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CN103079592B - 使用来自细胞的微泡治疗和诊断癌症的方法 - Google Patents

使用来自细胞的微泡治疗和诊断癌症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗和/或诊断癌症的方法，该方法使用来自细菌细胞的微泡，其在癌症治疗中提高癌症治疗效果并降低治疗药物的副作用。此外，本发明提供一种使用负载药物的细菌细胞的微泡来递送用于治疗或诊断疾病的药物，从而有效并且特异地治疗和诊断疾病。

Description

使用来自细胞的微泡治疗和诊断癌症的方法
技术领域
本发明涉及一种使用来自细菌细胞的微泡，治疗癌症和/或诊断癌症的方法。特别地，本发明涉及一种使用来自细菌细胞的微泡的组分治疗癌症的方法。
背景技术
在1813年，Vautier报道了在同时患有厌氧细菌产气荚膜梭菌感染引起的气性坏疽的患者中癌症的明显治愈。自那时起，对于有意注射各种细菌进行了广泛研究，所述细菌除了梭菌之外，还包括鼠伤寒沙门氏菌，即细菌介导的癌症治疗的概念。当癌细胞生长超过一定大小（大约1mm3）时，其经受周围血管的氧气供应不足，形成癌组织内缺氧。缺氧状态下的癌组织提供了厌氧细菌容易增殖的环境，同时其可能使用各种毒素和/或通过未知机制攻击周围癌细胞至坏死。已进行了各种尝试以增强细菌介导的癌症治疗。例如，细菌被转化以表达抗癌蛋白质，或用于递送携带抗癌蛋白质基因的质粒至癌组织。为了减轻由细菌增殖和毒素产生的副作用，也尝试将营养缺陷型突变体、孢子和减毒细菌用于癌症治疗。尽管这些努力，但在癌症治疗中使用细菌一直存在癌症周围的正常组织或器官中细菌增殖的风险。
广义上细菌中具有两种不同类型的细胞壁，称为革兰氏阳性和革兰氏阴性。已知革兰氏阴性菌，诸如大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌和福氏志贺氏菌自发地从外膜脱落微泡。来自革兰氏阴性菌细胞脱落的微泡被称为外膜囊泡，通常由脂质双分子层组成。通常其为大小为20～200nm的球状，并具有各种生物活性物质，诸如脂多糖(LPS)和外膜蛋白、脂质和遗传物质（DNA，RNA），其影响宿主细胞的炎症反应。来自细菌细胞脱落的微泡用作信息载体，其在同源细胞之间的蛋白质或遗传物质输送中及细胞至细胞的信号传导中起重要作用，并有助于竞争生物体的去除或细菌的存活。此外，脱落的微泡将毒素传递至宿主，因此部分地解释了细菌性疾病的病原学。在死于严重败血症的患者血液中发现脱落的微泡的报道表示脱落的微泡在败血症的病理学中起重要作用，败血症的特征是全身性炎症反应。发现来自细菌细胞脱落的微泡刺激宿主细胞分泌炎症性细胞因子和凝结剂的研究也支持上述观点。
本发明人首次发现，革兰氏阳性菌，包括枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌产生脱落的微泡。然而，还需要更多关于来自革兰氏阳性菌细胞脱落的微泡的组分或功能的信息。
已分离并观察到从各种细菌种类自发脱落的微泡。通常，通过过滤或超速离心从细胞培养物中分离脱落的微泡。此外，已知可用抗生素（诸如庆大霉素）控制脱落的微泡的产生。特别地，建议通过清洁剂处理制备脱落的微泡可能应用为抗脑膜炎奈瑟氏菌（一种细菌性病原体）感染的疫苗。然而，这些生产方法的容量受到严格限制。
尽管癌症和细菌之间的关系，但迄今为止未报道来自细菌细胞脱落的微泡在癌症发病及发展中的作用，特别地，未报道应用来自细菌细胞脱落的微泡治疗癌症和/或诊断癌症。
发明内容
技术问题
根据本发明，本发明人彻底深入的研究发现包含来自细菌或转化细菌的微泡的组合物能有效地抑制癌细胞的生长。
因此，本发明提供了一种使用来自细菌细胞的微泡治疗癌症和/或诊断癌症的方法，其在癌症治疗中卓有成效并显著减少副作用，及一种使用负载药物的来自细菌细胞的微泡，递送治疗或诊断疾病药物的方法，从而有效并特异性地治疗和诊断疾病。
然而，本发明所要达到的目的不限于上述，因此本领域技术人员将理解，可从以下描述中清楚地理解其他目的。
技术方案
根据一方面，本发明涉及用于治疗癌症和/或诊断癌症的药物组合物，其包含来自细菌细胞的微泡。本发明中使用的细菌可来自革兰氏阳性或革兰氏阴性菌，且其可以是天然的或基因转化的。该组合物还进一步包含中和微泡毒性的药物、提高抗癌活性的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂和/或细胞治疗剂。
所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
根据另一方面，本发明涉及一种治疗癌症和/或诊断癌症的方法，其包括向需要的受试者施用来自细菌细胞的微泡。所述微泡可与中和微泡毒性的药物、提高抗癌活性的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂和/或细胞治疗剂一起同时/顺序地施用。
根据还一方面，本发明涉及一种用于治疗癌症和/或诊断癌症的来自细菌细胞的微泡的制备方法。在本发明的制备方法中，所述来自细菌细胞的微泡可以是从细菌自发脱落的微泡或人工微泡。
在本发明的一个实施方式中，用于治疗癌症或诊断癌症的脱落的微泡的制备方法包括以下步骤：添加药物至细菌或转化细菌的悬浮液中以得到含有药物的细菌悬浮液；并将负载药物的脱落的微泡从细菌悬浮液中分离。
在本发明的另一实施方式中，用于治疗癌症或诊断癌症的脱落的微泡的制备方法包括以下步骤：将脱落的微泡从细菌或转化细菌的培养物中分离；并培养带有药物的已分离的微泡的悬浮液。该方法还进一步包括分离负载用于治疗癌症或诊断癌症的药物的脱落的微泡。
在本发明的还一实施方式中，用于治疗癌症或诊断癌症的人工微泡的制备方法包括以下步骤：将细菌或转化细菌的悬浮液与药物混合以得到含有药物的细菌悬浮液；使用选自下组的方法对细菌悬浮液进行处理以构建人工微泡，该组由挤压、超声波处理、分裂、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成；并分离人工微泡。
在本发明的又一实施方式中，用于治疗癌症或诊断癌症的人工微泡的制备方法包括以下步骤：使用选自下组的方法对细菌或转化细菌悬浮液进行处理以构建人工微泡，该组由挤压、超声波处理、分裂、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成；分离人工微泡；并培养带有药物的已分离的微泡的悬浮液。该方法还进一步包括从细菌悬浮液中分离负载用于治疗癌症或诊断癌症的药物的人工微泡。
根据本发明的制备方法还进一步可包括使用选自由抗生素治疗、紫外线照射、γ射线照射和过滤组成的组中的方法灭菌用于治疗癌症或诊断癌症的脱落的微泡或人工微泡。
根据还一方面，本发明提供了一种包含负载治疗癌症或诊断癌症的药物的来自细菌细胞的微泡的药物组合物。
根据还一方面，本发明提供了一种包含负载治疗癌症或诊断癌症的药物的来自细菌细胞的微泡的药物组合物，所述细菌细胞被转化以靶向癌细胞或癌组织。
此外，本发明的又一方面设想一种递送治疗癌症和/或诊断癌症的药物至癌细胞或癌组织的方法，其包括使用负载药物的来自细菌细胞的微泡，所述细菌细胞被转化以靶向癌细胞或癌组织。
此外，本发明的又一方面设想一种治疗癌症和/或诊断癌症的方法，其包括使用负载药物的来自细菌细胞的微泡，所述细菌细胞被转化以靶向癌细胞或癌组织。
根据还一方面，本发明提供了一种用于递送治疗疾病和/或诊断疾病的物质的组合物，其包含负载治疗物质和/或诊断物质的来自细菌细胞的微泡。
根据还一方面，本发明涉及一种递送治疗疾病和/或诊断疾病的药物的方法，其包括使用负载治疗药物和/或诊断药物的来自细菌细胞的微泡。
根据另一方面，本发明涉及一种递送治疗疾病和/或诊断疾病的药物至目的细胞或目的组织的方法，其包括使用负载治疗药物和/或诊断药物的来自细菌细胞的微泡，所述细菌细胞被转化以靶向目的细胞或目的组织。
根据还一方面，本发明涉及一种治疗疾病和/或诊断疾病的方法，其包括递送负载治疗疾病和/或诊断疾病的药物的微泡。
根据另一方面，本发明涉及一种用于诊断疾病和/或治疗疾病的药物递送系统，其包含负载治疗疾病和/或诊断疾病的药物的微泡。
根据还一方面，本发明涉及一种诊断疾病的试剂盒，其包含负载诊断疾病的物质的来自细菌细胞的微泡。
根据还一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括施用负载蛋白质作为活性成分的来自细菌细胞的囊泡。在本发明的这种方法中，所述蛋白质可以来自革兰氏阴性或革兰氏阳性菌。在该方法的一个实施方式中，所述微泡可负载中和微泡组分副作用的药物、提高抗癌活性的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂和/或细胞治疗剂。
根据又一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括施用负载核酸作为活性成分的来自细菌细胞的囊泡。在本发明的这种方法中，所述核酸可以来自革兰氏阴性或革兰氏阳性菌。在该方法的一个实施方式中，所述微泡可负载中和微泡核酸的副作用的药物、提高抗癌活性的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂和/或细胞治疗剂。
根据又一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括施用负载脂质作为活性成分的来自细菌细胞的囊泡。在本发明的这种方法中，所述脂质可以来自革兰氏阴性或革兰氏阳性菌。在该方法的一个实施方式中，所述微泡可负载中和微泡脂质的副作用的药物、提高抗癌活性的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂和/或细胞治疗剂。
根据还一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括施用负载两种或多种选自蛋白质、核酸及脂质的组分作为活性成分的来自细菌细胞的微泡。在该方法的一个实施方式中，所述微泡可负载中和微泡组分的副作用的药物、提高抗癌活性的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂和/或细胞治疗剂。
根据还一方面，本发明涉及在癌症治疗中与蛋白质重组的纳米颗粒治疗剂的用途，所述蛋白质是来自细菌细胞的微泡的组分。
根据另一方面，本发明本发明涉及在癌症治疗中负载核酸的纳米颗粒治疗剂的用途，所述核酸是来自细菌细胞的微泡的组分。
根据还一方面，本发明涉及在癌症治疗中与脂质重组的纳米颗粒治疗剂的用途，所述脂质是来自细菌细胞的微泡的组分。
根据又一方面，本发明涉及在癌症治疗中与两种或多种来自细菌细胞的微泡的组分负载或重组的纳米颗粒治疗剂的用途。
