制备流程如图1所示：
（1） 利用经典Frens法，在柠檬酸钠保护下合成金胶，具体步骤为:
(a) 在连有回流冷凝管的三颈烧瓶中加入1mmol/L 氯金酸（HAuCl4）溶液并煮沸；
(b) 加入38.8mmol/L柠檬酸三钠溶液，回流15min；
(c) 冷却。将所得到的红色溶液通过0.22μm滤膜过滤，即得尺寸为13nm的纳米金胶。
（2） 取10 mL金胶，在20000 rcf离心力下离心20min，弃去上清。根据在260nm下的吸光度将金胶浓度调整到92 nmol/L；
（3） 将 2μL 92 nmol/L金胶点在干净的靶板上，自然晾干过夜；
（4） 将烘箱调整到200 ℃，放入靶板，煅烧2 h；
（5） 自然冷却，用去离子水轻轻冲洗，晾干备用。
所得的表面修饰金膜靶板的电镜结果如图2所示, 电镜型号为Philips XL30(荷兰)，工作电压 20 kV。无需喷金，直接将修饰了金膜的靶板通过导电胶粘贴在电镜的样品台上，进样分析。
实施例2：以溶菌酶为模式蛋白，利用核酸适配体进行靶上富集、激光酶解和MALDI-TOF MS定性、定量分析：
（1）巯基修饰的溶菌酶适配体的固定：将巯基修饰溶菌酶适配体用2.5 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）处理1h，取2μL点于靶板上。将靶板放于湿盒中，避光过夜；
（2）标准蛋白溶液的配置：将溶菌酶蛋白用磷酸盐缓冲液（PBS，10 mM，pH7.4，含30μg/mL 人白蛋白）分别稀释到5000 ng/mL，1000 ng/mL，100 ng/mL，14 ng/mL；
（3）富集：吸取2μL溶菌酶蛋白溶液与MALDI靶板上，室温下湿盒中反应1h。依次用0.1%吐温20和去离子水冲洗1min。晾干；
（4）激光酶解：用25 mmol/L 碳酸氢铵缓冲液配置25 ng/μL胰蛋白酶溶液。取2μL点在富集有溶菌酶的靶板上。用激光照射30s。晾干。加入内标肽段SR-12；
（5）质谱分析：加入CHCA（α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质，送入MALDI-TOF MS分析。利用溶菌酶肽段m/z=1400.6和内标SR-12进行定性和定量分析。其中内标肽SR-12与溶菌酶肽段m/z=1400.6仅相差一个氨基酸，分子量相差14 Da。
质谱检测结果如图3-13所示，图8-13是适配体靶上富集和激光酶解检测溶菌酶方法的选择性示意图，可以得出其他5种蛋白（人血清白蛋白(Human Serum Albumin），肌红蛋白(Myoglobin），细胞色素C(Cytochrome C)，凝血酶（Thrombin），转铁蛋白（Transferrin））对溶菌酶的检测没有干扰。
实施例3：将溶菌酶添加到人尿液中，利用核酸适配体进行靶上富集、激光酶解和MALDI-TOF MS定性、定量分析：
（1）尿样的制备：收集健康人晨尿，离心去除沉淀，用0.22μm滤膜过滤，存于-20℃。将溶菌酶直接加入尿样分别至5000 ng/mL，500 ng/mL，100 ng/mL浓度；
（2）按照实施例2步骤（3），（4），（5）所述对样品进行富集，激光酶解和质谱分析。对溶菌酶进行定性和定量；
（3）尿液中内源性溶菌酶的检测：尿样中不添加任何蛋白，直接按实施例2步骤（3），（4），（5）所述对空白尿样进行富集，激光酶解和质谱分析。对肽段m/z=1400.6进行MS/MS分析，与标准的MS/MS谱图进行比对。利用标准曲线计算得出空白尿样中的内源性溶菌酶的浓度为125ng/mL。
质谱检测结果如图14-19所示。
Claims (5)
1.一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）将50-100nmol/L的金胶溶液点在靶板的表面，自然晾干10-12小时后，将靶板在150-200 ℃下煅烧1-3小时，得到表面修饰金膜的靶板；
（2）将一端为巯基修饰的核酸适配体共价修饰在表面修饰金膜的靶板表面；
（3）将需要分析的目标蛋白滴在步骤（2）所得的靶板上，在湿盒中放置1小时后，用体积比为0.1% 的吐温20 和去离子水依次进行冲洗，晾干；
（4）将步骤（3）所得的靶板表面滴加10-30 ng/μL的胰蛋白酶溶液，用激光照射10-40 秒，晾干；
（5）在步骤（4）所得的靶板表面上滴加基质α-氰基-4-羟基肉桂酸，进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法，其特征在于步骤（1）中所述金胶的尺寸为13 nm，其合成步骤为：
(a) 在连有回流冷凝管的三颈烧瓶中加入1 mmol/L 氯金酸溶液并煮沸；
(b) 加入38.8mmol/L柠檬酸三钠溶液，回流15 min；
(c) 冷却，将所得到的红色溶液通过滤膜过滤，即得所需金胶。
3.根据权利要求1所述的一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法，其特征在于步骤（1）所述的金胶溶液的浓度为 92 nmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法，其特征在于步骤（4）所述的激光波长为808 nm。
5.根据权利要求1所述的一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法，其特征在于步骤（4）所述的胰蛋白酶溶液浓度为25 ng/μL。
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