根据还一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，包括施用来自细菌细胞的微泡的组分。在本发明的一个实施方式中，来自细菌细胞的微泡的组分可与中和组分毒性的药物、提高抗癌活性的药物或负载这种药物的纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂一起同时或顺序地施用。
所述纳米颗粒治疗剂是大小10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
在本发明的一个实施方式中，蛋白质作为一种来自细菌细胞的微泡的组分存在，包括水溶性蛋白、脂溶性蛋白或膜蛋白，但不限于此。
在本发明另一实施方案中，核酸可包括DNA和RNA，但不限于此。
有益效果
根据本发明的来自细菌细胞的微泡可用于治疗癌症或诊断癌症，减少传统药物的副作用，由此可以减少患者在治疗过程中的痛苦和不便。
传统的抗癌药物非特异性地作用于增殖细胞，在正常细胞上产生细胞毒性导致副作用。此外，传统施用方法使抗癌药物不仅被递送至癌细胞或癌组织，还递送至非癌器官，从而导致严重的副作用。随着衰老人口的增加，老年人患癌症已上升为社会问题。免疫功能异常，即失去控制癌细胞生长的能力，大体上解释了癌症的发生和发展，但只有极少数情况下，通过增强防御机制有效抑制癌细胞生长而治疗癌症。
本发明的来自细菌细胞的微泡可用于有效抑制癌细胞的生长。一旦它们负载靶分子，来自细菌细胞的微泡，无论细菌细胞是否被转化，可靶向癌症血管、癌细胞或癌组织，从而最小化由微泡的错误靶向引起的副作用。此外，当诸如抗癌剂、抗炎剂等药物负载于微泡或封装于其中时，微泡可准确地递送药物并最大限度地提高药物的治疗效果，同时不靶向非靶细胞，也不会引起副作用。此外，可使用根据本发明的遗传、化学或机械方法制备降低毒性并提高治疗能力的微泡。
此外，本发明的来自细菌细胞的微泡具有同时被用于治疗癌症和诊断癌症的优势。特别地，来自转化至靶向癌细胞或目的组织的细菌的微泡，或显示分子靶向癌细胞或目的组织的或负载诸如荧光剂的外部可检测物质的来自细菌细胞的微泡，可同时应用于癌症治疗和癌症诊断。
另外，当本发明的来自细菌细胞的微泡负载与治疗和诊断疾病相关的物质时，其可用于治疗和诊断除癌症外的疾病。微泡可特异性地递送物质至靶细胞或靶组织，从而改善了疾病的治疗和诊断。
本发明的来自细菌细胞的微泡的另一个优势是其大量生产及适用性广泛。
此外，只要由细菌细胞表达，任何靶分子、治疗物质或诊断物质可不经纯化负载于来自细菌细胞的微泡上或负载于该微泡中。负载物质可有效地发挥其固有功能。
此外，根据本发明的负载治疗物质和/或诊断物质的来自细菌细胞的微泡及其制备方法可用于体外和/或体内治疗、诊断或实验。
附图说明
图1示出了通过挤压由革兰氏阴性菌大肠杆菌构建的微泡的TEM图像。
图2示出了在结肠癌的动物模型中来自革兰氏阴性菌大肠杆菌的脱落的微泡（大肠杆菌MV）抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图3示出了在结肠癌的动物模型中来自革兰氏阴性菌绿脓假单胞菌的脱落的微泡（绿脓假单胞菌MV）抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图4示出了在结肠癌的动物模型中来自革兰氏阴性菌肠炎沙门氏菌的脱落的微泡（肠炎沙门氏菌MV）抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图5示出了在结肠癌的动物模型中来自革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的脱落的微泡（金黄色葡萄球菌MV）抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图6示出了在结肠癌的动物模型中来自革兰氏阳性菌嗜酸乳杆菌的脱落的微泡（嗜酸乳杆菌MV）抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图7示出了在结肠癌的动物模型中来自野生型大肠杆菌和被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的脱落的微泡（大肠杆菌MV）对癌组织生长（肿瘤体积）的抗癌效应的图表。
图8示出了在结肠癌的动物模型中来自野生型金黄色葡萄球菌和被转化为具有减弱脂磷壁酸毒性的突变型金黄色葡萄球菌的脱落的微泡（金黄色葡萄球菌MV）对癌组织生长（肿瘤体积）的抗癌效应的图表。
图9示出了在转移性黑色素瘤的动物模型中来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的脱落的微泡（大肠杆菌MV）对癌组织生长（菌落数）的抗癌效应的图表。
图10示出了对结肠癌的动物模型共同施用来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的脱落的微泡（MV）和阿司匹林（ASA）的抗癌活性的图表。
图11示出了负载阿霉素的绿色荧光（DiO）标记的来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的脱落的微泡（突变型大肠杆菌MV）的图像。
图12示出了负载阿霉素（Doxo）的来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的脱落的微泡（MV+Doxo）对小鼠结肠26细胞系的抗癌活性的图表。
图13示出多粘菌素B（PMB）对来自大肠杆菌脱落的微泡（大肠杆菌MV）的副作用（全身性炎症引起的死亡）的效应图。
图14示出了来自野生型大肠杆菌的微泡（野生型MV）和来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的微泡（突变型MV）对来自大肠杆菌脱落的微泡的副作用（全身性炎症引起的死亡）的效应图。
图15示出了静脉注射来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的微泡（突变型大肠杆菌MV）后血小板数量的变化图。
图16示出了静脉注射来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的微泡（突变型大肠杆菌MV）后D-二聚体水平的变化图。
图17示出了在平板上培养来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的微泡（突变型大肠杆菌MV）后，在血液琼脂平板上观察到溶血的图示。
图18示出了来自野生型金黄色葡萄球菌和被转化为具有减弱脂磷壁酸毒性的突变型金黄色葡萄球菌的脱落的微泡（金黄色葡萄球菌MV）的副作用（由炎症细胞释放IL-6）的图表。
图19示出了在结肠癌的动物模型中共同施用阿司匹林（ASA）对来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的微泡（MV）的副作用（白细胞计数，全身性炎症反应的指标）的效应图。
图20示出了在结肠癌的动物模型中，来自被转化为具有减弱脂多糖毒性的突变型大肠杆菌的微泡（突变型大肠杆菌MV）将100nm大小的荧光微球递送至癌细胞的图像。
图21示出了在结肠癌的动物模型中来自细菌细胞脱落的微泡的主要外膜蛋白OmpA抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图22示出了在结肠癌的动物模型中来自OmpF-敲除（OmpF-/-）突变型大肠杆菌和野生型大肠杆菌（WT）的脱落的微泡（大肠杆菌MV）抑制癌组织生长（肿瘤体积）的图表。
图23示出了来自细菌细胞的微泡的组分OmpA作为纳米颗粒载体与脂质体重组后脂质体中存在OmpA的图示。
具体实施方式
根据一方面，本发明提供了一种用于治疗癌症和/或诊断癌症的药物组合物，其包含来自细菌细胞的微泡。
本发明中使用的细菌可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌的例子有大肠杆菌、绿脓假单胞菌和沙门氏菌。革兰氏阳性菌的例子包括金黄色葡萄球菌和嗜酸乳杆菌，但不限于此。
如本文所使用的术语“细菌”是指天然存在的细菌或转化细菌。更具体地，如本文所使用的术语“转化细菌”是指包括，但不限于，被转化为具有减弱毒性的细菌，例如，具有改性的内毒素基因；被转化的以表达靶向目的细胞或组织所必需的物质的细菌，例如癌症血管、癌组织或癌细胞；及被转化的以表达细胞膜与靶细胞融合，治疗和/或诊断目的疾病所必需的物质的细菌；及被转化的以同时上调目的物质和下调目的物质的细菌。
此外，通过用物质处理细胞或将外源基因导入细胞中转化细菌两次或多次。
在本发明的一个实施方式中，细菌可被转化以下调至少一种目的蛋白。
在本发明的一个实施方式中，转化细菌可用于表达一种或多种物质，所述物质选自由细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白及其融合蛋白所组成的组，但不限于此。
如本文所使用的术语“来自细菌细胞的微泡”是指包含由细菌自发分泌的“脱落的微泡”，及使用遗传、化学或机械方法人工合成的“人工微泡”。
如本文所使用的术语“来自细菌细胞的微泡”指的是亚细胞大小的囊泡，其内部和外部环境仅通过脂双层膜分开，且其具有质膜脂质、质膜蛋白、核酸和细菌组分。
可使用以下说明的非限制性的方法之一构建本发明的脱落的微泡。
(1)培养细菌或转化细菌，并过滤及超速离心培养物以得到脱落的微泡。
(2)用清洁剂处理细菌或转化的细菌，并过滤及超速离心培养物以得到脱落的微泡。对清洁剂不赋予任何限制。
(3)用抗生素处理细菌或转化的细菌，并过滤及超速离心培养物以得到脱落的微泡。抗生素不赋予特别限制，且其包括庆大霉素、氨苄青霉素和卡那霉素。
可使用选自下组方法处理含有细菌的悬浮液以构建本发明的人工微泡，该组由挤压、超声波处理、分裂、均质化、冻融、电穿孔、机械降解及化学处理组成，构建方法不限于此。
在本发明的一个实施方式中，来自细菌细胞的微泡还进一步包含来自细菌细胞膜的组分以外的膜内组分。
来自细菌细胞膜以外的组分还包含靶向分子、膜融合靶细胞所必需的融合剂、环糊精及聚乙二醇。此外，可使用各种方法，包括细胞膜的化学改性，添加来自细胞膜以外的组分。
例如，来自细菌细胞的微泡的膜组分可用巯基(-SH)或胺基(-NH2)化学改性或通过化学方法将聚乙二醇结合至膜。
根据本发明的来自细菌细胞的微泡的制备方法还进一步包括膜组分的化学改性。
根据本发明的一个实施方式，药物组合物还进一步包含中和微泡自身毒性的药物。在这方面，所述药物可负载于微泡。所述药物功能为抑制内毒素的毒性，且其可为多粘菌素B。
根据本发明的另一实施方式，药物组合物还进一步包含提高抗癌活性的药物。在这方面，所述药物可负载于微泡。本发明中使用的药物包含抑制Th17(辅助性T细胞17)免疫应答的药物、抑制白介素6(IL-6)的产生或活性的药物、抑制血管内皮生长因子(VEGF)的产生或活性的药物、抑制STAT3(信号传导及转录激活因子3)信号传导的药物、抗癌剂、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂及用于癌症的细胞治疗剂。抑制Th17免疫应答的药物可以是阿司匹林，且抑制VEGF形成或活性的药物可起到中断VEGF受体介导的信号传导的作用。负载抗癌剂的纳米颗粒可以是脂质体，诸如DOXIL。
纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其例子包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体，例如，生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体或其组合。如果需要，所述药物组合物还进一步包含典型的添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲液等。此外，借助稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂和/或润滑剂，所述药物组合物可配制成注射剂，诸如水溶液、悬浮液、乳剂等、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。此外，可根据本领域众所周知的方法或Remington′sPharmaceutical Science（Mack Publishing Company,Easton PA）中公开的方法，所述药物组合物可配制成合适的剂型。不赋予药物组合物的制剂特殊限制。优选地，所述药物组合物可配制成注射剂或可吸入形式。
不赋予本发明药物组合物的施用特殊限制。所述药物组合物可口服或肠胃外施用，诸如静脉内、皮下、腹腔内，经由吸入或局部地施用。在本发明药物组合物中活性成分的量可依据各种因素变化，所述因素包括患者体重、年龄、性别和健康情况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、疾病严重程度等。术语“日剂量”是指本发明的治疗上有效成分的量，当施用于需要的受试者时其足够缓解病情。本发明药物组合物中活性成分的合适剂量取决于负载化合物的种类、疾病严重程度及需要治疗的受试者的情况，并可由本领域技术人员确定。例如，本发明组合物的合适剂量可依据患者体重、年龄、性别和健康情况、给药途径和疾病严重程度变化，对于体重70kg的成年患者通常的剂量变化范围为0.1至1000mg/天，且优选地1至500mg/天。本发明药物组合物的总有效量可以单剂量施用于患者，或通过分级的治疗方案施用，其中在更长时间内施用多剂量。
根据另一方面，本发明涉及一种治疗癌症和/或诊断癌症的方法，其包括向需要的受试者施用来自细菌细胞的微泡。
如本文所使用的术语“受试者”指的是需要治疗目的疾病（例如癌症、血管疾病或炎症性疾病）的动物，包括人类、或非人类哺乳动物诸如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛等。
如本文所使用的术语“癌症”指的是一组不同疾病，其特征在于由于程序性细胞死亡的破坏引起的未经调节的细胞生长并浸润到邻近组织。根据本发明待处理的靶标可选自下组癌症中，但不限于此，该组由以下癌症组成：源于上皮细胞的癌症，诸如肺癌、咽喉癌、胃癌、大肠癌/直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌等，源于结缔组织细胞的肉瘤，诸如骨癌、肌肉癌、脂肪癌、纤维细胞癌等，源于造血细胞的血癌，诸如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，及神经组织肿瘤的神经瘤。
如本文所使用的术语“血管疾病”指的是一组不同疾病，其中由于代谢性、传染性、毒性或免疫原因引起血管内或血管壁内出现功能失调。根据本发明待处理的靶标可选自下组血管疾病中，但不限于此，该组由以下血管疾病组成：动脉硬化（或动脉粥样硬化）、心绞痛、急性心肌梗塞、中风、血管性痴呆、代谢性血管疾病，诸如缺血性血管疾病，及传染性、毒性或免疫血管疾病，诸如败血症、弥漫性血管内凝血、血栓栓塞、血管炎、肾炎、急性呼吸窘迫综合征、肺气肿等。
如本文所使用的术语“炎症”包括由体液在组织中异常积累造成的水肿、由于血管扩张引起的充血、由热原及血管舒张增加的热量，及花生四烯酸代谢物导致的疼痛的综合症或症状。根据时间，炎症可分类为急性炎症、亚急性炎症和慢性炎症，根据病理生理条件，炎症可分类为传染性炎症性疾病、过敏性炎症性疾病、自身免疫性炎症性疾病、毒性炎症性疾病、代谢性炎症性疾病和创伤性炎症性疾病。根据本发明待处理的靶标可选自下组中，但不限于此，该组由以下疾病组成：呼吸道炎症性疾病，诸如鼻炎、鼻窦炎、中耳炎、鼻咽炎、喉炎、支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、细支气管炎、肺炎、肺纤维化等，消化系统的炎症性疾病，诸如口腔炎、食管炎、胃炎、消化性溃疡、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、胆囊炎、胆管炎、胰腺炎、肝炎等，皮肤炎症，诸如过敏性皮炎、牛皮癣等，心血管炎症性疾病，诸如心内膜炎、心肌炎、心包炎、脉管炎、动脉硬化、败血症等，内分泌系统的炎症性疾病，诸如甲状腺炎、甲状旁腺炎、糖尿病等，泌尿生殖系统的炎症性疾病，诸如肾炎、肾病、间质性肾炎、睾丸炎、卵巢炎、子宫内膜炎、阴道炎等，肌肉骨骼系统的炎症性疾病，诸如风湿性关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、痛风、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、肌病、干燥综合征和白塞氏病及抗磷脂综合征，及神经系统的炎症性疾病，诸如血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症等。
本发明方法中使用的细菌和来自细菌细胞的微泡如上所述。
在本发明的一个实施方式中，所述方法可采用负载中和微泡自身副作用的药物的来自细菌细胞的微泡。
来自细菌细胞的微泡自身残留的副作用可通过如下各种方式减少。
(1)可由来自被遗传转化为具有减弱毒性的细菌制备微泡。例如，被转化为减弱介导宿主细胞的免疫应答的脂多糖毒性的细菌（msbB突变型）或被转化为减弱脂磷壁酸(LTA)毒性的细菌（LTA突变型）可用作微泡的来源。
(2)可采用抑制内毒素毒性的药物。这种药物可举例为多粘菌素B。这种药物可与来自细菌细胞的微泡一起施用，或负载于来自含有所述药物的细菌培养物构建的微泡。
(3)将药物用作抗炎剂和/或抗凝血剂可减少副作用。所述药物可包括阿司匹林。当与来自细菌细胞的微泡一起施用时，阿司匹林防止微泡引起的副作用，诸如炎症反应、血液凝固等。可替换地，可由存在药物条件下培养的细菌构建微泡。
(4)可通过化学改性来自细菌细胞的微泡的膜组分减少副作用。例如，膜组分可用巯基或胺基化学改性或通过膜结合聚乙二醇改性。
(5)可通过杀菌预防可能在施用来自细菌细胞的微泡时发生的细菌感染。例如，使用紫外线或γ射线或通过过滤对来自细菌细胞的微泡进行灭菌以杀死或去除细菌。
这些实例不限制减少来自细菌细胞的微泡的副作用的方法，且其可单独使用或组合使用。
在本发明另一实施方式中，可使用负载增强抗癌活性的药物的微泡。这种药物如上所述。
在本发明另一实施方式中，微泡可与抑制微泡副作用的药物和/或增强抗癌活性的药物，负载这种药物的纳米颗粒治疗剂以及细胞治疗剂组合施用于受试者。
所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
如本文所使用的术语“负载”指的是，但不限于，在来自细菌细胞的微泡的表面显示目的物质或将物质封装进微泡内的过程。
此外，根据另一方面，本发明提供了一种用于癌症治疗和/或癌症诊断的来自细菌细胞的微泡的制备方法。在本发明的制备方法中，来自细菌细胞的微泡包括由细菌自发释放的脱落的微泡，或人工微泡。
根据一个实施方式，所述用于癌症治疗或癌症诊断的脱落的微泡的制备方法包括以下步骤：添加药物至细菌或转化细菌的悬浮液中以得到含有药物的细菌悬浮液；并将负载药物的脱落的微泡从细菌悬浮液中分离。
根据另一实施方式，所述用于癌症治疗或癌症诊断的脱落的微泡的制备方法包括以下步骤：将脱落的微泡从细菌或转化细菌的培养物中分离；并培养带有药物的已分离的微泡的悬浮液。该方法还进一步包括分离负载用于癌症治疗或癌症诊断的药物的脱落的微泡。
在本发明的一个实施方式中，所述用于癌症治疗或癌症诊断的人工微泡的制备方法包括以下步骤：将细菌或转化细菌的悬浮液与药物混合以得到含有药物的细菌悬浮液；使用选自下组的方法对细菌悬浮液进行处理以构建人工微泡，该组由挤压、超声波处理、分裂、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成；并从细菌悬浮液中分离负载用于癌症治疗或癌症诊断的药物的人工微泡。
在本发明的另一实施方式中，所述用于癌症治疗或癌症诊断的人工微泡的制备方法包括以下步骤：使用选自下组的方法对细菌或转化细菌悬浮液进行处理以构建人工微泡，该组由挤压、超声波处理、分裂、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和化学处理组成；分离人工微泡；并在存在药物条件下培养已分离的人工微泡的悬浮液。该方法还进一步包括从人工微泡的悬浮液中分离负载用于癌症治疗或癌症诊断的药物的人工微泡。
根据本发明的用于癌症治疗或癌症诊断的脱落的微泡或人工微泡的制备方法可进一步包括使用选自由抗生素处理，紫外线照射，γ射线照射和过滤组成的组中的的方法灭菌脱落的微泡或人工微泡。
本发明的制备方法还进一步包括分离亚细胞大小的负载药物的微泡。
可使用选自下组的方法进行分离步骤，该组由密度梯度、超速离心、过滤、透析和自由流电泳的方法组成。
根据本发明的另一个实施方式，所述制备方法可进一步包括去除膜拓扑结构与来源的细菌细胞不同的微泡。在构建微泡后，根据用途只选择那些与源细胞具有相同膜拓扑结构的微泡。使用识别膜蛋白胞质区的抗体，可去除胞质区暴露于外部的微泡。就是说，质膜内朝外的微泡被去除，只保留膜蛋白的胞外区被定位以朝向外部的微泡。
根据还一方面，本发明涉及一种包含负载癌症治疗和/或断癌诊症药物的来自细菌细胞的微泡的药物组合物。
根据还一方面，本发明涉及一种包含负载癌症治疗和/或癌症诊断药物的来自细菌细胞的微泡的药物组合物，所述细菌细胞被转化以靶向癌细胞或癌组织。
此外，本发明的又一方面涉及一种递送癌症治疗和/或癌症诊断药物至癌细胞或癌组织的方法，其包括使用负载药物的来自细菌细胞的微泡，所述细菌细胞被转化以靶向癌细胞或癌组织。
根据又一方面，本发明涉及一种治疗癌症和/或诊断癌症的方法，其包括使用负载药物的来自细菌细胞的微泡，所述细菌细胞被转化以靶向癌细胞或癌组织。
此外，根据还一方面，本发明涉及一种用于递送治疗疾病和/或诊断疾病的物质的组合物，其包含负载治疗物质和/或诊断物质的来自细菌细胞的微泡。
不赋予负载于来自细菌细胞的微泡的物质以特定限制。例如，所述物质可以是治疗和/或诊断中使用的一种物质，或由细菌或转化细菌自身表达的蛋白质。如果需要，所述负载物质可以不来自细胞，而是外源物质。也就是说，治疗物质和/或诊断物质可以是至少一种来自细菌的物质或从细菌细胞外导入的物质。此外，可使用，但不限于，物理、化学和/或生物方法将物质负载于微泡表面。
本发明的来自细菌细胞的微泡可以如下的各种方式负载各种治疗物质或诊断物质。
首先，可由已负载目的治疗物质或诊断物质的细胞制备微泡。例如，当在含有目的治疗物质或诊断物质的培养基中培养细胞时，细胞中可含有所述物质。可替换地，可通过电穿孔将物质导入细胞。
此外，通过超声波处理、挤压或机械降解由含有物质的细胞脱落的微泡或构建的微泡负载所述物质。
接着，所述物质可在构建微泡过程中负载于微泡。例如，通过亚细胞大小的过滤器挤压含有目的物质的细菌细胞悬浮液时，由此形成的微泡负载所述物质。
在另一可选择的实施方式中，脱落的微泡或人工微泡可在其构建或形成后负载目的物质。例如，可通过电穿孔使物质进入已制备的脱落的微泡或人工微泡中以完成负载。
然而，本领域技术人员应该理解的是将目的物质负载于微泡的方法不限制于上述方法。
本发明中使用的治疗物质和/或诊断物质是抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽类、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒或纳米颗粒，但本发明不限于此。
核酸的实例包括DNA、RNA、适体、LNA（锁核酸）、PNA（肽核酸）及吗啉寡聚核苷酸，但不限于此。
纳米颗粒说明性、非限制性的实例包括氧化铁、金、碳纳米管和磁珠，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，治疗物质和/或诊断物质可以是荧光团，但不限于此。例如，荧光团可以是荧光蛋白或量子点(Qdot)。
在本发明的另一实施方式中，治疗物质和/或诊断物质可以是一种或多种抗癌剂。
本发明的微泡可被引导至特定细胞或组织。特定组织可包括，但不限于，血管、癌症组织和炎症组织。
根据还一方面，本发明涉及一种递送治疗疾病和/或诊断疾病的药物、负载所述药物的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂的方法，其包括使用负载治疗药物和/或诊断药物的来自细菌细胞的微泡。
根据另一方面，本发明涉及一种递送治疗疾病和/或诊断疾病的物质、负载治疗疾病和/或诊断疾病的物质的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂的方法，其包括使用负载治疗物质和/或诊断物质的来自细菌细胞的微泡，所述微泡来自被转化以靶向目的细胞或目的组织的细菌细胞。
所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
借助本发明的微泡，可递送治疗疾病和/或诊断疾病的物质、负载治疗疾病和/或诊断疾病的物质的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂。
在本发明的一个实施方案中，两种或多种不同治疗物质或诊断物质可被递送至特定细胞或组织。
例如，负载两种或多种不同治疗物质或诊断物质的微泡可用于递送所述物质至特定细胞或组织。
在本发明另一实施方式中，两种或多种不同微泡可用于递送递治疗物质或诊断物质，所述微泡选自下组，该组由负载一种治疗物质或诊断物质的微泡、负载两种或多种不同治疗物质或诊断物质的微泡及其组合组成。例如，两种或多种不同微泡可同时施用。
在本发明另一实施方式中，可通过顺序地施用两种或多种不同微泡，将两种或多种不同治疗物质或诊断物质递送至特定细胞或组织，所述微泡选自下组，该组由负载一种治疗物质或诊断物质的微泡、负载两种或多种不同治疗物质或诊断物质的微泡及其组合组成。
根据本发明另一实施方式，可顺序地施用负载一种或多种治疗物质或诊断物质的微泡，负载一种或多种治疗物质或诊断物质的纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂。
此外，根据另一方面，本发明涉及一种治疗疾病和/或诊断疾病的方法，其包括将负载治疗疾病或诊断疾病的药物的来自细菌细胞的微泡递送至靶细胞或靶组织。
根据另一方面，本发明涉及一种治疗药物或诊断药物的递送系统，其包含负载治疗药物或诊断药物的来自细菌细胞的微泡。
根据另一方面，本发明涉及一种用于诊断疾病的试剂盒，其包含负载诊断物质的来自细菌细胞的微泡。所述诊断物质可选自由引物、探针、反义核酸和抗体所组成的组。
[使用来自细菌细胞的微泡递送物质]
在本发明中，可采用来自靶向特定组织的细胞的微泡或来自表达靶向蛋白的转化细胞的微泡。此外，微泡可来自表达融合剂的转化细胞。
已知血细胞，就是说单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和血小板、髓源性抑制细胞及在骨髓、血液和脂肪组织中发现的干细胞，被引导至癌症组织和炎症组织。所以，来自免疫细胞/炎症细胞或干细胞膜的微泡被引入癌症组织或炎症组织。此外，来自被转化的以表达与特定细胞或组织表达的底物选择性结合的蛋白质的细菌的微泡可被引导至特定细胞或组织。在本发明中，负载治疗物质或诊断物质后，由这种细菌细胞构建的微泡可用于递送所述物质至靶细胞、组织或血液。
存在参与引导免疫细胞/炎症细胞和干细胞至特定组织中的各种质膜蛋白。例如，包括整合素，诸如LFA-1（白细胞功能相关抗原-1）和Mac-1（巨噬细胞-1抗原）的细胞粘附分子存在于单核细胞表面。这些细胞粘附分子可与其他细胞粘附分子结合，诸如血管细胞上的ICAM-1（细胞间粘附分子-1）和VCAM-1（血管细胞粘附分子-1）。LFA-1和ICAM-1之间的相互作用允许单核细胞通过血管内皮细胞以使单核细胞被引导至炎症组织或癌症组织。
当被转化以表达来自细菌细胞的微泡的表面上特异于癌症或目的组织的质膜蛋白时，所述微泡可被引导至特定组织，诸如血管组织、癌症组织或肿瘤组织等。例如ERBB2在乳腺癌细胞表面上过表达。来自被转化以表达由细菌跨膜蛋白和特异于膜蛋白ERBB2的抗体组成的融合蛋白的细菌的微泡可被允许靶向乳腺癌组织。此外，如果细菌被转化以表达一种融合蛋白，在所述融合蛋白中识别癌组织中大量发现的癌胚抗原(CEA)的抗体与细菌跨膜蛋白相融合，来自细菌细胞的微泡可被引导至大肠癌、胰腺癌和肺癌组织。
来自细菌细胞的微泡保留着与来源细菌细胞几乎相同的膜组分，以使其朝向细菌靶向的特定组织或细胞。如果需要，在构建微泡过程中可使用核酸酶以从微泡中去除对于递送治疗物质或诊断物质不必要的核酸。
[来自细菌细胞的微泡及其制备]
来自细菌细胞的微泡可容易地负载各种需递送的治疗物质或诊断物质。所以，微泡可以单独或组合用于治疗或诊断或同时治疗和诊断（治疗诊断，药物诊断）。在这方面，当需要递送的物质被封装时其存在于微泡内，当所述物质至少部分包埋或嵌入其中（如同跨膜蛋白）或存在于微泡表面时，其存在于脂质双分子层内。
来自细菌细胞的微泡可人工地构建成各种尺寸，如脂质体。由于EPR（高通透性和滞留）效应，通常尺寸为100nm或更大的分子在癌组织中比其在正常组织中积累时间更长。因此，负载于尺寸为100nm或更大的微泡的药物有利于诊断和治疗，因为这种药物能够在癌组织中停留更长时间，从而提高治疗或诊断效果。在另一方面，当吸入时，由于肺组织的结构特点，只有尺寸1μm或更小的颗粒允许到达肺泡。一种物质，例如，用于治疗哮喘的炎症抑制剂，如果其负载于尺寸小于1μm的微泡时可将所述炎症抑制剂递送至肺组织。如所描述的，可依据负载的物质应用的组织构建各种尺寸的微泡。优选地，本发明微泡的尺寸范围为10nm至10μm。
当负载于本发明微泡的治疗物质和/或诊断物质施用于“受试者”时，可一起使用免疫抑制剂。
在本发明中，可由所有种类的细菌细胞构建微泡，例如，可以通过转化以定向到靶标（诸如特定细胞或组织）的细菌。用于递送物质至特定组织，微泡可以由定向特定组织的细菌细胞构建。此外，当由其中定向特定组织的蛋白质被上调和/或参与非特异性导向的蛋白质被下调的细胞构建微泡时，微泡可有效地用于递送治疗物质或诊断物质至，例如，血管、癌组织或炎症组织。
可使用本领域已知的典型方法完成细菌细胞的转化，例如，通过刺激细胞或将外源基因导入细菌细胞以改性，例如，上调或下调目的蛋白的表达。特定刺激可能诱导目的蛋白表达的变化。导入外源基因可能诱导或抑制目的蛋白的表达。在这方面，使用电穿孔、显微注射、超声介导或本领域已知的其他方法将质粒DNA、RNA或噬菌体导入细胞。
细菌被转化以表达能够在其表面单独或作为融合蛋白结合癌细胞、癌组织或癌血管或炎症组织的蛋白或抗体后，可由细菌细胞构建微泡。此外，可由表达治疗物质和/或诊断物质的细菌细胞或被转化以表达治疗物质和/或诊断物质的细菌细胞制备微泡。此外，可由表达上述物质的组合的细菌细胞或被转化以表达上述物质的组合的细菌细胞制备微泡。为了抑制特定蛋白的表达，可使用反义RNA、LNA、PNA等。当由定向两种靶标的细菌细胞构建微泡时，细菌细胞可以这种方式转化，其中抑制一种或多种特定蛋白的表达以降低细胞至两种靶标之一的引导。所以，增强了递送用于来自转化细胞的微泡的物质的特异性。可替换地，可使用进行两轮或多轮转化的细菌细胞。例如，初级转化株在用作构建微泡的来源前可经过二次转化。然而，本发明的制备方法不限于上述的那些方法。
可使用各种机械方法、电学或化学方法构建根据本发明的微泡。这些方法包括使用利用渗透作用的细胞溶解、电穿孔、超声波处理、均质化、清洁剂处理、冻融、挤压、机械降解和化学处理，但不限于此。在机械降解方法中，细胞溶液与金属、陶瓷或足够坚硬的塑料球一起振摇。在挤压的情况下，强制细胞按顺序地通过较大孔径的过滤器，直到较小孔径的过滤器。例如，细胞按顺序地通过三个过滤器，其孔径分别为10μm→5μm→1μm以形成微泡。
[治疗物质或诊断物质]
本发明中使用的物质可包括，但不限于，细菌或转化细菌表达的物质或细菌不表达的外源物质。
本发明中使用的治疗物质或诊断物质可负载于微泡或根据需求和目的与微泡组合施用。
在本发明的一个实施方式中，治疗物质或诊断物质其本身或作为与纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂的复合物或与微泡组合施用。
所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
作为负载于本发明的微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的治疗物质或诊断物质，可无限制地使用各种来自有细胞核的哺乳动物细胞的物质，其包括蛋白质或肽类、核酸、脂质和代谢产物。
本发明中使用的可负载的蛋白质或肽类的实例包括，但不限于，生长因子，诸如VEGF、EGF（表皮生长因子）等，细胞因子，诸如IL-1、IFN-γ（干扰素γ）、IL-10等，抗体，受体和荧光蛋白。所述蛋白质或肽类可在细胞内表达或显露在质膜上。此外，其全部或活性位点可单独表达或作为融合蛋白表达。已知由于具有较高的局部浓度，蛋白质或肽类显露在微泡上时蛋白质或肽类的活性高于其在细胞内单独存在时的活性。负载于微泡的蛋白质或肽类可用作配体以触发信号传导或用作拮抗剂抑制各种配体的功能。
根据本发明的可负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的核酸实例包括DNA、miRNA（小分子RNA）、siRNA（小干扰RNA）、反义RNA和正义RNA，但不限于此。这些核酸可用于引发正义效应、反义效应、RNA干扰或抑制蛋白质功能。
作为可负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的外源治疗物质或诊断物质，可无限制地使用抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽类、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒和纳米颗粒。
抗癌剂是抑制癌细胞生长和转移而使用的药物的通用术语。多数抗癌剂用作阻止癌细胞的复制、转录和/或翻译。不赋予本发明中使用的抗癌剂种类特殊限制。根据一般原则选则抗癌剂，其中考虑癌细胞种类、抗癌剂的吸收率（治疗的持续时间、给药途径等）、肿瘤位置、肿瘤大小等。本发明中使用的抗癌剂的例子包括DNA烷化剂，诸如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸、芥末、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、链脲菌素、二甲磺酸丁酯、三胺硫磷、顺铂及卡铂，抗癌抗生素，诸如更生霉素（放线菌素D）、多柔比星（阿霉素）、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素及C博来霉素及植物生物碱，诸如长春新碱、长春花碱、紫杉醇、多西紫杉醇、柔红霉素、紫杉酚、长春碱、强的松、顺铂、赫塞汀、利妥昔单抗、依托泊苷、替尼泊苷、拓扑替康及伊立替康。同样，可使用本领域已知的放射性物质。然而，本发明中使用的抗癌剂不限于上述例子。
此外，本发明的可负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的抗炎剂选自下组，该组由地塞米松、吲哚美辛、布洛芬、氯倍他索丙酸酯、醋酸双氟拉松、卤倍他索丙酸酯、安西奈德、醋酸氟轻松、糠酸莫米松、去羟米松、双氯芬酸及吡罗昔康组成，但不限于此。
如本文所使用的术语“血管生成抑制剂”指的是功能为抑制新血管从已存在的血管生长的药物。多数血管生成抑制剂具有抑制肿瘤生长和转移及炎症反应的功能。不赋予作为本发明的治疗物质的血管生成抑制剂的种类特殊限制。
根据本发明负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的治疗物质或诊断物质可包括蛋白质或肽类。例如，可使用核糖核酸酶A，生长因子，诸如VEGF和EGF，细胞因子，诸如IL-1、IFN-γ和IL-10、抗体疗法、脱氧核糖核酸酶，及各种抑制癌细胞生长和转移及炎症反应的蛋白质或肽类，但不限于此。
此外，根据本发明负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的治疗物质或诊断物质可包括毒素。术语“毒素”指的是在活细胞或生物体内产生的毒性物质，与机体组织接触或被机体组织吸附时其能够导致疾病。使用毒素可诱导细胞死亡。不赋予用作本发明治疗物质的毒素的种类特殊限制。
根据本发明可负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的核酸中典型的为DNA、miRNA、siRNA、反义RNA、正义RNA和适配体。此外，核酸类似物，诸如LNA、PNA和吗啉寡聚核苷酸可负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂，但不限于此。这些核酸可用于引发正义效应、反义效应、RNA干扰或抑制蛋白质功能。
在本发明中，可将负载编码荧光蛋白的核酸或负载各种荧光的微泡用于诊断。当设计为靶向特定细胞或组织的微泡负载携带编码荧光蛋白的基因的质粒DNA并导入体内时，从荧光蛋白发射的荧光信号使得能识别靶细胞或靶组织的存在。此外，荧光量子点或其他各种荧光剂可负载于微泡并用于检测体内特定的靶细胞和靶组织的位置。就是说，靶细胞或靶组织产生的荧光可用于诊断。另外，因为其诱导细胞凋亡，所以荧光发射的量子点可用于治疗疾病。
除了荧光剂，可负载于微泡的治疗物质或诊断物质还可举例为微粒或纳米粒子。实例包括氧化铁颗粒、金颗粒和碳纳米管，但不限于此。磁珠可用作治疗物质或诊断物质并负载于微泡。磁性粒子诸如氧化铁可用作MRI（磁共振成像）的图像对比剂。此外，也可以使用与纳米颗粒结合的核酸或蛋白质。还可以使用诊断性的放射性物质。
通过本发明的微泡可递送两种或多种不同物质。例如，同时负载两种或多种不同物质的微泡可用于递送所述物质。可替换地，将组合使用单独或组合地负载不同物质的微泡，以递送两种或多种不同物质。为了递送三种不同物质，例如，第一、第二和第三微泡可分别负载三种不同物质。另一方面，同时负载两种不同物质的第四微泡及负载另一种不同物质的第五微泡可用于递送三种不同物质。第一、第二和第三微泡可同时或顺序地使用。同样地，第四和第五微泡可同时或顺序地使用。
存在多种从其他分子或其他细胞组分中分离微泡的方法，所述方法的例子包括密度梯度、超速离心、过滤、透析和自由流电泳，但不限于此。
用于区分具有不同密度的材料的最流行的方法之一为密度梯度方法，可应用于分离本发明的微泡，因为其密度与游离分子的密度不同。在密度梯度方法中，使用的介质可选自，但不限于聚蔗糖、甘油、蔗糖及OptiPrepTM。负载或未负载治疗物质或诊断物质的微泡可利用其密度差异相互分离。密度梯度方法可与离心或电泳组合使用。微泡还可通过凝胶过滤或超滤作用分离。可采用透析替代过滤去除小分子。另外，自由流电泳可用于分离本发明的微泡。
根据用途，可在使用前选择在一定尺寸范围之内的微泡。可在负载治疗物质或诊断物质之前、之间或之后进行选择在一定尺寸范围之内的微泡。
在本发明中，可构建其中部分膜组分改性的微泡。例如，当由融合蛋白和细胞的混合物构建微泡时，所述融合蛋白可至少部分地暴露于微泡上。用聚乙二醇涂层微泡可将微泡转化为隐形微泡。加入环糊精至微泡可降低微泡的非特异性靶向。当将同时显示亲水性和疏水性的环糊精附着于微泡表面时，可用作阻断脂质之间的非特异性结合。微泡或脱落的微泡可被化学改性。例如，从膜蛋白或跨膜蛋白至少部分地暴露于外面的细胞构建微泡后，各种分子可在蛋白质的暴露区域与半胱氨酸残基的巯基化学结合。此外，还可通过各种分子与膜蛋白内的胺基结合使微泡的膜组分改性。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向需要的受试者施用来自细菌细胞的微泡的组分。
本发明中使用的细菌可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌的实例为大肠杆菌、绿脓假单胞菌和沙门氏菌。革兰氏阳性菌的实例包括金黄色葡萄球菌和嗜酸乳杆菌，但不限于此。
微泡的组分的实例包括蛋白质、核酸和脂质，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，作为来自细菌细胞的微泡的组分之一存在的蛋白质，包括水溶性蛋白、脂溶性蛋白或膜蛋白，但不限于此。
在本发明另一实施方式中，膜蛋白可包括OmpA、OmpF、OmpC和鞭毛蛋白，但不限于此。
在本发明另一实施方式中，核酸可包括DNA和RNA，但不限于此。
在本发明另一实施方式中，蛋白质可与至少一种物质结合，所述物质选自下组，但不限于，该组由细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白及其融合蛋白所组成。
根据另一方面，本发明涉及在治疗癌症中与蛋白质重组的纳米颗粒治疗剂的用途，所述蛋白质是来自细菌细胞的微泡的组分。
根据还一方面，本发明涉及在治疗癌症中负载核酸的纳米颗粒治疗剂的用途，所述核酸是来自细菌细胞的微泡的组分。
根据还一方面，本发明涉及在治疗癌症中与脂质重组的纳米颗粒治疗剂的用途，所述脂质是来自细菌细胞的微泡的组分。
根据又一方面，本发明涉及在治疗癌症中负载或重组两种或多种来自细菌细胞的微泡的组分的纳米颗粒治疗剂的用途。
所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
在本发明的一个实施方式中，一种新物质可进一步用作来自细菌细胞的微泡的组分。
这种新物质可包括环糊精和聚乙二醇。此外，可使用各种方法（包括化学改性）将这种新物质作为组分。
在本发明另一实施方式中，纳米颗粒治疗剂还进一步包含减少组分副作用的药物，或增强抗癌活性的药物。减少组分副作用的药物可以是阿司匹林。增强抗癌活性的药物包括抑制Th17（辅助性T细胞17）免疫应答的药物、抑制白介素6(IL-6)的产生或活性的药物、抑制VEGF（血管内皮生长因子）的产生或活性的药物、抑制STAT3（信号传导及转录激活因子3）信号传导的药物，及抗癌剂。抑制Th17免疫应答的药物可以是阿司匹林，及抑制VEGF的产生或活性的药物功能可为干扰VEGF受体介导的信号传导。
在本发明的一个实施方式中，微泡的组分可与中和组分毒性的药物、增强抗癌活性的药物、或负载这种药物的纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂一起同时/顺序地施用。
所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至10μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡。
根据本发明的另一实施方式，将两种或多种不同组分同时施用，所述组分选自由微泡的一种组分、微泡的两种或多种不同组分及其组合所组成的组。
根据本发明的另一实施方式，将两种或多种不同组分顺序地施用，所述组分选自由微泡的一种组分、微泡的两种或多种不同组分及其组合所组成的组。
根据本发明的另一实施方式，两种或多种不同组分与减少组分副作用的药物、增强抗癌活性的药物、负载药物的纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂结合并顺序地施用，所述组分选自由微泡的一种组分、微泡的两种或多种不同组分及其组合所组成的组。
通过以下解释说明的实施例可以更好地理解本发明，但不解释为本发明的限制。
实施例
实施例1：通过挤压构建的来自革兰氏阴性细菌的人工微泡及其性质
由革兰氏阴性菌通过挤压构建人造微泡。
在该实验中，使用革兰氏阴性细菌大肠杆菌。将大肠杆菌在50mL的LB培养基中培养至光密度为1.0（600nm下）。以3,500x g离心10分钟后，收集微球形式的细菌细胞，并且将细胞微球重悬于PBS（磷酸盐缓冲盐水）中。
该细胞悬浮液通过每种膜滤器过滤三次，膜滤器的孔径按顺序依次为10μm、5μm和1μm。在5mL超速离心管中，按顺序地放置来自膜滤器的1mL的50％OptiPrep，1mL的5％OptiPrep和3mL的细胞悬浮液流出物。以100,000x g超速离心3小时，在50％OptiPrep和5％OptiPrep之间形成微泡层。
分析由革兰氏阴性菌构建的人造微泡的性质。来自革兰氏阴性菌细胞的人造微泡在辉光放电碳包覆铜载网中吸附3分钟。用蒸馏水清洗该铜载网，并用2％的乙酸双氧铀染色1分钟，然后在JEM101电子显微镜（Jeol,日本）下观察。结果如图1所示。由图1的透射电子显微镜的图像可以看出，由细菌细胞通过挤压构建的人造微泡由脂质双分子层组成，并且基本上是10至100nm大小的球形。
实施例2：来自革兰氏阴性菌细胞的脱落的微泡的体内抗癌活性
为了用于本实验，从革兰氏阴性菌分离自然脱落的微泡。革兰氏阴性菌大肠杆菌、绿脓假单胞菌、肠炎沙门氏菌被用作微泡的来源。将细菌接种到在锥形烧瓶中的100mL的LB中，并在37℃下培养6小时。将8mL培养物转移到在2L的锥形烧瓶中的600mL的LB培养基中，并在37℃下培养5小时，至光密度为1.5（600nm下）。将获得的培养物分在500mL的高速离心管中，然后在4℃下，以10,000x g离心20分钟。使上清液通过0.45μm孔径的膜滤器一次，然后使用装备有膜的Quixstand系统浓缩25倍，该膜具有100kDa的截留分子量。浓缩物通过0.22μm孔径的膜滤器一次，并分在70mL的超离心管中，接着在4℃下，以150,000x g超速离心3小时以提供沉淀形式的来自细菌细胞的脱落的微泡。该沉淀物在PBS中悬浮。
来自大肠杆菌、绿脓假单胞菌和肠炎沙门氏菌的脱落的微泡用于分析抗癌活性。以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，含有1μg或5μg的每种来自革兰氏阴性菌细胞的微泡以100μl的剂量通过尾静脉按每周两次注射给小鼠，将这些小鼠进行分组，每组3只小鼠。移植癌细胞23天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l x s2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。
皮下移植后，结肠癌组织的体积测量如图2至图4所示。与对照PBS相比，施用来自大肠杆菌的脱落的微泡以剂量依赖的方式降低了结肠癌组织的尺寸（图2），施用来自绿脓假单胞菌的脱落的微泡后获得的结肠癌组织，其中结肠癌组织的尺寸显著降低（图3）。同样，通过来自肠炎沙门氏菌的脱落的微泡减少了结肠癌组织的尺寸（图4）。
实施例3：来自革兰氏阳性菌细胞脱落的微泡的体内抗癌活性
为了用于本实验，从革兰氏阳性菌分离自然脱落的微泡。革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和嗜酸乳杆菌被用作微泡的来源。将细菌接种到在锥形烧瓶中的100mL的营养液体培养基中，并在37℃下培养6小时。将8mL培养物转移到在2L的锥形烧瓶中的600mL的营养液体培养基中，并在37℃下培养5小时，至光密度为1.5（600nm下）。获得的培养物分在500mL的高速离心管中，然后在4℃下，以10,000x g离心20分钟。使上清液通过0.45μm孔径的膜滤器一次，然后使用装备有膜的Quixstand系统浓缩25倍，该膜具有100kDa的截留分子量。浓缩物通过0.22μm孔径的膜滤器一次，并分在70mL的超离心管中，接着在4℃下，以150,000x g超速离心3小时以提供沉淀形式的来自细菌细胞的脱落的微泡。该沉淀物在PBS中悬浮。
来自金黄色葡萄球菌和嗜酸乳杆菌的脱落的微泡被用于分析抗癌活性。以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，含有10μg的每种来自革兰氏阳性菌细胞的微泡以100μl的剂量通过尾静脉按每周两次注射给小鼠，将这些小鼠进行分组，每组3只小鼠。移植癌细胞23天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l x s2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。
皮下移植后，结肠癌组织的体积测量如图5和图6所示。从图中可以看出，与对照PBS相比，在施用来自金黄色葡萄球菌（图5）或嗜酸乳杆菌(图6)的脱落的微泡后获得的结肠癌组织，其中结肠癌组织的尺寸显著降低。
实施例4：来自转化的革兰氏阴性菌脱落的微泡的体内抗癌活性
除了使用转化以具有减少的脂多糖细胞毒性（msbB突变体）的大肠杆菌之外，以下实验使用与实施例2相同的方式获得的脱落的微泡。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，将PBS或含有1mg来自野生型大肠杆菌或转化以具有减少的脂多糖毒性的突变型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液以100mL的剂量通过尾静脉按每周两次注射给小鼠，将这些小鼠进行分组，每组3只小鼠。移植癌细胞23天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l x s2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。
皮下移植后，结肠癌组织的体积测量如图7所示。如图7所示，与仅施用PBS的对照相比，在施用来自转化以具有减少的脂多糖毒性的突变型大肠杆菌脱落的微泡的小鼠组中，观察到了肿瘤尺寸的显著降低。同时，突变型组的结肠癌组织的尺寸也远远小于野生型组的结肠癌组织的尺寸。
实施例5：来自转化的革兰氏阳性菌脱落的微泡的体内抗癌活性
除了使用具有减少的脂多糖细胞毒性（LTA突变体）转化的金黄色葡萄球菌之外，以下实验使用与实施例3相同的方式获得的脱落的微泡。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，将PBS或含有10μg来自野生型金黄色葡萄球菌或转化以具有减少的脂磷壁酸毒性的突变型金黄色葡萄球菌脱落的微泡的PBS溶液以100μL的剂量通过尾静脉按每周两次注射给小鼠，将这些小鼠进行分组，每组3只小鼠。移植癌细胞23天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l x s2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。
皮下移植后，结肠癌组织的体积测量如图8所示。如图8所示，与仅施用PBS的对照相比，在施用来自转化以具有减少的脂磷壁酸毒性的突变型金黄色葡萄球菌脱落的微泡的小鼠组中，观察到了肿瘤尺寸的显著降低。同时，突变型组的结肠癌组织的尺寸也远远小于野生型组的结肠癌组织的尺寸。
实施例6：来自转化的革兰氏阴性菌脱落的微泡对于转移癌的体内治疗效果
除了使用转化以具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌之外，以下实验使用与实施例2相同的方式获得的脱落的微泡。
以1×105细胞的剂量将小鼠黑素瘤细胞系(B16BL6)通过尾静脉注射到小鼠体内，并培养。三天后，将PBS或含有1μg来自转化以具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌的脱落的微泡的PBS溶液以100μl/天的剂量，通过尾静脉注射给小鼠注射10天，将这些小鼠进行分组，每组3只小鼠。注射黑素瘤细胞14天后，从小鼠体内切除肺以计算转移到肺的黑素瘤菌落的数量。
图9示出了3只小鼠组中的每只小鼠中黑素瘤菌落转移到肺的数量。如图9所示，与PBS对照相比，在施用来自转化以具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡小鼠中，观察到了黑素瘤菌落转移到肺的数量较低。
实施例7：共同施用来自细菌细胞的脱落的微泡与药物的抗癌活性
几个世纪以前，就已经发现了炎症在肿瘤发生中起到的作用。近年来，由于对该类研究的高度关注，所以发现了由VEGF/IL-6介导的信号传导、STAT3（信号传导及转录激活因子3）信号传导，以及Th17免疫应答产生的炎症反应对癌症的发生和发展起着重要作用。此外，据报道阿司匹林可以降低患结直肠癌的风险。本发明人最近发现阿司匹林抑制Th17介导的炎症反应。在该实施例中，当与抑制Th17免疫应答的药物共同施用后，检测了来自细菌细胞的微泡的抗癌活性。关于这一点，使用与实施例2相同的方式获得来自转化以具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌的脱落的微泡，并将其与抑制Th17免疫应答的药物阿司匹林共同施用。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，将PBS、含有18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液、含有0.1μg的来自细菌细胞的微泡的PBS溶液或含有0.1μg的来自细菌细胞的微泡和18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液，以100μL的剂量通过尾静脉按每周两次注射给小鼠，将这些小鼠进行分组，每组4只小鼠。移植癌细胞23天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l xs2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。
皮下移植后，结肠癌组织的体积测量如图10所示。如图10所示，单独施用阿司匹林的组与单独施用PBS的对照组之间，结肠肿瘤的大小没有差异。也就是说，没有观察到阿司匹林的抗癌效果。然而，当共同施用来自转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡和阿司匹林时，与单独施用来自转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡相比，结肠肿瘤的尺寸显著的减小。
综合考虑，上述获得的数据表明当与抑制Th17免疫应答的药物（诸如阿司匹林）共同施用后，本发明的来自细菌细胞脱落的微泡发挥了更强的抗癌活性。
实施例8：负载抗癌药物到来自革兰氏阴性菌细胞脱落的微泡
为了在以下实验中使用，用实施例2相同的方式获得来自转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡。
将脱落的微泡以1：1的比例与0.4mg/ml的阿霉素混合，并在4℃下培养12小时。此后，将悬浮液在4℃下，以150,000×g进行超速离心3小时，以分离来自负载阿霉素的微泡的脱落的微泡。负载阿霉素的微泡与DiO一起培养，带有绿色荧光的脂质追踪剂可以与细胞膜结合。将负载DiO的微泡滴注到盖玻片上，接着在共聚焦显微镜下观察以检测阿霉素是否负载到了脱落的微泡上。图11中示出了荧光图像。
如图11所示，观察到出现荧光红色的阿霉素负载到了出现荧光绿色的脱落的微泡上。从这些结果可以理解，治疗或诊断药物可以有效地负载于来自细菌细胞的微泡上。
实施例9：负载抗癌药物的来自细菌细胞的微泡的体外抗癌活性
分析负载抗癌剂的来自细菌细胞的微泡的抗癌活性，以检测抗癌剂的负载是否影响微泡本身的活性。使用阿霉素作为抗癌剂。
为了在以下实验中使用，用实施例8相同的方式获得来自转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡。
以5×104细胞的密度，将小鼠结肠癌26细胞系接种到24孔板中，并培养过夜。每个孔中的癌细胞用1mL的PBS或含有来自细菌细胞的负载阿霉素或没有负载阿霉素的微泡的PBS溶液处理，然后培养18小时。在显微镜下计数有生命力的小鼠结肠癌26细胞系的数量，结果如图12所示。
如图12所示，负载阿霉素的来自细菌细胞的微泡比没有负载阿霉素的来自细菌细胞的微泡显示更强的抑制癌细胞的活性。
由该结果显而易见的是，负载抗癌药物的来自细菌细胞的微泡的抗癌活性不仅是由来自细菌细胞的微泡，而且还是由负载的抗癌药物所发挥的活性，从而其抗癌活性大于施用单独的来自细菌细胞的微泡。
实施例10：脂多糖抑制剂对于来自细菌细胞的微泡的副作用的影响
关于来自细菌细胞的微泡的副作用，已知来自细菌细胞的微泡的组分脂多糖在败血症的发病中起着重要作用。所以，用微泡保留的脂多糖的抑制剂检测对于微泡的副作用的影响。在该实验中，使用多粘菌素B作为脂多糖的抑制剂。
根据实施例2所述的方法构建来自大肠杆菌脱落的微泡。PBS、含有25μg来自大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液、含有25μg来自大肠杆菌脱落的微泡和250μg的多粘菌素B的PBS溶液，分别以100μl的剂量腹膜内注射到小鼠组中，之后以12小时的间隔监测小鼠的存活率120小时。结果如图13所示。
如图13所示，在施用含有25μg来自大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液120小时之后，小鼠的存活率为10％，但是在施用含有25μg来自大肠杆菌脱落的微泡和250μg的多粘菌素B的PBS溶液120小时之后，小鼠的存活率增加到55％。
从该结果可以可出，来自大肠杆菌微泡的脂多糖活性的抑制药物有效地抑制了来自细菌细胞的微泡的副作用。
实施例11：来自野生型革兰氏阴性菌细胞的微泡和转化的革兰氏阴性菌细胞的微泡的副作用差异
使用来自已转化的具有减少的脂多糖（微泡的组分）毒性的微泡来检查来自细菌细胞的微泡中的脂多糖的副作用，其中脂多糖是来自革兰氏阴性菌细胞的微泡的组分。在该实验中，使用msbB突变体作为转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌。
根据实施例2所述的相同方式构建来自转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌中脱落的微泡。将PBS、含有25μg来自野生型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液，及含有25μg来自突变型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液，分别以100μl的剂量腹膜内注射到各个小鼠组中，之后以12小时的间隔监测小鼠的存活率120小时。结果如图14所示。
如图14所示，在施用含有25μg来自野生型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液120小时之后，小鼠的存活率为45％，但是在施用含有25μg来自突变型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液120小时之后，小鼠的存活率增加到65％。
从该结果可以看出，与来自野生型大肠杆菌的微泡相比，当施用的微泡来自突变型大肠杆菌时，来自细菌细胞的微泡的副作用能够被有效降低，其中所述突变型大肠杆菌中的脂多糖活性通过改性负责生产脂多糖的基因而去除，而脂多糖则是微泡中引起副作用的组分之一。
实施例12：降低由来自转化的革兰氏阴性菌的微泡所产生的副作用
为了检查由静脉注射来自细菌细胞的微泡可能产生的副作用，使用来自大肠杆菌脱落的微泡，所述大肠杆菌已转化为具有减少的脂多糖毒性。由于副作用的指数可能随着静脉注射产生，所以检查血小板的数目、血凝固和溶血作用。
为了用于该试验，从来自已转化为具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌，用与实施例2中相同的方式分离脱落的微泡。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，将PBS或含有5μg的来自已转化为具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液通过尾静脉给小鼠注射，将这些小鼠进行分组，每组2只小鼠。3或6小时之后，从小鼠中抽取血样。
在血块的形成中，血小板起着重要角色。为了检测静脉内注射来自细菌细胞的微泡对血小板数目的影响，进行了以下实验。在稀释液（Rees-Ecker液）中将血样稀释100倍，并在室温下在血细胞计中培养10分钟，之后在光学显微镜下计数血小板的数目。结果如图15所示。
如图15所示，即使当静脉注射时，来自已转化为具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡对血小板也没有影响，所述血小板在凝血过程中起着十分重要的角色。
D二聚体是纤维蛋白降解产物，在通过纤维蛋白溶解血块后，血液中存在小的蛋白片段，并因此作为弥漫性血管内凝血的诊断标准。为了检测由已转化为具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡引发的血管内凝血，进行了以下实验。将来自实施例12的血样以1,300x g离心10分钟。将由此获得的血浆稀释3倍并涂布到涂覆有识别D二聚体的捕捉抗体的96孔板上。然后，加入特异性识别D二聚体的结合过氧化氢酶的检测抗体。接下来，用底物BM-POD显色，结果如图16所示。
如图16所示，即使当静脉注射时，来自已转化为具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡也没有激活凝血机制。
进行以下实验以检测来自已转化为具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡引发的溶血作用。将PBS及含有1μg/ml或2μg/ml来自突变型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液，以10μl的量逐滴加入到血液琼脂平皿中，并在37℃下培养12小时。结果如图17所示。
如图17所示，来自已转化为具有减少脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡不能破坏红细胞。
由图15到图17的数据显而易见的是，即使当静脉注射时，来自已转化为具有减少脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡也不能引起血小板数量的下降、血液凝固和溶血作用。因此，当细菌为已转化的具有减少脂多糖毒性的细菌时，来自细菌细胞的微泡的副作用能有效的降低。
实施例13：来自野生型革兰氏阳性菌细胞的微泡和转化的革兰氏阳性菌细胞的微泡的副作用差异
已知脂磷壁酸通过特异的免疫应答诱发炎症，并因此是来自革兰氏阳性菌细胞的微泡产生副作用的原因，因为脂磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的组分。所以，使用来自已转化的缺乏参与脂磷壁酸生物合成基因的细菌的微泡来评估脂磷壁酸对于来自革兰氏阳性菌细胞的微泡引发的副作用的影响。在该实验中，使用LTA突变体作为已转化的从细胞壁去除脂磷壁酸的金黄色葡萄球菌。
用与实施例3相同的方式从金黄色葡萄球菌中构建脱落的微泡，所述金黄色葡萄球菌已转化为具有减少的脂磷壁酸的毒性。从小鼠腹腔内分离后，将巨噬细胞(2.5x105细胞)与0.5mL的PBS、0.5mL的含有0.1μg/ml的来自野生型金黄色葡萄球菌脱落的微泡的PBS溶液，及0.5mL的含有0.1μg/ml的来自突变型金黄色葡萄球菌脱落的微泡的PBS溶液一起培养12小时，并以500x g离心条件培养基5分钟。
涂覆有IL-6捕捉抗体的96孔板的每孔用100μl的1％BSA（牛血清白蛋白）封闭1小时。将条件培养基稀释1/2，加入到板中，并在室温下培养2小时，然后在存在生物素化的抗IL-6的检测抗体存在下继续培养2小时。用1％BSA洗涤板，并用链霉亲和素-POD培养30分钟，接着用底物BM-POD显色。结果如图18所示。
从图18的数据显而易见的是，与施用来自野生型金黄色葡萄球菌脱落的微泡相比，当施用已转化为具有减少的脂磷壁酸毒性的金黄色葡萄球菌脱落的微泡时，IL-6的水平降低。
由该结果可以理解的是，与来自野生型的微泡相比，当微泡来自突变型细菌时，来自细菌细胞的微泡的副作用能够被有效的减少，在所述突变型细菌中通过改性负责产生脂磷壁酸的基因而使得脂磷壁酸的活性降低，所述脂磷壁酸是引起副作用的微泡组分之一。
实施例14：共同施用抗炎剂和/或抗凝血剂对来自细菌细胞的微泡的副作用的影响
来自细菌细胞的微泡的副作用中，比较严重的是微泡触发的免疫应答，其减少了炎性介质的释放，引发局部或全身性炎症反应，并且微泡引发的凝血导致血栓栓塞或弥漫性血管内凝血。在该试验中，使用阿司匹林作为抗炎剂和抗凝血剂，其目的是减少来自细菌细胞的微泡的副作用。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。以实施例2相同的方式，从已转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌中分离脱落的微泡。一周后，将PBS、含有18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液、含有0.1μg的来自细菌细胞的微泡的PBS溶液，及含有0.1μg的来自细菌细胞的微泡和18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液，以100μL的剂量通过尾静脉按每周两次注射给各组的四只小鼠。在第五次注射的6小时后，从每只小鼠眼部抽取0.2ml的血样，并置于含有50mMEDTA（乙二胺四乙酸）的抗凝剂管中。10μl的血样与90μl的1％HCl一起混合，并在室温下储存7分钟。在10μl的混合物中使用血细胞计数器计数作为全身性炎症的指标的白细胞。结果如图19所示。
如图19所示，单独施用阿司匹林的组和施用PBS的组之间白细胞水平没有差异。施用来自已转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌中的微泡降低了白细胞的水平。然而，当共同施用阿司匹林和来自已转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌的微泡时，白细胞恢复到正常水平。
由该结果可知，共同施用来自细菌细胞的微泡和抗炎剂和/或抗凝血剂能够有效地降低来自细菌细胞的微泡的副作用（白细胞减少）。
实施例15：利用来自细菌细胞的微泡将药物递送至癌组织
在该实施例中，将对与实施例2中相同的方式制备的来自已转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠脱落的微泡进行检测递送药物的能力，及递送有与药物相关的各种尺寸的载体的能力。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养一周。将PBS、或含有5μg的来自已转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液，以100μL的剂量静脉注射给小鼠。6小时后，同样静脉注射100nm大小的绿色荧光珠，然后允许在体内充分循环5分钟。此后，用PBS代替小鼠所有的血液，以从血管中去除荧光珠。切除结肠癌组织，并冷冻切割成20μm厚，接着用10μg/ml的Hoechst染料给细胞核染色。在共聚焦显微镜下观察存在于癌组织中的荧光珠。结果如图20所示。
当注射来自已转化的具有减少的脂多糖毒性的大肠杆菌脱落的微泡时，如图20所示，在癌组织中观察到存在100nm大小的荧光珠。相反，PBS并不使荧光珠靶向癌组织。
从这些结果可以断定，施用来自细菌细胞的微泡导致随后注射的抗癌药物或负载抗癌药物的载体更有效地递送到癌组织，所述载体的尺寸为几十到几百纳米。
实施例16：来自细菌细胞的微泡的主要成分OmpA的抗癌效果
根据本发明人的蛋白质组学分析，一种革兰氏阴性菌的外膜蛋白的最丰富的蛋白之一的OmpA，在脱落的微泡中大量存在。因此，为了检查OmpA是否能够介导来自细菌细胞的微泡的抗癌活性，分析了OmpA的抗癌活性。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，将PBS及含有1mg的重组OmpA蛋白的PBS溶液，以100μL的剂量通过尾静脉按每周两次注射给各组的四只小鼠。移植癌细胞21天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l x s2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。测量结果如图21所示。
如图21所示，与对照相比，施用重组的OmpA蛋白后，观察到结肠癌组织的体积显著的降低。该结果表明，存在于来自细菌细胞脱落的微泡的外膜的OmpA是介导来自细菌细胞的微泡抗癌活性的因子。
实施例17：来自缺乏外膜蛋白OmpF的细菌脱落的微泡的抗癌活性
除了OmpA，根据本发明人的蛋白质组学分析，也发现外膜蛋白OmpF是一种来自细菌细胞脱落的微泡的主要成分。因此，分析了来自细菌细胞脱落的微泡的OmpF诱导的抗癌活性。
关于此，除了使用缺乏OmpF的大肠杆菌外，使用与实施例2相同的方式获得微泡。
以1×106细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养。一周后，将PBS、含有1μg的来自野生型大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液及含有1μg的来自来自缺乏OmpF的大肠杆菌脱落的微泡的PBS溶液，以100μL的剂量通过尾静脉按每周两次给各小鼠组注射。移植癌细胞21天后，监测结肠癌组织的尺寸。癌组织的体积用等式V=l xs2/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。测量结果如图22所示。
如图22所示，来自缺乏OmpF的大肠杆菌脱落的微泡的抗癌活性低于来自野生型大肠杆菌脱落的微泡的抗癌活性。
该结果证明，在来自细菌细胞脱落的微泡的外膜中存在的OmpF，与OmpA一起，作为负责来自细菌细胞的微泡的抗癌活性的因子。
实施例18：具有OmpA外膜蛋白的脂质体的重组
为了构建脂质体，将N-（羰基甲氧基聚乙二醇2000）-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、完全氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和胆固醇分别以3.19mg/mL、9.58mg/mL和3.19mg/mL浓度溶解于氯仿中，并且三种脂质溶液以1:1:1的比例混合。然后，使用氮气去除氯仿以形成薄膜。尿素缓冲液（344mM尿素，10mM KCl，10mMHEPES（pH7.0，3mM NaN3）加入到该薄膜中，接着在56℃下在水浴超声波发生器中超声波处理1小时。获得的悬浮液通过1μm孔径的膜滤器5次，然后通过400nm孔径的膜滤器5次，并且最后通过100nm孔径的膜滤器5次从而提供脂质体。
向0.3ml的脂质体中加入含有280μg的OmpA的0.7ml的尿素缓冲液，接着加入辛烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷至终浓度为1.1％。在37℃下培养2小时后，加入15ml的尿素缓冲液。获得的溶液以100,000x g超速离心1小时。小球悬浮于0.2ml的尿素缓冲液中，并加入到50％OptiPrep溶液中，以形成30％的终浓度。在5ml超速离心管中，将2ml的30％脂质体悬浮液、1ml的20％OptiPrep及1ml的5％OptiPrep按顺序加入。以100,000x g超速离心2小时后，在20％OptiPrep层和5％OptiPrep层之间形成负载OmpA的脂质体层。
在200ng的OmpA和5μg的负载OmpA的脂质体分别与5x上样染料混合后，混合物在100℃下煮沸5分钟，并上样到12％的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，在400mA电流下转移蛋白质到PVDF膜2小时。该膜在3％脱脂乳的PBS中在室温下封闭2小时，在4℃下与OmpA抗体一起培养12小时，并用PBS清洗两次。接着在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起培养1小时，并用PBS清洗膜30分钟，然后用ECL底物显色。结果如图23所示。
如图23所示，发现OmpA负载脂质体。当分离时，OmpA蛋白处于变性的形式，因为其与清洁剂一起存在。然而，当重组到脂质体中时，发现OmpA存在为折叠形式和变性形式。从该结果可以看出OmpA可以重组于脂质体中。
尽管本发明的优选的实施方式已经出于说明的目的进行公开，但是本领域技术人员应该理解各种改变、增加和替代都是可能的，而不脱离本发明的附属的权利要求书所公开的范围和精神。
工业实用性
作为说明，本发明的来自细菌细胞的微泡能够特异性地递送治疗或诊断各种疾病（包括癌症）的物质到目的细胞或目的组织，从而增加治疗和诊断效果。
此外，根据本发明的负载治疗和/或诊断物质的来自细菌细胞的微泡及其制备方法可用于体外和/或体内治疗、诊断或实验。

Claims (6)

1.一种用于治疗或诊断癌症的药物组合物，其包含来自细菌细胞的脱落的微泡，其中所述细菌是经转化的具有减弱的脂多糖毒性的革兰氏阴性菌或者是经转化的具有减弱的脂磷壁酸毒性的革兰氏阳性菌，所述细菌表达诊断或治疗癌症的物质或被转化为表达所述物质。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，还进一步包含抑制脱落的微泡引起的毒性的药物。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述药物是阿司匹林。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，还进一步包含增强抗癌活性的药物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述药物选自由阿司匹林、抑制Th17（辅助性T细胞17）介导的免疫应答的药物、抑制白介素-6的形成或活性的药物、抑制血管生成的药物、抑制血管内皮生长因子的形成或活性的药物、抑制血管内皮生长因子受体介导的信号传导的药物、抑制STAT3 (信号传导及转录激活因子)信号传导的药物和抗癌剂组成的组中。
6.一种用于治疗或诊断癌症的药物组合物，包含负载用于治疗或诊断癌症药物的脱落的微泡，其来自已转化为靶向癌细胞或癌组织的细菌，其中所述细菌是经转化的具有减弱的脂多糖毒性的革兰氏阴性菌或者是经转化的具有减弱的脂磷壁酸毒性的革兰氏阳性菌，所述已转化的细菌被转化以表达所述物质。
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